CN105886665B - B19、htlv和hev的四重荧光pcr快速超敏检测试剂盒及其应用 - Google Patents

B19、htlv和hev的四重荧光pcr快速超敏检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

B19、HTLV和HEV的四重荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用。本发明涉及在单个PCR反应容器中四重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，用于检测样品中人类微小病毒B19(Human parvovirus B19，B19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T‑cell lymphotropic virus 1，HTLV‑I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T‑cell lymphotropic virus 2，HTLV‑II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)。

Description

B19、HTLV和HEV的四重荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，本发明涉及能同时对人类微小病毒B19(Human parvovirus B19，B19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T-cell lymphotropic virus1，HTLV-I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T-cell lymphotropic virus 2，HTLV-II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)四种致病病原体进行检测的多重实时PCR方法，其快速、超敏且一步完成。另外，本发明还涉及上述PCR方法中所涉及的试剂，如互不相干绕的引物、探针等，以及用于上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。
背景技术
人细小病毒B19(Human parvovirus B19)是线性单链DNA病毒，基因组大小为5.6kb。1975年Cossart等人检测献血员血清中的乙肝抗原时，在编号为19号的献血员的血清中发现了特征与细小病毒类似的颗粒，并首先报道，但当时对其特性和在人类疾病中的意义仍不清楚，直至1981年，Pattison等发现其与镰状细胞贫血发生的再障危象之间的关系后，才证实它是一种人的致病病原体。
流行病学研究表明，B19的传播主要通过呼吸道，血液制品及母婴传播，且在全世界广泛分布，B19的感染率随着人们年龄的增长而呈现明显的上升趋势，少儿中的B19感染率只有10％左右，二十岁以上的成年人中感染率就可到达50％左右，而七十岁以上的人群中感染率就可高达80％以上。虽然B19的感染率很高，但是在免疫正常的人群中并不会带来严重的疾病，多表现为隐性感染；B19感染儿童，可引起传染性红斑(第五病)；感染成年人，可引起关节炎或关节痛；对免疫能力正常者，B19的感染多是自限性的；但对孕妇、免疫力低下者，B19的危害较大，感染孕妇可造成胎儿水肿及胎儿先天性贫血，甚至死胎；对免疫力低下者会导致慢性贫血，短暂的再生障碍性危象等严重疾病。近年来，发现B19还可能与系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病相关。
HTLV是20世纪80年代初由美国Poiesz等和日本Miyoshi等分别从成人T细胞白血病患者(ATL)和外周血培养的T细胞中分离出来的一种逆转录病毒,1983年在美国冷泉港的T淋巴细胞白血病病毒研讨会上将其命名为HTLV-I，同时将1982年日本Kalyanaraman报告的1例T细胞变异的多毛细胞白血病患者中与HTLV-I有血清学交叉反应的病毒命名为HTLV-II。
HTLV的传播途径与HIV类似,能通过输血、性接触、胎盘和哺乳、共用针头等途径传播。输血是目前HTLV家庭外水平传播的最主要途径。有人对血友病患者进行了血清学研究,结果显示美国4个不同地区患者抗-HTLV阳性率为5％～19％,而对照组阳性率小于1％。Okochi等研究发现,输入HTLV-I阳性献血者细胞成分的受者中,有69.9％的患者出现血清阳性。我国黑龙江省的抽样调查结果显示,单采血浆人群HTLV感染率明显高于普通人群。
HTLV-I具有嗜神经性,与神经性疾病病因相关。HTLV-I感染主要表现为慢性进行性炎症反应,淋巴细胞和单核细胞浸出,进入脊髓的灰质和白质。一般认为HAM/TSP患者的大脑组织损伤较轻,多表现为神经组织慢性退行性病变，此外,HTLV-I还可导致T淋巴细胞性恶性疾病,包括成人T淋巴细胞白血病(ATL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、T细胞性毛细胞白血病(THCL)、播散性混合性淋巴瘤(DML)。到目前为止,HTLV-II主要在发达国家的静脉吸毒者以及巴西亚马逊地区、美国和非洲的印地安人中流行,新的研究表明,HTLV-Ⅱ感染除能够引起神经系统的并发症以外,还可以增加肺炎、支气管炎的发病率,导致病死率提高,其导致皮肤淋巴瘤的情况较少见。
