CN105986038A - 丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒及其使用方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒及其使用方法和应用，该试剂盒包括：核酸扩增试剂和杂交试剂；其中，所述核酸扩增试剂包括：如SEQ ID NO.1‑4所示的引物；杂交试剂包括：如SEQ ID NO.5‑16所示的探针。该试剂盒的使用方法包括：1)样本的核酸提取；2)扩增试剂配制；3)PCR扩增；4)杂交反应；5)荧光反应；6)检测；7)根据检测反应体系中的荧光信号值来确定丙型肝炎病毒基因型别。该试剂盒可应用于检测9种不同型别的丙型肝炎病毒，具有高通量、高灵敏度、高型别覆盖范围、操作简便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因分型检测试剂盒及其使用方法和应用，特别是涉及一种丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒及其使用方法和应用。
背景技术
丙肝病毒(HCV)，于1989年首次发现，是世界上最常见的由输血及社区获得的非甲非乙型肝炎病毒。HCV是一种折叠的单链正义RNA病毒，在黄病毒科中单独成属。在世界范围内，已发现至少六种基因型和多种亚型以及病毒变异型。感染不同基因型会影响疾病严重程度以及治疗应答。HCV主要通过受污染的血液和血液制品传播，通过人体分泌物感染的可能性很低。
HCV流行率在全世界范围内超过3.0％，中国的携带率为3.7％。中国的HCV多为1b和2a基因型，但6型、3a型、3b型也时有发现，其中，尤以1b更为普遍。其它亚型也可见于某些区域，但比例较低，如HCV 4型、5型主要存在于非洲地区。
基因分型的重要性：
按照慢性丙肝的防治指导，明确要求在治疗之前需要提供基因分型的分析。基因分型的意义就是针对不同的亚型来决定治疗方案:现在最有效的治疗方法是采用聚乙二醇干扰素联合利巴韦林,HCV 2、3型可以通过24周的疗程来治愈,HCV 1型是最流行，但也是最难被治愈的：需要至少48周的治疗以及评估。
目前，HCV基因分型检测方法有基因测序法、液相芯片法、膜杂交法、实时荧光PCR法等，其中，最有前景的是基因测序法和液相芯片法。基因测序法目前在某些第三方试验室可以进行，但由于测定序列的选择局限，本是金标准的测序法时而也有分型不准确的问题，而且由于测序仪器昂贵，测序后数据分析繁杂，测序法目前还无法进入医院进行现场分析，即虽然基因测序法对HCV型别的鉴定是金标准，可以鉴别所有的型别，由于高昂的费用，复杂的操作及结果分析过程，在市场上应用有局限。
液相芯片技术暂时还未出现类似的产品，但液相芯片技术有许多突出的优点：多型别同时检测、高灵敏度、自动化程度日益提高、高通量。比起金标准测序法，有一个明显优势是可以实现混合型别的鉴定。但液相芯片法相比实时荧光PCR操作略复杂，需要在PCR反应结束后进行开盖操作，对产品的抗污染能力是一个考验。
另外，膜杂交法操作费用相对较低，但自动化程度低，时间长，灵敏度不高。实时荧光PCR法可以实现较高的灵敏度，但由于通道个数的限制难以实现多种型别的鉴别。
上述的检测方法均存在自身的缺陷，为临床HCV型别诊断和治疗带来一定困难。因此，有效地在控制成本的基础上实现快速灵敏地鉴别HCV型别，使其在HCV临床检测时能够发挥更为有效的作用至关重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒及其使用方法和应用。该试剂盒以液相芯片技术为核心，可应用于检测9种不同型别的丙型肝炎病毒，具有高通量、高灵敏度、高型别覆盖范围(能鉴别较多HCV型别(如9种HCV型别))、操作简便等优点。
为解决上述技术问题，本发明的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒，包括：核酸扩增试剂和杂交试剂；
其中，所述核酸扩增试剂包括：如SEQ ID NO.1-4所示的引物；
杂交试剂包括：如SEQ ID NO.5-16所示的探针【即如SEQ ID NO.5-14所示的用于丙型肝炎病毒基因分型检测的探针、如SEQ ID NO.15所示的质控(QC)探针以及如SEQ ID NO.16所示的内标(IC)探针】。
所述SEQ ID NO.1-4所示引物的5’端还连接有生物素(Biotin)，即5’端进行生物素标记。
所述SEQ ID NO.5-16所示探针的5’端标记有amino-C6。
表1引物序列
| 引物名称 | 序列(5’-3’) | 序列编号 |
| 引物F1 | cgggagagccatagtggtctgcg | SEQ ID NO.1 |
| 引物R1 | gggcactcgcaagcaccctatcaggc | SEQ ID NO.2 |
| 引物F2 | ttcacggakgctatgacyaggta | SEQ ID NO.3 |
| 引物R2 | cacctggagagtawcygtggag | SEQ ID NO.4 |
表2探针序列
| 名称 | 序列 | 序列编号 | 探针针对类型 |
| P1 | AATTGCCAGGACGACCGG | SEQ ID NO.5 | HCV 1型 |
| P2 | CTACTCCATAGAACCACTGG | SEQ ID NO.6 | HCV 1a型 |
| P3 | TTCTCCATCCTTCTAGCHCAG | SEQ ID NO.7 | HCV 1b型 |
| P4 | AATTGCCGGGAAGACTGGGT | SEQ ID NO.8 | HCV 2a型 |
| P5 | AATTACCGGAAAGACTGGGT | SEQ ID NO.9 | HCV 2b型 |
| P6 | CGCGAGATCACTAGCCGAG | SEQ ID NO.10 | HCV 3a型 |
| P7 | CCGTCTTTCCTTGTCTGTGG | SEQ ID NO.11 | HCV 3b型 |
