CN104120195B - 单管辨别优生优育检查中四种病原体的pcr方法及试剂盒 - Google Patents

单管辨别优生优育检查中四种病原体的pcr方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在单个PCR反应管中同时检测四种靶核酸的实时荧光PCR方法，用于检测样品中弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒。本方法操作快速、一步完成，准确性和灵敏度高，在实践检测中还未出现假阳性和假阴性结果。另外，本发明还涉及上述PCR方法中所涉及的试剂，用于上述方法的检测试剂盒和该检测试剂盒的制备应用等。

Description

单管辨别优生优育检查中四种病原体的PCR方法及试剂盒
技术领域
本发明属于核酸检测领域，具体说，本发明提供了在同一PCR管中快速平行地检测四种病原体(弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒)的荧光PCR方法及其试剂盒等。
背景技术
弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒是我国优生优育检查中的四种常见病原体。
弓形虫中医叫三尸虫，是细胞内寄生虫。寄生于细胞内，随血液流动，到达全身各部位，破坏大脑、心脏、眼底，致使人的免疫力下降，患各种疾病。弓形虫可以通过食用不熟的被污染的肉类，或饲养宠物感染。人感染后，便患了弓形虫病。孕妇一旦感染，病原体即可通过胎盘血液循环“游荡”到胎儿身上，可以导致流产、早产；胎儿可能患上视网膜炎、脉络膜炎等，影响视力；同时可能发生脑积水、脑钙化、小脑畸形等疾病。
风疹病毒是RNA病毒，属于披膜病毒科，电镜下多呈不规则球形。该病毒多于春季传播，它会伴随人的咳嗽和喷嚏而漂浮在空气中，抵抗力较弱的人吸入风疹病毒后，经过2～3周的潜伏期，之后出现发热、耳后及枕部淋巴结肿大，全身奇痒皮疹等症状。风疹病毒容易发生垂直感染，孕妇妊娠早期初次感染风疹病毒后，病毒可通过胎盘屏障进入胎儿，常可造成流产或死胎，还可导致胎儿发生先天性风疹综合征，引起胎儿畸形。
人类巨细胞病毒(HCMV)亦称细胞包涵体病毒，感染的细胞肿大并具有巨大的核内包涵体，它是一种疱疹病毒组DNA病毒，只能感染人。该病毒可通过性、血液、唾液、尿液、眼泪、母婴传播。孕妇感染后可通过胎盘侵袭胎儿引起先天性感染，少数造成早产、流产、死产或生后死亡。患儿可发生黄疸，肝脾肿大，血小板减少性紫斑及溶血性贫血。存活儿童常遗留永久性智力低下，神经肌肉运动障碍，耳聋和脉络视网膜炎等。
单纯疱疹属于疱疹病毒科a病毒亚科，大小约180nm，是一种DNA病毒。单纯疱疹病毒在全球广泛分布，人群中感染极为普遍，潜伏和复发感染者较多。患者和带毒者是该病的传染源。病毒可通过皮肤、粘膜的直接接触或性接触途径进入机体。该病毒可分为两型，HSV-1的原发感染常局限在口咽部，尤以龈口炎(gingivostomatitis)最为多见。HSV-2的原发感染主要引起生殖器疱疹。新生儿疱疹是临床上常见而又严重的感染，据统计死亡率超过50％，存活者约有1/2严重损伤。HSV-1、HSV-2在分娩时均可通过产道感染新生儿，其中HSV-2约占75％。感染后，新生儿常出现皮肤、眼和口腔的局部损伤、脑炎、脓毒血症等症状，可引起死亡。此外也可通过吸乳、接吻、性接触、输血等途径感染，引起单核细胞增多症、肝炎、间质性肺炎、视网膜炎、脑炎等。
目前我国各医院对弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒的检测均以免疫学检测为主，如参见中国专利(申请)第00130423、01115286、03136487、200810045267、201310367213、201310441198号等。
本发明人的团队致力于通过PCR方法直接针对病原体的特异性基因片段进行检测，曾经在中国专利第200910157409号等专利中实现了对HBV等病毒进行多重(种)同时在单管中检测。然而，弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等病原体的基因序列存在片段的重复性多、GC含量偏离以及特异性短片段少，而特异长片段的相互相干扰严重等特点，因此至今无法在单管中同时通过PCR方法一次性检测，只开发出了诸如中国专利(申请)第201410016220号这样的芯片杂交检测方法，其中探针是分离点样的，才避免了互相干扰。