戊型肝炎病毒(hepatitis virus，HEV)是1982年发现的一种新病毒，是引起肠道传播非甲非乙型肝炎的主要病因。1983年前苏联学者Balayan等首次用免疫电镜技术从一名志愿者粪便中观察到直径为27～30nm的病毒样颗粒，1989年东京国际会议正式将其命名为戊型肝炎病毒。戊型肝炎(HE)主要通过母婴传播、输血传播，呈全球分布，严重危害人类健康。
不同人群感染HEV的致病性：HEV主要侵犯15-35岁的青壮年，以男性为主，病死率介于0.2％-1.0％之间。同时，HEV对特殊人群的致病性也有很大差异。在发展中国家，孕妇感染HEV后，其发病率在不同妊娠期各不相同，其中以妊娠中期和妊娠晚期最高，分别为20.0％和45.0％。各妊娠期的重症肝炎病死率为15.0％-25.0％，远高于由其他肝炎病毒引起的病死率。
对于具有肝硬化倾向的慢性肝病和晚期肝病患者，感染HEV后会出现超感染情况：即不仅增加肝脏的损害.还并发多器官衰竭而导致死亡，这种现象称之为慢加急性肝衰竭(ACLF)。WHO制订的艾滋病治疗指南中，认为CD4 +T淋巴细胞计数>200个/mm3者，仍具有抵抗外界常见病原体的免疫功能，不需服用抗病毒药物，只有当CD4 +T淋巴细胞低于200个/mm3，才进行抗病毒治疗。而有病例研究结果表明，无论是HIV感染者还是艾滋病患者，均可在CD4 +T淋巴细胞计数>200个/mm3的前提下感染HEV，并呈现隐性感染、显性感染和孕妇爆发性肝衰竭倾向等临床表现。
鉴于孕妇、受血者、慢性肝病、末期肝病患者及各种免疫力低下的患者(器官移植术后、淋巴瘤化疗和HIV感染等)感染HEV后，重症肝炎发生率和病死率较高，且目前尚无有效疫苗预防，因此，对高危人群应定期进行HEV检测，同时还要加强对献血员和血液制品的筛查，应把HEV检测列为献血员常规筛查项目。对于阻断HEV经血传播途径，降低戊肝发病率具有重要意义。
尽管对于人类微小病毒B19(Human parvovirus B19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T-cell lymphotropic virus 1，HTLV-I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T-celllymphotropic virus 2，HTLV-II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)这四种病毒来说，这些病毒本身均可以使用PCR方法进行各自独立的检测，然而它们的联合检测却没有报道。目前常规的实时PCR检测，如中国专利CN1768151A、CN101189505A、CN101273262A、CN101302473A等，多数仅用于检测单一靶核酸。本发明人团队的中国专利CN101624629A等，公开了(在单个PCR反应容器中)多重检测样品中靶核酸的实时PCR方法，执行速度更快、更整合，但是其仅仅用于检测特定的多重靶核酸的检测，无法将该平台技术不经创造性劳动而推广到其他病毒组合。
尤其是目前核酸多重检测技术产业多对自身的平台技术实施保密，没有关于如何设计互不干扰的引物对和探针的提示，更没有提示对探针浓度的进行调整。本发明人发现，直接通过目前已知的引物对和探针序列设计方法(包括现有的生物信息学软件)，无法设计出这四重互不干扰的引物对和探针，设计出的将导致互相干扰而使得荧光检测曲线失真。为此，本发明人经过艰苦的努力并且凭借了一些运气，从天文数字般多的病毒种类中，挑选出了这四种相对不容易互相干扰检测的病毒，并针对它们设计出了互相干扰程度在实时PCR检测中可接受的引物对和探针，更令人意外的是，在探针浓度上进行了调整，增强了它们的检测曲线都能的清晰度和分辨度(曲线相互分离)，使得检测灵敏度达到了超敏级，而且可以不使用内对照。另外，本发明对于上述病毒的核酸提取方法进行了优化。
发明内容
本发明的要解决的问题在于提供新的四重实时PCR方法，用于四重检测样品中人类微小病毒B19(Human parvovirus B19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T-celllymphotropic virus 1，HTLV-I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T-cell lymphotropicvirus 2，HTLV-II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)，通过互相干扰程度在实时PCR检测中可接受的引物对和探针，并任选优化探针浓度和核酸提取的过程，可以同时高特异性、高灵敏度和高重复性地分辨出样品中是否存在来自上述病毒的靶核酸。另外，本发明还涉及提供上述方法的检测试剂盒和应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了在单个PCR反应容器中四重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，所述靶核酸来自人类微小病毒B19(Human parvovirus B19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T-cell lymphotropic virus 1，HTLV-I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T-cell lymphotropic virus 2，HTLV-II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)，其包括，
