CN103255131A - 采用固相支持物纯化dna的制剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于从生物材料纯化DNA的试剂、方法和试剂盒，尤其是采用固相支持物纯化DNA的制剂和方法。本发明采用缓冲于pH7以上的DNA裂解液，该DNA裂解液含有表面活性剂和浓度大于1M的DNA络合盐。

Description

采用固相支持物纯化DNA的制剂和方法
本申请是国际申请PCT/US2005/027419，国际申请日2005年8月2日，中国国家阶段申请号200580025930.1，名称“采用固相支持物纯化DNA的制剂和方法”的发明专利申请的分案申请。
关于联邦资助的研究或开发的说明
有关本文件的工作受到国立卫生研究院资金1 R43 CA106124-01的支持。美国政府对本发明拥有一定权利。
对相关专利申请的交互参考
本文件要求2004年8月2日提交的美国专利申请序号10/909，724的优先权，该申请是2003年4月16日提交的美国专利申请序号10/418，194的部分延续，而后者是2001年10月12日提交的美国专利申请序号09/947，798的延续，这些申请均通过援引于本文而纳入。
发明背景
在分子生物学领域，核酸如脱氧核糖核酸DNA)和核糖核酸(RNA)已广泛用于研究和临床分析。已有许多核酸纯化方法，包括二种通用类型的液相和固相纯化方法。液相纯化时，DNA留在液相中而杂质通过沉淀和/或离心被除去。固相纯化时，DNA结合于固相支持物而杂质被选择性洗脱。常规的液相和固相纯化方法需要采用许多步骤和有害的试剂。
本发明一些实施方式的概述
本文描述一种分离和/或纯化核酸的制剂。该制剂含有浓度至少约1M的锂盐、至少一种表面活性剂和缓冲液。该制剂还含有螯合剂如EDTA或柠檬酸盐。该制剂不含离液剂和/或强离液物质。强离液物质的例子有胍盐、尿素、铵盐、铯盐、鉫盐、钾盐或碘盐。该制剂中的锂盐可以是氯化锂。锂盐的浓度可以是2M-10M，或2M-6M。在某些实施方式中，锂盐的浓度可以是2M、3M、4M、5M、6M、7M、8M、9M或10M，或上述二种浓度之间的任何范围(如5.5M)。该制剂的pH约高于7，例如在约7-9之间(如pH8、8.5、9)。在某些实施方式中，所分离和/或纯化的核酸是DNA。
此制剂中的表面活性剂浓度约占制剂总体积的10-40%(或其间的任何百分比)。此组合物中的表面活性剂可以是去污剂。所述去污剂可以是阴离子、阳离子、两性离子或非离子去污剂。在一实施方式中，表面活性剂是非离子去污剂。合适的非离子去污剂的例子包括：Tween、Triton、Nonidet、Igepal或Tergitol。例如，去污剂可以是Triton-X。表面活性剂还可以是二甘醇单乙醚(DGME，diethyl glycolmonoethyl ether)。DGME的浓度占此制剂总体积的约5-35%(或此二百分比之间的任何百分比)。总之随着该制剂其它组分浓度的增加DGME的用量也增加，从而可提高其它组分的溶解度。在某些实施方式中，表面活性剂是Triton-X与DGME的混合物。在一实施方式中，表面活性剂是5%v/v Triton与5%v/v DGME的混合物。在一实施方式中，表面活性剂的浓度占此制剂终体积的约10%v/v。
在一实施方式中，表面活性是阴离子去污剂。合适阴离子去污剂的例子包括十二烷基硫酸钠(SDS)或N-十二烷酰肌氨酸。在一实施方式中，SDS是阴离子去污剂。在一实施方式中，去污剂的浓度在约0.05-0.2%之间(和此间的任何百分比)。在一实施方式中，其浓度约为0.1%。
在某些实施方式中，该制剂含有浓度为0.1%SDS和30%DGME的一种以上表面活性剂的混合物。
该制剂中的缓冲液的pKa至少约为8。螯合剂可以是EDTA或柠檬酸盐。
在一实施方式中，用于分离和纯化核酸的该制剂含有至少约1M浓度的锂盐、表面活性剂、缓冲液和任选的螯合剂，其中该溶液的pH约为7。
在另一实施方式中，用于分离和纯化核酸的该制剂基本上由至少约1M浓度的锂盐、至少一种表面活性剂、缓冲液和任选的螯合剂组成。
在还有一种实施方式中，该制剂基本上由锂盐、至少一种表面活性剂、缓冲液和任选的螯合剂组成，该制剂的pH约为7。
另一实施方式该制剂基本上由至少约1M浓度的锂盐、表面活性剂、缓冲液和任选的螯合剂组成，pH约为7。
本发明也提供了从生物学材料纯化基本纯和无降解DNA的方法。所用的生物学材料可以是核酸的初制样品或部分纯化的混合物。生物学材料的例子包括；真核细胞、原核细胞、微生物细胞、细菌细胞、植物细胞、支原体、原虫、细菌、真菌、病毒、酵母菌或立克氏体，或它们的匀浆液。生物学材料的其它例子包括；全血、骨髓、宫颈拭子、血斑点、血清、血浆、白细胞层制品、唾液、脑脊液或动物固体组织。生物学材料的其它例子包括：粪便、尿、眼泪或汗液。生物学材料也可以是取自空气、水、沉积物或土壤的环境样品。生物学材料的样品可有各种类型，包括例如培养的细胞、固定的细胞和/或组织。在一实施方式中，生物学样品是宫颈细胞样品。在另一实施方式中，生物学样品是全血。
所用的固相支持物包括二氧化硅、纤维素、醋酸纤维素、硝酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚烯烃或聚偏1,1-二氟乙烯，或它们的组合。可将固相支持物包装在在容器中。所述容器可以是离心管、旋转管、针筒、筒芯、小室、多孔板或试管，或它们的组合。固相支持物可在生物学材料与其接触前用RNA酶溶液预处理。
DNA裂解液中的锂盐是一种DNA络合盐(DNA-complexing salt)。可采用的锂盐的例子有氯化锂和溴化锂。DNA裂解溶液中的DNA-络合盐浓度高于约1M。在一实施方式中，DNA络合盐的浓度可以在2M-8M之间。在某些实施方式中，DNA-络合盐的浓度约为2M、3M、4M、5M、6M、7M或8M，或它们之间的任何浓度(例如约5.5M)。
所述裂解液可任选含有螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐。
所提供的方法还涉及以下步骤：使生物学材料接触DNA裂解液而形成混合液，其中所述DNA裂解液缓冲于pH大于7，且所述DNA裂解液含有锂盐和至少一种表面活性剂；使该混合液与DNA结合液(Spiking Solution)接触；使该混合液与固相支持物接触从而生物学材料中存在的DNA结合于该固相支持物；用洗涤液洗涤该固相支持物去除结合的基本上未降解的DNA以外的生物学物质；用DNA洗脱液洗脱DNA获得基本纯的未降解DNA。“基本上未降解的DNA结合于固相支持物”指基本上未降解的DNA结合于固相支持物而生物学样品中的其它细胞或非细胞组分(如细胞膜或蛋白质)不结合于该固相支持物。
