CN109207472A

CN109207472A - Dna病毒核酸提取试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN109207472A
Application number: CN201710547681.7A
Authority: CN
Inventors: 方琴; 蒋淼
Original assignee: SHANGHAI KEHUA BIOENGINEERING CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI KEHUA BIOENGINEERING CO Ltd
Priority date: 2017-07-06
Filing date: 2017-07-06
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2037-07-06
Also published as: CN109207472B

Abstract

本发明公开了一种DNA核酸提取试剂盒以及利用所述试剂盒进行DNA核酸提取的方法。所述试剂盒装有裂解液、洗涤液、去抑制剂和硅胶膜吸附柱，其中所述裂解液包含异硫酸氰胍、柠檬酸钠、表面活性剂和乙醇。利用本发明的DNA核酸提取试剂盒在样品裂解后无需再加入乙醇，进而实现在吸附转柱后进行一步洗涤，不但减少了操作步骤，同时提取产物性能表现良好，获得了双重益处。

Description

DNA病毒核酸提取试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及医学检测和诊断领域。具体地说，本发明涉及一种新型的DNA病毒核酸提取方法以及用于该方法的DNA病毒核酸提取试剂盒。

背景技术

核酸提取纯化是下游核酸检测、生物学研究或新产品开发的基础，获得的核酸的质量和完整性直接影响检测的结果。经典的核酸提取纯化方法有酚-氯仿提取法，碱裂解法，溴化十六烷基三甲铵(CTAB)提取法等。但是这些方法存在操作繁琐，耗时，提取微量核酸效果欠佳。

随着技术的发展，目前广泛应用的为硅吸附法，硅胶膜吸附柱离心法为其中一种。然而，该方法需要离心，不便于自动化仪器操作，多为手工法或负压法半自动化完成核酸的提取纯化过程。其步骤一般分为裂解，加入乙醇混匀，转柱吸附，两到三步洗涤，离心干燥，洗脱。具体地说，该方法在操作时先对样本使用裂解液和去抑制剂进行消解，完成后开盖加入一定量的乙醇，混合液转硅胶膜吸附柱，进行核酸与柱的结合，再进行2～3步的洗涤。因此，该方法存在操作步骤繁琐等缺陷。

因此，本领域急需高效、快速、提取产物性能良好的核酸提取方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核酸提取方法以及用于该方法的核酸提取试剂盒，所述方法具备高效、快速、提取产物性能良好等优点。

在第一方面，本发明提供一种DNA核酸提取试剂盒，所述试剂盒装有裂解液、洗涤液、去抑制剂和硅胶膜吸附柱，其中所述裂解液包含异硫酸氰胍、柠檬酸钠、表面活性剂和乙醇。

在具体的实施方式中，所述裂解液中乙醇的浓度为7-15％；优选地，所述裂解液中乙醇的浓度为11％。

在具体的实施方式中，所述裂解液包含50％的异硫酸氰胍、1％的柠檬酸钠、10％的Triton-100和11％的乙醇。

在优选的实施方式中，所述DNA核酸是DNA病毒核酸；包括但不限于乙型肝炎病毒、人细小病毒B19。

在优选的实施方式中，所述表面活性剂包括但不限于：NP40、Triton 100、Tween20；优选地，所述表面活性剂是Triton 100。

在优选的实施方式中，所述去抑制剂含有8～12mg/ml的蛋白酶K。

在优选的实施方式中，所述洗涤液包含氯化钠、pH 7.0～8.5的Tris-HCl缓冲液和乙醇。

在第二方面，本发明提供一种进行DNA核酸提取的方法，所述方法包括利用本发明第一方面所述的DNA核酸提取试剂盒提取待测样品中的DNA核酸。

在具体的实施方式中，所述方法包括以下步骤：

1)向待测样品中加入去抑制剂，然后加入裂解液；

2)将步骤1)所得的混合液在56℃干浴10分钟，转入硅胶膜吸附柱中，离心，并弃去废液；

3)向所述硅胶膜吸附柱中加入洗涤液，离心，并弃去废液；

4)将所述硅胶膜吸附柱转入新的收集管，并离心；

5)将硅胶膜吸附柱转入新的收集管，将超纯水加在柱面中央，并静置；和

6)离心所述硅胶膜吸附柱，收集滤液，从而获得DNA核酸提取产物。

在优选的实施方式中，所述方法不限于诊断目的。

在第三方面，本发明提供本发明第一方面所述的DNA核酸提取试剂盒在提取待测样品中的DNA核酸中的用途。

在优选的实施方式中，所述用途不限于诊断目的。

在第四方面，本发明提供一种用于DNA核酸提取试剂盒中的裂解液，其中所述裂解液包含异硫酸氰胍、柠檬酸钠、表面活性剂和乙醇。

在第五方面，本发明提供本发明度四方面所述的裂解液在制备用于DNA核酸提取试剂盒中的用途。

在第六方面，本发明提供一种DNA核酸提取试剂盒的制备方法，所述方法包括将本发明第四方面所述的裂解液与洗涤液、去抑制剂和硅胶膜吸附柱制备成DNA核酸提取试剂盒的步骤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了对实施例2所述的提取乙型肝炎病毒线性样本产物应用荧光PCR法扩增的检测结果。

