CN102061341A - 风疹病毒荧光定量pcr试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种风疹病毒(Rubella virus，RV)检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括RNA提取液、逆转录酶、RNA酶抑制剂、标准阳性模板、Taq DNA聚合酶、荧光定量PCR反应液和标准阴性质控品。利用该试剂盒，首先提取待测样品中病毒RNA，然后与标准阳性质控品和阴性质控品一起作荧光定量RT-PCR，根据荧光定量PCR仪器所带有的软件计算出待测样本中风疹病毒的起始浓度。本发明检测速度快、操作方便安全，省时效率高，可有效的对风疹病毒感染患者进行病毒RNA检测，从而达到了早期诊断和有效预防风疹病毒感染。

Description

风疹病毒荧光定量PCR试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属病原体核酸检测领域，特别涉及一种风疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒，同时，本发明还涉及一种荧光定量PCR试剂盒检测风疹病毒的方法，荧光定量PCR是通过实时监控收集PCR体系中的荧光信号，对样品中的初始模板进行定量，可广泛应用于医学、生物学等相应领域。

背景技术

风疹病毒(rubella virus，RV)是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员，是临床上常见的呼吸道感染，引起出疹性疾病(有时也无症状)的病原体之一，人是其唯一宿主。孕妇，特别是妊娠早期的孕妇感染风疹病毒可导致胎儿先天性风疹综合征(congenital rubel lasyndrome，CRS)。目前对其预防仅限于接种RV减毒活疫苗，并取得一定成效。在发达国家，风疹已几乎被实施疫苗计划免疫所消灭，只是在未免疫人群中仍有少数发生。但在免疫项目开展不好的国家，风疹仍在流行。另据报道，在许多国家免疫后的人群仍有一部分保持着对RV的敏感性，我国虽已有减毒活疫苗问世，但尚未将此列入高危人群的计划免疫范畴。

风疹病毒基因组为单股正链RNA，长度为9757个核苷酸，G+C含量较高(69.5％)。病毒基因组包含40sRNA，含帽状结构，具有真核细胞典型的mRNA功能；24sRNA连接于40sRNA3′末端，它负责编码一个分子量110×10³的多肽链，此肽链为RV结构蛋白前体。

风疹病毒有4种结构蛋白，它们分别是胞膜糖蛋白E1(分子量58×10³)、E2a(分子量47×10³)、E2b(分子量42×10³)和核壳蛋白C(分子量33×10³)。E1、E2a、E2b结构相似，均为糖蛋白，位于病毒颗粒的包膜上。其中E2a、E2b由同一基因编码，多肽组成相同，两者分子量的差异因糖基侧链不同而致。C蛋白不含糖基侧链，与RNA相连，包绕病毒基因共同组成核衣壳。E1的多肽部分由412～481个氨基酸残基组成，富含脯氨酸和半胱氨酸。作为抗原，E1较E2具有较好的免疫原性，能刺激产生针对各决定簇的单克隆抗体，相应单抗能抑制RV的凝血功能，并表现出中和活性。此外，RV感染可产生特异性免疫球蛋白IgG、IgM、IgA，它们均具有致病意义和诊断价值。

目前风疹病毒的临床检测常用病毒分离法、血清诊断技术(包括血凝试验、酶免疫技术、放射免疫技术和荧光免疫技术等)和分子生物学检测技术。病毒分离是一种很准确的方法，但培养周期长，操作复杂，生物影响因素多，不宜被一般实验室采用。免疫学方法是一种常用的方法，它不需要对血清样本进行预处理，临床应用操作简便，适用于RV感染的实验室诊断和大规模现场调查，但该方法易受抗体产生时间的限制，可由于采血时间不当而引起假阴性反应；并且一些其它病毒如EB病毒等感染还可引起假阳性反应。核酸杂交法也可用于诊断RV感染且优于免疫学方法，不会造成假阳性反应。目前PCR技术广泛应用于生物科学的各个领域，其中RT-PCR具有快速、灵敏度高和特异性强的特点，适用于RV感染的初步和早期诊断，也可用于大样本的初筛工作。