| P8 | CAATGCCCGGAAATTTGGGC | SEQ ID NO.12 | HCV 4型 |
| P9 | AATTGCCGGGATGACCG | SEQ ID NO.13 | HCV 5型 |
| P10 | CCTTTCCATTGGACCAAACCCG | SEQ ID NO.14 | HCV 6型 |
| QC | GCGAAAGGCCTTGTGGTA | SEQ ID NO.15 | 覆盖所有型别 |
| IC | CTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAG | SEQ ID NO.16 | 内标基因 |
进一步地，所述杂交试剂包括：与带有编号的磁珠进行偶联后的如SEQ ID NO.5-16所示的探针。通过上述探针与有编号的磁珠上氨基结合成整体，一个编号连接一个探针。
所述与带有编号的磁珠进行偶联后的如SEQ ID NO.5-16所示的探针，其制备方法包括以下步骤：
A.将12种带编号的磁珠溶液(如1ml)转移到各自的管中，离心(如2500～3500rpm离心1～3分钟)，去除上清液；其中，磁珠溶液的浓度可为250K个磁珠/ml；该磁珠可采用商业化产品；
B.取MEST溶液(如200～400μl)分别加入每管中，离心(如2500～3500rpm离心1～3分钟)，去除上清液；
其中，MEST溶液是含体积浓度为0.01％-0.05％的Tween20(吐温20)和50mM～100mMpH5～7的MES(2-吗啉乙磺酸)的混合溶液；
C.重复步骤B一次；
D.加入水(优选超纯水125μl)、4×MEST溶液(即含体积浓度为0.04％-0.20％Tween20和200mM～400mM pH5～7的MES混合溶液，优选取75μl 4×MEST溶液)，并且分别对应每种磁珠加入如SEQ ID NO.5-16所示的探针；
其中，探针浓度优选为50～100μM，探针的加入量可为10～20μl。
E.配制含10mg/ml～5mg/ml EDC(N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺)的MEST溶液，将其加入到每个磁珠管中，震荡(室温)；
如可将1管EDC(N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺，10mg，购自SIGMA公司)从-18℃新鲜取出，加入1～2ml冷MEST溶液(2～8℃)，震荡混匀后，迅速取60～80μl加入到每个磁珠管中，震荡后，放入恒温震荡仪中，室温震荡1000～1400rpm，15～30分钟；
F.重复步骤E一次；
G.将TNT溶液(如500～800μl)加入磁珠管中，震荡混匀，离心(如2500～3500rpm离心1～3分钟)，去除上清液；
其中，TNT溶液是含25～50mM Tris-HCl、0.05～0.2M NaCl、0.01～0.05vol％(体积百分数)Tween 20的溶液；
H.重复步骤G一次；
I.将浓度为1g/100ml～5g/100ml的SDS溶液(如500～800μl)加入磁珠管中，缓慢滚动混匀，尽量避免气泡的产生，离心(如2500～3500rpm离心1～3分钟)，去除上清液；
J.重复步骤G一次，用上述TNT溶液洗涤磁珠；
K.加入TE溶液(如1.5ml)，得到与带有编号的磁珠进行偶联后的探针。也可进行如下操作：加入TE溶液(如1.5ml)，2～8℃保存，备用。磁珠制备完成。其中，TE溶液是含有10～30mM Tris-HCl和1～5mM EDTA的pH7～8的溶液。
上述核酸扩增试剂还可包括：核酸扩增所需的其他试剂，如包括：KCl、Tris-HCl缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和MgCl2。
所述杂交试剂还包括：杂交液、荧光反应液、杂交洗液和检测液。
其中，杂交液的组分为：TMAC(四甲基氯化铵)2～5M、Tris-HCl 20～60mM pH8、N-月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)0.1g/100ml～0.5g/100ml、EDTA 4～8mM。
荧光反应液包括：SAPE(链霉亲和素-R-藻红蛋白，Streptavidin R-PhycoerythrinConjugate)；SAPE可采用商业化产品。
杂交洗液的组分为：Na2HPO40.2～0.6M、NaH2PO425mM～55mM、NaCl 0.15～0.50M、体积浓度为10～30％的Tween20。
检测液的组分为：Na2HPO40.2～0.6M、NaH2PO425mM～55mM、NaCl 0.15～0.50M、体积浓度为10～30％的Tween20、体积浓度为0.2～0.5％的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)。
另外，所述试剂盒还可包括：核酸提取试剂、阳性对照品、阴性对照品、内标和杂交质控品。
其中，所述核酸提取试剂还可包括以下组分：
1)抽提液，其是含异硫氰酸胍、TritonX-100、高氯酸盐、醋酸盐和有机溶剂的水溶液，其中，异硫氰酸胍的浓度为2M～6M，TritonX-100的体积浓度为1％～2％，高氯酸盐的浓度优选为17g/100mL～30g/100mL，醋酸盐的浓度优选为1g/100mL～10g/100mL，有机溶剂的体积浓度优选为40％～60％；
另外，高氯酸盐包括：高氯酸钠；醋酸盐包括：醋酸钠；有机溶剂包括：乙醇；
优选地，抽提液的配制方法为：取100g-200g异硫氰酸胍、3-5ml TritonX-100、200g-300g高氯酸钠、20g-40g醋酸钠溶解于少量纯化水中，然后加入400-600mL无水乙醇，并用纯化水定容至1L即可。
2)洗液A，其是含高氯酸钠、醋酸盐和乙醇的水溶液，其中，高氯酸钠的浓度优选为10g/100mL～30g/100mL，醋酸盐的浓度优选为4g/100mL～15g/100mL，乙醇的体积浓度优选为35％～50％；另外，醋酸盐包括：醋酸钠；
