CN103725799A - 一种检测风疹病毒rna的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提取纯化和检测RV RNA（风疹病毒RNA）的方法，并提供相应的检测RV RNA的试剂盒。本发明提供的试剂盒中包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针的PCR反应液。本发明提供的试剂盒可检测出RV RNA，但不能检测出非RV病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性；另外，本发明选择吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，其检测下限即灵敏度可达400copies/ml，检测范围（试剂盒的定量线性范围）为4.00E+02～4.00E+08copies/ml。
Description
技术领域
本发明提供一种提取纯化和检测风疹病毒RNA（RV-RNA）的方法，本发明还提供一种相应的检测RV RNA的试剂盒。
背景技术
实时荧光PCR技术（FQ-PCR）把PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行。实时荧光PCR技术与其它检测技术相比具有以下优势：（1）与免疫学检测比较，其具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来。（2）根据各种病原体独特的保守基因序列设计引物，能够保证PCR反应的高度特异性，避免交叉反应。（3）能对病毒进行定量检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的高低和复制情况。定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的作用，了解感染疾病病人用药后病情的变化情况。这对理解发病机制和预测抗病毒治疗的有效性十分关键。（4）可扩大检测人群的范围，适用于大规模的流行病调查。（5）将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤。（6）全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染。（7）实时检测技术可连续不断的检测PCR过程中荣耀信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。
目前，国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术检测RV-RNA的科研试剂盒，这些试剂盒所提供的RV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒存在很多不足之处：1）检测灵敏度低，约在1000copie/ml左右；检测范围窄，对于临床低值（小于1.00E+03copie/ml）的样本无法检测；2）酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；3）无法有效去除样本中的PCR抑制物（如全血、痰液等）；4）体系中一般没有阳性内对照（即内标），无法预防假阴性；5）国外试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。
磁珠（免疫磁珠）法是近年发展迅速且被广泛应用的一种核酸提取方法，其优于传统方法的特点可以总结为以下几点：其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂；提取纯化的核酸质量好、产量高；提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化；这些优点使其有替代其它核酸提取和纯化方法的发展趋势。但在现有技术中，并未见有磁珠法用于提取纯化和检测RV RNA的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于解决现有风疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的RV核酸荧光PCR检测试剂盒，可以对血浆、羊水等未知样本中的RV-RNA进行快速检测，为诊断风疹感染提供可靠的实验依据。
本发明用磁珠法提取样本核酸，采用实时荧光定量PCR技术，以RV基因组的高度保守区域为扩增靶目标，设计特异性引物及TaqMan探针，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对RV RNA进行检测。
本发明首先提供一种风疹病毒RNA检测试剂盒，所述试剂盒中包括RNA提取溶液和PCR反应液，所述RNA提取溶液包括RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠，RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠，RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠，和RNA提取溶液Ⅳ：含矿物油；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。
本试剂盒所采用的磁珠法提取核酸，能够有效去除复杂样本中的PCR抑制物，适合于血浆、羊水等样本的RNA提取和PCR检测。
在本发明所述检测试剂盒中，优选的是，用于靶多核苷酸扩增的上游引物序列为5’-CTTCAACCCTGGCGGCA-3’；用于靶多核苷酸扩增的下游引物序列为5’-TGTCCGAAGGCAGGTTCAA-3’。
在本发明所述检测试剂盒中，也优选的是，用于靶多核苷酸检测的探针序列为5’-ACTACAAGCAGTACCACCCCACCGC-3’。发明人寻找出RV基因组的保守序列而设计出用于靶多核苷酸扩增和检测的引物和/或探针序列，为RV RNA的实时荧光PCR检测提供了保障。
在本发明所述试剂盒中，优选的是，所述试剂盒中还包括内标，所述内标即为一段长为100碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，其碱基序列为5’-CCTCTAGCGCTGCGAATAGAACTTCCTCTGTTCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGCTGGTTCTTCTTCAAGGTTCAAGCAATAGAAACGGAGATCTAC-3’。当所述试剂盒中包括内标时，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；且内标探针序列为5’HEX-TCAAGCCTTCCCTTTATAC GCTCAAGC-BHQ1 3’。在本发明的上述试剂盒中，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物和/或用于靶多核苷酸检测的探针序列是本发明的核心；而用于内标扩增的上、下游引物和用于内标检测的探针均可以据内标的碱基序列而任意选择。在该优选实施方式中，在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控RNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。