本发明提供了从生物学材料纯化基本纯和未降解DNA的方法，该方法包括以下步骤：使含DNA的生物学材料与用DNA裂解液预处理的固相支持物接触，其中所述DNA裂解液缓冲于pH大于约7，且该DNA裂解液含有表面活性剂和锂盐；在生物学材料中加入DNA结合液；使生物学材料与固相支持物接触以释放含基本上未降解DNA的核酸和非核酸生物物质，其中所述含基本上未降解DNA的核酸结合于该固相支持物；用洗涤液洗涤该固相支持物以去除包含基本上未降解DNA的结合核酸以外的生物学物质；用DNA洗脱液从固相支持物上洗脱结合的未降解DNA。所述洗涤液可以是pH大于约7的缓冲液。在某些实施方式中，所述洗涤液是pH约7-9之间(如pH约8、约8.5或约9)的缓冲液。此方法和/或制剂中所用的裂解液和/或洗涤液可没有离液剂和/或强离液物质。
所述DNA结合液可包含醇类。所述醇类可以是异丙醇、乙醇、甲醇等。所述醇类可以是各种醇的混合液。在一实施方式中，所述DNA结合液是100%异丙醇。
所述表面活性剂可以是去污剂。所述去污剂可以是非离子去污剂，如Tween、Triton、Nonidet、Igepal或Tergitol。所述去污剂可以是阴离子去污剂，如SDS(十二烷基硫酸钠)或N-十二烷酰肌氨酸，所述表面活性剂可以是去污剂的混合物，或去污剂与增溶表面活性剂(如DGME)的混合物。
所述DNA结合液可含碱金属盐如锂盐。DNA结合液可以是pH大于7的缓冲液。在某些实施方式中，DNA结合液是pH值在约7-9之间(如pH约8、约8.5或约9)的缓冲液。DNA结合液可含有表面活性剂。在一实施方式中，所述表面活性剂是DGME。
本发明提供了从生物学材料纯化基本纯和未降解DNA的方法，该方法包括以下步骤：(a)使含DNA的生物学材料与用缓冲于pH大于约7的DNA裂解液预处理的固相支持物接触而使DNA裂解液结合于固相支持物，其中所述DNA结合液含有DNA络合盐；(b)在该混合液中加入任选的DNA结合液；(c)使生物学材料与固相支持物接触而使含基本上未降解DNA的核酸结合于该固相支持物；(d)用DNA洗涤液洗涤该固相支持物以去除包含基本上未降解DNA的结合核酸以外的生物学物质；(e)用DNA洗脱液从固相支持物上优先洗脱结合的基本上未降解的DNA以获得基本纯和未降解的DNA。
本发明提供了从生物学材料纯化基本纯和未降解DNA的方法，该方法包括以下步骤：(a)使含DNA的生物学材料与缓冲于pH大于约7的DNA裂解液预处理的固相支持物接触而使DNA裂解结合于固相支持物，所述DNA裂解液含有表面活性剂和DNA络合盐；(b)在该生物学样品中加入任选的DNA结合液；(c)使该生物学材料与固相支持物接触以释放含基本上未降解DNA的核酸和非核酸生物物质，导致含基本上未降解DNA的核酸结合于该固相支持物；(d)洗涤该固相支持物以去除含基本上未降解DNA的结合核酸以外的生物学物质；(e)用DNA洗脱液从固相支持物上优先洗脱结合的未降解的DNA以获得基本纯和未降解的DNA。
还提供了不使用红细胞(RBC)裂解步骤从生物学材料如全血纯化基本纯和未降解DNA的直接裂解方法，该方法包括以下步骤：使含DNA的生物学材料与第一DNA裂解液接触，该第一DNA裂解液缓冲于pH大于约7并含有浓度在约5-15%v/v之间的表面活性剂和浓度大于1M的DNA络合盐；使该生物学材料与第二DNA裂解液接触，该第二DNA裂解液含有表面活性剂和1M以上浓度的DNA络合盐；使该混合液与DNA结合液接触；使该混合液与固相支持物接触，其中所述含有来自于该生物学材料的基本上未降解DNA的核酸结合于固相支持物；用DNA洗涤液洗涤该固相支持物以去除含基本上未降解DNA的结合核酸以外的生物学物质，该DNA洗涤液含DNA络合盐和表面活性剂；和用DNA洗脱液从固相支持物上优先洗脱结合的未降解的DNA。在某些实施方式中，第二DNA裂解液中的表面活性剂浓度在约25-35%v/v之间。在某些实施方式中，第二DNA裂解液还含螯合剂。
还提供了从生物学材料如固定的宫颈细胞样品纯化基本纯和未降解的DNA的方法，该方法包括以下步骤：使含DNA的生物学材料与缓冲于pH大于约7的DNA裂解液接触，该DNA裂解液含有表面活性剂和浓度大于1M的DNA络合盐；在混合液中加入含醇的任选DNA结合液；使该生物学材料与固相支持物接触以释放含基本上未降解DNA的核酸和非核酸生物物质，导致含基本上未降解DNA的核酸结合于该固相支持物；用DNA洗涤液洗涤该固相支持物以去除含基本上未降解DNA的结合核酸以外的生物学物质；用DNA洗脱液从固相支持物上优先洗脱结合的未降解的DNA以获得基本纯和未降解的DNA。在某些实施方式中，DNA裂解液中的表面活性剂浓度在约25-35%v/v之间。在某些实施方式中，DNA裂解液还含有螯合剂。
如本文所用，“基本纯的”指基本上没有RNA、糖、蛋白质、脂质污染物，因此这种DNA可用于本领域技术人员所知的后续分析，例如核酸定量测定、限制性酶消化、DNA测序、杂交技术如Southern印迹等，和扩增技术如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、核酸序列为基础的扩增(NASBA)、自身支持的序列复制(SSR或3SR)、链置换扩增(SDA)和转录介导的扩增(TMA)、定量PCR(qPCR)或其它DNA分析。
如本文所用，“基本上未降解的”DNA指未被消化的或完整的DNA，对此本领域技术人员不难用标准技术测定。“基本上未降解的”DNA指在本文所述纯化方法中未受到酶、物理或化学物质损害的DNA。
可采用所述的试剂、方法和试剂盒来分离生物学广泛来源的和生命形式的基本纯和未降解的DNA，可回收的分子量范围广泛。可评价基本纯和未降解的DNA的纯度、产量、大小、逆转录或其它杂交、扩增和杂交的功能等。所述生物学样品包括：例如细胞或病毒悬液或其沉淀物、体液、宫颈细胞拭子和组织匀浆液等。如果生物学样品包含细胞或病毒、可计数这些细胞和病毒。所述计数可采用标准的细胞计数方法，如电子细胞计数器(如CBC5Coulter Couter，Coulter Corp，Hialeah，FL)或可视计数小室(如血细胞计数器，Bright Line，American Optical，Buffalo，NY)进行。
应注意，除非另有说明，本文所用的不定冠词“一”和定冠词“该”的含义与专利文献中相同，指一个或多个。此外，本文所用术语“或”的含义与专利文献中相同，指转折连接词“或”，或连接词“和”。
附图简述
