CN101487064A - 检测五种人兽共患病病毒的方法及专用试剂盒 - Google Patents
检测五种人兽共患病病毒的方法及专用试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测五种人兽共患病病毒的方法及专用试剂盒。该检测病毒的试剂盒，包括用于检测口蹄疫病毒的引物对A：序列表中序列1所示的DNA，序列表中序列2所示的DNA。用本发明试剂盒检测病毒的方法，特异性强，检测结果可靠；当用几种引物同时检测时，可以实现在同一次PCR反应中同时检测出几种病毒，检测效率高，大大节省了时间、试剂，降低了成本，因此，本发明方法具有简便、快捷、灵敏优点，对于加强人兽共患病的疫病监测，以及预防人兽共患病的流行具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及检测五种人兽共患病病毒的方法及专用试剂盒。
背景技术
近年来，人兽共患病在世界各地疫情有所回升。其中裂谷热病毒(Rift valleyfever virus，RVFV)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus；Rabies virus，HEV)、狂犬病毒(Rabies virus，RV)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)及口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)均是重要的人兽共患传染病病原，流行范围广，严重危害畜牧业的发展，同时也严重威胁公共卫生安全，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疫病。目前检测上述五种病毒的常用方法主要有：动物接种、病毒分离培养、酶联免疫实验(ELISA)、血清中和试验等方法。近年来，已建立了针对以上病毒的RT-PCR检测方法，可以特异、敏感地检测病原体，在裂谷热病毒(Rift valley fever virus，RVFV)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus；Rabies virus，HEV)、狂犬病毒(Rabies virus，RV)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)及口蹄疫病毒(Foot and mouthdisease virus，FMDV)疫病检测、鉴别诊断方面已经得到了广泛应用。但RT-PCR方法一次仅可检测一种病原体，用于多重感染或未知病原体检测时，需要进行多个实验反应，操作过程复杂，耗费人力和时间。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测人兽共患病病毒的试剂盒。
本发明所提供的检测病毒的试剂盒，包括如下引物对中的至少一种：
用于检测口蹄疫病毒的引物对A：序列表中序列1所示的DNA，序列表中序列2所示的DNA；
用于检测裂谷热病毒的引物对B：序列表中序列3所示的DNA，序列表中序列4所示的DNA；
用于检测戊型肝炎病毒的引物对C：序列表中序列5所示的DNA，序列表中序列6所示的DNA；
用于检测水泡性口炎病毒的引物对D：序列表中序列7所示的DNA，序列表中序列8所示的DNA；
用于检测狂犬病毒的引物对E：序列表中序列9所示的DNA，序列表中序列10所示的DNA。
所述试剂盒还可包括Mg离子、dNTPs、DNA聚合酶。
所述试剂盒还可包括DMSO；所述dNTPs为dATP、dTTP、dGTP、dCTP等摩尔比混合物。
本发明的另一个目的是提供一种检测病毒的方法。
本发明所提供的检测病毒的方法，是用上述任一所述试剂盒对待测样品进行PCR扩增，检测PCR产物的大小，判断所述待测样品中病毒种类；
所述判断方法如下：
若所述PCR产物为389bp，则所述待测样品中含有口蹄疫病毒；
若所述PCR产物为499bp，则所述待测样品中含有裂谷热病毒；
若所述PCR产物为137bp，则所述待测样品中含有戊型肝炎病毒；
若所述PCR产物为224bp，则所述待测样品中含有水泡性口炎病毒；
若所述PCR产物为274bp，则所述待测样品中含有狂犬病毒。
其中，所述对待测样品进行PCR扩增的方法可包括如下步骤：
(1)提取所述待测样品的核酸RNA；
(2)将所述RNA反转录得到cDNA；
(3)以所述cDNA为模板，用上述任一所述试剂盒进行PCR扩增。
所述PCR扩增的反应体系包括上述任一所述试剂盒中的引物对、Mg离子、dNTPs、DMSO；