(1)在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
靶核酸引物对包括
B-19-F：ACTTTTAGTGCCAACTCTG
B-19-R：GACTAATGGTGCAAACCTT
HTLV-I-F：CCTAGTAGCCTCCCTCCATCACC
HTLV-I-R：GCTGGTATTCTCGCCTCAATCCTT
HTLV-II-F：GATGACAGGCTACAACCCCAT
HTLV-II-R：AGGTTCTGGTACTCCCGTCT
HEV-F:GATTCTCAGCCCTTCGCCCTCC和
HEV-R:AGCTGGGGCAGATCGACGAC
靶核酸探针包括：
B-19-P：AAGTAGCTGCCACAATGCC
HTLV-I-P：CCCCTCCGTGTCCAAGCCAACA
HTLV-II-P：CCCCGCCCAGCAAGGTCT和
HEV-P:CTCGGCAGCCAGCCCGTCCAC
(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和，
(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。
可以对核酸提取液进行直接检测，但是优选对样品进行处理后获得核酸提取液后再进行检测。所以，优选核酸提取液是提取样品中的核酸而获得的提取液，如是采用磁珠提取法提取的。非特异性的磁珠提取法采用表面涂有非特异性核酸吸附类物质的顺磁性颗粒，在低pH(如，pH值5～7)和高盐浓度的情况下核酸可以吸附到顺磁性颗粒表面，在进行磁分离和充分洗涤后，在高pH(如，pH值8～9)、低盐浓度的条件下可将核酸洗脱下来，由此富集了核酸(如靶核酸)的样品可用于PCR试验；另外还可以采用特异性吸附(如杂交吸附和免疫吸附)的磁珠提取法。这些处理过程对于本领域技术人员来说是熟知的，也可参见郑秀芬等，模板DNA磁珠提取法.中国法医学杂志，18(3)：107-108；中国专利200610030229.5、200710118802.2和201110105181.0等。
优选采用本发明人进一步优化的磁珠提取法，其对于同时提取人类微小病毒B19(Human parvovirus B19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T-cell lymphotropic virus 1，HTLV-I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T-cell lymphotropic virus 2，HTLV-II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)中的核酸，更为可靠，步骤也方便。优选的提取受试品中的核酸的过程是：向样品加入核酸萃取液(优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl))，保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤(优选洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优选其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇)，并洗脱(优选洗脱所用的洗脱液包含pH缓冲液(如，Tris-HCl))。
因此，本发明优选提供了四重检测样品中人类微小病毒B19(Human parvovirusB19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T-cell lymphotropic virus 1，HTLV-I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T-cell lymphotropic virus 2，HTLV-II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis Evirus，HEV)的方法，其包括，
(A)提取样品中的核酸，获得核酸提取液；和，
(B)对核酸提取液实施本发明的第一方面的在单个PCR反应容器中四重检测样品中靶核酸的实时PCR方法。
在本文中，所检测的“样品”是潜在可能含有靶核酸或病毒的离体样品，如血液、血液制品、医疗用品或药品等。本发明的方法优选不是诊断方法，如可用于公共卫生领域的血液样品检测(如，输血前血液样品检测，其直接目的是判断是否可以使用该血液样品，而非对患者进行诊断)，以及检验检疫领域的产品安全检测(如，衣物是否污染有上述病毒，其直接目的是检测产品质量)。本发明的方法优选仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸或病毒的存在性与否。即使对于利用本发明的检测方法检测人或动物的血液样品中病原体(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中的病原体还是取样时不慎污染的病原体，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况；即使靶核酸来自于血液中的病原体，也只能说明相应人或动物是相应病原体的携带者，还需要有经验的医生根据相应人或动物的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出是否会造成疾病或对健康状况有影响。