经过多年的研究，本发明人摒弃了现有引物和探针的一些传统做法，包括序列完全配对、GC比等，结合对工具酶的研究，终于使得弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等病原体能够通过PCR方法多重单管实时检测出来，灵敏、快速而且准确率高，尤其适合自动化、大样本量的检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是首次提供在单管中同时检测弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒的实时PCR方法。尽管由于这些病毒的靶核酸本身为设计同时检测的引物对和探针带来了极大地困难，但是在本发明人长期的研究下，通过摸索出的引物对和探针序列、比例以及工具酶的研究，终于使得在单管中同时检测来自这是中病毒的靶核酸得以顺利实施，而且具有较高的准确性和灵敏度，尤其可应用在大型自动化检测分析上。另外，本发明还提供了可以用于上述方法的试剂盒及核酸混合物等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了在单个PCR反应管中同时检测样品中四种靶核酸的实时荧光PCR方法，所述靶核酸来自弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒，所述方法包括：
(1)提取样品中的核酸，获得病毒总核酸提取液；
(2)在所述单个PCR反应管中混合核酸提取液、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
靶核酸引物对包括：
弓形虫：
TO-L：CTGGTATGTACGCAATAG
TO-R：GTCCTTGTATCATGTCAATA
风疹病毒：
RV-L：GGTCAAGTTCCATACAGA
RV-R：GGTGTAATTCATAATGTACTCA
巨细胞病毒：
HCMV-L：CCTAGTATATTTGCCTCCTTA
HCMV-R：CATGCAAACTTCTCATTTATTG
单纯疱疹病毒：
HSV-L：GCATCTATACCTCTTTCTGA
HSV-R：CGATCCGTTGATAAACATC
靶核酸探针包括：
弓形虫：
TO-P：TTCGTCTGCCACTGTCATAAGC
风疹病毒：
RV-P：AGGACCGTCTGGCAACTCTC
巨细胞病毒：
HCMV-P：CGGTCGCACGGATTATTCCTTC
单纯疱疹病毒：
HSV-P：TGAAACAGACACGCCAACTGG
(3)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光信号；
(4)判断是否有靶核酸存在于样品中。
其中，判断是否有靶核酸存在于样品中可以根据荧光检测结果计算出的Ct值来进行。尽管由于大量核酸片段存在于同一扩增体系中，互相干扰不可避免，但是扩增仍旧能得以进行，并且仍旧能够由ABI7500荧光仪等设备计算得出Ct值，而且相互很容易区分。
在本文中，“样品”是潜在可能含有靶核酸的离体样品，如食品、空气、血液、血液制品、唾液、医疗用品或药品等。本发明的实时PCR方法仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的存在性与否。即使对于利用本发明的检测方法检测人或动物的血液样品中病原体(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中的病原体还是取样时不慎污染的病原体，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况；即使靶核酸来自于血液中的病原体，也只能说明相应人或动物是相应病原体的携带者，还需要有经验的医生根据相应人或动物的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出是否会造成疾病或对健康状况有影响。当然，由于这些病毒可以经口、鼻传播，因此本发明的实时PCR方法可以针对食品和/或空气样品进行检测，用于环境安全领域，不涉及疾病的诊断和治疗。
优选在本发明的第一方面的方法中，样品是经过预处理而富集了核酸(如靶核酸)的样品，如样品是经过磁珠提取法处理过的样品。优选地，提取样品中的核酸是采用磁珠提取法提取得，具体而言，其中的步骤如下：向样品加入核酸萃取液，保温后加入磁珠，混合均匀，施加磁场后，弃去其中液体，然后两次洗涤，第一次洗涤使用包含高氯酸钠和乙醇的洗涤液，第二次洗涤使用包含乙醇的洗涤液，最后采用包含pH缓冲液Tris-HCl洗脱。更优选在磁珠提取法中，所述核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液Tris-HCl。