优选地，洗液A的配制方法为：取200g-300g高氯酸钠、40g-60g醋酸钠、溶解于少量纯化水中，然后加入350ml-500ml无水乙醇，并用纯化水定容至1L即可。
3)洗液B，其为体积浓度40％～80％的乙醇；
4)洗脱液，其为10～20mM pH8.0的Tris-HCl。
5)磁珠悬液，可采用商业化产品，如可包括：chemagen公司的顺磁性氧化硅纳米磁珠的悬浮液(磁珠为购自chemagen公司的M-PVA011型号的磁珠，该磁珠可通过纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠)。
所述阳性对照品，其是通过将具有蛋白包被的一段如SEQ ID NO.17所示的RNA片段(即包含丙型肝炎病毒基因片段的假病毒颗粒)放入消毒后的人类丙型肝炎病毒阴性血浆后制成。其中，SEQ ID NO.17：
AGGACCCCCCCUCCCGGGAGAGCCAUAGUGGUCUGCGGAACCGGUGAGUACACCGGAAUUGCCAGGACGACCGGGUCCUUUCUUGGAUCAACCCGCUCAAUGCCUGGAGAUUUGGGCGUGCCCCCGCGAGACUGCUAGCCGAGUAGUGUUGGGUCGCGAA。
阴性对照品，其是由消毒后的人类丙型肝炎病毒阴性血浆制成。
内标，其为包含一段指定片段的质粒制成。内标片段为自主设计，质粒制作外包完成。如所述内标是一种包含SEQ ID NO.18所示序列的质粒，优选包含SEQ ID NO.18所示序列的pUC57质粒。
SEQ ID NO.18：
ACCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTGTGGCTCCACAGGGTGAGGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGT。
杂交质控品，其为一段含QC探针互补序列的单链DNA，即所述杂交质控品是如SEQ IDNO.19所示的单链DNA。另外，该杂交质控品的5’端还可有生物素标记。
SEQ ID NO.19：CCTATCAGGCAGTACCACAAGGCCTTTCGCGACCCAACACT。
另外，本发明还公开了上述试剂盒的使用方法，即利用上述试剂盒检测丙型肝炎病毒基因型别的方法(可利用96孔板进行的检测方法)，包括步骤：
1)样本的核酸提取
利用上述的核酸提取试剂，并按照常规的磁珠法，对样本、上述阳性对照和阴性对照同时进行核酸提取，得到PCR模板，并且上述内标在进行核酸提取之前加入每个样本中，内标的加入量可为5～10μl/样本；
其中，样本包括：血清或者血浆等；
2)扩增试剂配制：
将以下的反应液A、反应液B和酶体系E混合，形成扩增试剂；其中，反应液A、反应液B和酶体系E的体积比可优选为(20～40)：(40～60)：(10～30)，特别优选3：5：2；
反应液A的组分：30～60mM KCl、10～20mM pH8.0-8.5的Tris-HCl缓冲液和10～30mMdNTPs(10～30mM dATP，10～30mM dTTP，10～30mM dCTP，10～30mM dGTP，10～30mMdUTP)；
反应液B：50～100nM的如SEQ ID NO.1所示的引物F1、200～500nM的如SEQ ID NO.2所示的引物R1、100～200nM的如SEQ ID NO.3所示的引物F3、500～1000nM的如SEQ IDNO.4所示的引物R4和20～60mM的MgCl2；
酶体系E：Taq酶3～7U/test(3～7U/次检测)和UNG酶0.1～0.5U/test(0.1～0.5U/次检测)；
3)PCR扩增：将步骤1)中的PCR模板加入步骤2)的扩增试剂进行PCR扩增反应，并且阳性对照品与阴性对照品提取的核酸与样本同时进行PCR扩增反应；
PCR扩增方法包括以下步骤：
Step 1：37℃ 2分钟
Step 2：50℃ 5分钟
Step 3：42℃ 20分钟
Step 4：94℃ 2分钟
Step 5：94℃ 10秒，60℃35秒；50个循环；
Step 6：72℃ 2分钟
Step 7：10℃保存；
其中，对于UNG酶，在开始PCR扩增步骤之前，进行37℃保温2mins，随后50℃保温5mins对UNG酶进行灭活；
4)杂交反应：将与带有编号的磁珠进行偶联后的如SEQ ID NO.5-16所示的探针和上述杂交液混合后(每种磁珠在每个测试中为25～50个)，加入到PCR产物中，放置恒温振荡器上50～60℃、1200～1400rpm进行杂交反应15-30min，同时，杂交质控品参与整个杂交过程，监测杂交的有效性。
5)荧光反应：吸除杂交反应物的上清，将底部的磁珠中加入上述荧光反应液【如，SAPE(购自QIAGEN，稀释浓度至2～8μg/ml)反应液100～200μl】，放入振荡器上振荡反应5-15min；
6)检测：荧光反应产物用上述杂交洗液洗涤后，加入上述检测液，在液相芯片检测仪上进行荧光检测；具体可为：荧光反应产物用洗板机进行条洗，用上述杂交洗液洗板3-6次，冲液量350μl，静置间隔20-60秒每次，洗板结束后加入50～100μl上述检测液，在液相芯片检测仪上进行荧光检测；
7)根据检测反应体系中的荧光信号值来确定丙型肝炎病毒基因型别。
再者，本发明还公开了上述试剂盒的应用，即所述试剂盒用于检测以下的丙型肝炎病毒基因型别；
型别包括：1a、1b、2a、2b、3a、3b、4、5和6。
本发明基于多重PCR技术和Applied Bio-Code平台，可配合半自动化/自动化仪器设备来进行样品预处理，核酸提取、扩增、杂交、检测等步骤，用于人血清和血浆中丙型肝炎病毒基因分型的定性检测。本发明对血清/血浆样本中丙型肝炎病毒基因分型检测主要通过核酸提取、反转录PCR扩增、探针杂交、荧光检测等过程完成。