在本文中，“单个PCR反应容器”指所述实时PCR方法在技术上是在同一个容器中进行的，没有必要更换容器。最优选其中所述容器是PCR反应管，其它可以进行PCR反应并可进行实时荧光检测的容器也在本发明的保护范围内。在本发明第一方面的实时PCR方法中，在同一个容器中就可以完成PCR扩增和实时检测的步骤，整个过程不必更换容器，因而方便了操作者。操作者只需要向容器中加入样品与各种试剂即可，就可以通过市售的普通实时荧光PCR仪来自动完成，整个过程操作者只需添加样品和试剂即可，非常方便。尤其是，整个过程只需添加样品和试剂的步骤干预，便于实现全自动操作，如使用中国专利申请2007100030261公开的自动微量加液系统(即，吸取和分配实验液体的移液装置及带有该装置的PCR仪)，即可完成本发明检测方法的全过程自动化，从而节约了人力成本并最大程度降低了人为失误的可能性，因此本发明的检测方法便于自动化所带来的成本和可靠性优势是可以预期的。
在本文中，“四重”检测指的是同时检测的核酸(或其所代表的病毒)有四种，即人类微小病毒B19(Human parvovirus B19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T-celllymphotropic virus 1，HTLV-I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T-cell lymphotropicvirus 2，HTLV-II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)。在实时荧光PCR反应中，Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达实时荧光PCR仪所默认设定的阈值时所经历的循环数，其具有良好的再现性，因此可以用于作为判读结果的优良指标。在本发明的第一方面的方法中，对于步骤(3)，其中一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值<45，则这种靶核酸存在于样品中；一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值>45，则这种靶核酸不存在于样品中。这是我们经过长期大量试验摸索出来的经验，可靠性和重复性俱佳。因此也优选在本发明的第一方面的方法中，优选不采用内对照核酸。
本发明人发现，如果提高探针的浓度，可以进一步提高本发明的第一方面的方法的检测灵敏度。所以，优选在本发明的第一方面的方法中，每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml，优选为6～12pmol/ml，更优选为7～10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。另外，优选在本发明的第一方面的方法中，在步骤(1)中所述单个PCR反应容器中还进一步混合有PCR反应所需的其他试剂，如盐。还优选了甘油浓度，用以延长PCR条件下酶活耐久力。在本发明的具体实施方式中，盐优选是Mg盐。本领域技术人员还可以容易地选择出其他pH缓冲剂(如磷酸缓冲液等)来调节到合适的pH，也可以容易地选择出其他可溶性盐(如KCl等)来调节离子强度。另外，还可以进一步混合有抗氧化剂(还原剂)、蛋白(酶)保护剂(如，牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等)。这些成分的选择对于本领域技术人员来说都是熟知的。
在本文中，核酸按照本领域所常用的表示方法表示，其序列如未特别指出，均为5’端到3’端方向。其中，探针上标记有荧光标记物。荧光标记物可以位于探针的5’端、内部和/或3’端，优选位于5’端和/或3’端。在本发明的第一方面的方法中，不同种探针(之间所标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，这样能够同时或快速地顺序扫描不同的检测波长，分别记录下各种荧光基团的荧光变化，从而能够进行同时检测。在本文中，探针具有本领域技术人员所熟知的含义，其由为能与扩增出的靶核酸单链结合的单链DNA。通常，在每种探针的核苷酸序列的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。优选其中各种探针标记有不同的荧光基团。优选荧光基团及其淬灭基团是市售的，如可以采用FAMTM/ Green I、/JOE/HEX、NEDTM/TAMRATM/ROXTM/Texas 和等常规产品，它们的检测波长互不相同，也可以委托公司合成标记有荧光标记的探针。在本发明的具体实施方式中，其中采用的标记有不同检测波长的荧光标记的探针都是委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成的，纯度达到HPLC纯，不含杂带。优选在本发明的第一方面的方法中，各种探针标记有不同的荧光基团。在本发明的具体实施方式中，优选的荧光基团是FAM、VIC、ROX和CY5。
本领域技术人员能够根据引物及相应需要PCR扩增的核酸来设计PCR反应条件。对于本发明的五重检测，为了平衡不同种核酸的扩增条件，本发明人经过长期摸索，优化出的条件为：PCR反应的每个循环的条件为94℃10秒、55℃15秒以及65℃45秒。在本发明的具体实施方式中，PCR反应优选先25℃保温5分钟42℃反转录35分钟并94℃变性10分钟，然后进行上述条件的45个循环。