在本文中，“单管”可以与“单个PCR反应容器”互换使用，指所述实时PCR方法在技术上是在同一个容器中进行的，没有必要更换容器。最优选其中所述容器是PCR反应管，其它可以进行PCR反应并可进行实时荧光检测的容器也在本发明的保护范围内。在本发明第一方面的实时PCR方法中，在同一个容器中就可以完成PCR扩增和实时检测的步骤，整个过程不必更换容器，因而方便了操作者。操作者只需要向容器中加入样品与各种试剂混合即可，就可以通过市售的普通实时荧光PCR仪来自动完成，整个过程操作者只需添加样品和试剂即可，非常方便。尤其是，整个过程只需添加样品和试剂的步骤干预，便于实现全自动操作，从而节约了人力成本并最大程度降低了人为失误的可能性，因此本发明的检测方法便于自动化所带来的成本和可靠性优势是可以预期的。
本发明的实时PCR方法是多重检测方法，即同时检测的核酸有多(如，四)种。在本发明的第一方面的方法中，每种核酸可以是RNA，也可以是DNA，或者这两种核酸类型的混合物。
在本发明的第一方面的方法中，不同种探针(包括不同种靶核酸探针、不同种内对照核酸探针)之间所标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，这样能够同时或快速地顺序扫描不同的检测波长，分别记录下各种荧光基团的荧光变化，从而能够进行同时检测。在本文中，探针具有本领域技术人员所熟知的含义，其由为能与扩增出的靶核酸单链结合的单链DNA。通常，在每种探针的核苷酸序列的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。优选其中各种探针标记有不同的荧光基团。优选荧光基团及其淬灭基团是市售的，如可以采用FAMTM/GreenI、/JOE/HEX、NEDTM/TAMRATM/、ROXTM/Texas和等常规产品，它们的检测波长互不相同，也可以委托公司合成标记有荧光标记的探针。优选在本发明的第一方面的方法中，荧光基团分别是FAM，TAMRA，ROX，Cy5。
由于现有的引物对和探针设计方法难以设计出避免相互干扰的引物对和探针，所以经过长期摸索，本发明人摒弃了现有引物和探针的一些传统做法，包括序列完全配对、GC比等，采用了自主技术独立地设计出了每种靶核酸的引物对与探针。在本发明的具体实施方式中，每种靶核酸引物对与该靶核酸探针在所述单个PCR反应管中的摩尔比为2～4：1，优选是4：1，能够从Ct值上进一步区分不同的靶核酸来源。
通常，本领域技术人员认为越是昂贵、越是保真度高的DNA聚合酶，效果越是好。但是本发明人发现，在本发明的实时PCR方法中并非保真度取决定作用，甚至许多昂贵的酶会降低灵敏度甚至更容易导致错误结果。因此优选所述DNA聚合酶不是HotstartTaqDNA聚合酶、FastTaqDNA聚合酶或pfu酶，更优选是B684TaqDNA聚合酶。这样本发明不但检测效果好，而且还能够降低成本。
在第二方面，本发明提供了用于本发明第一方面所述方法的检测试剂盒，其包括：
(1)磁珠提取法所需试剂，包括：
核酸萃取液，包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液Tris-HCl；
第一次洗涤所用的洗涤液，包含高氯酸钠和乙醇；
第二次洗涤所用的洗涤液，包含乙醇；
洗脱所用的洗脱液，包含pH缓冲液Tris-HCl。
(2)PCR反应所需试剂
反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和探针，其中所述探针两端标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同。
在本发明的第二方面的试剂盒中，可以优选本发明第一方面的各个优选方面，只要没有矛盾即可。另外，不同的试剂可以分装在不同容器中，也可以选择几种长期保存而不发生化学反应并且在本发明第一方面的方法中将混合使用的试剂合并保存在相同的容器中。容器可以是瓶、盒、注射器等能容纳上述试剂的容器，例如常规用于装PCR、酶或核酸试剂的容器。检测试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示按照本发明第一方面所述方法进行操作。标签可以贴在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供独立的说明书。根据需要，如方便运输、存放的需要，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。
