CN110468125A - 一种用于病毒核酸提取的试剂盒及其提取方法 - Google Patents

一种用于病毒核酸提取的试剂盒及其提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于病毒核酸提取的试剂盒及其提取方法，属于核酸提取技术领域，该试剂盒包含裂解液、去蛋白液、促吸附液、洗涤液、洗脱液和纯化柱，裂解液包含3～7mol/L异硫氰酸胍、体积浓度为0.6％～1％TritonX‑100、30～50mmol/L Tris‑HCl和30～50mmol/L尿素，裂解液的pH值为4.3～4.6；另外，本发明还对去蛋白液、促吸附液和洗涤液的组分和含量进行限定，该试剂盒的价格便宜，试剂盒配合提取方法能高效、稳定地提取出病毒核酸。

Description

一种用于病毒核酸提取的试剂盒及其提取方法
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，尤其涉及一种用于小于500μL小量体积病毒样品核酸提取的试剂盒及其提取方法。
背景技术
病毒不仅具有潜在的致病性，而且在分子生物学和生物医学研究中起着重要的作用。分离高纯度、完整的病毒核酸通常是一个挑战，另外，临床病毒样品获取比较困难，大量取样会增加病人的痛苦。传统的病毒核酸纯化方法先采用变性剂、蛋白酶K等裂解溶液释放出核酸，再用苯酚、氯仿萃取，异丙醇沉淀，去除上清后即得到核酸；该方法步骤繁琐，耗时长，提取率低且重复性差。此外，商品化的病毒核酸提取试剂盒的价格都比较昂贵。
因此，针对小量体积的病毒核酸提取，迫切需要开发出一种价格便宜、高效、稳定和简便的提取试剂盒。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种用于病毒核酸提取的试剂盒及其提取方法，该试剂盒的价格便宜，试剂盒配合提取方法能高效、稳定地提取出病毒核酸。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于病毒核酸提取的试剂盒，其包括裂解液、去蛋白液、促吸附液、洗涤液、洗脱液和纯化柱，所述裂解液含有3～7mol/L异硫氰酸胍、体积浓度为0.6％～1.0％TritonX-100、30～50mmol/L Tris-HCl和30～50mmol/L尿素，所述裂解液的pH值为4.3～4.6。
本发明对裂解液的组分和含量进行改进，这种组合无需加热，在常温下就可以保证病毒的完全裂解、释放出病毒核酸，病毒的感染性被消除，并且有利于病毒核酸与柱体的玻璃纤维膜的结合。
优选地，所述裂解液含有5mol/L异硫氰酸胍、体积浓度为0.8％TritonX-100、40mmol/L Tris-HCl和40mmol/L尿素，所述裂解液的pH值为4.4。
优选地，所述去蛋白液包含5～6mol/L盐酸胍和体积浓度为53％～59％乙醇，所述去蛋白液的pH值为6.4～6.6。在病毒核酸上柱前，该去蛋白液可以去除蛋白及其它杂质，可以进一步提高病毒核酸的吸附、洗脱的效果。
优选地，所述去蛋白液包含5mol/L盐酸胍和体积浓度为55％乙醇，所述去蛋白液的pH值为6.5。
优选地，所述促吸附液是包含异丙醇和乙酸的水溶液，所述乙酸水溶液中乙酸的体积浓度为1％。
作为上述技术方案的改进，所述洗涤液是包含乙醇和氯化钠的水溶液，所述洗涤液中，乙醇的浓度大于95％，所述洗涤液中氯化钠的浓度为20mmol/L，所述洗涤液的pH值为7～8。该洗涤液可以去除玻璃纤维膜上吸附的蛋白及其它杂质，如多糖、纤维素、脂等。
优选地，所述洗涤液的pH值为7.5。
优选地，所述洗脱液是一种不含核酸酶的蒸馏水，且pH值为7～8；该洗脱液的pH值优选为7.5；洗脱液是将水经过焦磷酸二乙酯(DEPC)处理而得到，从而可以将玻璃纤维膜上吸附的核酸洗脱下来。
优选地，本发明中以玻璃纤维滤膜作为核酸的吸附介质，将其制备成一定规格后装入聚丙乙烯材料制备的中空柱体中，压入垫圈固定即可作为纯化柱使用。玻璃纤维滤膜对于本领域技术人员来说是公知的，已经有多种商品化的玻璃纤维滤膜可供选择，如美国Millipore和英国Whatman公司生产的玻璃纤维深层截流滤膜。
另外，本发明还提供一种病毒核酸的提取方法，其包含以下步骤：
S1)向病毒液体样本中加入裂解液，室温下孵育；
S2)向步骤S1得到的溶液中添加去蛋白液，搅拌均匀后离心，获得上清液；
S3)将步骤S2得到的上清液转移到离心管中，添加促吸附液，混匀后加入到纯化柱的柱体中，离心弃流出液；
S4)向步骤S3纯化柱的柱体中加入洗涤液，离心弃流出液；再向纯化柱的柱体中加入洗涤液，重复洗涤1次；