试剂盒采用磁珠提取法用于HCV核酸提取，该法运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在高浓度胍盐的作用下，使血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的细胞裂解，然后向裂解液中加入磁珠，当溶液的PH值小于6.5时，磁珠选择性的与提取的DNA/RNA结合，此时将吸附有DNA/RNA的磁珠置于磁场中，通过缓冲液去除没有被吸附的杂质(蛋白等)，然后将磁珠置于PH值8.5的缓冲液中，纯化的DNA/RNA即可进入缓冲液中，然后用于作为后续PCR扩增的模板。磁珠法提取核酸既可以保证较高的核酸提取效率，同时有利于HCV核酸检测过程自动化的实行。
经过提取后的病原体核酸和内对照同时反转录和PCR扩增HCV病毒核酸两段基因型特异性区域(5‘非编码区(引物F1/R1)与NS5b区(引物F2/R2))，增加了分型的准确性。
经过一步法RT-PCR得到的扩增产物与固定在带编码磁珠上的已知序列的单链核酸探针进行杂交。与探针杂交成功的PCR产物通过自身末端所带的生物素biotin与后加入的链霉亲和素-藻红蛋白SAPE结合产生荧光信号。将磁珠洗涤后在Applied Biocode 1000A荧光分析平台上读取磁珠的编码及磁珠上因与DNA杂交产生的荧光信号来判断与何种探针结合，从而进行HCV分型。
本发明利用微编码磁珠为基础的液相芯片技术作为技术平台(即将以微编码磁珠为载体的液相芯片技术应用于HCV基因分型检测中)，综合HCV在全球范围内主要感染型别进行试剂盒的开发，实现了在一孔的反应中同时进行9种HCV基因型别(1a、1b、2a、2b、3a、3b、4、5、6)的鉴别，是市场上现有的除测序法之外鉴别型别最多的技术平台(检测的9种型别可覆盖〉97％的感染人群)，同时最低检测浓度低于测序法检测浓度，大大的提高了检测的灵敏度。且对目前存在的内源外源干扰物质有优异的抗干扰能力。且对样本的需求量低于其他检测手段。可以实现多达96份样本的同时检测。对于丙肝病人的治疗起到一定的辅助作用。同时，本发明中选择了两段基因片段用来对HCV进行分型，有效提高的分型的准确度。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、特征、所能实现的目的及效果，以下通过具体实施例对本发明进行详细的说明。
另外，以下实施例中涉及的试剂如未特别说明，则为商业化产品。
本实施例中提供了一种丙型肝炎病毒核酸分型检测试剂盒，可以对目前97％以上的丙型肝炎病毒进行分型检测，具体包含9种型别：1a，1b，2a，2b，3a，3b，4，5，6。该试剂盒可用于丙型肝炎病毒感染者的辅助诊断及治疗参考。
一、试剂盒组成
1、A盒：储存于2-8℃。
表3A盒核酸提取试剂盒
| 序号 | DNA/RNA提取试剂 | 规格 | 数量 |
| 1 | 抽提液 | 24mL | 1瓶 |
| 2 | 磁珠悬液 | 450μL | 1管 |
| 3 | 洗液A | 24mL | 1瓶 |
| 4 | 洗液B(体积浓度60％的乙醇) | 24mL | 1瓶 |
| 5 | 洗脱液(15mM pH8.0的Tris-HCl) | 2.4mL | 1瓶 |
| 6 | 使用说明书 | 1份 |
其中，抽提液是含异硫氰酸胍4M、TritonX-100(体积浓度为1.5％)、高氯酸钠17g/100mL、醋酸钠1g/100mL和乙醇(体积浓度为50％)的水溶液。
磁珠悬液，采用商业化产品，为chemagen公司的顺磁性氧化硅纳米磁珠的悬浮液(磁珠为购自chemagen公司的M-PVA011型号的磁珠，该磁珠可通过纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠)。
洗液A是含高氯酸钠、醋酸钠和乙醇的水溶液，其中，高氯酸钠的浓度20g/100mL，醋酸钠的浓度为4g/100mL，乙醇的体积浓度为50％。
2、B盒：储存于-18℃。
表4B盒核酸扩增试剂盒
上述核酸扩增试剂中，各溶液的组分配制如下：
反应液A，其组分为：15mM Tris-HCl pH8.3、30mM KCl和dNTPs(20mM dATP,20mMdTTP,20mM dCTP,20mM dGTP,20mM dUTP)。
反应液B，其组分为：SEQ ID NO.1所示的引物F1(50nM)、SEQ ID NO.2所示的引物R1(200nM)、SEQ ID NO.3所示的引物F3(100nM)、SEQ ID NO.4所示的引物R4(500nM)和MgCl2(40mM)；其中，引物F1与R1用于HCV 5‘端非编码序列的扩增，引物F2与R2用于HCV NS5b片段的扩增。另外，SEQ ID NO.1-4所示引物的5’端还连接有生物素。
酶体系E，其组分为：Taq酶7U/次检测和UNG酶0.5U/次检测。
阳性对照品，其是通过将具有蛋白包被的一段如SEQ ID NO.17所示的RNA片段(即包含丙型肝炎病毒基因片段的假病毒颗粒)放入消毒后的人类丙型肝炎病毒阴性血浆后制成。浓度在105IU/ml。其中，假病毒颗粒制作外包完成。
阴性对照品：由消毒后的人类丙型肝炎病毒阴性血浆制成。
内标：包含SEQ ID NO.18所示序列的pUC57质粒(质粒制作外包完成)。质粒制作外包完成。
3、C盒:储存于2-8℃。
表5C盒
上述一些组分的配制如下：
杂交质控品：如SEQ ID NO.19所示的单链DNA。该杂交质控品的5’端还可有生物素标记。
杂交洗液的组分为：Na2HPO40.4M、NaH2PO440mM、NaCl 0.15M、体积浓度为15％的Tween20。
检测液的组分为：Na2HPO40.4M、NaH2PO440mM、NaCl 0.15M、体积浓度为15％的Tween20、体积浓度为0.3％的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)。
