CN105671201B - 用于鉴定口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的引物组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的引物组合及其应用。本发明的引物组合由引物组Ⅰ和引物组Ⅱ组成。引物组Ⅰ由引物FMDV‑F3、FMDV‑B3、FMDV–FIP和FMDV‑BIP组成，依次如序列1至4所示。引物组Ⅱ由引物VSV‑F3、VSV‑B3、VSV‑FIP和VSV‑BIP组成，依次如序列5至8所示。本发明还保护所述引物组合在鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒中的应用、鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒或水泡性口炎病毒中的应用、鉴定待测样本是否感染了口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒中的应用。本发明所建立的二重RT‑LAMP方法是一种简便，快速，低成本的诊断方法，可用于条件不好的基层和现场检疫，也适用于大规模的流行病学调查。

Description

用于鉴定口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的引物组合及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于鉴定口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的引物组合及其应用。
背景技术
口蹄疫和水泡性口炎是牛的高度急性病毒传染病，一般呈暴发性流行,给畜产品贸易和养牛业造成巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的。水泡性口炎是由水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)引起的。FMDV和VSV在临床上常存在混合感染，均表现为精神不撅，体温升高，口腔、乳头和蹄部冠状带等处发生水泡及溃疡，临床症状十分相似，难以区分。因此急需建立口蹄疫和水泡性口炎的快速鉴别检测技术，为我国FMDV和的VSV防控提供技术支持。
FMDV包括7个血清型：O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型和AsiaⅠ型，目前国内流行的为O型、A型和AsiaⅠ型。VSV分为两种血清型，NJ型(新泽西型)和IND型(印第安型)，在引起家畜发病的血清型中，NJ型占多数。
目前OIE推荐通过病毒分离、ELISA、RT-PCR、荧光RT-PCR等方法检测FMDV和VSV。病毒分离虽然是检测的黄金标准，但耗时耗力。RT-PCR和荧光RT-PCR快速准确，但成本较高，需要昂贵的仪器设备。环介导的体外等温扩增检测技术(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)是在PCR方法上发展起来的新兴核酸检测技术，实现了在恒温条件下方便、快速、灵敏、特异的检测，已在多种主要动物病原体检测上得到应用，可在条件贫乏的基层使用。目前，国内尚未有二重RT-LAMP检测技术的研究报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的引物组合及其应用。
本发明提供了一种引物组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)由引物组Ⅰ和引物组Ⅱ组成；
(a2)所述引物组Ⅰ；
(a3)所述引物组Ⅱ；
所述引物组Ⅰ由引物FMDV-F3、引物FMDV-B3、引物FMDV–FIP和引物FMDV-BIP组成；
所述引物FMDV-F3为如下(b1)或(b2)；
(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物FMDV-B3为如下(b3)或(b4)；
(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物FMDV-FIP为如下(b5)或(b6)或(b7)或(b8)；
(b5)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列3自5’末端第1-21位核苷酸、序列表的序列3自5’末端第28-51位核苷酸；
(b6)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列3自5’末端第1-21位核苷酸、限制性内切酶识别序列(具体可为EcoRⅠ酶切位点序列)、序列表的序列3自5’末端第28-51位核苷酸(所述DNA分子具体可由上述各个元件组成)；
(b7)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b8)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物FMDV-BIP为如下(b9)或(10)或(b11)或(b12)；
(b9)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列4自5’末端第1-21位核苷酸、序列表的序列4自5’末端第28-50位核苷酸；