S5)向步骤S4纯化柱的柱体中加入洗脱液，离心收集流出液。
作为上述技术方案的改进，所述小于500μL小量体积病毒液体样本是血浆、尿液或病毒培养上清。
在本发明病毒核酸的提取方法中，裂解液能有效地溶解了体液中的病毒颗粒，病毒核酸被释放；去蛋白液去除蛋白质和PCR抑制剂，病毒核酸通过促吸附液牢固吸附在柱体内的玻璃纤维薄膜上；洗涤液可以去除残留的杂质和盐，然后在洗脱纯化的病毒核酸。该提取方法纯化的核酸不含蛋白质、色素、脂质和PCR/RT-PCR抑制剂等污染物，病毒核酸尤其适用于临床血液筛查等应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种用于病毒核酸提取的试剂盒及其提取方法，本发明对试剂盒中裂解液、去蛋白液、促吸附液和洗涤液的组分和含量进行优化，通过上述组合可以达到安全、高效、快速提取病毒核酸；另外，改进后裂解液可以缩短病毒液体样本的时间，时间短至5min。
附图说明
图1为本发明试剂盒对同一样品的荧光定量PCR的扩增曲线；
图2为本发明试剂盒对不同浓度样品的荧光定量PCR的扩增曲线；
图3为本发明试剂盒和市场购买的试剂盒分别提取核酸后的荧光定量PCR的扩增曲线。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
本发明提供一种用于病毒核酸提取的试剂盒，其包含裂解液、去蛋白液、促吸附液、洗涤液、洗脱液和纯化柱，裂解液包含3～7mol/L异硫氰酸胍、体积浓度为0.6％～1.0％TritonX-100、30～50mmol/L Tris-HCl和30～50mmol/L尿素，裂解液的pH值为4.3～4.6；去蛋白液包含5～6mol/L盐酸胍和体积浓度为53％～59％乙醇，去蛋白液的pH值为6.4～6.6；促吸附液是包含异丙醇和乙酸水溶液，乙酸水溶液中乙酸的体积浓度为1％；洗涤液是包含乙醇和氯化钠的水溶液，洗涤液中乙醇的浓度大于95％，洗涤液中氯化钠的浓度为20mmol/L，洗涤液的pH值为7～8。
本发明提供一种病毒核酸的提取方法，其包含以下步骤：
S1)向病毒液体样本中加入裂解液，室温下孵育；
S2)向步骤S1得到的溶液中添加去蛋白液，搅拌均匀后离心，获得上清液；
S3)将步骤S2得到的上清液转移到离心管中，添加促吸附液，混匀后加入到纯化柱的柱体中，离心弃流出液；
S4)向步骤S3纯化柱的柱体中加入洗涤液，离心弃流出液；再向纯化柱的柱体中加入洗涤液，重复洗涤1次；
S5)向步骤S4纯化柱的柱体中加入洗脱液，离心收集流出液。
实施例1
本实施例提供一种用于病毒核酸提取的试剂盒，其包括裂解液、去蛋白液、促吸附液、洗涤液、洗脱液和纯化柱；裂解液是由3mol/L异硫氰酸胍、体积浓度为0.6％TritonX-100、30mmol/L Tris-HCl和30mmol/L尿素组成，裂解液的pH值为4.3；去蛋白液是由5mol/L盐酸胍和体积浓度为55％乙醇组成，去蛋白液的pH值为6.5；促吸附液是包含异丙醇和乙酸水溶液，乙酸水溶液中乙酸的体积浓度为1％；洗涤液是包含乙醇和氯化钠的水溶液，洗涤液中乙醇的浓度大于95％，洗涤液中氯化钠的浓度为20mmol/L，洗涤液的pH值为7；洗脱液是一种不含核酸酶的蒸馏水。
另外，本实施例还提供一种病毒核酸的提取方法，其包含以下步骤：
S1)在1.5mL离心管中收集200μL病毒液体样本，在提取前，先将样品12,000g高速离心5分钟，去除细菌或细胞，小心地将上清液转移到干净的管子内，并加200μL裂解液，混合均匀，在室温下孵育5分钟；
S2)加75μL去蛋白液，涡旋混合，12,000g高速离心5分钟，获得上清液；
S3)将从步骤S2得到上清液转移到2mL离心管，并添加250μL促吸附液拌匀后将纯化柱放入到此2mL的离心管中，将澄清的液体转移到纯化柱中，6,000g离心1min，将在2mL的离心管中的滤液丢弃，将纯化柱柱放回2mL离心管中；
S4)向纯化柱中加入500μL的洗涤液，室温下放置1min，在12,000g离心1min，丢弃滤液，将纯化柱放回2mL离心管中，重复洗涤1次；
S5)将纯化柱转移到一个干净的1.5mL离心管，加入40～60μL的洗脱液，室温下静置1分钟；在12,000g离心1分钟，收集流出液。
实施例2