在第三方面，本发明提供了本发明第二方面所述的检测试剂盒在制备用于在单个PCR反应管中同时检测四种靶核酸的实时荧光PCR方法的制品中的应用，其中所述靶核酸来自弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒。检测试剂产品可以是检测试剂盒本身，也可以是合并装有多个检测试剂盒的更大包装产品。优选其中在单个PCR反应管中同时检测四种靶核酸的实时荧光PCR方法是本发明第一方面所述的方法。
在另外一个独立的方面，本发明提供了引物和探针的混合物，其包括：
引物对包括：
弓形虫：
TO-L：CTGGTATGTACGCAATAG
TO-R：GTCCTTGTATCATGTCAATA
风疹病毒：
RV-L：GGTCAAGTTCCATACAGA
RV-R：GGTGTAATTCATAATGTACTCA
巨细胞病毒：
HCMV-L：CCTAGTATATTTGCCTCCTTA
HCMV-R：CATGCAAACTTCTCATTTATTG
单纯疱疹病毒II型：
HSV-L：GCATCTATACCTCTTTCTGA
HSV-R：CGATCCGTTGATAAACATC
靶核酸探针包括：
弓形虫：
TO-P：TTCGTCTGCCACTGTCATAAGC
风疹病毒：
RV-P：AGGACCGTCTGGCAACTCTC
巨细胞病毒：
HCMV-P：CGGTCGCACGGATTATTCCTTC
单纯疱疹病毒II型：
HSV-P：TGAAACAGACACGCCAACTGG。
优选在该混合物中，每种靶核酸引物对与该靶核酸探针的摩尔比为2～4：1。
本发明的有益效果在于：首次实现了单管同时检测样品中是否存在来自弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒的靶核酸，检测准确、可靠、灵敏，重复性佳，而且可以使用目前市售的实时荧光PCR设备完成，也方便规模化应用。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1是本发明示例性的对弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒II型的实时PCR扩增曲线图，图中各种曲线都能够清晰区分。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(第三版)(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社,北京,中国,2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社,北京,中国,1991)等实验手册所列方法来实施。其中，所用的探针、引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例1
1、核酸提取
按照卫生部的病毒保存和研究规范，对弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒II型毒株进行核酸提取。
核酸的提取按照常规磁珠提取法进行提取，方法如下：向10μl标准样本(假病毒颗粒1*104IU/ml)加入90μl核酸萃取液(配方及终浓度为：异硫氰酸胍1.2M、乙二胺四乙酸钠(pH8.0)10mM、吐温-202％(W/W)、高氯酸钠1.0M、乙醇40％(V/V)、Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，然后加入10μl磁珠悬浮液(50mg/mL，购自北京艾比根生物技术有限公司)，振荡混合均匀后，套在磁架上施加磁场，弃去其中液体，然后加入200μl洗涤液A(配方及终浓度为：高氯酸钠1M、乙醇30％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液A，再加入200μl洗涤液B(配方及终浓度为：乙醇70％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液B，最后加入洗脱液(配方及终浓度为：Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，吸出并保留液体，即为核酸提取液，为每种病毒的基因组总核酸。
2、荧光PCR反应体系确定
通过我们摸索，确定PCR反应体系中各个组分，尤其是探针和引物的组合浓度。
2.1引物及探针序列
靶核酸引物对包括：
弓形虫(简称TO)：
TO-L：CTGGTATGTACGCAATAG
TO-R：GTCCTTGTATCATGTCAATA
风疹病毒(简称RV)：
RV-L：GGTCAAGTTCCATACAGA
RV-R：GGTGTAATTCATAATGTACTCA
巨细胞病毒(简称HCMV)：
HCMV-L：CCTAGTATATTTGCCTCCTTA
HCMV-R：CATGCAAACTTCTCATTTATTG