在第二方面，本发明提供了用于在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂盒，其包括DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
靶核酸引物对包括
B-19-F：ACTTTTAGTGCCAACTCTG
B-19-R：GACTAATGGTGCAAACCTT
HTLV-I-F：CCTAGTAGCCTCCCTCCATCACC
HTLV-I-R：GCTGGTATTCTCGCCTCAATCCTT
HTLV-II-F：GATGACAGGCTACAACCCCAT
HTLV-II-R：AGGTTCTGGTACTCCCGTCT
HEV-F:GATTCTCAGCCCTTCGCCCTCC和
HEV-R:AGCTGGGGCAGATCGACGAC
靶核酸探针包括：
B-19-P：AAGTAGCTGCCACAATGCC
HTLV-I-P：CCCCTCCGTGTCCAAGCCAACA
HTLV-II-P：CCCCGCCCAGCAAGGTCT和
HEV-P:CTCGGCAGCCAGCCCGTCCAC；
在试剂盒中，不同的试剂可以分装在不同容器中，也可以选择几种长期保存而不发生化学反应的试剂合并保存在相同的容器中。容器可以是瓶、盒、注射器等能容纳上述试剂的容器，例如常规用于装PCR、酶或核酸试剂的容器。检测试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示按照本发明第一方面所述方法进行操作。标签可以贴在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供独立的说明书。根据需要，如方便运输、存放的需要，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。
对于本发明第二方面的检测试剂盒，其中优选的各成分如本发明第一方面所述的那样优选。优选诸如，其中各种探针标记有不同的荧光基团，更优选荧光基团是FAM、VIC、ROX和CY5；其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml，优选为6～12pmol/ml，更优选为7～10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。也优选其中不含有内对照核酸。
在第三方面，本发明提供了本发明第二方面所述的试剂盒在制备用于在单个PCR反应容器中四重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂产品中的应用，优选提供了本发明第二方面所述的检测试剂盒在制备用于本发明第一方面所述方法的检测试剂产品中的应用。在本文中，检测试剂产品可以是检测试剂盒本身，也可以是合并装有多个检测试剂盒的更大包装产品。根据前文所述，本领域技术人员很容易理解其中检测试剂盒的成分以及其中方法的流程。
试剂盒中还可以包含提取样品中的核酸获得核酸提取液所用的试剂。因此，在第四方面，本发明提供用于四重检测样品中人类微小病毒B19(Human parvovirus B19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T-cell lymphotropic virus 1，HTLV-I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T-cell lymphotropic virus 2，HTLV-II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)的检测试剂盒，其包括本发明的第二方面的试剂盒和磁珠提取法所需试剂。
优选其中磁珠提取法所需试剂包括，
核酸萃取液，优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl)；
第一次洗涤所用的洗涤液，优选其包含高氯酸钠和乙醇；
第二次洗涤所用的洗涤液，优选其包含乙醇；和，
洗脱所用的洗脱液，优选其包含pH缓冲液(如，Tris-HCl)。
相应地，在第五方面，本发明提供了本发明第四方面所述的试剂盒在制备用于四重检测样品中人类微小病毒B19(Human parvovirus B19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T-cell lymphotropic virus 1，HTLV-I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T-celllymphotropic virus 2，HTLV-II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)的检测试剂中的应用。
在第六方面，本发明提供了互不干扰实时PCR的核酸混合物，其是引物或探针的混合物，所述引物或探针选自
B-19-F：ACTTTTAGTGCCAACTCTG，
B-19-R：GACTAATGGTGCAAACCTT，
HTLV-I-F：CCTAGTAGCCTCCCTCCATCACC，
HTLV-I-R：GCTGGTATTCTCGCCTCAATCCTT，
HTLV-II-F：GATGACAGGCTACAACCCCAT，
HTLV-II-R：AGGTTCTGGTACTCCCGTCT，
HEV-F:GATTCTCAGCCCTTCGCCCTCC，