本实施例提供一种用于病毒核酸提取的试剂盒，其包括裂解液、去蛋白液、促吸附液、洗涤液、洗脱液和纯化柱；裂解液是由5mol/L异硫氰酸胍、体积浓度为0.8％TritonX-100、40mmol/L Tris-HCl和40mmol/L尿素组成，裂解液的pH值为4.4；去蛋白液是由5.5mol/L盐酸胍和体积浓度为53％乙醇组成，去蛋白液的pH值为6.4；促吸附液是包含异丙醇和乙酸水溶液，乙酸水溶液中乙酸的体积浓度为1％；洗涤液是包含乙醇和氯化钠的水溶液，洗涤液中乙醇的体积浓度大于95％，洗涤液中氯化钠的浓度为20mmol/L，洗涤液的pH值为7.5；洗脱液是一种不含核酸酶的蒸馏水。
另外，本实施例还提供一种病毒核酸的提取方法，其类似于实施例1。
实施例3
本实施例提供一种用于病毒核酸提取的试剂盒，其包括裂解液、去蛋白液、促吸附液、洗涤液、洗脱液和纯化柱；裂解液是由7mol/L异硫氰酸胍、体积浓度为1％TritonX-100、50mmol/L Tris-HCl和50mmol/L尿素组成，裂解液的pH值为4.6；去蛋白液是由6mol/L盐酸胍和体积浓度为59％乙醇组成，去蛋白液的pH值为6.6；促吸附液是包含异丙醇和乙酸水溶液，乙酸水溶液中乙酸的体积浓度为1％；洗涤液是包含乙醇和氯化钠的水溶液，洗涤液中乙醇的体积浓度＞95％，洗涤液中氯化钠的浓度为20mmol/L，洗涤液的pH值为8；洗脱液是一种不含核酸酶的蒸馏水。
另外，本实施例还提供一种病毒核酸的提取方法，其类似实施例1。
采用本发明试剂盒和对应的核酸提取方法对样本核酸进行提取并检测，检测结果如下所示：
1)重复性：如图1所示，采用本发明试剂盒提取同一样品的核酸，之后进行荧光定量PCR扩增时，扩增曲线的重复性良好；
2)精确性：如图2所示，采用本发明试剂盒提取样品核酸后稀释成不同浓度，之后进行荧光定量PCR扩增时，不同样品的扩增曲线的区分明显，精确度好；
3)重复性：如图3所示，采用本发明试剂盒和市场购买的试剂盒提取同一样品的核酸，之后进行荧光定量PCR扩增时，本发明试剂盒提取获得核酸的PCR扩增曲线中CT更小，灵敏度更好。
最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种用于病毒核酸提取的试剂盒，包含裂解液、去蛋白液、促吸附液、洗涤液、洗脱液和纯化柱，其特征在于，所述裂解液包含3～7mol/L异硫氰酸胍、体积浓度为0.6％～1％TritonX-100、30～50mmol/L Tris-HCl和30～50mmol/L尿素，所述裂解液的pH值为4.3～4.6。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液含有5mol/L异硫氰酸胍、体积浓度为0.8％TritonX-100、40mmol/L Tris-HCl和40mmol/L尿素，所述裂解液的pH值为4.4。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述去蛋白液包含5～6mol/L盐酸胍和体积浓度为53％～59％乙醇，所述去蛋白液的pH值为6.4～6.6。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述去蛋白液包含5mol/L盐酸胍和体积浓度为55％乙醇，所述去蛋白液的pH值为6.5。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述促吸附液是包含异丙醇和乙酸水溶液，所述乙酸水溶液中乙酸的体积浓度为1％。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液是含乙醇和氯化钠的水溶液，所述洗涤液中乙醇的体积浓度大于95％，洗涤液中氯化钠的浓度为20mmol/L，所述洗涤液的pH值为7～8。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液的pH值为7.5。
8.一种病毒核酸的提取方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1)向病毒液体样本中加入裂解液，室温下孵育；
S2)向步骤S1得到的溶液中添加去蛋白液，拌匀混合后离心，获得上清液；
S3)将步骤S2得到的上清液转移到离心管中，添加促吸附液，混匀后加入到纯化柱的柱体中，离心弃流出液；
S4)向步骤S3纯化柱的柱体中加入洗涤液，离心弃流出液；再向纯化柱的柱体中加入洗涤液，重复洗涤1次；
S5)向步骤S4纯化柱的柱体中加入洗脱液，离心收集流出液。
9.如权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述病毒液体样本是血浆、尿液或病毒培养上清。
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