近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluoroenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点，已在病原体的定性检测(Mcgolddrik A，Lowing J P，Ibata G，et al.A Novel Approach to the Detection of Classical Swine Fever Virus by RT-PCR with aFluorogenic Probe(TaqMan)[J].J Virol Methods，1998，72：125-135；Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay(TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，83：1-10)、定量检测(Desire N，Dehee A，Schneider V，etal.Quantification if Human Immndeficiency Virus Type I Proviral Load by a TaqMan Real-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，39：1301-1310；Martell M，Gomez J，Esteban H，etal.High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37：327-332；Kearns AM，Turner AJL，Eltringham GJA，et al.Rapid Detection and Quantification of CMV DNA in Uring Using Lightcycler-based Real-Time PCR[J].J.Clin，Virol，2002，24：131-134；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95：111-119)、肿瘤基因检测(Gelmini S et al.Clin Chem.1997，43(5)：752-758；Bieche I et al.Int J Cancer.1998，78(5)：661-666)、免疫分析(Lang R et al.J Immunol Methods.1997，203(2)：181-192)、基因表达水平分析(Hirayama Y et al.Blood，1998，92(1)：46-52；Shimokama T et al.Biochem Biophys Res Commun，1998，246(1)：287-292；Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，163：29-38)及其多态性(Ibrhim MS et al.Mol Cell Probes，1997，11(2)：143-147)的研究等多个领域得到应用。对感染者体内风疹病毒的直接检测和定量研究，不仅对于了解患病程度，预测、评价治疗效果有十分重要意义，同时也使对病原体感染发病机制的研究进入量化阶段，点面而且对新药的研究与试用等极为重要。国内外在相关的这些方面研究很多，虽然也研制开发出许多检测试剂盒，但几乎均为免疫法检测。经检索尚无检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒的的开发和应用。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种风疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒，能快速、灵敏、准确的检测风疹病毒。

本发明的另一个目的在于提供了一种荧光定量PCR风疹病毒检测方法，该方法简便，检测速度快，操作方便安全，省时效率高。

本发明的荧光定量PCR试剂盒在快速定量检测风疹病毒中可广泛应用。

为了解决上述任务，本发明有取以下措施：一种风疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括RNA提取液；RT-PCR反应液；混合酶；RV阳性标准模板；阳性对照和阴性对照。

所述的RT-PCR反应液含PCR Buffer；0.1～10μM浓度的引物P1、P2；0.1～10μM浓度的荧光探针RVFP；0.1～1mM的dNTPs溶液和1～10mM的MgCl₂。

所述的PCR反应液中引物(P1、P2)和探针(RVFP)为风疹病毒E1基因片段，其中引物P1序列为：5’-ACGCGCAGCTGGCCTCTTAC-3’，引物P2序列为：5’-ACGGTCTTGTGAGGGTGCTG-3’，RV荧光标记探针RVFP序列为：5’-CCACCGACACCGTGATGAGCGT-3’；

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

所述的荧光探针标记的发光基团为FAM、HEX、JOE、TET、Cy3、Cy5、ROX、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine 6G、Orengon Green 488、Orengon Green 500、Orengon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、FITC或Acridine orange中的任意一种；荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或DABSYL中的任意一种。

所述的混合酶由1～100U的逆转录酶SuperscriptIII和1～10U的Taq DNA聚合酶配制而成。

所述的RV标准阳性模板为含有风疹病毒E1基因片段SEQ ID NO.1与PGEM-T Easy载体构成的PGEMT181-1重组质粒SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1序列为：