(b10)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列4自5’末端第1-21位核苷酸、限制性内切酶识别序列(具体可为EcoRⅠ酶切位点序列)、序列表的序列4自5’末端第28-50位核苷酸(所述DNA分子具体可由上述各个元件组成)；
(b11)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b12)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅱ由引物VSV-F3、引物VSV-B3、引物VSV-FIP和引物VSV-BIP组成；
所述引物VSV-F3为如下(c1)或(c2)；
(c1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物VSV-B3为如下(c3)或(c4)；
(c3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述引物VSV-FIP为如下(c5)或(c6)或(c7)或(c8)；
(c5)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列7自5’末端第1-22位核苷酸、序列表的序列7自5’末端第29-47位核苷酸；
(c6)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列7自5’末端第1-22位核苷酸、限制性内切酶识别序列(具体可为EcoRⅠ酶切位点序列)、序列表的序列7自5’末端第29-47位核苷酸(所述DNA分子具体可由上述各个元件组成)；
(c7)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(c8)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物VSV-BIP为如下(c9)或(c10)或(c11)或(c12)；
(c9)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列8自5’末端第1-25位核苷酸、序列表的序列8自5’末端第32-49位核苷酸；
(c10)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列8自5’末端第1-25位核苷酸、限制性内切酶识别序列(具体可为EcoRⅠ酶切位点序列)、序列表的序列8自5’末端第32-49位核苷酸(所述DNA分子具体可由上述各个元件组成)；
(c11)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(c12)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒；
(d2)鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒或水泡性口炎病毒；
(d3)鉴定待测样本是否感染了口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒。
本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒；
(d2)鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒或水泡性口炎病毒；
(d3)鉴定待测样本是否感染了口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒；
(d2)鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒或水泡性口炎病毒；
(d3)鉴定待测样本是否感染了口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种鉴别待测病毒为口蹄疫病毒还是水泡性口炎病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测病毒的总RNA；
(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用所述引物组合进行逆转录环介导等温扩增，然后进行EcoRⅠ酶切，然后进行如下判断：
如果得到大小分别为201bp、181bp、137bp、118bp的四种DNA片断，待测病毒为口蹄疫病毒；如果得到大小分别为124bp、100-102bp、78bp的三种DNA片断，待测病毒为水泡性口炎病毒。
所述待测病毒为口蹄疫病毒或水泡性口炎病毒。所述口蹄疫病毒可为口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒AsiaⅠ型。所述水泡性口炎病毒可为水泡性口炎病毒NJ型或水泡性口炎病毒IND型。
本发明还提供了一种鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒或水泡性口炎病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测病毒的总RNA；
(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用所述引物组合进行逆转录环介导等温扩增，然后进行EcoRⅠ酶切，然后进行如下判断：