单纯疱疹病毒II型(简称HSV)：
HSV-L：GCATCTATACCTCTTTCTGA
HSV-R：CGATCCGTTGATAAACATC
靶核酸探针包括：
弓形虫：
TO-P：TTCGTCTGCCACTGTCATAAGC
风疹病毒：
RV-P：AGGACCGTCTGGCAACTCTC
巨细胞病毒：
HCMV-P：CGGTCGCACGGATTATTCCTTC
单纯疱疹病毒II型：
HSV-P：TGAAACAGACACGCCAACTGG
2.2荧光标记
在上述探针TO-P、RV-P、HCMV-P、HSV-P的5’端分别委托合成标记荧光标记FAM、TAMRA、ROX、CY5，并在3’端标记相应的淬灭基团。
2.3引物和探针的组合浓度
(1)PCR反应体系总体积为60μl，其中各组分的浓度分别为：Tris.HClpH8.310mM；KCl50mM；MgCl25mM；dNTP0.2mM；TaqDNA聚合酶5U；M-MLV反转录酶150U；RNasin20U；各种引物16pmol/种；各种荧光探针4pmol/种；甘油5％(v/v)；各种靶核酸提取液。其中各种把核苷酸提取液浓度为1000IU/mL，用量为40ul。
2.4反转录和PCR条件
42℃30分钟50℃2分钟94℃3分钟
(94℃10秒52℃10秒65℃45秒)45个循环
2.5试验结果
荧光采集FAM、TAMRA、ROX、Cy5。结果分析条件仍旧遵从严格设定，即：以ABI7500荧光仪的基线自动设定，荧光阈值设定在(dR＝1000)，以Ct值45为分界，其中，
1)FAM层Ct值>45，则判定为TO阴性；
FAM层Ct值≤45，则判定为TO阳性。
2)TAMRA层Ct值>45，则判定为RV阴性；
TAMRA层Ct值≤45，则判定为RV阳性。
3)ROX层Ct值>45，则判定为HCMV阴性；
ROX层Ct值≤45，则判定为HCMV阳性。
4)Cy5层Ct值>45，则判定为HSV阴性；
Cy5层Ct值≤45，则判定为HSV阳性。
3.荧光定量PCR条件的摸索
由于引物和探针的设计已经达到极限，其他试剂如无优化，将干扰以上结果分析条件设定的有效性，甚至会导致无法完成PCR。
3.1Taq酶的选定
现有TaqDNA聚合酶的种类非常多，包括价格较贵的HotstartTaq酶、FastTaq酶和pfu等高保真Taq酶，但是使用这些酶的效果一般，有的甚至无法完成样品的同时扩增，如采用HotstartTaq酶，将使得TO、RV和HSV的Ct值在104IU/ml的浓度下较之优选的酶上升2-5；而采用FastTaq酶，将使得RV和HCMV的Ct值在104IU/ml的浓度下较之优选的酶上升7-12，非常接近45的判断界限，在样本中病毒浓度低的时候，会非常容易出现假阴性结果。经过我们多年研究，终于发现B684TaqDNA聚合酶(可购自上海西唐生物科技有限公司或上海浩源生物科技有限公司)效果最好，配合如下优化条件，能够使得同时扩增能够完成，相互的扩增曲线形态能够清晰地区分，而且消除了假阳性结果。
3.2探针和引物比例的优化
在四种病毒(各104IU/ml)的荧光PCR体系中进行多次扩增(使用B684TaqDNA聚合酶)，当引物探针比例为3：1时，TO、RV、HCMV和HSV的Ct值的多次结果分别为29.18-31.78、28.25-30.86、24.33-25.63和25.84-28.57；当引物探针比例为2：1时，TO、RV、HCMV和HSV的Ct值的多次结果分别为31.22-33.55、32.06-33.95、25.83-26.25和28.98-29.67；当引物探针比例为4：1时，TO、RV、HCMV和HSV的Ct值的多次结果分别为32.02-34.68、29.77-31.53、24.83-26.29和27.98-30.31。所以在扩增体系中，各种引物的浓度为16pmol/种；各种荧光探针的浓度为4pmol/种。
实施例2
以弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒II型，沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、生殖支原体、人形支原体、解脲支原体、人乳头瘤病毒等样品的总核酸为模板，采用本实验设计的引物和探针进行实时荧光PCR反应，结果只有弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒II产生荧光信号，扩增情况参见表1，各种病毒单管同时的PCR扩增曲线示例参见附图1。这表明本方法对于弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒II的检测具有特异性。