磁珠杂交液的组分为：TMAC(四甲基氯化铵，购自SIGMA公司，品号：T3411-500ML)3M、Tris-HCl 40mM pH8、Sarkosyl(N-月桂酰肌氨酸钠，购自SIGMA公司，品号：L5125-100G)0.5g/100ml、EDTA 6mM。同时，该磁珠杂交液包含与SEQ ID NO.5-16所示的探针进行偶联后的12种磁珠。每种磁珠为1800个左右。其中，该与SEQ ID NO.5-16所示的探针进行偶联后的12种磁珠的制备工艺如下：
A.将12种250k浓度磁珠(编码为76～87)1ml转移到1.5ml低吸附离心管中，3000rpm离心1分钟。放置于离心管专用磁板架上，缓慢将上清液完全吸出。将磁珠留于管底部。其中，磁珠购自美国公司Applied Biocode(货号：44-B-0102)；
B.取400μl MEST溶液分别加入每管中，震荡混匀，3000rpm离心1分钟，放置于离心管专用磁板架上，缓慢将上清液完全吸出。将磁珠留于管底部。
其中，MEST溶液是含体积浓度为0.05％Tween20的100mM pH5的MES溶液；
C.重复步骤B一次。
D.加入125μl超纯水、75μl 4×MEST溶液(400mM MES pH5、0.20％Tween20)，分别对应每种磁珠加入10μl SEQ ID NO.5-16所示的探针，对照表格如下：
表6
| 磁珠编码 | 76 | 77 | 78 | 79 | 80 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 |
| 探针 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 | P8 | P9 | P10 | QC | IC |
其中，所述SEQ ID NO.5-16所示探针的5’端标记有amino-C6。
另外，探针浓度可为80μM。
E.将1管EDC(N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺，10mg，购自SIGMA公司)从-18℃新鲜取出，加入1ml冷的上述MEST溶液(2～8℃)，震荡混匀后迅速取60μl加入到每个磁珠管中。震荡后，放入恒温震荡仪中，室温震荡1400rpm，30分钟。
F.重复步骤E一次。
G.将800μl TNT溶液加入磁珠管中。震荡混匀。3000rpm离心1分钟，放置于离心管专用磁板架上，缓慢将上清液完全吸出。将磁珠留于管底部。
其中，TNT溶液是含50mM Tris-HCl、0.2M NaCl、0.05％Tween 20的溶液；
H.重复步骤G一次。
I.将800μl浓度为1g/100ml的SDS加入磁珠管中。缓慢滚动混匀，尽量避免气泡的产生。3000rpm离心1分钟，放置于离心管专用磁板架上，缓慢将上清液完全吸出。将磁珠留于管底部。
J.重复步骤G一次。用上述TNT溶液洗涤磁珠。
K.加入1.5ml TE溶液，2～8℃保存，备用。磁珠制备完成。其中，TE溶液是含有30mM Tris-HCl和5mM EDTA的pH7～8的溶液。
二、结果分析：
结果分析由HCV genotyping配套软件(苏州新波生物技术有限公司)完成。各个探针的cutoff值已设置在分析软件中。其中，该软件可以自动读取Applied Biocode平台结果进行分析，对HCV样本直接给出分型结果。
上述试剂盒采用PCR联合液相芯片技术，能同时检测血液样本中9种丙型肝炎病毒(1a，1b，2a，2b，3a，3b，4，5，6)。
以下实施例中使用上述试剂盒做性能指标测试。
一、样本准备
1、采样
上述试剂盒可对血清/血浆中的HCV进行检测。医护人员用专业的采血设备进行血样采集。保存在采血管中。
2、标本保存
样本采集后，须尽快送检测试。标本室温保存不超过2小时；4℃保存不超过24小时；-20℃保存不超过两个月；如样本需长期保存，应放置于-70℃以下环境保存，需避免反复冻融样本。
3、标本运输
在运输过程中需保证冷链运输。
二、检验方法
1、上述试剂盒采用常规的磁珠法对HCV核酸进行提取。
本实例用Ezbeads核酸提取仪为例进行说明。
1.1实验前准备
A.将核酸提取试剂、对照品取出，平衡至室温并漩涡震荡混匀。
B.在样本制备用96孔深孔反应盘中预分装下列试剂：
表7
| 孔位 | 试剂 |
| A1～H1、A7～H7 | 无 |
| A2～H2、A8～H8 | 结合液600μl+磁珠悬液15μl |
| A3～H3、A9～H9 | 洗液A 800μl |
| A4～H4、A10～H10 | 洗液B 800μl |
| A5～H5、A11～H11 | 无 |
| A6～H6、A12～H12 | 洗脱液150μl |
1.2待测样本核酸提取过程
A、取待测样本(血清或血浆)以及试剂盒中的阴性对照，阳性对照各300μL分别加入到预分装试剂的反应盘A2～H2或A8～H8孔中。每块反应盘可处理16个样本。每台仪器可同时放入2个反应盘处理32个样本。
B、将金属条对准反应盘的A6～H6及A12～H12列底部，并将反应盘及金属条固定于EZbead System-32核酸提取仪上，进行核酸提取(提取程序见表8)。
表8提取程序
C、待程序结束后，取下反应盘，吸取洗脱液进行PCR扩增反应。如果提取的样本当天不进行扩增，则要放-18℃以下保存)。
2、核酸扩增
2.1HCV反应混合液配制：
根据待测样本的数量，按照下列比例配制HCV反应混合液。
表9 HCV反应混合液
| HCV反应混合液 | 单份测定用量 |
| 反应液A | 3μl |
| 反应液B | 5μl |
| 酶体系E | 2μl |
| 总计 | 10μl |
注：配制HCV反应混合液时，请计算阴阳性对照的数量。
配制的HCV反应混合液需振荡混匀，离心20秒去除气泡后再分装到PCR扩增用反应管中。
2.2HCV扩增参数：
A、在PCR扩增用反应管中分装10μl HCV反应混合液(PCR扩增用反应管推荐使用Axygen0.2ml平盖八联管，Cat No：管PCR-0208-C、盖PCR-2CP-RT-C)；
B、取制备好的样品15μl到加入上述PCR扩增反应管中，盖上盖子，轻微震荡混匀，离心20秒去除气泡；
C、将PCR扩增用反应管放到PCR荧光仪上进行扩增；