图1是说明QIAamp Blood DNA Midi Kit(Qiagen，Inc.，德国)与Versagene BloodDNA Kit(Gentra Systems Inc.，明尼苏达州)相比较的DNA产量理论百分比的图。
图2是说明锂盐和裂解液pH相比较的DNA产量理论百分比的图。
发明详述
为结合和纯化核酸而采用离液盐是该领域从所周知的。例如，Kuroita等(美国专利No.5，990，302)报导可用含锂盐和离液剂如异硫氰酸胍(GITC)的酸性溶液裂解生物学材料，然后使RNA与核酸结合载体如二氧化硅接触。然后以低离子强度缓冲液从二氧化硅上洗脱来纯化RNA。此法的缺点是采用了有害物质如异硫氰酸胍离液盐。
为纯化RNA，该领域报导了联用离子强度高于4M的离液物质如异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和尿素的混合物与二氧化硅相结合。例如，Hillebrand等(WO95/343569)描述的一步方法包括在二氧化硅珠浆液中加入离液物质使其与RNA结合。
与采用离液剂明显相反的方法是采用抗离液剂(该领域也称为“Kosmotropes”来分离RNA。Hillebrand等(US2001/0041332)描述采用“抗离液剂”如氯化铵(也提及铯盐、钠盐和/或钾盐)与PVP(聚乙烯吡咯烷酮)联合裂解初始样品，和用去污剂/醇类混合液使RNA结合于固相支持物。除通常所知铯和钾盐由于其电荷密度低和水合性能弱而清楚地视为离液剂外，而认为铵盐是一种边缘性离液剂(Collins，K.生物系统中的粘性离子(Sticky Ions in biological systems)，PNAS，92；5553-5557，1995；Wiggins，P，M.细胞内的高和低密度水份(High and Low Density IntracellularWater)，Cellular and Molecular Biology，47(5)，735-744)。Hillebrand的方法存在几个缺点，第一，其方法采用了据研究有致瘤原性的PVP。第二，裂解和洗脱需要65-70℃加热步骤。这种加热可因非特异性降解或消化而损伤核酸，导致下游应用受到限制，如与限制性酶消化或印迹分析不相容。
应注意，从含核酸和其它生物学材料的溶液中选择性沉淀核酸的方法，在物理上不同于采用固相选择性结合溶液中的DNA或RNA分子的方法。“沉淀”是“溶解”的逆反应。溶解包括溶质如DNA的溶解，溶剂围绕溶质使溶策分子分开。沉淀包括去除溶剂和各DNA分子结合形成固体与溶剂分离。这些沉淀和溶解发生在溶液环境中，不依赖于分离成为截然不同的固相，而这是DNA纯化和分离所依赖的。
为促进DNA样品制备领域的发展，需要有DNA固相纯化方法。也需要适合于固相纯化策略的试剂和方法，这些方法不仅应简便快速而且应最大程度通用适合于自动化。通常需要这些试剂是低浓度、室温(即20-25℃)稳定、危害性低(如腐蚀性低、易燃性低和毒性低)、非颗粒性而不需要混合、和能保护DNA质量的试剂。也需要操作步骤少、可采用各种生物学原料(不论是含水或干燥的)实施的、特别是可应用于临床实验室常规实验的方法。所述试剂不应因为干扰了PCR缓冲液的缓冲能力，或因引起DNA扩增时所用聚合酶、引物或寡核苷酸的降解而抑制随后的DNA分析。也需要操作步骤少、可采用各种生物学原料(不论是含水或干燥的)实施的、特别是可应用于临床实验室常规实验的方法。固相纯化策略中所用的试剂和方法也不应干扰核酸的标准实验和/或诊断方法。
此外，分离和纯化核酸由于发现了更多类型的挑战性样品而变得更有挑战性。例如，随着PHV(人乳头瘤病毒)感染对宫颈癌的作用得到证明，临床实验室已迅速采用了宫颈细胞的分离和纯化的DNA进行HPV的分子试验。分子诊断实验室现在每年要进行6百万例以上的HPV诊断试验。然而制备用于分子试验的宫颈细胞样品的DNA跟不上该日益增长的需求。在标准的测试方法中，收集表皮脱落宫颈上皮细胞的液体介质中含有防腐剂，如SurePathTM防腐液(TriPath Imaging，Burlington，NC)或
Figure BDA00003055621000071
Pap TestTM(Cytyc，Boxborough，MA)，这些样品常严重污染有各种细胞和非细胞组分，使分离和纯化困难。这些污染物可包括粘液、白细胞、红细胞和蛋白质。目前的手工DNA纯化方法有几个明显缺点阻碍了临床实验室进一步采用分子HPV诊断。因此目前迫切需要纯化含表皮脱落宫颈细胞DNA的更有效和更高效方法。
在本文提供的试剂、方法和试剂盒中加入了用于从生物学样品，如新鲜、冻存和干燥的生物学样品中分离基本纯和未降解DNA的固相支持物。这种纯化DNA的方法广泛适合用于分析和诊断方法，如核酸定量、限制性酶消化、DNA测序、杂交技术如Southern印迹等，和扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、核酸序列为基础的扩增(NASBA)、自身支持的序列复制(SSR或3SR)、链置换扩增(SDA)和转录介导的扩增(TMA)、定量PCR(qPCR)或其它DNA分析
生物学材料和/或样品
本文提供用于纯化生物学样品DNA的试剂、方法和试剂盒。这类生物学样品包括含有DNA的通常为含水混合物或干燥的生物材料，包括原核或真核细胞的复杂生物学混合物。该生物学材料通常也含有RNA、糖、蛋白质和脂质。生物学材料包括但不限于以下：体液如全血、骨髓、血斑点、血清、血浆、白细胞层制品、唾液、脑脊液、口腔拭子；培养的细胞、固定的细胞、宫颈细胞拭子；细菌细胞的悬浮液或组织匀浆液；动物的实体组织如心、肝和脑；身体排泄的废物如粪便、尿；取自空气、水、沉积物或土壤的环境样品；植物组织、、酵母菌、细菌、病毒、支原体、原虫、立克氏体和其它小微生物细胞。也可采用这些生物学材料的裂解液、匀浆液、或部分纯化的样品。在一实施方式中，生物学材料是初步或部分纯化的核酸混合物。
试剂
本文描述了4类试剂。它们是DNA裂解液、DNA结合液、DNA洗涤液和DNA洗脱液。与适合的固相支持物联用的这些试剂可用于制备基本纯和无污染的未降解DNA。这些试剂可用于纯化各种生物学材料中的DNA，而不采用有害物质如苯酚、氯仿，或有害的离液剂如胍盐、尿素等。
(1)DNA裂解液：此DNA裂解液能有效裂解生物学样品以释放核酸，和有效抑制DNA酶活性。该DNA裂解液含以下组分：锂盐、缓冲液、表面活性剂如去污剂或去污剂/表面活性剂混合物、和任选的螯合剂。该DNA裂解液的独特性在于不需要加入强离液物质如胍盐、尿素等。胍盐和尿素是强离液盐，能破坏水结构倾向降低疏水性相互反应的强度，导致对其它溶质分子的显著影响。例如当尿素溶于水时，能破坏蛋白质的二级、三级和四级结构，进而导致蛋白质与DNA分离。胍盐和尿素通过吸热反应溶于水，如Hofmeister系列(一种根据相对离液强度给阳离子和阴离子分等级的广泛采用的系统)定义的那样，认为胍盐和尿素二者都是强离液盐(F.Hofmeister，对盐作用的了解(On the understanding of the effects of salts)，ArchExp Pathol Pharmakol.(Leipzig)24：247-260，1888)。