表1单管检测四种优生优育检查中病原体方法特异性荧光PCR扩增结果
样品名称 测试1 测试2 结果判定
结果 结果
弓形虫 阳性 阳性 检出
风疹病毒 阳性 阳性 检出
巨细胞病毒 阳性 阳性 检出
单纯疱疹病毒II型 阳性 阳性 检出
沙眼衣原体 阴性 阴性 未检出
淋病奈瑟菌 阴性 阴性 未检出
生殖支原体 阴性 阴性 未检出
人型支原体 阴性 阴性 未检出
解脲支原体 阴性 阴性 未检出
人乳头瘤病毒 阴性 阴性 未检出
结果表明：该检测试剂盒的特异性高，与沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、生殖支原体、人形支原体、解脲支原体、人乳头瘤病毒等多种因子没有交叉，而且互相间的干扰被降低，可以同时在一个试管中检测。
实施例3
截至本专利申请，我们以上述方法对78名受试者的样本一一进行检测，同时对同一样本分别进行不同病毒的单独PCR扩增检测和免疫印迹检测各一次(共进行8次验证，如果结果有冲突，再重复3次确定结果，以多数结果为准)作为验证，使用本发明的方法没有发现有假阴性和假阳性检测结果。
所以，本发明采用荧光PCR方法能够在单管中检测四种优生优育检查中的病原体，完全可以用在全自动荧光PCR仪上具有操作简便，灵敏度高、准确性和重复性好的特点。因此，本发明可用来进行快速大量的体外样本检测，具有很好的应用前景。

Claims (5)

1.试剂盒在制备用于在单个PCR反应管中同时检测样品中四种靶核酸的实时荧光PCR方法的制品中的应用，其中所述靶核酸来自弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒，
所述试剂盒包括：
(1)磁珠提取法所需试剂，包括：
核酸萃取液，包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液Tris-HCl；
第一次洗涤所用的洗涤液，包含高氯酸钠和乙醇；
第二次洗涤所用的洗涤液，包含乙醇；
洗脱所用的洗脱液，包含pH缓冲液Tris-HCl；
(2)PCR反应所需试剂
反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和探针，其中所述探针两端标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，所述DNA聚合酶是购自上海西唐生物科技有限公司或上海浩源生物科技有限公司的B684TaqDNA聚合酶，这些靶核酸引物对和探针是：
TO-L：CTGGTATGTACGCAATAG
TO-R：GTCCTTGTATCATGTCAATA
RV-L：GGTCAAGTTCCATACAGA
RV-R：GGTGTAATTCATAATGTACTCA
HCMV-L：CCTAGTATATTTGCCTCCTTA
HCMV-R：CATGCAAACTTCTCATTTATTG
HSV-L：GCATCTATACCTCTTTCTGA
HSV-R：CGATCCGTTGATAAACATC
TO-P：TTCGTCTGCCACTGTCATAAGC
RV-P：AGGACCGTCTGGCAACTCTC
HCMV-P：CGGTCGCACGGATTATTCCTTC
HSV-P：TGAAACAGACACGCCAACTGG；
所述方法包括：
(1)提取样品中的核酸，获得病毒总核酸提取液；
(2)在所述单个PCR反应管中混合核酸提取液、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，这些靶核酸引物对和探针是：
TO-L：CTGGTATGTACGCAATAG
TO-R：GTCCTTGTATCATGTCAATA
RV-L：GGTCAAGTTCCATACAGA
RV-R：GGTGTAATTCATAATGTACTCA
HCMV-L：CCTAGTATATTTGCCTCCTTA
HCMV-R：CATGCAAACTTCTCATTTATTG
HSV-L：GCATCTATACCTCTTTCTGA
HSV-R：CGATCCGTTGATAAACATC
TO-P：TTCGTCTGCCACTGTCATAAGC
RV-P：AGGACCGTCTGGCAACTCTC
HCMV-P：CGGTCGCACGGATTATTCCTTC
HSV-P：TGAAACAGACACGCCAACTGG
(3)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光信号；