HEV-R:AGCTGGGGCAGATCGACGAC，
B-19-P：AAGTAGCTGCCACAATGCC，
HTLV-I-P：CCCCTCCGTGTCCAAGCCAACA，
HTLV-II-P：CCCCGCCCAGCAAGGTCT，
HEV-P:CTCGGCAGCCAGCCCGTCCAC；
该混合物可以用于本发明的第一方面的方法中，也可以用于制备本发明第二和/或第四方面的试剂盒。
本发明的有益效果在于：能够四重检测样品中是否存在人类微小病毒B19(Humanparvovirus B19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T-cell lymphotropic virus 1，HTLV-I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T-cell lymphotropic virus 2，HTLV-II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)，四重引物/探针无交叉污染及干扰，保证了的准确性、可靠性、特异性、灵敏度和重复性，而且使用目前常规的市售实时荧光PCR设备，无需改造，操作方便并节省成本，并且可以不使用内对照监控，进一步节约了成本。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1显示了示例性的本发明实施例中对人类微小病毒B19(Human parvovirusB19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T-cell lymphotropic virus 1，HTLV-I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T-cell lymphotropic virus 2，HTLV-II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis Evirus，HEV)进行四重实时PCR的检测图谱，其结果曲线能够清晰区分，但已经达到极限。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社,北京,中国,2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社,北京,中国,1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例1核酸的提取
人类微小病毒B19(Human parvovirus B19)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T-celllymphotropic virus 1，HTLV-I)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T-cell lymphotropicvirus 2，HTLV-II)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)在许可条件下可购自国家卫生部临检中心，均为标准品，供核酸提取。
核酸的提取按照常规磁珠提取法进行提取，为了同时适应上述四种病毒的核酸提取，改进如下：向1uL标准品加入90uL核酸萃取液(配方及终浓度为：异硫氰酸胍1.2M、乙二胺四乙酸钠(pH8.0)10mM、吐温-20 2％(W/W)、高氯酸钠1M、乙醇40％(V/V)、Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，然后加入10uL D-Beads DNA磁珠悬浮液(50mg/mL，可购自北京艾比根生物技术有限公司)，振荡混合均匀后，套在磁架上施加磁场，弃去其中液体，然后加入200uL洗涤液A(配方及终浓度为：高氯酸钠1M、乙醇30％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液A，再加入200uL洗涤液B(配方及终浓度为：乙醇70％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液B，最后加入洗脱液(配方及终浓度为：Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，吸出并保留液体，即为核酸提取液。
合并各病毒标准品的核酸提取液，并稀释供以下步骤测试。
实施例2四重实时PCR测试
1，引物及探针序列
委托合成如下引物对和探针：
检测人类微小病毒B19(Human parvovirus B19)的引物对：
B-19-F：ACTTTTAGTGCCAACTCTG，
B-19-R：GACTAATGGTGCAAACCTT，
检测人类微小病毒B19(Human parvovirus B19)的探针：
B-19-P：AAGTAGCTGCCACAATGCC，
检测人类嗜T细胞病毒I型(Human T-cell lymphotropic virus 1，HTLV-I)的引物对：
HTLV-I-F：CCTAGTAGCCTCCCTCCATCACC，
HTLV-I-R：GCTGGTATTCTCGCCTCAATCCTT，
检测人类嗜T细胞病毒I型(Human T-cell lymphotropic virus 1，HTLV-I)的探针：
HTLV-I-P：CCCCTCCGTGTCCAAGCCAACA，