与强离液盐不同，锂盐(如氯化锂和溴化锂)在水中的反应是放热反应，显示强kosmotropic锂离子的巨大离子偶极相互作用可导致溶解度增加，这些差异表明强离液剂(如胍盐)与碱金属盐(具体是氯化锂)之间存在差异。
本文描述采用锂盐，包括例如氯化锂和溴化锂的效果。认为锂离子由于其表面电荷密度高和水合特性强而非常kosmotropic。锂离子的独特处在于与也属于碱金属组的钠、钾、鉫和铯离子相比，它的半径小。这使得它的表面电荷密度比同组其它离子高。表面电荷密度较高使锂离子与水分子相互反应时作用极强。这导致水分子围绕锂离子而维持其结构的作用甚至超过先形成的水壳的保护作用。
适合的DNA络合盐包括含碱金属离子的盐，如钠、钾、鉫和铯盐，因为所有这些阳离子均能与DNA分子的磷酸基团特异性络合。DNA分子的这种络合和随后的中和使DNA分子在水环境中不大稳定，而促使其与固相结合。一种实施方式采用锂盐。锂盐包括但不限于氯化锂和溴化锂。但氟化锂和碘化锂是不够理想的碱金属盐，因为它们的价格比氯化锂和溴盐高5倍。此外，在上述名单中锂离子是唯一清楚了解的kosmotropic离子，而钾、鉫和铯离子是离液离子(Collins，K，生物系统中的粘性离子(Sticky Ions in Biological Systems)，Proc Natl Acad Sci.USA，92：5553-5557，1995)。氯化铯的价格比其它碱金属盐酸盐高5倍(见表1)，溶解度比氯化锂和溴化锂差。此外，如锂盐溶于水时溶液大量放热显示的那样，氯化钠、氯化钾和氯化铵盐的溶解度比氯化锂和溴化锂差很多(《CRC化学和物理手册》(CRCHandbood of Chemistry and Physics)，第62版，CRC Press，Boca Raton，F1)。
上述裂解液和结合液中高浓度的碱金属盐可促进DNA与固相支持物结合。碱金属盐的浓度可以是2-10M之间。在实施例2中，观察到氯化铵和氯化钾盐在裂解液中的溶解度分别为3M和<3M，而氯化铯和氯化钠盐易溶解至4M。如表2所见，这些盐的溶解度值大致上与它们在水溶液中的预期值相匹配，除氯化铵外(《CRC化学和物理手册》，第62版，CRC Press，Boca Raton，F1)。
碱土金属盐含有kosmotropic镁和钙离子，虽然也具有与DNA形成盐络合物的能力，但在DNA与固相支持物结合所需的高浓度时不可溶。此外，例如碱土金属铍盐比碱金属盐氯化锂或溴化锂贵约20倍，因此不适合用于实施本发明。
DNA裂解液含锂盐可使DNA通过吸附机制与特定的固相结合。采用锂盐导致DNA吸附于固相(的机理)不同于用锂盐沉淀DNA。在吸附过程中，溶剂分子与DNA分子相分离。DNA与固相之间的相互作用耗能优于DNA分子之间的作用，因而吸附于固相而不发生沉淀。合适的固相材料的例子是硼硅酸盐。
与生物学材料中的其它物质相比，所述DNA裂解液通过缓冲液中存在的DNA-络合锂盐(如氯化锂或溴化锂)和表面活性剂而实现DNA(与固相)结合，而不必采用有害的离液剂如胍盐、尿素等。锂离子结合于核酸(如DNA)的带电荷磷酸骨架，在存在高浓度锂离子时导致DNA溶解度降低(Kazakov，S.A.，金属离子导致核酸结合和促进(Nucleic Acid Binding and Catalysis by Metal Ions)，选自Hecht，S.M.编的《Bioorganic Chemistry：Nucleic Acid》(Bioorganic Chemistry:Nucleid Acids)，牛津大学出版社，NY&Oxford，1996)。这样，DNA-络合盐赋予了核酸(如DNA)独特的结合性能，使核酸与固相支持物的结合超过其它污染物如蛋白质、磷脂等。
DNA裂解液中的第二种组分是维持溶液pH的缓冲剂。本文描述采用独特的中性至高pH的DNA裂解液可使各种不同类型样品的DNA产量最高。例如，所述DNA裂解液中的缓冲剂可保持此液的pH至少约为7，至少约为8，至少约为8.5或甚至至少约为9。该缓冲液的pKa至少约为8，可采用10-100mM浓度。合适缓冲剂的一个例子是tris(羟甲基)氨基乙烷(Tris)。所用的碱可以是能提高该溶液pH不低于7的碱。所述碱可以是碱金属氢氧化物。这类碱金属氢氧化物包括氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂。
所述DNA裂解液还含一种或多种表面活性剂。表面活性剂包括能降低液体表面张力和降低不同极性和结构分子之间吸引力的分子，从而使不同极性和结构的分子之间易溶。在一实施方式中，表面活性剂是去污剂，或去污剂/表面活性剂的混合物，以帮助裂解生物学材料。采用去污剂是为了溶解膜组分如脂质和蛋白质，以促进细胞膜裂解和匀浆过程。采用表面活性剂是为了帮助该溶液中(溶质)的溶解度以及提高该溶液的贮存期。阴离子、阳离子、非离子和两性离子去污剂均可采用。在某些例子中，DNA的分离优选采用非离子去污剂，而在其它例子中，DNA的分离优选采用阴离子去污剂。可采用非离子或阴离子去污剂，非离子去污剂的例子有：Tween类(Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80等)、Triton类(X-100、X-114、XL-80N等)、Tergitol(XD、TMN-6等)和Nonidets或Igepal(NP-40等)；阴离子去污剂的例子有：SDS(十二烷基硫酸钠)或N-十二烷酰肌氨酸。阴离子洗涤所用的浓度为5-15%，如约10%。在另一实施方式中，联用去污剂和表面活性剂。在一实施方式中，表面活性剂是DGME(二甘醇单乙醚)。在一实施方式中，联用去污剂Triton-X和表面活性剂DGME。联用的浓度可以是5-15%，如5-10%。在一实施例中，联用5%Triton-X和5%DGME。在另一实施方式中，联用的浓度可以是25-35%，如约30%。在一实施例中，联用0.1%SDS和30%DGME。