D、循环条件设置：
Step 1：37℃ 2分钟
Step 2：50℃ 5分钟
Step 3：42℃ 20分钟
Step 4：94℃ 2分钟
Step 5：(94℃ 10秒；60℃35秒)×50个循环
Step 6：72℃ 2分钟
Step 7：10℃ 保存
3.探针杂交及结果读取
3.1将含有探针磁珠的杂交液充分混匀，使磁珠均匀悬浮在杂交液中，将20μL杂交液分别加入到扩增结束的PCR反应管中，放入恒温震荡器中，50℃15分钟。
3.2将100μL已稀释好的洗液C加入到PCR反应管中，与管中液体充分混合后全部移入96孔微孔板中。将96孔微孔板放置在磁板架上，静置1分钟后，缓慢将液体吸出，磁珠留在孔底。
3.3将SAPE在洗液C中稀释250倍后，取100μL加入每个留有磁珠的微孔板中。在振荡器上震荡5分钟。
3.4将96孔板移至带磁板洗板机上，选择条洗模式，洗板5次，冲液量350μL，静置间隔40秒每次。
3.5洗板结束后，每孔加入100μL检测液，放入Applied Biocode(ABC)信号读取仪读取荧光信号。(如有气泡，需将气泡去除后再放入信号读取仪)
三、结果判定
1、结果分析由HCV genotyping配套软件完成。各个探针的cutoff值已设置在分析软件中。
2、常见结果判定规则如下：
表10探针对HCV分型的判别
注：X表示对应的探针显示阳性结果。
IC信号在阳性样本中，信号值可以忽略。
当只有QC、IC为阳性时，说明样品中存在HCV RNA。
实施例1使用上述试剂盒检测临床样本中的HCV感染情况
用上述试剂盒对100例阳性临床样本进行检测，所有样本均采用金标准测序法进行验证，检测结果和分析结果见下表。
表11本发明检测结果与金标准对比
| 样本ID | 分型结果 | 测序结果 |
| 1 | 1b | 1b |
| 2 | 1b | 1b |
| 3 | 1b | 1b |
| 4 | 1b | 1b |
| 5 | 1b | 1b |
| 6 | 1b | 1b |
| 7 | 1b | 1b |
| 8 | 2a | 2a |
| 9 | 2a | 2a |
| 10 | 1b | 1b |
| 11 | 2a | 2a |
| 12 | 2a | 2a |
| 13 | 1b | 1b |
| 14 | 1b | 1b |
| 15 | 1b | 1b |
| 16 | 1b | 1b |
| 17 | 1b | 1b |
| 18 | 1b | 1b |
| 19 | 1b | 1b |
| 20 | 1b | 1b |
| 21 | 1b | 1b |
| 22 | 3a | 3a |
| 23 | 6 | 6 |
| 24 | 6 | 6 |
| 25 | 6 | 6 |
| 26 | 3a | 3a |
| 27 | 3a | 3a |
| 28 | 3a | 3a |
| 29 | 2a | 2a |
| 30 | 2a | 2a |
| 31 | 2a | 2a |
| 32 | 1b | 1b |
| 33 | 3b | 3b |
| 34 | 3b | 3b |
| 35 | 1b | 1b |
| 36 | 2a | 2a |
| 37 | 2a | 2a |
| 38 | 1b | 1b |
| 39 | 1b | 1b |
| 40 | 1b | 1b |
| 41 | 2a | 2a |
| 42 | 2a | 2a |
| 43 | 1b | 1b |
| 44 | 1b | 1b |
| 45 | 1b | 1b |
| 46 | 2a | 2a |
| 47 | 2a | 2a |
| 48 | 2a | 2a |
| 49 | 2a | 2a |
| 50 | 1b | 1b |
| 51 | 1b | 1b |
| 52 | 1b | 1b |
| 53 | 1b | 1b |
| 54 | 1b | 1b |
| 55 | 1b | 1b |
| 56 | 1b | 1b |
| 57 | 1b | 1b |
| 58 | 1b | 1b |
| 59 | 1b | 1b |
| 60 | 1b | 1b |
| 61 | 6 | 6 |
| 62 | 3a | 3a |
| 63 | 3a | 3a |
| 64 | 3a | 3a |
| 65 | 3a | 3a |
| 66 | 3a | 3a |
| 67 | 3a | 3a |
| 68 | 1b | 1b |
| 69 | 1b | 1b |
| 70 | 1b | 1b |
| 71 | 1b | 1b |
| 72 | 2a | 2a |
| 73 | 2a | 2a |
| 74 | 2a | 2a |
| 75 | 2a | 2a |
| 76 | 2a | 2a |
| 77 | 1b/2a | 1b |
| 78 | 1b | 1b |
| 79 | 1b | 1b |
| 80 | 1b/2a | 1b |
| 81 | 1b | 1b |
| 82 | 1b | 1b |
| 83 | 2a | 2a |
| 84 | 2a | 2a |
| 85 | 3a | 3a |
| 86 | 3a | 3a |
| 87 | 3a | 3a |
| 88 | 3a | 3a |
| 89 | 3a | 3a |
| 90 | 3a | 3a |
| 91 | 3a | 3a |
| 92 | 3b | 3b |
| 93 | 3b | 3b |
| 94 | 3b | 3b |
| 95 | 3b | 3b |
| 96 | 3b | 3b |
| 97 | 3b | 3b |
| 98 | 6 | 6 |
| 99 | 6 | 6 |
| 100 | 6 | 6 |
上述试剂盒检测结果与测序结果对比结果一致。上述试剂盒对100例阳性临床样本进行检测，对于检测范围之内的HCV型别(1a，1b，2a，2b，3a，3b，4，5，6)具有较好的检测能力，对于阴性样本检测100份，上述试剂盒的检测结果为阴性，阴性符合率100％，特异性较高。出现两例混合感染样本，本发明检测出混合型别，测序法检测为单型别，视为结果一致。