如果得到大小分别为201bp、181bp、137bp、118bp的四种DNA片断，待测病毒为或候选为口蹄疫病毒；如果得到大小分别为124bp、100-102bp、78bp的三种DNA片断，待测病毒为或候选为水泡性口炎病毒。
所述待测病毒具体可为口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、蓝舌病毒或小反刍兽疫病毒。所述口蹄疫病毒可为口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒AsiaⅠ型。所述水泡性口炎病毒可为水泡性口炎病毒NJ型或水泡性口炎病毒IND型。
本发明还保护一种鉴定待测样本是否感染口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总RNA；
(2)以步骤(1)提取的总RNA为模板，采用所述引物组合进行逆转录环介导等温扩增，然后进行EcoRⅠ酶切，然后进行如下判断：
如果得到大小分别为201bp、181bp、137bp、118bp的四种DNA片断，待测样本为或候选为感染口蹄疫病毒的样本；如果得到大小分别为124bp、100-102bp、78bp的三种DNA片断，待测样本为或候选为感染水泡性口炎病毒的样本；如果得到大小分别为201bp、181bp、124-137bp、100-118bp、78bp的五种DNA片断，待测样本为或候选为混合感染口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的样本。
所述待测样本为离体的动物组织，例如牛肉、牛肉加工制成的食品、牛内脏，牛内脏加工制成的食品等等。
所述口蹄疫病毒可为口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒AsiaⅠ型。
所述水泡性口炎病毒可为水泡性口炎病毒NJ型或水泡性口炎病毒IND型。
本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒；
(d2)鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒或水泡性口炎病毒；
(d3)鉴定待测样本是否感染了口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒。
所述口蹄疫病毒可为口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒AsiaⅠ型。所述水泡性口炎病毒可为水泡性口炎病毒NJ型或水泡性口炎病毒IND型。
以上任一所述逆转录环介导等温扩增的反应温度可为58-68℃，具体可为62℃。
以上任一所述逆转录环介导等温扩增的反应条件具体可为：62℃反应90分钟。
以上任一所述逆转录环介导等温扩增的反应条件具体可为：先62℃反应90分钟，然后80℃5min以终止反应。
以上任一所述逆转录环介导等温扩增的反应体系中，引物组合中的各条引物的浓度如下：40pmol FMDV-FIP、40pmol FMDV-BIP、40pmol VSV-FIP、40pmol VSV-BIP、5pmolFMDV-F3、5pmol FMDV-B3、5pmol VSV-B3、5pmol VSV-F3。
以上任一所述逆转录环介导等温扩增的反应体系(25μL)具体可为：1μL模板、2.5μL10×buffer、15U Bst DNA聚合酶、20U AMV逆转录酶、40pmol FMDV-FIP、40pmol FMDV-BIP、40pmol VSV-FIP、40pmol VSV-BIP、5pmol FMDV-F3、5pmol FMDV-B3、5pmol VSV-B3、5pmol VSV-F3，不足体积用水补足。
近几年随着我国畜牧业高速发展，养牛饲业规模的不断扩大,疫病防治工作正面临着前所未有的压力,需要简便、快速、高通量检测技术以保证养牛业的健康发展。LAMP技术是基于PCR技术发展起来的一种新型核酸扩增技术，该技术克服了传统PCR技术的一些缺点，具有简便、快速、特异性高和成本低的优点。反应只需一台水浴锅中2小时即可完成，结果可凭肉眼直接观察，已经应用在多种微生物的检测。本发明的发明人设计了多套引物，优化筛选特异性引物组合，最终成功建立了在同一反应管里鉴别诊断口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重RT-LAMP检测方法。采用本发明提供的引物组合和方法鉴定口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒特异性好(能高效扩增目的基因，而对其它病原核酸无扩增)、灵敏度高(最低能检测到100个FMDV和100个VSV RNA拷贝)。
多重PCR的扩增效率受到多方面因素的影响，特异性引物的设计是多重PCR成功的关键。本发明的发明人将FMDV和VSV的不同浓度模板进行组合，探讨了高浓度模板对低浓度模板是否存在抑制。发现控制反应体系中引物的用量，可大大抵制干扰性，即使高浓度模板优先反应，也会因引物耗尽而停止扩增，把反应体系留给低浓度的另一模板，达到同时扩增高浓度模板和低浓度模板而不相互不受干扰效果，不影响二重RT-LAMP反应系的扩增效果。
本发明所建立的二重RT-LAMP方法是一种简便，快速，低成本的诊断方法，能在同一个反应管内检测FMDV和VSV。可用于条件不好的基层和现场检疫，也适用于大规模的流行病学调查。
附图说明
图1为实施例2的结果。
图2为实施例3的结果。