所述引物对中的任一条引物在所述反应体系中的浓度如下：引物对B0.6mol/L、引物对A0.2mol/L、引物对D0.2mol/L、引物对E0.6mol/L、引物对C0.4mol/L；所述Mg离子在所述反应体系中的浓度为2mmol/L；所述DMSO在所述反应体系中的浓度为1％(体积百分含量)；所述dNTPs在所述反应体系中的浓度为150mmol/L。
所述PCR扩增的反应条件中退火温度为54℃，每个循环的退火时间为30s。
用本发明试剂盒检测病毒的方法，特异性强，检测结果可靠；当用几种引物同时检测时，可以实现在同一次PCR反应中同时检测出几种病毒，检测效率高，大大节省了时间、试剂，降低了成本，简便、快捷、灵敏。因此，本发明试剂盒及检测方法在检测未知病原体及病毒的混合感染上具有明显的优势，对于加强人兽共患病的疫病监测，以及预防人兽共患病的流行具有重要的意义。
附图说明
图1为多重PCR特异性检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、多重RT-PCR的引物序列的设计
根据GenBank提供的FMDV、VSV、RVFV、RV和HEV的基因组序列，通过Bioedit分析软件进行多序列比对分析，挑选高度保守的区段，分别选取FMDV的非结构蛋白3ABC区域、RV和VSV的N蛋白区域、RVFV的M蛋白区域，HEV的结构蛋白ORF2区域，应用Primer5.0及AnnHyb多重引物设计软件设计了5对特异性引物。引物序列及扩增基因产物的长度见表1。
表1、多重RT-PCR引物设计
实施例2、用多重RT-PCR引物检测病毒
口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)购自哈尔滨维科生物技术开发公司；
水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)购自哈尔滨维科生物技术开发公司；
裂谷热病毒(Rift valley fever virus，RVFV)重组质粒(王清华，王喜军，胡森，步志高重组杆状病毒表达裂谷热囊膜蛋白的研究[J].中国预防兽医学报，2006，1(28)：22-25)(中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所)；
狂犬病毒(Rabies virus，RV)(刘忠钰；袁慧君；朱武洋；姜涛；陈水平；于曼；秦成峰；秦鄂德；狂犬病毒载体的构建与鉴定，中国人兽共患病学报2008年11期2008，24(11))(中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所)；
戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus；Rabies virus，HEV)感染猪组织标本(于敏，曲娟娟，郭巍，赵立平，相文华，猪戊型肝炎病毒大庆株DQ1全基因序列分析，中国预防兽医学报，2006，28(5)，)(中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所)。
日本乙型脑炎病毒(JBEV)购自中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所；新城疫病毒(NDV)购自中国药品生物制品检定所；牛流行性出血热病毒(BEFV)购自哈尔滨维科生物技术开发公司；赤羽病毒(AKAV)购自购自哈尔滨维科生物技术开发公司。
1、病毒核酸提取及反转录
核酸提取按照QIAGEN RNeasy mini kit说明书进行。
反转录过程为：病毒RNA 5μL和随机引物六聚体1μL，在65℃条件下作用10min，冰浴5min，再加5×RT buffer 4μL，RNase Inhibitor(5U/μL)0.5μL，10mmol/L dNTPs 2μL，AMV RNase Reverse Transcriptase(Takara公司产品)(5U/L)1μL，灭菌双蒸水补足至20μL，42℃水浴60min，反转录为cDNA。然后94℃ 5min灭活AMV RNase Reverse Transcriptase。4℃保存待用。
2、多重PCR扩增检测
分别以上述5种病毒的cDNA及其混合物为模板，用上述5对引物的混合物进行PCR扩增，再进行电泳。
反应体系：病毒的反转录产物(以每种病毒的cDNA为模板时，每种病毒取3μl；以5种病毒的混合物为模板时，每种病毒取3μl)，5对引物的混合物(引物在反应体系中的浓度分别为：RVFV 0.6μmol/L、FMDV 0.2μmol/L、VSV 0.2μmol/L、RV 0.6μmol/L、HEV 0.4μmol/L)，dNTPs(Takara公司产品)150mmol/L(所述dNTPs为dATP、dTTP、dGTP、dCTP等摩尔比混合物)、Mg2+ 2mmol/L，TaqDNA聚合酶(Takara公司产品)2.5U，1×反应缓冲液，1％DMSO，加水补足至50μL。