综上所述，本实施例中的试剂盒的性能指标如下：
1)检测限度：500IU/ml。
2)检测型别：1a、1b、2a、2b、3a、3b、4、5、6型。
3)干扰试验：本品检测不受样本中甘油三酯(5mg/ml)、血红蛋白(0.5mg/ml)、胆红素(30mg/ml)的影响。
4)交叉反应试验：本品检测不受标本中巨细胞病毒、EB病毒带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒I，II型、乙肝病毒、HIV-2型病毒的影响。
5)标本类型试验：本品对血清、EDTA抗凝血浆、枸橼酸钠抗凝血浆三种类型的标本具有一致的检测效率。
6)抗病毒药物：本品检测不受标本中抗病毒药物(齐多夫定、利巴韦林等)的影响。
7)自身抗体：本品检测不受标本中ANA(抗核抗体)、AMA(抗线粒体抗体)等自身免疫性抗体的影响。
此外，对于上述试剂盒，本发明还进行了以下的实验：
1)上述试剂盒与市场上已有的类似产品进行对比
将各产品的测试原理及可进行的分型对象进行比较。其中，每种产品可检测类型信息来自各产品的说明书。
结果如表12所示，表明目前市场上的已有产品可分型类型都少于本发明的试剂盒。
表12
| 厂家编号 | 方法学 | 可检测型别 |
| 1 | Real-Time PCR | HCV 1a,1b,1,2,3,4,5,6 |
| 2 | Real-Time PCR | HCV genotype 1and Non-1 |
| 3 | PCR-dot hybridization | HCV 1b、2a、3a、3b、6a |
| 4 | PCR-dot hybridization | HCV1b、2a、3a、3b、6a |
| 5 | Real-Time PCR | HCV 1b、2a、3a、3b、6a |
| 本发明的上述试剂盒 | PCR-Liquid microassay | HCV1a，1b，2a，2b，3a，3b，4，5，6 |
2)上述试剂盒与金标准(测序法)对临床样本检测结果比较
本发明的上述试剂盒与金标准(测序法)对临床样本检测结果比较的总结如表13所示，可见本发明的分型效果与基因测序法相比，有极高的一致性。不同型别都在97％以上的符合率。
其中，比较的具体方法如下：
收集HCV阳性的临床样本，每份样本都用上述试剂盒描述的方式进行核酸提取，核酸扩增。核酸扩增后的产物一份寄去测序公司进行测序，一份用于本试剂盒杂交反应进行分型。测序后的结果输入NCBI网站中用nucleotide BLAST与基因库中的基因序列进行比对(网站链接：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)，找到与序列最相近的HCV型别作为测序得到的HCV型别结果。测序的结果视为HCV基因分型的金标准，用来与本发明中的检测方法进行比对。
表13
其中，表13中的“本发明的上述试剂盒测出的份数”是指用上述试剂盒进行分型后得到与测序结果一致的样本数量，“符合率”是指上述试剂盒测出结果份数与测序结果份数相除得到的百分数。
3)各种不同型别样本及对照、质控品在本发明的上述试剂盒中的测试
具体试验方法：取HCV 9种基因型别的样本各一份，再取一份已知HCV阴性样本和一份定制的杂交质控，同时按照上述试剂盒所述方法进行核酸提取，核酸扩增，核酸杂交步骤之后，得到的不同探针的荧光信号。每一份样本得到12个探针的荧光信号，根据荧光信号的高低进行分型判别，可由人工完成也可由HCV基因分型配套软件进行分型。当荧光信号低于300时，为阴性结果。当荧光信号高于300时，视为阳性信号。不同型别的丙型肝炎病毒出现质控信号，内标信号和对应的型别探针信号。阴性质控结果只有内标信号。杂交质控结果为质控信号升高。
结果如表14所示，其表明探针所针对的型别如上述表2所示。
表14荧光信号值
Claims (10)
1.一种丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒，其特征在于，包括：核酸扩增试剂和杂交试剂；
其中，所述核酸扩增试剂包括：如SEQ ID NO.1-4所示的引物；
杂交试剂包括：如SEQ ID NO.5-16所示的探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述SEQ ID NO.1-4所示引物的5’端还连接有生物素；
所述SEQ ID NO.5-16所示探针的5’端标记有amino-C6；
所述杂交试剂包括：与带有编号的磁珠进行偶联后的如SEQ ID NO.5-16所示的探针。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述与带有编号的磁珠进行偶联后的如SEQ ID NO.5-16所示的探针，其制备方法包括以下步骤：
A.将12种带编号的磁珠溶液转移到各自的管中，离心，去除上清液；
B.取MEST溶液分别加入每管中，离心，去除上清液；
其中，MEST溶液是含体积浓度为0.01％-0.05％的Tween20和50mM～100mM pH5～7的2-吗啉乙磺酸的混合溶液；
C.重复步骤B一次；
D.加入水、4×MEST溶液，并且分别对应每种磁珠加入如SEQ ID NO.5-16所示的探针；
E.配制含10mg/ml～5mg/ml N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺的MEST溶液，将其加入到每个磁珠管中，震荡；
F.重复步骤E一次；
G.将TNT溶液加入磁珠管中，震荡混匀，离心，去除上清液；
其中，TNT溶液是含25～50mM Tris-HCl、0.05～0.2M NaCl、0.01～0.05vol％Tween 20的溶液；
H.重复步骤G一次；
I.将浓度为1g/100ml～5g/100ml的SDS溶液加入磁珠管中，离心，去除上清液；
J.重复步骤G一次，用上述TNT溶液洗涤磁珠；