在中性和高pH缓冲条件下锂盐与去污剂或表面活性剂联合也起着使通常与生物学材料相关的酶(如DNA酶)变性的作用。所述DNA裂解液也任选含有能与外来金属离子络合的螯合剂。螯合剂的浓度可以是1-100mM，或1-10mM浓度。螯合剂的例子有EDTA或柠檬酸盐。所述DNA裂解液的优点明显优于其它同类试剂。在中性和高pH缓冲条件下DNA络合锂盐与去污剂的独特组合可灭活对DNA有害的酶(如DNA酶)而且不必采用苯酚、氯仿和胍盐等试剂，当与DNA结合液联用时可完全裂解生物学材料并促进结合过程。
(2)DNA结合液：本文描述了DNA结合液的的用途，可用其使DNA分子脱水导致DNA与固相有效结合。所述DNA结合液可以是醇类。醇类的例子有异丙醇、乙醇或甲醇。在一实施方式中，DNA结合液是100%醇，如100%异丙醇。或者DNA结合液可包含碱金属盐。碱金属盐DNA结合液可以是pH大于7的缓冲液或不是。碱金属盐DNA结合液也可含任选的去污剂或表面活性剂。在一实施方式中，所述表面活性剂是DGME。
所述DNA结合液可使DNA分子脱水导致DNA与固相有效结合。已发现LiCl能在其它盐不能充分溶解的极高浓度(13摩尔)时将DNA从溶液中沉淀出来(Emanuel，C.F.，溶于高盐介质的脱氧核糖核酸的某些物理性能：盐的超化学性能(Some Physical Properties of Deoxyribonucleic Acids Dissolved in a High-Salt Medium:Salt Hyperchromicity)，Biochim Biophys Acta，42：91-98，1960)。高浓度盐或醇可导致DNA与玻璃纤维结合而获得较高产量。随着LiCl浓度的增加，核酸水合壳中的水被排出，而使核酸优先与溶液中的Li结合。一项研究表明，当LiCl浓度足够高时，最终与DNA结构结合的残留水分子消失了(Chattoraj，D.K.和Birdi，K.S.，生物聚合物对水蒸气的吸附(Adsorption of Water Vapor by Biopolymers)，选自《吸附和吉布斯表面超额》(Adsorption and the Gibbs Surface Excess)，Plenum Press，NY&London，1984)。表面的脱水和随后的中和迫使DNA分子因疏水性提高而从高序水溶液中逸出与固相结合。DNA分子吸附于二氧化硅固相表面也部分受到能熵提高的驱动。、能熵提高发生在脱水过程中当水分子从DNA分子和二氧化硅固相表面释放时(Melzak，K.A等，在高氯酸盐溶液中趋使DNA吸附于二氧化硅的力(Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions)，J Colloidinterface Science，181：635-644，1996)。采用含高浓度盐或高醇组分的DNA结合液使脱水或脱盐更完全，使DNA分子离开溶液而吸附于固相。
在一实施方式中，DNA结合液含有高浓度的碱金属盐，如锂盐。在一实施方式中，所述碱金属盐的浓度为10-15M。DNA结合液可以是pH至少7的缓冲液。DNA结合液可含表面活性剂以帮助盐和缓冲剂的溶解。所述表面活性剂是DGME。
(3)DNA洗涤液：本文也描述用于洗涤核酸所结合的固相支持物，以洗去非核酸污染物或杂质(如蛋白质和磷脂)，同时保持核酸与固相支持物结合的DNA洗涤液。该洗涤液含有醇和缓冲盐或螯合剂(如EDTA)。所述缓冲组分可以是例如pH6-8的Tris-HCl。缓冲剂的浓度为50-150mM(例如100mM)。所述醇是乙醇。醇的浓度为25-100%。EDTA的浓度为1-20mM(例如5-10mM)。
(4)DNA洗脱液：结合于固相支持物的DNA可用DNA洗脱液洗脱。裂解生物学材料和使DNA结合于固相支持物及洗涤固相支持物所用的试剂很简单，本身就使DNA洗脱液简单化。也可采用该领域技术人员已知的其它DNA洗脱液。例如，可用的DNA洗脱液是VersageneTM DNA洗脱液(Gentra Systems Inc，Minneapolis，MN)或者可采用Tris-EDTA(TE)。
固相支持物
可采用各种固相支持物。合适的固相支持物包括：二氧化硅支持物如玻璃纤维，或其它材料如纤维素、醋酸纤维素、硝酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚烯烃、聚偏1,1-二氟乙烯和它们的组合。可将固相支持物包封或固定在容器中从而可采用脉冲流动或持续流动的DNA分离方法。或者可将该固相支持物材料制成无(流动死角)的固体支持物如膜、园盘或园筒，再将它们固定或包封在合适的容器如管子或平板中。在一实施方式中，该固相支持物是适合接触所述生物学材料的纤维或颗粒。适合与所述试剂一起使用的固相支持物的尺寸视生物学材料的体积而不同。例如，可将玻璃纤维膜切成不同大小用以结合、纯化和洗脱不同量的DNA。
在一实施方式中，所述固相支持物是充许本文所述DNA裂解液中的核酸结合于该固相支持物而其它生物学污染物不结合的材料。这类固相支持物是二氧化硅或硼硅酸盐玻璃纤维材料。玻璃纤维材料因为DNA具有能特异性结合于带阳电的硅和硼原子的性质，及氢原子具有结合硅酸表面的性质而能提供更高产量。因为二氧化硅对核酸具有(结合)特异性，与其它污染物相比，DNA结合更多，制备的洗脱产物基本纯度更高。
适合与所述试剂联用的固相支持物形状可以是，例如片层、预先切成的园盘、园筒、一层纤维或由颗粒组成的固相支持物。可将该固相支持物材料制成无(流动死角)的固体支持物如膜、园盘或园筒，再将它们固定或包封在合适的容器中。如果需要，可将该固相支持物，以纸张形式(如纸板)、微离心管、旋转管、96孔板、小室或厚纸形式装在合适的容器中。如果固相支持物含有纤维，可将其包封在合适的容器中，适当压紧纤维以使核酸能最佳结合而洗去污染物如蛋白质、磷脂等。
可用RNA酶预处理该固相支持物以降解生物学样品中的RNA。此外，采用经预处理的柱可取消分离RNA消化产物的步骤，而这是常规方法通常需要的。
任选采用经RNA酶处理的柱(Gentra Systems Inc)来改进纯化。RNA酶处理的柱能降解生物学样品中的RNA。此外，采用经预处理的柱可取消分离RNA消化产物的步骤，而这是常规方法通常需要的。
在另一实施方式中，可将DNA裂解液直接加入到制备该固相支持物的原料(如纤维)中，等其干燥后将其制成用户易使用形式(如纸张、拭子、园盘、柱塞、柱子等)。采用RNA酶处理的柱(Gentra Systems Inc)减少了纯化过程的步骤和加工DNA样品的时间。
为更好地理解本发明，现详细描述装有该固相支持物的容器的具体实施方式。在一实施方式中，此容器是顶部配有一个或多个入口或可剌穿的隔膜的筒芯。该入口可通过一连接管，如凹形Luer锁紧接口(Luer-Lock)与装有样品或试剂的上游容器相连。可利用一个入口(加样孔)将生物学样品加入到固相支持物。该加样孔的一种任选特征是具有自身可密封机制，当样品液通过此入口后可密封加样孔。第二个入口是试剂入口。这二入口的一种特征是能保护性打开密封。因此，通过此二入口打开密封后可用任选的螺旋盖防止液体扩散。