5’-ACGCGCAGCTGGCCTCTTACTTCAACCCTGGCGGCAGCTACTACAAGCAGTACCACCCTACCGCGTGCGAGGTTGAACCTGCCTTCGGACACAGCGACGCGGCCTGCTGGGGCTTCCCCACCGACACCGTGATGAGCGTGTTCGCCCTTGCTAGCTACGTCCAGCACCCTCACAAGACCGT-3’

该质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用超纯质粒提取试剂盒提取纯化，用紫外分光光度计测A₂₆₀定量并稀释至1×10⁷拷贝数/μl，-20℃保存，使用前10倍稀释至1×10⁶拷贝数/μl、1×10⁵拷贝数/μl、1×10⁴拷贝数/μl。

所述的阳、阴性对照分别为RV阳性培养物(灭活)；阴性对照为无模板荧光定量反应液。

所述的RNA提取液为提取效率＞80％、RNA完整性好、稳定性好且操作简便的核酸提取液。

根据本发明提供的试剂盒，采用风疹病毒检测试剂盒，按以下步骤进行：

(a)采RNA提取液从待测标本中提取RNA；

(b)将RV标准阳性模板进行10倍梯度稀释；

(c)分别取第(a)步中的RNA和第(b)步中的RV阳性标准品，加入到含有混合酶的RT-PCR反应体系中，与标准阴性质控品一起用荧光定量PCR检测仪进行RT-PCR检测；

(d)通过比较待测样本和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量，在荧光定量PCR仪自带软件生成的标准曲线上找出待测样品对应的拷贝数浓度。

所述的待检样本为含漱液或咽拭子抽提液。

在本发明提供检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒中，有一条两端标记有荧光基团和淬灭基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5’端荧光报告基团产生的荧光共振能量转移(FRET)而被3’端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化，在PCR退火和伸延过程中，探针与模板特异性结合，随引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’→3’外切酶活性对探针进行切割，释放出报告基团，破坏了两基团之间的FRET，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对风疹病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Throshold Cycle)相比较得出。Ct值与起始模板数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样本的Ct值可准确测出该样本的起始拷贝数。

在本发明提供风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒中，针对风疹病毒中的特殊性，对不同的靶序列进行反应体系(引物和探针浓度、Mg²⁺浓度、退火温度等)的优化，并将FQ-PCR技术与定量检测系统相结合，将其用于风疹病毒的定量检测，通过优化方案，反复实验，建立了定量检测风疹病毒(RV)的方法，并研制出风疹病毒定量检测试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检测10¹个病毒粒子。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

(1)特异性更强，灵敏度更高，由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，而且所设计的引物和探针与RV特异性结合，与其它病原体无明显的同源性，特异性极高。另外，由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，结果可靠，又进一步提高了灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段也可得到有效的检测。

(2)全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠可重复。

(3)分析PCR产物的对数期，摒弃常规PCR受多因素干扰的终点分析法，使得定理更准确可靠，而且定量范围可宽达10个数量级。

(4)在线性实时监测荧光，结果客观又直观。

(5)可实现单管双检或多检，还可设计针对性对标，监控模板抽提效率及排除抑制干扰。

(6)不接触有毒试剂，操作安全，省时高效。

(7)检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。

(8)可同时进行大批量的样本检测，有利于规模化，自动化。

具体实施方式：

实施例1：风疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒的制备

(1)RNA提取液，dNTPs(25mM)，逆转录酶Superscript III(200U/μl)，RNA酶抑制剂(40U/μl)，Taq DNA聚合酶(5U/μl)，MgCl₂(100mM)。

(2)荧光PCR 5×buffer组成：

50mM Tris-HCl(PH8.3)，250mM KCl，1mg/ml明胶。

(3)混合酶组成：

1.5U/μl逆转录酶Superscript III，1.5U/μl Taq DNA聚合酶，5U/μl RNA酶抑制剂。

(4)荧光定量PCR反应液：

PCR 5×buffer 6μl，P1、P2各0.3μl(25μM)，荧光探针FP 0.2μl(25μM)，MgCl₂ 0.9μl(100mM)，dNTPs 0.24μl(25mM)，DEPC处理水15.86μl。