K.加入TE溶液，得到与带有编号的磁珠进行偶联后的探针；其中，TE溶液是含有10～30mM Tris-HCl和1～5mM EDTA的pH7～8的溶液。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述步骤A中，磁珠溶液的浓度为250K个磁珠/ml；
步骤D中，探针浓度为50～100μM。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸扩增试剂还包括：KCl、Tris-HCl缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和MgCl2；
所述杂交试剂还包括：杂交液、荧光反应液、杂交洗液和检测液；
其中，杂交液的组分为：四甲基氯化铵2～5M、Tris-HCl 20～60mM pH8、N-月桂酰肌氨酸钠0.1g/100ml～0.5g/100ml、EDTA 4～8mM。
荧光反应液包括：链霉亲和素-R-藻红蛋白SAPE；
杂交洗液的组分为：Na2HPO40.2～0.6M、NaH2PO425mM～55mM、NaCl 0.15～0.50M、体积浓度为10～30％的Tween20；
检测液的组分为：Na2HPO40.2～0.6M、NaH2PO425mM～55mM、NaCl 0.15～0.50M、体积浓度为10～30％的Tween20、体积浓度为0.2～0.5％的Triton X-100。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：核酸提取试剂、阳性对照品、阴性对照品、内标和杂交质控品。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品是通过将具有蛋白包被的一段如SEQ ID NO.17所示的RNA片段放入消毒后的人类丙型肝炎病毒阴性血浆后制成；
阴性对照品，其是由消毒后的人类丙型肝炎病毒阴性血浆制成；
内标，是一种包含SEQ ID NO.18所示序列的质粒；
杂交质控品，是如SEQ ID NO.19所示的单链DNA；
所述核酸提取试剂还包括以下组分：
1)抽提液，其是含异硫氰酸胍、TritonX-100、高氯酸盐、醋酸盐和有机溶剂的水溶液，其中，异硫氰酸胍的浓度为2M～6M，TritonX-100的体积浓度为1％～2％，高氯酸盐的浓度为17g/100mL～30g/100mL，醋酸盐的浓度为1g/100mL～10g/100mL，有机溶剂的体积浓度为40％～60％；高氯酸盐包括：高氯酸钠；醋酸盐包括：醋酸钠；有机溶剂包括：乙醇；
2)洗液A，其是含高氯酸钠、醋酸盐和乙醇的水溶液，其中，高氯酸钠的浓度为10g/100mL～30g/100mL，醋酸盐的浓度为4g/100mL～15g/100mL，乙醇的体积浓度为35％～50％；醋酸盐包括：醋酸钠；
3)洗液B，其为体积浓度40％～80％的乙醇；
4)洗脱液，其为10～20mM pH8.0的Tris-HCl。
5)磁珠悬液。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述内标，是一种包含SEQ ID NO.18所示序列的pUC57质粒；
所述杂交质控品的5’端还有生物素标记。
9.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括步骤：
1)样本的核酸提取
利用权利要求6所述的核酸提取试剂，并按照磁珠法，对样本、阳性对照和阴性对照同时进行核酸提取，得到PCR模板，并且上述内标在进行核酸提取之前加入每个样本中；
其中，样本包括：血清或者血浆；
2)扩增试剂配制：
将以下的反应液A、反应液B和酶体系E混合，形成扩增试剂；其中，反应液A、反应液B和酶体系E的体积比为20～40：40～60：10～30；
反应液A的组分：30～60mM KCl、10～20mM pH8.0-8.5的Tris-HCl缓冲液和10～30mMdNTPs；
反应液B：50～100nM的如SEQ ID NO.1所示的引物F1、200～500nM的如SEQ ID NO.2所示的引物R1、100～200nM的如SEQ ID NO.3所示的引物F3、500～1000nM的如SEQ IDNO.4所示的引物R4和20～60mM的MgCl2；
酶体系E：Taq酶3～7U/次检测和UNG酶0.1～0.5U/次检测；
3)PCR扩增：将步骤1)中的PCR模板加入步骤2)的扩增试剂进行PCR扩增反应，并且阳性对照品与阴性对照品提取的核酸与样本同时进行PCR扩增反应；
PCR扩增方法包括以下步骤：
Step 1：37℃2分钟
Step 2：50℃5分钟
Step 3：42℃20分钟
Step 4：94℃2分钟
Step 5：94℃10秒，60℃35秒；50个循环；
Step 6：72℃2分钟
Step 7：10℃保存；
其中，对于UNG酶，在开始PCR扩增步骤之前，进行37℃保温2mins，随后50℃保温5mins对UNG酶进行灭活；
4)杂交反应：将与带有编号的磁珠进行偶联后的如SEQ ID NO.5-16所示的探针和权利要求5所述的杂交液混合后，加入到PCR产物中，50～60℃、1200～1400rpm进行杂交反应15-30min，同时，杂交质控品参与整个杂交过程；
5)荧光反应：吸除杂交反应物的上清，将底部的磁珠中加入权利要求5所述的荧光反应液，振荡反应5-15min；
6)检测：荧光反应产物用权利要求5所述的杂交洗液洗涤后，加入权利要求5所述的检测液，在液相芯片检测仪上进行荧光检测；
7)根据检测反应体系中的荧光信号值来确定丙型肝炎病毒基因型别。
10.一种如权利要求1～8中的任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒用于检测以下的丙型肝炎病毒基因型别；
型别包括：1a、1b、2a、2b、3a、3b、4、5和6。
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