DNA裂解液的通用性和效果使其能用于DNA分离的二种切实可行的方法。第一种方法，使生物学材料与DNA裂解液接触，然后与固相支持物接触。在一实施方式中，当生物学材料含细胞或病毒物质时，用该DNA裂解液裂解细胞释放核酸(包括DNA)。第二种方法，将DNA裂解液直接加入固相支持物使其结合于固相支持物。从而减少了一步，还简化了此方法。在后一方法中，将DNA裂解液直接加入固相支持物使生物学材料与经(RNA酶)处理的固相支持物接触，然后抽干固相支持物。
在该固相支持物的底部是含有孔径适合细胞碎片、蛋白质和脂分子通过而分离的任选扩散层。该扩散层能使生物学材料均匀通过此筒芯的横截面和防止生物学材料(无论在固相支持物之上或之下)不均匀凝聚。筒芯的出口配有与其锥形管几乎匹配的保护盖。将纯化的DNA收集到收集管(包括有紧闭盖子的锥形管)中，以方便和无污染保存。所有容器的大小取决于要加工样品体积的大小和后续分析所需的用量。
在另一实施方式中，所述容器是离心管，设计在其中可安置压紧的固相支持物。该固相支持物可以是二氧化硅纤维素、醋酸纤维素、硝酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚烯烃、聚偏1,1-二氟乙烯和它们的组合。在一实施方式中，该支持物是二氧化硅为基础的硼硅酸盐玻璃纤维膜。此膜具有使其能保持在离心管中的凸形顶部和让液体流穿同时支撑该固相支持物的有孔底部。可利用该离心管的盖子封住此膜。通过离心力使溶液，如含有非核酸污染物的DNA裂解液、DNA洗涤液或DNA洗脱液通过该有孔底部，收集到离心管底部而抽吸除去这些溶液。
在另一实施方式中，所述容器是多孔板，例如6、12、24、48、96或384孔板，其中各孔中有压紧的固相支持膜。各孔底有一出口，含污染物的溶液或纯化的DNA可通过此出口。
所选固相支持物与专用试剂(DNA裂解液、DNA结合液、DNA洗涤液和DNA洗脱液)的独特组合可用于分离得到基本纯的未降解DNA。所述DNA裂解和结合液的性能有利于裂解和使核酸结合于固相支持物，而用DNA洗脱液和任选的RNA酶处理此柱有利于从固相支持物上洗脱DNA。
试剂盒
本发明提供的纯化DNA试剂盒也装有制备生物学样品的基本纯和未降解DNA的说明书，和一种或多种(如全部)以下物质：DNA裂解液，分装的溶液或装在固相支持物上的预处理溶液；未经DNA裂解液处理的固相支持物；DNA结合液；DNA洗涤液；DNA洗脱液或它们的任何组合。此外，该试剂盒可装有辅助组分，如蛋白酶K溶液、装有固相支持物的容器、装基本纯和未降解DNA的容器，和它们的组合。基本纯和未降解的DNA适合用于该领域技术人员所知的后续分析，如核酸定量、限制酶消化、DNA测序、杂交技术如Southern印迹等，和扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、核酸序列为基础的扩增(NASBA)、自身支持的序列复制(SSR或3SR)、链置换扩增(SDA)和转录介导的扩增(TMA)、定量PCR(qPCR)或其它DNA分析。
本发明的试剂、方法和试剂盒提供的基本纯和未降解的DNA所含RNA污染或其它杂质少，因而该DNA可用于下游研究，如核酸定量、限制酶消化、DNA测序、杂交技术如Southern印迹等，和扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、核酸序列为基础的扩增(NASBA)、自身支持的序列复制(SSR或3SR)、链置换扩增(SDA)和转录介导的扩增(TMA)、定量PCR(qPCR)或其它DNA分析。
方法
本文提供从生物学材料纯化DNA的方法。所述试剂和固相支持物本身构成了所选的分离方法。
在方法的一实施方法中，使生物学材料与DNA裂解液接触，再与固相支持物接触。用DNA裂解液裂解生物学材料以释放DNA，再将其加入固相支持物。此外，该DNA裂解液可防止有害酶(如DNA酶)的不良作用。可成功地用该DNA裂解液来裂解培养的细胞或沉淀的白细胞，或裂解粘附在或收集在培养板(如标准的96孔板)中的细胞。如果生物学材料含有组织块或小颗粒，该DNA裂解液的有效裂解能力能有效地粉碎这种组织块成为浆液。根据细胞数量或组织大小，可增加或减少DNA裂解液的体积。一旦生物学材料裂解，可在裂解液中加入DNA结合液，然后将它们加到固相支持物上。
在另一实施方式中，将DNA裂解液直接加到固相支持物上，从而减少了一步，还简化了此方法。在后一方法中，将DNA裂解液加到固相支持物上使生物学材料与经处理的固相支持物接触，然后抽干固相支持物。
可将RNA酶直接加到固相支持物上来预处理该柱，或加到裂解液中来降解生物学样品中的RNA。采用预处理柱和/或将RNA酶加入裂解液中，不需要分别进行裂解和/或RNA酶消化步骤，而这是常规方法通常需要的。
当生物学材料含有细胞或病毒物质时，使之直接与DNA裂解液接触，或与用DNA裂解液和/或RNA酶溶液预处理的固相支持物接触，可导致细胞膜和核膜或病毒包膜溶解和/或破裂，而释放核酸及其它污染物质如蛋白质、磷脂等。
在第三种实施方式中，例如所述试剂可用于全血直接裂解方法。此法不需要进行其它大多数全血纯化方法中共同采用的红细胞裂解步骤。此法中，先将DNA裂解液加入到生物学材料中。第一DNA裂解液含碱金属盐和非离子去污剂。将含碱金属盐和阴离子去污剂的第二DNA裂解液加入到生物学材料中。采用二种裂解液有助于在直接裂解大量血液时成功裂解和溶解所有血细胞。
在第四种实施方法中，例如能有效地纯化固定的细胞、或宫颈拭子上的细胞、或固定的宫颈细胞的DNA。简单地将含阴离子去污剂的裂解液加入到生物学材料中，用吸管上下吹打裂解细胞和使蛋白质变性。裂解步骤后，对某些类型的样品，如宫颈拭子，可能需要采用蛋白酶K溶液。在这些样品中加入蛋白酶K，振荡混合样品。65℃培育样品2-3小时。
在上述方法之一的裂解步骤后，可用DNA结合液脱水DNA分子使其有效结合于固相。然后任选采用适当方法，如离心、移液管上下吸取、加压、抽真空，或这些方法与DNA洗涤液联用，除去生物学材料而DNA仍维持与固相结合。可先通过离心除去残留的非核酸生物材料(包括蛋白质、磷脂等)。这样做可使裂解液中未结合的污染物从固相支持物上分离下来。
然后用本领域技术人员已知的足量DNA洗脱液洗脱结合的DNA，将固相支持物离心、加压或抽真空使DNA释放，收集在适当的容器中。