实施例2：用荧光定量PCR试剂盒检测风疹病毒

(1)取离心处理过的含漱水或咽拭子抽提液500μl，加入1ml RNA提取液，再加入200μl氯仿，振荡15s，室温孵化10min。4℃12000g离心10min，RNA位于上层。将上层更换至新的1.5ml的EP管，加入500μl异丙醇，-20℃下孵化10min，再室温下12000g离心10min。弃上清，加入1ml 75％的乙醇洗RNA沉淀，振荡混匀，4℃12000g离心5min。弃上清，37℃干燥5min，从而得到病毒RNA。

(2)将标准阳性模板10倍稀释至1×10⁶拷贝数/μl、1×10⁵拷贝数/μl、1×10⁴拷贝数/μl。

(3)取荧光定量PCR反应液24μl，分别加2μl混合酶，再加入第1步提取的RNA和第2步稀释好的阳性标准模板各4μl，另外一管加(f)标准阴性质控液，在荧光定量PCR检测仪(ABI 7500)上平行做PCR检测。循环条件为：先在37℃反应30分钟，然后94℃保温5分钟，再按94℃10秒→60℃45秒循环40次，60℃采集FAM荧光通道的信号。

(4)循环结束后，运行ABI 7500PCR检测仪自带软件，读取待测样品拷贝数。

(5)结果为：阳性标准模板1×10⁶拷贝数/μl、1×10⁵拷贝数/μl、1×10⁴拷贝数/μl其Ct值分别为20.27、23.52、26.90。检测的样品Ct值为29.87，换算为每毫升检测样本中含有7.48×10⁴拷贝个病原体。