(4)判断是否有靶核酸存在于样品中。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，提取样品中的核酸系采用磁珠提取法提取，其特征在于步骤如下：向样品加入核酸萃取液，保温后加入磁珠，混合均匀，施加磁场后，弃去其中液体，然后两次洗涤，第一次洗涤使用包含高氯酸钠和乙醇的洗涤液，第二次洗涤使用包含乙醇的洗涤液，最后采用包含pH缓冲液Tris-HCl洗脱。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：每种靶核酸引物对与该靶核酸探针在所述单个PCR反应管中的摩尔比为2～4：1。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述荧光基团是FAM，TAMRA，ROX，Cy5。
5.用于在单个PCR反应管中同时检测样品中四种靶核酸的实时荧光PCR方法的检测试剂盒，其包括：
(1)磁珠提取法所需试剂，包括：
核酸萃取液，包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液Tris-HCl；
第一次洗涤所用的洗涤液，包含高氯酸钠和乙醇；
第二次洗涤所用的洗涤液，包含乙醇；
洗脱所用的洗脱液，包含pH缓冲液Tris-HCl。
(2)PCR反应所需试剂
反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和探针，其中所述探针两端标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，所述DNA聚合酶是购自上海西唐生物科技有限公司或上海浩源生物科技有限公司的B684TaqDNA聚合酶，这些靶核酸引物对和探针是：
TO-L：CTGGTATGTACGCAATAG
TO-R：GTCCTTGTATCATGTCAATA
RV-L：GGTCAAGTTCCATACAGA
RV-R：GGTGTAATTCATAATGTACTCA
HCMV-L：CCTAGTATATTTGCCTCCTTA
HCMV-R：CATGCAAACTTCTCATTTATTG
HSV-L：GCATCTATACCTCTTTCTGA
HSV-R：CGATCCGTTGATAAACATC
TO-P：TTCGTCTGCCACTGTCATAAGC
RV-P：AGGACCGTCTGGCAACTCTC
HCMV-P：CGGTCGCACGGATTATTCCTTC
HSV-P：TGAAACAGACACGCCAACTGG。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105886665B (zh) * 2016-05-11 2019-06-28 苏州华益美生物科技有限公司 B19、htlv和hev的四重荧光pcr快速超敏检测试剂盒及其应用
CN106191305A (zh) * 2016-07-08 2016-12-07 艾康生物技术(杭州)有限公司 优生优育检测试剂盒、检测用寡核苷酸和方法
CN106048098A (zh) * 2016-08-17 2016-10-26 瀚吉康生物科技（北京）有限公司 多重核酸体外诊断疱疹病毒的试剂盒及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074448A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种同步检测二十三种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及其检测方法
CN103725799A (zh) * 2014-01-15 2014-04-16 湖南圣维尔医学检验所有限公司 一种检测风疹病毒rna的方法及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074448A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种同步检测二十三种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及其检测方法
CN103725799A (zh) * 2014-01-15 2014-04-16 湖南圣维尔医学检验所有限公司 一种检测风疹病毒rna的方法及试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TORCH病原及其检测技术研究进展;程璐等;《中国病原生物学杂志》;20080331;第3卷(第3期);第223-226页 *
硅珠法在纯化污染检材中的应用;杨百全等;《刑事技术》;20031031(第5期);第10-12页 *

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