反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。
取5μl PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
结果如图1所示，泳道M表示marker，泳道1表示以5种病毒的cDNA及重组质粒的混合物为模板，泳道2表示以RVFV的重组质粒为模板(499bp)，泳道3表示以FMDV的cDNA为模板(389bp)，泳道4表示以RV的cDNA为模板(274bp)，泳道5表示以VSV的cDNA为模板(224bp)，泳道6表示以HEV的cDNA为模板(137bp)。
结果表明，在凝胶电泳上，RVFV扩增产物显示为450-550bp的一条带，FMDV扩增产物显示为350-450bp的一条带，RV扩增产物显示为250-300bp的一条带，VSV扩增产物显示为200-250bp的一条带，HEV扩增产物显示为100-150bp的一条带。
实验设3次重复，结果一致。表明，5种病毒及其混合物均扩增出特异性目的条带，且条带单一清晰。
3、多重RT-PCR方法的特异性检测
按照2中所述方法及反应体系和反应程序，分别以日本乙型脑炎病毒(JBEV)、新城疫病毒(NDV)、牛流行性出血热病毒(BEFV)、赤羽病毒(AKAV)的cDNA为模板，进行PCR扩增和电泳。
实验设3次重复，结果一致。结果如图1所示(泳道7表示JBEV，泳道8表示NDV，泳道9表示BEFV，泳道10表示AKAV)。4种病毒均未出现扩增条带，表明本发明的引物及反应体系和程序的特异性高。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
<120>检测五种人兽共患病病毒的方法及专用试剂盒
<130>CGGNAC92092
<160>10
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Claims (6)
1、一种检测病毒的试剂盒，包括如下引物对中的至少一种：
用于检测口蹄疫病毒的引物对A：序列表中序列1所示的DNA，序列表中序列2所示的DNA；
用于检测裂谷热病毒的引物对B：序列表中序列3所示的DNA，序列表中序列4所示的DNA；
用于检测戊型肝炎病毒的引物对C：序列表中序列5所示的DNA，序列表中序列6所示的DNA；
用于检测水泡性口炎病毒的引物对D：序列表中序列7所示的DNA，序列表中序列8所示的DNA；
用于检测狂犬病毒的引物对E：序列表中序列9所示的DNA，序列表中序列10所示的DNA。
2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括Mg离子、dNTPs、DNA聚合酶。
3、根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括DMSO；所述dNTPs为dATP、dTTP、dGTP、dCTP等摩尔比混合物。
4、一种检测病毒的方法，是用权利要求1-3中任一所述试剂盒对待测样品进行PCR扩增，检测PCR产物的大小，判断所述待测样品中病毒种类；
所述判断方法如下：
若所述PCR产物为389bp，则所述待测样品中含有口蹄疫病毒；
若所述PCR产物为499bp，则所述待测样品中含有裂谷热病毒；
若所述PCR产物为137bp，则所述待测样品中含有戊型肝炎病毒；
若所述PCR产物为224bp，则所述待测样品中含有水泡性口炎病毒；
若所述PCR产物为274bp，则所述待测样品中含有狂犬病毒。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述对待测样品进行PCR扩增的方法包括如下步骤：
(1)提取所述待测样品的核酸RNA；
(2)将所述RNA反转录得到cDNA；
(3)以所述cDNA为模板，用权利要求1-3中任一所述试剂盒进行PCR扩增。
6、根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系包括权利要求1-3中任一所述试剂盒中的引物对、Mg离子、dNTPs、DMSO；
所述引物对中的任一条引物在所述反应体系中的浓度如下：引物对B0.6mol/L、引物对A 0.2mol/L、引物对D 0.2mol/L、引物对E 0.6mol/L、引物对C0.4mol/L；所述Mg离子在所述反应体系中的浓度为2mmol/L；所述DMSO在所述反应体系中的浓度为1％(体积百分含量)；所述dNTPs在所述反应体系中的浓度为150mmol/L；
所述PCR扩增的反应条件中退火温度为54℃，每个循环的退火时间为30s。
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