图2显示了对实施例3所述的提取乙型肝炎病毒25IU/mL浓度样本产物应用荧光PCR法扩增的检测结果。

图3显示了实施例4所述的提取乙型肝炎病毒50IU/mL浓度样本产物应用荧光PCR法扩增的检测结果。

图4显示了实施例4中所述的提取乙型肝炎病毒5.0E+04IU/mL浓度样本产物应用荧光PCR法扩增的检测结果。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现在提取病毒核酸的硅胶膜吸附柱离心法过程中，可以将乙醇直接作为裂解液的组分，从而在裂解后无需再加入乙醇，进而实现一步洗涤。如此不但减少了操作步骤，同时提取产物性能表现良好，获得了双重益处。在此基础上完成了本发明。

在现有技术中，一般使用硅胶性质的柱膜提取核酸，具体操作中需要额外加入一定体积的乙醇以增强溶液的疏水作用，从而使得核酸充分紧密地结合于载体。但该方法需要在转柱吸附后再进行2～3步的洗涤，因此操作步骤繁琐。

为解决该缺陷，本发明提供一种快速提取DNA核酸的试剂盒和操作方法，其裂解后无需再加入乙醇，直接转柱，并可只进行一步洗涤，从而减少了实验操作步骤，同时提取产物性能良好。

具体地说，本发明提供了这样一种DNA核酸提取试剂盒，所述试剂盒装有裂解液，所述裂解液包含异硫酸氰胍、柠檬酸钠、表面活性剂和乙醇。

进一步地，申请人发现上述DNA核酸提取试剂盒的裂解液中，乙醇的浓度需要在合适范围以实现本发明的目的。在具体的实施方式中，乙醇的浓度为7-15％；在优选的实施方式中，乙醇的浓度为11％；在最优选的实施方式中，所述裂解液包含50％的异硫酸氰胍、1％的柠檬酸钠、10％的Triton-100和11％的乙醇。

在本发明的DNA核酸提取试剂盒中，还装有洗涤液、去抑制剂和硅胶膜吸附柱。在具体的实施方式中，所述表面活性剂包括但不限于：NP40、Triton 100、Tween 20；优选地，所述表面活性剂是Triton 100。在具体的实施方式中，所述去抑制剂是8～12mg/ml的蛋白酶K溶液。在具体的实施方式中，所述洗涤液包含氯化钠、pH 7.0～8.5的Tris-HCl缓冲液和乙醇。

本领域技术人员知晓，本发明的DNA核酸提取试剂盒主要用于提取DNA病毒核酸；所述DNA病毒核酸包括但不限于乙型肝炎病毒、人细小病毒B19。

在本发明的DNA核酸提取试剂盒的基础上，本发明提供了一种利用硅胶膜吸附柱进行高效、快速、性能良好的DNA核酸提取方法，该方法在裂解后无需再加入乙醇，进而可以实现一步洗涤。本发明的DNA核酸提取方法的操作简单，同时提取产物性能良好。

例如，本发明的DNA核酸提取方法可以具体包括以下步骤：

1)在1.5ml的无菌离心管中加入20ul的去抑制剂，加入100ul的样本，加入155ul的裂解液，涡旋震荡混匀充分，56℃干浴10min；

2)将上述混合液静置室温，转入硅胶膜吸附柱中，10000rpm离心1min，弃废液；

3)向硅胶膜吸附柱中加入500ul洗涤液，10000rpm离心1min，弃废液；

4)把硅胶膜吸附柱转入一个新的收集管中，14000rpm离心1min；

5)把硅胶膜吸附柱转入一个新的收集管中，小心将50ul超纯水加在柱面中央，静置1min；

6)10000rpm离心1min，收集滤液，获得DNA核酸提取产物。

本领域技术人员知晓，本发明的DNA核酸提取方法可以用于诊断目的，但不限于诊断目的，例如，可用于科研目的等等。

本发明的优点：

1.本发明的DNA核酸提取方法可以实现高效、快速地提取DNA核酸；

2.本发明的DNA核酸提取方法的操作简便；

3.通过本发明的DNA核酸提取方法得到的提取产物的性能良好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或本领域已知的文献，例如各种教科书中所述的条件；或者按照市售可得仪器或试剂的使用说明书，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.本发明的DNA病毒核酸提取的裂解液、洗涤液、去抑制剂的配制