图3为实施例5的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。片断同片段。
口蹄疫灭活疫苗O型(即口蹄疫病毒O型的灭活疫苗)、口蹄疫灭活疫苗A型(即口蹄疫病毒A型的灭活疫苗)、口蹄疫灭活疫苗AsiaⅠ型(即口蹄疫病毒AsiaⅠ型的灭活疫苗)均购自兰州兽医研究所。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(IBRV)、大肠杆菌(ETEC)均购自中国兽药监察所。
FMDV O型灭活病毒、FMDV A型灭活病毒、FMDV AsiaⅠ型灭活病毒、VSV NJ型灭活病毒、VSV IND型灭活病毒、BTV 4型(即蓝舌病病毒4型)灭活病毒、PPRV(即小反刍兽疫病毒)疫苗株均记载于如下文献：“蓝舌病、口蹄疫、小反刍兽疫和水泡性口炎多重PCR检测方法的建立”，动物医学进展，2015，36(9)：18-22；由云南出入境检验检疫局惠赠，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
2.5μL 10×buffer组成为：200mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)、100mM KCl、80mMMgSO4、100mM(NH4)2SO4、体积百分含量为1％的Tween20、8M betaine和14mM dNTPs。
实施例1、引物组合的设计和制备
进行大量序列分析、比对获得了用于鉴定FMDV的若干引物组和用于鉴定VSV的若干引物组。将各个引物组进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于鉴定FMDV的一个引物组和用于鉴定VSV的一个引物组。
用于鉴定FMDV的引物组由如下四条引物组成(5’→3’)：
FMDV-F3(序列1)：GAACAACATCCACGTGCTCTAC；
FMDV-B3(序列2)：GGCGTGCAAAGGAGAGGATA；
FMDV-FIP(序列3)：ACGATGTCGTCTCCGTAGGAG-gaattc-TAGACACTATGAGGGAGTTGAGCT；
FMDV-BIP(序列4)：CTGACAAAAGCGACAAAGGTT-gaattc-ACAGGTTTGTAAAACCCAGTTCC。
用于鉴定VSV的引物组由如下四条引物组成(5’→3’)：
VSV-F3(序列5)：GAACTGAAGACAGCACTTC；
VSV-B3(序列6)：CCATCCTCGACTAGACTCTC；
VSV-FIP(序列7)：GGATGTAGATGGGAAGCCATTT-gaattc-TGATGGGAAATCAGACCCT；
VSV-BIP(序列8)：ACGGATTACAGAAAGAAACTACTGG-gaattc-AAATCTGGTTGACGCCAC。
每个引物组由针对6个位点的4条引物组成：外引物F3、外引物B3、内引物FIP(F1c+F2)和内引物BIP(B1c+B2)，在F1c和F2之间引入EcoRⅠ酶切位点序列，在B1c和B2之间引入EcoRⅠ酶切位点序列(下划线标注酶切位点序列)。
用于鉴定FMDV的引物组命名为引物组Ⅰ。用于鉴定VSV的引物组命名为引物组Ⅱ。
引物组合由引物组Ⅰ和引物组Ⅱ组成。
实施例2、特异性
1、提取待测样本的总RNA。待测样本分别为：VSV NJ型灭活病毒、FMDV O型灭活病毒、FMDV O型灭活病毒和VSV NJ型灭活病毒的等量混合物(简称混合病毒)、BTV4型灭活病毒、PPRV疫苗株、BVDV、BRV或IBRV。
2、取步骤1得到的总RNA，作为模板，采用实施例1的引物组合进行RT-LAMP扩增。
RT-LAMP扩增的反应体系(25μL)：1μL模板(含RNA 10-100ng)、2.5μL 10×buffer、15U Bst DNA聚合酶、20U AMV逆转录酶、40pmol FMDV-FIP、40pmol FMDV-BIP、40pmol VSV-FIP、40pmol VSV-BIP、5pmol FMDV-F3、5pmol FMDV-B3、5pmol VSV-B3、5pmol VSV-F3，不足体积用水补足。设置用等体积水代替模板的空白对照。
RT-LAMP扩增的反应条件：先62℃反应90分钟，然后80℃5min以终止反应。
3、提取ETEC的基因组DNA，作为模板，采用实施例1的引物组合进行LAMP扩增。
LAMP扩增的反应体系(25μL)：1μL模板(含DNA 10-100ng)、2.5μL 10×buffer、15UBst DNA聚合酶、20U AMV逆转录酶、40pmol FMDV-FIP、40pmol FMDV-BIP、40pmol VSV-FIP、40pmol VSV-BIP、5pmol FMDV-F3、5pmol FMDV-B3、5pmol VSV-B3、5pmol VSV-F3，不足体积用水补足。
LAMP扩增的反应条件：先62℃反应90分钟，然后80℃5min以终止反应。
4、分别取步骤2和步骤3的产物，用EcoRⅠ酶切后进行2％琼脂糖凝胶电泳。
结果见图1。图1中，泳道M为DNA marker(DL 2000)，泳道1为VSV NJ型灭活病毒的结果，泳道2为FMDV O型灭活病毒的结果，泳道3为混合病毒的结果，泳道4为BTV 4型灭活病毒的结果，泳道5为PPRV疫苗株的结果，泳道6为BVDV的结果，泳道7为BRV的结果，泳道8为IBRV的结果，泳道9为ETEC的结果，泳道10为空白对照的结果。