检测人类嗜T细胞病毒II型(Human T-cell lymphotropic virus 2，HTLV-II)的引物对：
HTLV-II-F：GATGACAGGCTACAACCCCAT，
HTLV-II-R：AGGTTCTGGTACTCCCGTCT，
检测人类嗜T细胞病毒II型(Human T-cell lymphotropic virus 2，HTLV-II)的探针：
HTLV-II-P：CCCCGCCCAGCAAGGTCT，
检测戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)的引物对：
HEV-F:GATTCTCAGCCCTTCGCCCTCC，
HEV-R:AGCTGGGGCAGATCGACGAC，
检测戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)的探针：
HEV-P:CTCGGCAGCCAGCCCGTCCAC；
2，荧光标记
在上述探针B-19-P、HTLV-I-P、HTLV-II-P和HEV-P的5’端分别委托合成标记荧光标记FAM、VIC、ROX和CY5，并在3’端标记相应的淬灭基团。
3，PCR反应条件
PCR反应体系总体积为20μl，其中各组分的终浓度分别为：核酸提取液(100倍稀释)1uL，上述5对引物对中的每一种引物含量为15pmol/ml，上述5种探针中的每一种含量增加至8pmol/ml，Mg2+(MgCl2)浓度为3.75mmol/ml，dNTP浓度各为0.2mmol/ml，UNG酶含量为0.05U，2×PCR buffer(可购自TaKaRa公司，pH8.3，无Mg2+)为10ul，Taq DNA聚合酶为2U，甘油15％(V/V)，余量为去离子水。
反应热循环条件如下：
使用ABI 7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM、VIC、ROX和CY5检测波长。
4，结果判断
基线和阈值设定为ABI 7500荧光仪默认自动设定。如果各荧光(FAM、VIC、ROX或CY5)层Ct值大于45，则判定为相应病毒的核酸检测阴性，如果小于等于45，则判定相应病毒的核酸检测阳性。如图1所示，本发明的方法能够检测极底浓度的上述病毒的靶核酸，而且检测互相不干扰，达到了超敏的检测灵敏度，但是还是存在略微的干扰，已经达到设计极限。
以上测试重复720次(包括样品中只添加一、二、三或四种病毒标准品的核酸提取液，或者未添加任何提取液的情况，但是其他检测条件不变)，结果均正确，表明本发明准确性和可靠性好，无需内对照。

Claims (36)

1.用于在单个PCR反应容器中四重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂盒，其包括DNA聚合酶、逆转录酶、RNA保护剂、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
靶核酸引物对包括
ACTTTTAGTGCCAACTCTG
GACTAATGGTGCAAACCTT
CCTAGTAGCCTCCCTCCATCACC
GCTGGTATTCTCGCCTCAATCCTT
GATGACAGGCTACAACCCCAT
AGGTTCTGGTACTCCCGTCT
GATTCTCAGCCCTTCGCCCTCC和
AGCTGGGGCAGATCGACGAC
靶核酸探针包括：
AAGTAGCTGCCACAATGCC
CCCCTCCGTGTCCAAGCCAACA
CCCCGCCCAGCAAGGTCT和
CTCGGCAGCCAGCCCGTCCAC。
2.权利要求1所述的试剂盒，其中各种探针标记有不同的荧光基团。
3.权利要求2所述的试剂盒，其中荧光基团是FAM、VIC、ROX和CY5。
4.权利要求1所述的试剂盒，其中每种靶核酸探针在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml。
5.权利要求4所述的试剂盒，其中每种靶核酸探针在所述单个PCR反应容器中的浓度为6～12pmol/ml。
6.权利要求5所述的试剂盒，其中每种靶核酸探针在所述单个PCR反应容器中的浓度为7～10pmol/ml。
7.权利要求6所述的试剂盒，其中每种靶核酸探针在所述单个PCR反应容器中的浓度为8pmol/ml。
8.用于四重检测样品中人类微小病毒B19、人类嗜T细胞病毒I型、人类嗜T细胞病毒II型、戊型肝炎病毒的检测试剂盒，其包括权利要求1～7之任一所述的试剂盒和磁珠提取法所需试剂。
9.权利要求8所述的试剂盒，其中磁珠提取法所需试剂包括，
核酸萃取液；
第一次洗涤所用的洗涤液；
第二次洗涤所用的洗涤液；和，
洗脱所用的洗脱液。
10.权利要求9所述的试剂盒，其中核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液。
11.权利要求10所述的试剂盒，其中pH缓冲液是Tris-HCl。
12.权利要求9所述的试剂盒，其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇。
13.权利要求9所述的试剂盒，其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇。
14.权利要求9所述的试剂盒，其中洗脱所用的洗脱液包含pH缓冲液。
15.权利要求14所述的试剂盒，其中pH缓冲液是Tris-HCl。
16.权利要求1～7之任一所述的试剂盒在制备用于在单个PCR反应容器中四重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂产品中的应用。