本发明的DNA病毒核酸提取的裂解液、洗涤液、去抑制剂按照如下所述配方配制。

裂解液为：50％的异硫酸氰胍、1％柠檬酸钠、10％的Triton-100、11％的乙醇；

去抑制剂为：10mg/ml的蛋白酶K溶液；

洗涤液为：10％氯化钠、0.1％pH 7.5的Tris-HCl缓冲液、80％乙醇；

洗脱液：超纯水。

在制得相应的试剂后，将这些试剂与硅胶膜吸附柱(Axygen)制成用于病毒核酸提取的试剂盒。

实施例2.提取待测样本中的DNA病毒(乙型肝炎病毒)以及利用得到的核酸进行荧光PCR检测和结果

本实施例利用实施例1得到的试剂盒来提取待测样本中的DNA病毒(乙型肝炎病毒)，并利用提取得到的核酸进行荧光PCR检测。

首先，本实施例的待测样本为2.0E+07IU/mL(标记为S1)、2.0E+06IU/mL(标记为S2)、2.0E+05IU/mL(标记为S3)、2.0E+04IU/mL(标记为S4)、2.0E+03IU/mL(标记为S5)、2.0E+02IU/mL(标记为S6)、1.0E+02IU/mL(标记为S7)、5.0E+01IU/mL(标记为S8)线性血浆样本(公司内部乙型肝炎病毒定量参考品)。

使用实施例1配制的试剂，利用硅胶膜吸附柱(Axygen)提取乙型肝炎病毒核酸，每个浓度2个重复。提取过程如下所述：

裂解：在1.5ml无核酸酶的离心管中分别加入20ul的去抑制剂、100ul的样本、155ul的裂解液，涡旋震荡15s彻底混匀，瞬时离心，放置56℃干浴10min，瞬时离心，以去除管盖上的液滴；

吸附：将混合液转入套有收集管的硅胶膜吸附柱中，10000rpm离心1min，弃废液；

洗涤：吸取500ul的洗涤液加入硅胶膜吸附柱中，10000rpm离心1min，弃废液；

离心干燥：将硅胶膜吸附柱转至新的收集管上，14000rpm离心1min；

洗脱：把硅胶膜吸附柱转入一个新的收集管中，小心将50ul超纯水加在柱面中央，静置1min，10000rpm离心1min，收集滤液，获得DNA病毒核酸提取产物；

荧光PCR检测：将上述含有核酸的提取产物转移至PCR反应管中，运用荧光PCR检测仪进行核酸的检测。结果见下表1，曲线图见图1。

表1

由表1可知，线性相关系数|r|＝0.999，说明本实施例分离纯化的DNA病毒核酸线性良好。而从图1可以看出，不同浓度下的重复性优异。

实施例3.提取待测样本中的DNA病毒(乙型肝炎病毒)以及利用得到的核酸进行荧光PCR检测和结果

本实施例的待测样本为：购买卫生部临检中心的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)血清标准物质GBW09150(编号：NCCL200208)，研制单位为卫生部临床检验中心，标准值及不确定度为(1.2±0.24)×106IU/mL，稀释到25IU/mL，将其分装为30管用于30次重复实验，提取方法同实施例2。洗脱产物转移至PCR反应管中，运用荧光PCR仪进行检测。

PCR扩增的结果如图2所示，图2的纵坐标为荧光值。从图2可见，扩增结果均为阳性检出。

实施例4.提取待测样本中的DNA病毒(乙型肝炎病毒)以及利用得到的核酸进行荧光PCR检测和结果

本实施例的待测样本为：购买卫生部临检中心的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)血清标准物质GBW09150(编号：NCCL200208)，研制单位为卫生部临床检验中心，标准值及不确定度为(1.2±0.24)×106IU/mL，分别稀释到50IU/mL和5E+04IU/mL，高低浓度使用实施例1试剂盒均进行10个重复的核酸提取，提取方法同实施例2。洗脱产物转移至PCR反应管中，运用荧光PCR仪进行检测，其检测结果见表2。

由表2中的变异系数(CV,％)可知，低浓度(50IU/mL)和高浓度(5.0E+04IU/mL)的CV均＜2％，说明采用实施例1配制的试剂来提取、分离、纯化乙型肝炎病毒核酸的重复性好。图3为50IU/mL乙肝样本重复性曲线图，图4为5E+04IU/mL乙肝样本重复性曲线图。