结果表明，采用本发明提供的引物组合可以实现对VSV NJ型、FMDV O型以及混合病毒的有效扩增，对其它病毒不存在非特异性扩增，本发明提供的引物组合特异性良好。
进行三次重复试验，结果一致。
实施例3、灵敏度
一、RNA标准品的制备
1、提取FMDV O型灭活病毒的总RNA并反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用FMDV-B3和FMDV-F3组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。经测序，PCR扩增产物如序列表的序列9所示。
3、采用T7体外转录试剂盒(Fermentas)并按说明书操作，将步骤2得到的PCR扩增产物进行体外转录，得到RNA甲，通过D260测定RNA浓度，根据阿弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数，-70℃保存备用。
4、提取VSV NJ型灭活病毒的总RNA并反转录为cDNA。
5、以步骤4得到的cDNA为模板，采用VSV-F3和VSV-B3组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。经测序，PCR扩增产物如序列表的序列10所示。
6、采用T7体外转录试剂盒(Fermentas)并按说明书操作，将步骤5得到的PCR扩增产物进行体外转录，得到RNA乙，通过D260测定RNA浓度，根据阿弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数，-70℃保存备用。
7、将RNA甲和RNA乙按照等拷贝数混合，得到RNA混合物。
二、灵敏度检测
1、采用无菌去离子水将待测样本(步骤一制备的RNA混合物)进行10倍梯度稀释，得到各个稀释液。稀释液1中，RNA甲和RNA乙均为1×108拷贝/μL。稀释液2中，RNA甲和RNA乙均为1×107拷贝/μL。稀释液3中，RNA甲和RNA乙均为1×106拷贝/μL。稀释液4中，RNA甲和RNA乙均为1×105拷贝/μL。稀释液5中，RNA甲和RNA乙均为1×104拷贝/μL。稀释液6中，RNA甲和RNA乙均为1×103拷贝/μL。稀释液7中，RNA甲和RNA乙均为1×102拷贝/μL。稀释液8中，RNA甲和RNA乙均为1×101拷贝/μL。稀释液9中，RNA甲和RNA乙均为100拷贝/μL。
2、分别以步骤1得到的各个稀释液为模板，采用实施例1的引物组合进行RT-LAMP扩增。
RT-LAMP扩增的反应体系(25μL)：1μL模板、2.5μL 10×buffer、15U Bst DNA聚合酶、20U AMV逆转录酶、40pmol FMDV-FIP、40pmol FMDV-BIP、40pmol VSV-FIP、40pmol VSV-BIP、5pmol FMDV-F3、5pmol FMDV-B3、5pmol VSV-B3、5pmol VSV-F3，不足体积用水补足。
RT-LAMP扩增的反应条件：先62℃反应90分钟，然后80℃5min以终止反应。
RT-LAMP扩增的过程中，采用时实浊度仪loopam LA-320C实时检测浊度，结果见图2。图2中，1至7依次代表稀释液3、稀释液4、稀释液5、稀释液6、稀释液7、稀释液8和稀释液9的结果。
结果表明，采用本发明提供的引物组合，采用二重RT-LAMP检测FMDV和VSV的灵敏度均可达100个拷贝/μl，灵敏度非常高。
进行三次重复试验，结果一致。
实施例4、普适性
待测样本分别为：口蹄疫灭活疫苗O型、口蹄疫灭活疫苗A型、口蹄疫灭活疫苗AsiaⅠ型、FMDV O型灭活病毒、FMDV A型灭活病毒、FMDV AsiaⅠ型灭活病毒、VSV NJ型灭活病毒、VSV IND型灭活病毒。
1、提取待测样本的总RNA。
2、取步骤1得到的总RNA，作为模板，采用实施例1的引物组合进行RT-LAMP扩增。
RT-LAMP扩增的反应体系(25μL)：1μL模板(含RNA 10-100ng)、2.5μL 10×buffer、15U Bst DNA聚合酶、20U AMV逆转录酶、40pmol FMDV-FIP、40pmol FMDV-BIP、40pmol VSV-FIP、40pmol VSV-BIP、5pmol FMDV-F3、5pmol FMDV-B3、5pmol VSV-B3、5pmol VSV-F3，不足体积用水补足。设置用等体积水代替模板的空白对照。
RT-LAMP扩增的反应条件：先62℃反应90分钟，然后80℃5min以终止反应。
3、取步骤2的产物，用EcoRⅠ酶切后进行2％琼脂糖凝胶电泳。结果表明，采用本发明提供的引物组合可以实现对各个待测样本的有效扩增。
4、完成步骤3的琼脂糖凝胶电泳后，分别切取各个条带进行测序。测序结果表明：采用本发明提供的引物组合扩增各种FMDV并进行EcoRⅠ酶切后，得到四种DNA片断(大小分别为201bp、181bp、137bp、118bp)；采用本发明提供的引物组合扩增各种VSV并进行EcoRⅠ酶切后，得到三种DNA片断(大小分别为124bp、100-102bp、78bp)；采用本发明提供的引物组合扩增各种FMDV和各种VSV的混合病毒并进行EcoRⅠ酶切后，得到五种DNA片断(大小分别为201bp、181bp、124-137bp、100-118bp、78bp)。
结果表明，本发明提供的引物组合对口蹄疫病毒的不同血清型和水泡性口炎病毒的不同血清型均具有良好的普适性。
进行三次重复试验，结果一致。
实施例5、干扰性