17.权利要求16所述的应用，其中检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法包括：
(1)在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、逆转录酶、RNA保护剂、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
靶核酸引物对包括
ACTTTTAGTGCCAACTCTG
GACTAATGGTGCAAACCTT
CCTAGTAGCCTCCCTCCATCACC
GCTGGTATTCTCGCCTCAATCCTT
GATGACAGGCTACAACCCCAT
AGGTTCTGGTACTCCCGTCT
GATTCTCAGCCCTTCGCCCTCC和
AGCTGGGGCAGATCGACGAC
靶核酸探针包括：
AAGTAGCTGCCACAATGCC
CCCCTCCGTGTCCAAGCCAACA
CCCCGCCCAGCAAGGTCT和
CTCGGCAGCCAGCCCGTCCAC
(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和，
(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。
18.权利要求17所述的应用，其中各种探针标记有不同的荧光基团。
19.权利要求18所述的应用，其中荧光基团是FAM、VIC、ROX和CY5。
20.权利要求17所述的应用，其中PCR反应的每个循环的条件为94℃10秒、55℃15秒以及65℃45秒。
21.权利要求17所述的应用，其中每种靶核酸探针在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml。
22.权利要求21所述的应用，其中每种靶核酸探针在所述单个PCR反应容器中的浓度为6～12pmol/ml。
23.权利要求22所述的应用，其中每种靶核酸探针在所述单个PCR反应容器中的浓度为7～10pmol/ml。
24.权利要求23所述的应用，其中每种靶核酸探针在所述单个PCR反应容器中的浓度为8pmol/ml。
25.权利要求8～15之任一所述的试剂盒在制备用于四重检测样品中人类微小病毒B19、人类嗜T细胞病毒I型、人类嗜T细胞病毒II型、戊型肝炎病毒的检测试剂中的应用。
26.权利要求25所述的应用，其中四重检测样品中人类微小病毒B19、人类嗜T细胞病毒I型、人类嗜T细胞病毒II型、戊型肝炎病毒的方法包括，
(A)提取样品中的核酸，获得核酸提取液；
(B)对核酸提取液实施在单个PCR反应容器中四重检测样品中靶核酸的实时PCR方法，所述靶核酸的实时PCR方法包括：
(1)在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、逆转录酶、RNA保护剂、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
靶核酸引物对包括
ACTTTTAGTGCCAACTCTG
GACTAATGGTGCAAACCTT
CCTAGTAGCCTCCCTCCATCACC
GCTGGTATTCTCGCCTCAATCCTT
GATGACAGGCTACAACCCCAT
AGGTTCTGGTACTCCCGTCT
GATTCTCAGCCCTTCGCCCTCC和
AGCTGGGGCAGATCGACGAC
靶核酸探针包括：
AAGTAGCTGCCACAATGCC
CCCCTCCGTGTCCAAGCCAACA
CCCCGCCCAGCAAGGTCT和
CTCGGCAGCCAGCCCGTCCAC
(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和，
(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。
27.权利要求26所述的应用，其中提取样品中的核酸是采用磁珠提取法提取的。
28.权利要求27所述的应用，其中提取样品中的核酸的过程是：向样品加入核酸萃取液，保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤，并洗脱。
29.权利要求28所述的应用，其中核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液。
30.权利要求29所述的应用，其中pH缓冲液是Tris-HCl。
31.权利要求28所述的应用，其中洗涤是洗涤两次。
32.权利要求31所述的应用，其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇。
33.权利要求31所述的应用，其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇。
34.权利要求28所述的应用，其中洗脱所用的洗脱液包含pH缓冲液。
35.权利要求34所述的应用，其中pH缓冲液是Tris-HCl。
36.互不干扰实时PCR的核酸混合物，其是引物和探针的混合物，所述引物或探针是
ACTTTTAGTGCCAACTCTG
GACTAATGGTGCAAACCTT
CCTAGTAGCCTCCCTCCATCACC
GCTGGTATTCTCGCCTCAATCCTT
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