表2

序号	50IU/mL样本Ct值	5.0E+04IU/mL样本Ct值
			1	34.37	25.35
2	35.57	25.45
			3	35.71	25.44
4	35.64	25.17
			5	35.48	25.33
6	35.97	25.26
			7	35.24	25.26
8	34.98	25.31
			9	35.66	25.39
10	34.60	25.49
			计算获得CV(％)	1.41％	0.39％

实施例5.提取待测样本中的DNA病毒(乙型肝炎病毒)和RNA病毒(丙型肝炎病毒)以及利用得到的核酸进行荧光PCR检测

本实施例利用实施例1得到的试剂盒来提取待测样本中的DNA病毒(乙型肝炎病毒)和RNA病毒(丙型肝炎病毒)的方法，并利用提取得到的核酸进行荧光PCR检测。

本实施例的待测样本为：购买卫生部临检中心的丙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HCVRNA)血清标准物质GBW(E)090115，研制单位为卫生部临床检验中心，标准值为6.7E+03IU/mL，稀释到1.0E+03IU/mL；购买卫生部临检中心的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)血清标准物质GBW09150，研制单位为卫生部临床检验中心，标准值为1.2E+06IU/mL，稀释至1.0E+03IU/mL。

使用实施例1的试剂盒(编号为A)与Roche的High Pure Viral Nucleic Acid Kit(编号为B)同时提取HBV和HCV待测样本，洗脱产物转移至PCR反应管中，运用荧光PCR仪进行检测，比较2种试剂盒的提取效率比较，结果见下表3。

表3

由表3的Ct值差值分析可知，对于DNA类乙型肝炎病毒，本发明的试剂盒的提取效率甚至优于Roche的High Pure Viral Nucleic Acid Kit，但对于RNA类丙型肝炎病毒，结果是相反的。从而说明本发明的试剂盒及其提取方法更适用于DNA类病毒核酸的提取。

对比例1.乙醇浓度和加入的步骤的影响

本发明人本实施例利用实施例1得到的试剂盒来提取待测样本中的DNA病毒(乙型肝炎病毒)的方法，并利用提取得到的核酸进行荧光PCR检测。区别在于乙醇的加入浓度和加入的步骤如下表所示。

对购买卫生部临检中心的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)血清标准物质GBW09150，研制单位为卫生部临床检验中心，标准值为1.2E+06IU/mL，稀释至1.0E+03IU/mL。

结果为见下表。

从结果可以看出，对于采用硅胶膜吸附柱法进行核酸提取而言，乙醇浓度和加入步骤对于结果的影响比较明显，采用常规方式的在裂解完成后加入乙醇、无乙醇加入以及简单混合裂解液与乙醇的效果均比较类似。然而，本发明人出乎意料地发现在裂解液与乙醇混合并将乙醇浓度调整到特定范围内可以产生显著提高检测灵敏度的技术效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种DNA核酸提取试剂盒，所述试剂盒装有裂解液、洗涤液、去抑制剂和硅胶膜吸附柱，其中所述裂解液包含异硫酸氰胍、柠檬酸钠、表面活性剂和乙醇。

2.如权利要求1所述的DNA核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液中乙醇的浓度为7-15％；优选地，所述裂解液中乙醇的浓度为11％。

3.如权利要求1或2所述的DNA核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包含50％的异硫酸氰胍、1％的柠檬酸钠、10％的Triton-100和11％的乙醇。

4.一种进行DNA核酸提取的方法，所述方法包括利用权利要求1-3中任一项所述的DNA核酸提取试剂盒提取待测样品中的DNA核酸。

5.如权利要求4所述的DNA核酸提取的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)向待测样品中加入去抑制剂，然后加入裂解液；

3)向所述硅胶膜吸附柱中加入洗涤液，离心，并弃去废液；

4)将所述硅胶膜吸附柱转入新的收集管，并离心；

6.权利要求1-3中任一项所述的DNA核酸提取试剂盒在提取待测样品中的DNA核酸中的用途。

7.一种用于DNA核酸提取试剂盒中的裂解液，其中所述裂解液包含异硫酸氰胍、柠檬酸钠、表面活性剂和乙醇。

8.如权利要求7所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液中乙醇的浓度为7-15％；优选地，所述裂解液中乙醇的浓度为11％；更优选地，所述裂解液包含50％的异硫酸氰胍、1％的柠檬酸钠、10％的Triton-100和11％的乙醇。

9.如权利要求7或8所述的裂解液在制备用于DNA核酸提取试剂盒中的用途。

10.一种DNA核酸提取试剂盒的制备方法，所述方法包括将权利要求7或8所述的裂解液与洗涤液、去抑制剂和硅胶膜吸附柱制备成DNA核酸提取试剂盒的步骤。