另一方面，本发明提供的试剂盒装有具体使用方案，说明可按照本文所述方法，用本文所述的试剂和任选的固相支持物来从生物学材料纯化DNA。
本发明现将参考以下详述的实施例来进一步说明。这些实施例进一步阐述了各种具体和说明性的实施方式及技术。然而，应理解可对其作出许多变化和修改，但仍属于本发明的范围内。
以下提及的所有原料不难获自商业来源，如Sigma化学公司，St，Louis，MO。除非另有说明，文中所有的百分数是根据试剂总体积的体积百分比。
实施例1：价格分析
为了生产出质量最好的用于固相DNA纯化的产品，该产品应在几个方面都具有极其良好的性能。用于固相纯化DNA的产品应能有效分离纯化各种类型样品中的DNA，和尽可能高的DNA产量。应是用户喜欢的，即其步骤不麻烦，其组分无害、易使用后丢弃。此外，该产品对用户应经济实惠。因此必须寻找成本效益好的溶液组分。表1显示本文评估的各种盐的价格。
Figure BDA00003055621000161
虽然锂盐在这些方法中工作良好，但锂盐LiF和LiI较贵，此外LiF有相当毒性。这些方法中LiCl和LiBr工作良好，ADW价格大约相同为60-65美元/500克。KCl、NaCl和NH4Cl虽然都很经济但不能产生所需量的DNA。
实施例2：固相DNA纯化过程中盐酸盐的溶解度和溶解热数据，及其与LiCl 和LiBr盐的比较
检测了几种盐酸盐的溶解度和性能，并与两种锂盐氯化锂和溴化锂作比较。用其它盐酸盐制备DNA裂解液以检测基于DNA裂解液的缓冲剂和去污剂所获得的最大溶解度。表2显示此研究所测定的几乎是最大的溶解度，是将其与获自《化学和物理手册》(第62版，CRC Press，Boca Raton，FL)的外推至20℃的表内溶解度数据以及表内溶解热数据作比较。
所研究的用于裂解液的大多数盐酸盐的溶解度与4M浓度的氯化锂和溴化锂盐相当，除氯化钾和氯化铵外。与其它盐的相比，氯化钾在水溶液中溶解度只是大约3M，比预期的溶解度低。预计其它盐在水溶液中更易达到4M以上，然而观察到氯化铵盐只能溶解至大约3M，而其预期溶解度约为7M。这可能是由于溶液中存在表面活性剂，如Triton X-100(5%)和DGME(5%)，因为溶液中此二种组分联合的浓度为10%。除盐外，DNA裂解液中的其余组分保持恒定，含有5%Triton X-100、5%DGME(二甘醇单乙醚)、10mM EDTA、10mM TCEP、1%钨酸钠、10mMTRIZMA，pH8.8。
氯化锂和溴化锂溶于水时溶液放出大量热证明了锂盐通常显示的高溶解度。此实施例中的其它盐酸盐显示溶解时吸热，表明这些盐溶于水溶液中时，溶解度不如锂盐。
表2
Figure BDA00003055621000171
*注：数据从化学和物理手册表中列出数据外推至20℃。
实施例3：DNA纯化用去污剂的比较
鉴定了能充分裂解细胞也能在DNA裂解液中保持可溶的去污剂。检测了去污剂Tween、Triton、Nonidet和Igepal家族与一些表面活性剂化合物。
发现这些去污剂中的许多去污剂当与DNA裂解液其它成分混合时随时间变化而皂化或降解从溶液中沉淀出来。例如这发生在用10%Tween-20(聚氧乙烯山梨醇单月桂酯)时。类似现象见于采用等量Triton X-100(叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)和Tween-20的混合物时，虽然这种混合物在长时间内稳定。选择DGME(二甘醇单乙醚)测试其作为表面活性剂促进盐和去污剂组合物溶解的性能。发现5%Triton-X和5%DGME特别好地维持了第一DNA裂解液的溶解度。
抽提宫颈细胞的DNA证明是一种特别的挑战，因需要用蛋白酶K来消化此类样品中坚硬的DNA收集物。裂解液中存在十二烷基硫酸钠(SDS)时工作良好可获得最高的蛋白酶K活性。通过系统测试用蛋白酶K处理的不同裂解液确定了SDS的最佳浓度。在高于或低于室温时较高浓度的SDS(SDS最终浓度大于0.1%)可使裂解液产生沉淀，导致蛋白酶K活性低于所需活性。较低浓度的SDS(SDS最终浓度低于0.1%)可使蛋白酶K活性完全消失，从而有助于完全裂解固定的细胞制品如宫颈细胞。第二DNA裂解液中也含DGME时可使SDS和LiCl在裂解、掺加和结合过程中保持可溶。
开发直接裂解全血技术的主要障碍是去污剂对全血的裂解效率。初步试验致力于采用非离子去污剂Triton X-100来裂解细胞。采用此去污剂导致该直接裂解方法的DNA回收低，可能是由于溶液中的红细胞和红细胞裂解物的干扰所致。TritonX-100不是蛋白变性剂，由于细胞污染物水平高，决定尝试采用含蛋白变性剂的去污剂。为了提高裂解效率，测试了去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)代替非离子去污剂。这提高了DNA回收率但引起纯化时膜堵塞。采用沉淀细胞时显示二种去污剂联用提高了DNA回收率。在直接裂解法中用这二种去污剂提高了DNA回收率和消除了膜堵塞。测试了加入去污剂的顺序(阴离子/非离子对比非离子/阴离子)表明非离子去污剂必须在阴离子去污剂之前加入才能最优回收DNA。
实施例4：用直接裂解法分离血的DNA
在全血样品中加入等到体积的第一DNA裂解液(6M LiCl、5%Triton X-100、5%DGME(二甘醇单乙醚)、10mM EDTA、100mM Tris，pH8.8)。用移液管上下吸取所得溶液5次，高速振荡5次，用移液管上下吸取20次，再振荡5次，获得完全的匀浆液。匀浆后，在样品中加入二倍血体积的第二DNA裂解液(25mM柠檬酸盐、2M LiCl，0.1%SDS、30%DGME、25mM Tris pH9.1)。按上述第一DNA裂解液同样方法混合样品。匀浆和用二种裂解液裂解后，各样品中加入4倍血体积的DNA结合液(10M LiCl、10%DGME、100mM Tris pH7.9)。用移液管上下吸取所得溶液5次混合。
匀浆后将各600微升的裂解匀浆液移入各纯化柱中。该纯化柱的篮子中装有硼硅酸玻璃纤维膜(Whatman D玻璃纤维膜)，放在抽真空洗脱平台内侧。抽真空过滤将裂解液抽滤通过此膜。在柱中加入其余的裂解液，每次600微升，真空过滤抽除。
真空过滤各裂解液使DNA结合于硼硅酸膜表面后，在柱填料中加入400微升DNA洗涤液(5mM EDTA、70%乙醇、100mM Tris HCl pH7.6)，抽真空30秒去除洗涤液。重复加入DNA洗涤液和真空过滤步骤一次，收集洗涤液到同一管中。