1、将实施例3制备的RNA甲和RNA乙按照不同拷贝数比例进行混合，得到各个样本。样本1中，RNA甲的浓度为106拷贝/μL、RNA乙的浓度为102拷贝/μL。样本2中，RNA甲的浓度为106拷贝/μL、RNA乙的浓度为104拷贝/μL。样本3中，RNA甲的浓度为102拷贝/μL、RNA乙的浓度为106拷贝/μL。样本4中，RNA甲的浓度为104拷贝/μL、RNA乙的浓度为106拷贝/μL。
2、分别以步骤1得到的各个样本为模板，采用实施例1的引物组合进行RT-LAMP扩增。
RT-LAMP扩增的反应体系(25μL)：1μL模板、2.5μL 10×buffer、15U Bst DNA聚合酶、20U AMV逆转录酶、40pmol FMDV-FIP、40pmol FMDV-BIP、40pmol VSV-FIP、40pmol VSV-BIP、5pmol FMDV-F3、5pmol FMDV-B3、5pmol VSV-B3、5pmol VSV-F3，不足体积用水补足。
RT-LAMP扩增的反应条件：先62℃反应90分钟，然后80℃5min以终止反应。
3、取步骤2的产物，用EcoRⅠ酶切后进行2％琼脂糖凝胶电泳。
结果见图3。图3中，泳道M为DNA marker(DL 2000)，泳道1为样本1的结果，泳道2为样本2的结果，泳道3为样本3的结果，泳道4为样本4的结果。
结果表明，当RNA甲和RNA乙浓度不同时，仍然可以通过不同的条带大小分别检测到两种病毒RNA，即本发明提供的引物组合中的两个引物对相互干扰性小。
进行三次重复试验，结果一致。
实施例6、应用
待测样本：10份可疑牛样品(口腔棉拭子，来自广西某地区，均采集自口腔出现水泡样溃烂的牛)。
1、提取待测样本的总RNA。
2、取步骤1得到的总RNA，作为模板，采用实施例1的引物组合进行RT-LAMP扩增。
RT-LAMP扩增的反应体系(25μL)：1μL模板(含RNA 10-100ng)、2.5μL 10×buffer、15U Bst DNA聚合酶、20U AMV逆转录酶、40pmol FMDV-FIP、40pmol FMDV-BIP、40pmol VSV-FIP、40pmol VSV-BIP、5pmol FMDV-F3、5pmol FMDV-B3、5pmol VSV-B3、5pmol VSV-F3，不足体积用水补足。设置用等体积水代替模板的空白对照。
RT-LAMP扩增的反应条件：先62℃反应90分钟，然后80℃5min以终止反应。
3、取步骤2的产物，用EcoRⅠ酶切后进行2％琼脂糖凝胶电泳。
4、采用OIE推荐的引物和方法鉴定待测样本，验证本发明提供的方法的可靠性。
结果表明：采用本发明提供的引物组合和方法进行鉴定，10份可疑牛样本中，3份为FMDV阳性，与OIE推荐引物和方法的鉴定结果一致；采用本发明提供的引物组合和方法进行鉴定，10份可疑牛样本均未检出VSV，与OIE推荐引物和方法的鉴定结果一致。
进行三次重复试验，结果一致。

Claims (4)

1.引物组合，由引物组Ⅰ和引物组Ⅱ组成；
所述引物组Ⅰ由引物FMDV-F3、引物FMDV-B3、引物FMDV–FIP和引物FMDV-BIP组成；所述引物FMDV-F3为序列表的序列1所示的单链DNA分子；所述引物FMDV-B3为序列表的序列2所示的单链DNA分子；所述引物FMDV-FIP为序列表的序列3所示的单链DNA分子；所述引物FMDV-BIP为序列表的序列4所示的单链DNA分子；
所述引物组Ⅱ由引物VSV-F3、引物VSV-B3、引物VSV-FIP和引物VSV-BIP组成；所述引物VSV-F3为序列表的序列5所示的单链DNA分子；所述引物VSV-B3为序列表的序列6所示的单链DNA分子；所述引物VSV-FIP为序列表的序列7所示的单链DNA分子；所述引物VSV-BIP为序列表的序列8所示的单链DNA分子。
2.权利要求1所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒；
(d2)鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒或水泡性口炎病毒；
(d3)鉴定待测样本是否感染了口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒。
3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒；
(d2)鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒或水泡性口炎病毒；
(d3)鉴定待测样本是否感染了口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106191309A (zh) * 2016-07-19 2016-12-07 广西壮族自治区兽医研究所 一种同时鉴别8种牛病原体的引物组合及GeXP检测方法
CN106591498A (zh) * 2017-02-23 2017-04-26 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于检测水疱性口炎病毒的荧光lamp引物及检测方法
CN106636476A (zh) * 2017-03-03 2017-05-10 张薇 一种用于检测口蹄疫的环介导等温扩增引物组及试剂盒
CN106929605B (zh) * 2017-04-14 2020-12-25 中国海关科学技术研究中心 一种能同时检测和鉴别口蹄疫和水泡性口炎的检测试剂盒及引物和探针