核苷酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110>上海复星医学科技发展有限公司

上海复星医药(集团)股份有限公司

<120>风疹病毒荧光定量PCR试剂盒及其检测方法

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>181

<212>DNA

<213>Rubella virus

<400>1

acgcgcagct ggcctcttac ttcaaccctg gcggcagcta ctacaagcag taccacccta    60

ccgcgtgcga ggttgaacct gccttcggac acagcgacgc ggcctgctgg ggcttcccca    120

ccgacaccgt gatgagcgtg ttcgcccttg ctagctacgt ccagcaccct cacaagaccg    180

t                                                                    181

<210>2

<211>1443

<212>DNA

<213>Rubella virus

<400>2

gaggaggcct tcacctacct ctgcactgca ccggggtgcg ccactcaaac acctgtcccc    60

gtgcgcctcg ctggcgtccg ctttgagtcc aagattgtgg acggcggctg ctttgcccca    120

tgggacctcg aggccactgg agcctgcatt tgcgagatcc ccactgacgt ctcgtgcgag    180

ggcttggggg cctgggtacc cacagcccct tgcgcgcgca tctggaatgg cacacagcgc    240

gcgtgcacct tctgggctgt caacgcctac tcctctggcg ggtacgcgca gctggcctct    300

tacttcaacc ctggcggcag ctactacaag cagtaccacc ctaccgcgtg cgaggttgaa    360

cctgccttcg gacacagcga cgcggcctgc tggggcttcc ccaccgacac cgtgatgagc    420

gtgttcgccc ttgctagcta cgtccagcac cctcacaaga ccgtccgggt caagttccat    480

acagagacca ggaccgtctg gcaactctcc gttgccggcg tgtcgtgcaa cgtcaccaca    540

gaacatccgt tctgcaacac gccgcacgga caactggagg tccaggtccc gcccgacccc    600

ggggacctgg ttgagtacat tatgaattac accggcaatc agcagtcccg gtggggcctc    660

gggagcccga attgtcatgg tcccgattgg gcctccccgg tttgccaacg ccattcccct    720

gactgctcgc ggcttgtggg ggccacacca gagcgtcccc ggctgcgcct ggtcgacgcc    780

gacgaccccc tgctgcgcac tgcccctggg cccggcgagg tgtgggtcac gcccgtcata    840

ggctctcagg cgcgcaagtg cggactccac atacgcgctg gaccgtacgg ccatgctacc    900

gtcgaaatgc ccgagtggat tcacgcccac accaccagcg acccctggca cccaccgggc    960

cccttggggc tgaagttcaa gacagttcgc ccggtggccc tgccacgcgc gttagcgcca    1020

ccccgcaatg tgcgtgtgac cgggtgctac cagtgcggta cccccgcgct ggtggaaggc    1080

cttgcccccg ggggagggaa ttgccatctc accgtcaatg gcgaggacgt cggcgccttc    1140

ccccctggga agttcgtcac cgccgccctc ctcaacaccc ccccgcctta ccaggtcagc    1200

tgcgggggcg agagcgatcg cgcgagcgcg cgggtcattg accccgccgc gcaatcgttt    1260

accggcgtgg tgtatggcac acacaccact gctgtgtcgg agacccggca gacctgggcg    1320

gagtgggctg ctgcccattg gtggcagctc actctgggcg ccatttgcgc cctcctactt    1380

gctggcctac tcgcttgctg tgccaaatgc ttgtactact tgcgcggcgc tatagcgccg    1440

cgc                                                                  1443

Claims (10)

1.一种风疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括RNA提取液；RT-PCR反应液；混合酶；RV阳性标准模板；阳性对照和阴性对照。

2.如权利要求1所述的含有内对照系统的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR反应液含PCR Buffer；0.1～10μM浓度的引物P1、P2；0.1～10μM浓度的荧光探针RVFP；0.1～1mM的dNTPs溶液和1～10mM的MgCl₂。

3.如权利要求2所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR反应液中引物(P1、P2)和探针(RVFP)为风疹病毒E1基因片段，其中引物P1序列为：5’-ACGCGCAGCTGGCCTCTTAC-3’，引物P2序列为：5’-ACGGTCTTGTGAGGGTGCTG-3’，RV荧光标记探针RVFP序列为：5’-CCACCGACACCGTGATGAGCGT-3’；

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

4.如权利要求3所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针标记的发光基团为FAM、HEX、JOE、TET、Cy3、Cy5、ROX、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine 6G、Orengon Green 488、Orengon Green 500、Orengon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、FITC或Acridine orange中的任意一种；荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或DABSYL中的任意一种。

5.如权利要求1所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的混合酶由1～100U的逆转录酶SuperscriptIII和1～10U的Taq DNA聚合酶配制而成。

6.如权利要求1所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的RV标准阳性模板为含有风疹病毒E1基因片段SEQ ID NO.1与PGEM-T Easy载体构成的PGEMT181-1重组质粒SEQ ID NO.2。

7.如权利要求1所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的阳、阴性对照分别为RV阳性培养物(灭活)；阴性对照为无模板荧光定量反应液。

8.如权利要求1所述的风疹病毒检测试剂盒，其特征在于，其特征在于，所述的RNA提取液为提取效率＞80％、RNA完整性好、稳定性好且操作简便的核酸提取液。

9.一种风疹病毒检测方法，其特征在于，采用风疹病毒检测试剂盒，按以下步骤进行：

(a)采RNA提取液从待测标本中提取RNA；

(b)将RV标准阳性模板进行10倍梯度稀释；

(c)分别取第(a)步中的RNA和第(b)步中的RV阳性标准品，加入到含有混合酶的RT-PCR反应体系中，与标准阴性质控品一起用荧光定量PCR检测仪进行RT-PCR检测；

(d)通过比较待测样本和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量，在荧光定量PCR仪自带软件生成的标准曲线上找出待测样品对应的拷贝数浓度。

10.如权利要求9所述的风疹病毒检测方法，其特征在于，所述的待检样本为含漱液或咽拭子抽提液。