为洗脱固相支持物上的DNA，将装有膜的篮子转移到微量离心管中，在柱填料中加入50微升DNA洗脱液(1mM EDTA、10mM Tris pH7.5)，培育5分钟，以最高速度离心一分钟。重复加入DNA洗脱液、培育5分钟和离心步骤一次。进行了5种血体积(300ml、500ml、1ml、1.5ml和3ml)的纯化，跑电泳与200纳克LambdaHind III梯级(标准品)比较。结果表明，采用大量输入体积的全血直接裂解法，可纯化全血获得完整的高分子量DNA。
实施例5：用RBC裂解法分离血的DNA
一种用于分离全血样品DNA的实施方式是先裂解血样品中的红细胞，然后离心沉降红细胞裂解液中的白细胞。倒去红细胞裂解上清液后，洗涤和反复沉降白细胞沉淀，在该沉淀中加入200微升DNA裂解液(6M LiCl、5%Triton X-100、5%DGME(二甘醇单乙醚)、10mM EDTA、100mMTris，pH8.8)振荡裂解白细胞，用移液管吸取DNA裂解液彻底匀浆样品。匀浆后，在白细胞裂解液中加入400微升DNA结合液(10M LiCl、10%DGME、100mM Tris，pH7.90，将混合液加到装有硼硅酸玻璃纤维膜(Whatman D玻璃纤维膜)篮子的纯化柱中，放在2ml微离心管内。然后7000xg离心该微离心管一分钟。离心裂解液后，在柱填料中加入400微升DNA洗涤液(5mM EDTA、70%乙醇、100mM Tris HCl pH7.6)，以最高速度离心微离心管一分钟。重复加入DNA洗脱液、培育5分钟和离心步骤一次。为洗脱柱上的DNA，将装有膜的篮子转移到一新的微离心管中，在柱中加入50微升DNA洗脱液(1mM EDTA、10mM Tris pH7.5)，以最高速度离心微离心管一分钟。重复加入DNA洗脱液、培育5分钟和离心步骤一次，收集洗脱液到同一洗脱管中。
直接与QIAamp血DNA Midi试剂盒(Qiagen Inc，德国)比较，2ml血样品Versagene血DNA(试剂盒)的平均产量大约是QIAamp平均产量的二倍，见图1(也见表3的相关统计)。
表3
Figure BDA00003055621000201
根据每个白细胞含有6pg基因组DNA的假设，计算理论上的产量百分比。在采用图2所示的RBC裂解法和2ml血样品的某些例子中获得了高达预期理论产量约70-80%的产率，其中DNA裂解液组合物的pH和LiCl浓度不同(见表4相关统计)。
表4
Figure BDA00003055621000202
实施例6：分离宫颈细胞的DNA
由于提取宫颈拭子上的细胞或固定的颈细胞的核酸特别困难，故可用其阐明本文所述组合物和方法的效果。然而，本领域技术人员知道本文所述的组合物和方法也可有效地用于其它广泛的生物学样品，本发明可采用的样品类型不受限制。
将宫颈细胞样品收集在
Figure BDA00003055621000203
Pap TestTM(Cytyc，Boxborough，MA)中，2200xg离心5分钟，然后重悬于PBS以洗涤细胞。将重悬细胞置于微离心管中14000xg离心15秒沉降。除去宫颈细胞沉淀上方的PBS上清液。强力振荡各管重悬细胞；这大大有利于细胞裂解。在样品中加入200微升裂解液(25mM柠檬酸盐、2M LiCl，0.1%SDS、30%DGME、25mM Tris pH9.1)重悬细胞，用移液管上下吸取裂解细胞和使蛋白质变性。在细胞裂解液中加入1微升蛋白酶K溶液(20mg/ml)，简单振荡混合；然后65℃培育样品2-3分钟。在样品中加入400微升100%异丙醇DNA结合液。间歇振荡样品30秒，让其静置2分钟然后加入柱中。将样品加到用RNA酶预处理的纯化柱(Gentra Systems，Inc.)上。以7000xg离心样品一分钟。将装有纯化柱的篮子转移到新的清洁管子中。每个纯化柱加入200微升DNA洗涤液(5mM EDTA、70%乙醇、100mM Tris HCl pH7.6)。然后7000xg离心纯化柱一分钟。每个纯化柱再加入200微升DNA洗涤液。7000xg离心纯化柱二分钟。将装有纯化柱的篮子小心转移到新的清洁管子中。每个纯化柱加入50微升DNA洗脱液(1mMEDTA、10mM Tris pH7.5)室温培育5分钟。然后14000xg离心纯化柱一分钟。
直接比较Puregene Liquid Chemistry(Gentra Systems Inc)、Versagene Solid PhaseDNA Chemistry(Gentra Systems Inc)，就初始宫颈样品类型而言，平均产量相似，见下表所示。
表5
Figure BDA00003055621000211
表6
Figure BDA00003055621000212
表7
Figure BDA00003055621000221
本文革所引用的所有出版物、专利、专利申请均纳入本文参考文献。虽然在上述说明书中，已用某些优选实施方式描述了本发明，提供了许多细节目的是说明，但本领域技术人员将理解可对本发明的附加实施方式和详细内容作相当改变而不脱离本发明的基本原理。

Claims (3)

1.一种不用红细胞裂解步骤从生物学材料纯化基本纯和未降解的DNA的直接裂解方法，其特征在于，该方法包括：
(a)使含DNA的生物学材料与第一DNA裂解液接触，该第一DNA裂解液缓冲于pH大于约7并含有约5-15%v/v的表面活性剂和浓度大于1M的DNA络合盐；
(b)使该生物学材料与第二DNA裂解液接触，该第二DNA裂解液含有表面活性剂和浓度高于1M的DNA络合盐；
(c)使该混合液与DNA结合液接触；
(d)使该混合液与固相支持物接触，其中所述含有来自于该生物学材料的基本上未降解DNA的核酸结合该固相支持物；
(e)用DNA洗涤液洗涤该固相支持物以去除含基本上未降解DNA的结合核酸以外的生物学物质，所述DNA洗涤液含DNA络合盐和醇；和
(f)用DNA洗脱液从固相支持物上优先洗脱结合的基本上未降解的DNA。
2.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述第二DNA裂解液还含有螯合剂。
3.一种从生物学材料纯化基本纯和未降解DNA的方法，其特征在于，该方法包括：
(a)使含DNA的生物学材料与缓冲于pH大于约7的DNA裂解液接触，该DNA裂解液含有表面活性剂和浓度大于1M的DNA络合盐；
(b)使该生物学材料与固相支持物接触，其中所述含基本上未降解DNA的核酸结合该固相支持物；
(c)使该固相支持物与DNA结合液接触；
(d)用DNA洗涤液洗涤固相支持物以去除含未降解DNA的结合核酸以外的生物学物质，所述DNA洗涤液含DNA络合盐和醇；和
(e)用DNA洗脱液从固相支持物上优先洗脱结合的基本上未降解的DNA。
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