本发明在对RV所有已知基因型的基因组序列进行比对的基础上，在RV的最保守区域设计了两对引物和探针，经定量PCR优化，筛选出扩增效果最好的一对引物和探针，可检测出RV所有已知基因型，但不能检测出非RV病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。另外，本发明对RV-RNA的提取方法进行了比较和优化，选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，其检测下限即灵敏度可达400copie/ml，检测范围（试剂盒的定量线性范围）为4.00E+02～4.00E+08copies/ml。
本发明中，在荧光PCR扩增结束后，经仪器自带软件自动分析样本的Ct值，可为灵敏、早期诊断风疹病毒感染提供可靠的实验证据。
本发明还提供一种风疹病毒RNA检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸扩增的上游引物序列为5’-CTTCAACCCTGGCGGCA-3’；下游引物序列为5’-TGTCCGAAGG CAGGTTCAA-3’。
本发明还提供一种风疹病毒RNA检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸检测的探针序列为5’-ACTACAAGCAGTACCACCCCACCGC-3’。
本发明又提供一种检测RV RNA的方法，其中使用磁珠法提取和纯化RV RNA。
在本发明中，所述磁珠是生物科学和纳米材料科学二者结合的产品。它运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠；该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。它利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能将血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的DNA和RNA分离出来，可应用于临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。在本发明中，所述磁珠可经商购获取。
在优选的情况下，本发明结合使用磁珠法和实时荧光PCR技术提取纯化和检测RVRNA。
在一个具体的实施方式中，本发明所述方法包括如下步骤，步骤A，裂解病毒：每支离心管加入含磁珠的RNA提取溶液和待测样本，混匀后离心；RV阴性对照和RV阳性对照参照与待测样本相同的方法作RNA提取和纯化处理；步骤B，磁珠吸附核酸：每管加入含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠的RNA提取溶液Ⅱ，混匀后静置；步骤C，去除杂质：经离心后将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，再缓慢将溶液吸出；步骤D，洗涤：每管加入含曲拉通和氯化钠的RNA提取溶液Ⅲ和含矿物油的RNA提取溶液Ⅳ，混匀后离心，将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，静置分层后将液体吸出丢弃；步骤E，RNA洗脱：加入含Tris-HCl和EDTA的RNA洗脱液将离心管壁上的磁珠洗脱到管底，混匀并静置后将离心管再次置于磁珠分离器上，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的灭菌离心管中；步骤F，荧光PCR分析：将洗脱磁珠后的待测样本RNA、RV阴性对照、RV阳性对照中均加入含PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、探针的PCR反应液和含H-Taq DNA聚合酶的RV酶混合液，在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR反应，并分析结果。
附图说明
图1为本发明中一个RV阳性样本和一个RV阴性样本的扩增曲线图；
具体实施方式
以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。
实施例1
本实施例提供一种风疹病毒核酸检测试剂盒（检测RV RNA的试剂盒），它包括如下组分：
①RNA提取溶液Ⅰ：由十二烷基硫酸钠0.2～1.0%（质量/体积）、曲拉通1.0～4.0%（体积/体积），异硫氰酸胍0.2～1.0mol/L和100～400μg/ml的磁珠组成；
②RNA提取溶液Ⅱ：包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L、氯化钠100～300mmol/L，溶液ⅡpH值为6.5±0.2；
③RNA提取溶液Ⅲ：曲拉通0.1～1.0%（体积/体积）、氯化钠100～300mmol/L；
④RNA提取溶液Ⅳ：矿物油；
⑤RNA洗脱液：Tris-HCl0.8～1.2mol/L、EDTA0.1～1.0mol/L；
⑥内标（阳性内对照）：一段长为100碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，浓度为1.00E+04～5.00E+04copies/ml；其碱基序列为：5’-CCTCTAGCGCTGCGAATAGAACTTCCTCTGTTCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGCTGGTTCTTCTTCAAGGTTCAAGCAATAGAAACGGAGATCTAC-3’；
⑦PCR反应液：5×PCR反应缓冲液10μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上游引物与下游引物，0.2～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针RV-P，0.1～0.2μmol/L的用于内标扩增的上游引物与下游引物，0.05～0.2μmol/L的用于内标检测的探针，
所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物和靶多核苷酸检测的探针的碱基序列分别为：
上游引物：5’-CTTCAACCCTGGCGGCA-3’；
下游引物：5’-TGTCCGAAGGCAGGTTCAA-3’；
探针：5’FAM-ACTACAAGCAGTACCACCCCACCGC-BHQ1 3’；
针对100碱基对的序列设计了非竞争性内标的引物探针，其碱基序列分别为：
上游引物：5’-CCTCTAGCGCTGCGAATAGAA-3’；
下游引物：5’-GTAGATCTCCGTTTCTATTGCTTGA-3’；
探针：5’HEX-TCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGC-BHQ1 3’；