CN106893787A (zh) * 2017-04-20 2017-06-27 广西壮族自治区兽医研究所 鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光rt‑lamp检测引物组、试剂盒及其应用
CN106987657B (zh) * 2017-04-21 2020-06-09 广西壮族自治区兽医研究所 用于鉴别牛病毒腹泻病毒和牛轮状病毒的引物组合及其应用
CN108796131B (zh) * 2018-06-29 2020-10-20 广西壮族自治区兽医研究所 可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光rt-lamp检测组、试剂盒及其应用
CN112899400B (zh) * 2021-02-07 2022-07-05 西北农林科技大学 口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒双重rpa检测试剂盒
CN113005227A (zh) * 2021-03-12 2021-06-22 长沙海关技术中心 一种高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的引物以及试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101487064A (zh) * 2009-02-24 2009-07-22 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 检测五种人兽共患病病毒的方法及专用试剂盒
CN103224994A (zh) * 2013-03-04 2013-07-31 中国检验检疫科学研究院 口蹄疫病毒分型诊断环介导等温扩增试剂盒及其使用方法
CN103602757A (zh) * 2013-08-30 2014-02-26 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光rt-pcr检测方法的建立及其应用
CN104789694A (zh) * 2014-09-15 2015-07-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种水疱性病检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101487064A (zh) * 2009-02-24 2009-07-22 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 检测五种人兽共患病病毒的方法及专用试剂盒
CN103224994A (zh) * 2013-03-04 2013-07-31 中国检验检疫科学研究院 口蹄疫病毒分型诊断环介导等温扩增试剂盒及其使用方法
CN103602757A (zh) * 2013-08-30 2014-02-26 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光rt-pcr检测方法的建立及其应用
CN104789694A (zh) * 2014-09-15 2015-07-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种水疱性病检测试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A one-step reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay for simple and rapid detection of swine vesicular disease virus;Anne-Lie Blomstrom等;《Journal of Virological Methods》;20071017;188-193
Detection of foot-and-mouth disease virus rna by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification;Hao-tai Chen等;《Virology Journal》;20111109;第8卷(第510期);摘要，表1，表2，第2.2、2.3、2.4、3.1、3.2节，图1，第24页右栏第1段
Development and evaluation of multiplex RT-LAMP assays for rapid and sensitive detection;Wataru Yamazaki等;《Journal of Virological Methods》;20130930;第192卷(第1-2期);18-24
Novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of foot-and-mouth disease virus;J. P. Dukes等;《Arch Virol》;20060202;第151卷;1093-1106
水疱性口炎病毒RT-LAMP快速检测方法的研究;罗琼等;《畜牧与兽医》;20090731;第41卷(第7期);摘要，第1.4.1、1.3、1.7、2.2节

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