⑧RV酶混合液：1～5U/μl Tth DNA聚合酶，1～5U/μl H-Taq DNA聚合酶；
⑨RV阳性对照：为临床医院收集的已灭活的RV阳性血浆样本，其浓度为1.00～5.00E+05copies/ml；
⑩RV阴性对照：为临床医院收集的已灭活的RV阴性血浆样本。
实施例2
本实施例提供上述实施例1所述试剂盒用于检测血浆、羊水等未知样本中RV-RNA的操作步骤：
一、试剂准备
1）按比例取相应量的RNA提取溶液Ⅰ（200μl～1ml/人份）及内标（0.5μl/人份）充分混匀成RNA提取溶液1-mix，瞬时离心后备用。
2）根据待测样本、RV阴性对照、RV阳性对照的数量，按比例取相应量的PCR反应液（38μl/人份）及RV酶混合液（2μl/人份），充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。
二、RNA提取操作
1）裂解病毒：每管加入200μl～1ml RNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本（如血浆、羊水），盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；RV阴性对照和RV阳性对照参照与待测样本相同方法作RNA提取和纯化处理；
2）磁珠吸附核酸：每管加入50～400μl RNA提取溶液Ⅱ，震荡混匀10秒钟后，室温静置10～30分钟；
3)去除杂质：瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，2～5分钟后缓慢将溶液吸出；
4）洗涤：每管加入400μl～1ml RNA提取溶液Ⅲ和100～500μl RNA提取溶液Ⅳ，震荡混匀3～7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于磁珠分离器上进行磁珠分离；
5）2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃；
6）加入10～100ul RNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于磁珠分离器上2～5分钟，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；
7）每个反应管加入40μl的PCR-mix，吸取已经洗脱磁珠后的待测样本RNA、RV阴性对照、RV阳性对照各10μl加入PCR-mix中，盖好管盖。
三、荧光PCR反应与结果分析（在荧光定量PCR扩增仪上进行）
1）将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。
2）荧光检测通道选择：选择FAM通道（Reporter:FAM,Quencher:None）检测RV；选择HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None）检测内标。
3）荧光定量PCR反应条件见表1：
表1
4）结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析，也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值进行分析，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct值（即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值）；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。对于测定Ct值≤36（Ct值＞0）的样本，报告为RV RNA阳性，此时待测样本的扩增曲线呈S型（见图1中①）；对于测定显示无Ct值的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤36），报告为RV RNA阴性，此时待测样本扩增曲线平直（见图1中②）；对于测定Ct值>36的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤36），报告为低于检测下限。若内标Ct值>36或内标显示无Ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。
使用本发明中试剂盒的特异性试验表明，试剂盒能够检测风疹病毒，而其与常见病原体乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB病毒、巨细胞病毒、弓形虫、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念球菌等均无交叉反应，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。使用本发明中试剂盒对临床样本的检测试验表明，该试剂盒的定量线性范围为400～4.00E+08copies/ml，检测下限即灵敏度为400copies/ml。
Claims (10)
1.一种风疹病毒RNA检测试剂盒，所述试剂盒中包括RNA提取溶液和PCR反应液，所述RNA提取溶液包括RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠，RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠，RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠，和RNA提取溶液Ⅳ：含矿物油；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，用于靶多核苷酸扩增的上游引物序列为5’-CTTCAACCCTGGCGGCA-3’；用于靶多核苷酸扩增的下游引物序列为5’-TGTCCGAAGGCAGGTTCAA-3’。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，用于靶多核苷酸检测的探针序列为5’-ACTACAAGCAGTACCACCCCACCGC-3’。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标，所述内标的序列为5’-CCTCTAGCGCTGCGAATAGAACTTCCTCTGTTCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGCTGGTTCTTCTTCAAGGTTCAAGCAATAGAAACGGAGATCTAC-3’。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；且内标探针序列为5’HEX-TCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGC-BHQ13’。
6.一种风疹病毒RNA检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸扩增的上游引物序列为5’-CTTCAACCCTGGCGGCA-3’；下游引物序列为5’-TGTCCGAAGG CAGGTTCAA-3’。
7.一种风疹病毒RNA检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸检测的探针序列为5’-ACTACAAGCAGTACCACCCCACCGC-3’。
8.一种检测风疹病毒RNA的方法，其中使用磁珠法提取和纯化风疹病毒（RV）RNA。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，结合使用磁珠法和实时荧光PCR技术提取纯化和检测RV-RNA。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤A，裂解病毒：每支离心管加入含磁珠的RNA提取溶液和待测样本，混匀后离心；RV阴性对照和RV阳性对照参照与待测样本相同的方法作RNA提取和纯化处理；
步骤B，磁珠吸附核酸：每管加入含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠的RNA提取溶液Ⅱ，混匀后静置；
步骤C，去除杂质：经离心后将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，再缓慢将溶液吸出；
步骤D，洗涤：每管加入含曲拉通和氯化钠的RNA提取溶液Ⅲ和含矿物油的RNA提取溶液Ⅳ，混匀后离心，将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，静置分层后将液体吸出丢弃；
步骤E，RNA洗脱：加入含Tris-HCl和EDTA的RNA洗脱液将离心管壁上的磁珠洗脱到管底，混匀并静置后将离心管再次置于磁珠分离器上，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的灭菌离心管中；
步骤F，荧光PCR分析：将洗脱磁珠后的待测样本RNA、RV阴性对照、RV阳性对照中均加入含PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、探针的PCR反应液和含H-Taq DNA聚合酶的RV酶混合液，在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR反应，并分析结果。
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Effective date of registration: 20150610 Address after: 410012, No. 680, Lu Song Road, hi tech Development Zone, Hunan, Changsha Patentee after: Sansure Biotech Inc. Address before: 410012 No. 680, Lu Song Road, hi tech Industrial Development Zone, Hunan, Changsha Patentee before: Hunan company limited of Sheng Weier medical test institute |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Method and kit for detecting RV RNA (Rubella Virus Ribose Nucleic Acid) Effective date of registration: 20170711 Granted publication date: 20150311 Pledgee: Ningbo free trade zone Terry with equity investment partnership (limited partnership)|Suzhou equity equity investment center (limited partnership)|Ningbo Meishan Bonded Port District, Jun and equity investment partnership (limited partnership)|Chen Bang Pledgor: Hunan Gene Technology Co.|Hunan San Xiang Biological Technology Co. Ltd. Registration number: 2017430000042 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 410012 No. 680, Lu Song Road, hi tech Industrial Development Zone, Hunan, Changsha Patentee after: Shengxiang Biotechnology Co., Ltd Address before: 410012, No. 680, Lu Song Road, hi tech Development Zone, Hunan, Changsha Patentee before: Sansure Biotech Inc. |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20200217 Granted publication date: 20150311 Pledgee: Suzhou Lirui equity investment center (limited partnership)|Triton equity investment partnership (limited partnership)|JUNHE Tongrui equity investment partnership (limited partnership)|Chenbang Pledgor: SANSURE BIOTECH Inc. Registration number: 2017430000042 |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210316 Address after: 201108 2nd floor, building 2, no.479 Chundong road and No.128 Shenfu Road, Minhang District, Shanghai Patentee after: Shengxiang (Shanghai) Gene Technology Co.,Ltd. Address before: No. 680, lushong Road, high tech Industrial Development Zone, Changsha City, Hunan Province, 410012 Patentee before: Shengxiang Biotechnology Co.,Ltd. |