CN101460636A - 从细胞中提取蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于从细胞,诸如包含病毒蛋白的细胞中产生蛋白质提取物的方法。概括地,所述方法包括:增高所述细胞的pH到至少约pH 10.0,从而产生中间组合物,和然后,在非离子型洗涤剂的存在下,中和所述中间组合物的pH,从而产生蛋白质提取物。本发明还提供了用于实践本主题方法的试剂盒和组合物。
Description
交叉参考
本申请要求于2006年5月11日提交的美国临时申请号60/747,076的权益,将该申请引入本文作为参考。
发明背景
在许多诊断方法中,从受试者中获取细胞并将其存放在含有固定剂的液体培养基中。将细胞固定在培养基中,并通过细胞学方法对其进行检查,从而提供诊断。例如,检测子宫颈组织中的癌前或癌细胞通常通过显微镜评估脱落的子宫颈细胞进行。这种由George N.Papanicolaou开发并称为“Pap”检验的方法包括利用取样装置从女性子宫颈剥离细胞,将剥离的细胞存放在含有固定剂的运送培养基中,和然后将该细胞放置在载玻片上。然后,染色细胞,并由受训的医学专业人员通过光学显微镜法检查细胞的异常性。仅在美国,每年进行超过5千5百万次的Pap检验。
尽管该细胞学检验很成功,但是该检验容易出错。例如,估计多至40%的常规Pap检验受到存在污染物诸如粘液、血细胞和不明显的炎性细胞的危害。这些污染物引起假阴性结果、假阳性结果、和巨大的后继工作量。参见,例如,Koss,L.G.(1989),用于子宫颈癌检测的巴帕尼科拉乌试验:成功和灾难(The Papanicolaou Test for Cervical Cancer Detection:A Triumphand a Tragedy),JAMA 261:737-743;还参见DeMay,“Pap涂片解释中的问题”("Problems in Pap Smear Interpretation"),病理学实验室医学纪录(Arch.Pathol.Lab.Med.)121:229-23(1997)。
鉴于上述内容,存在着对用于分析在含有固定剂的液体培养基中存在的细胞的补充分子诊断方法的需要。然而,该方法不是直接的,因为不总是可能在固定的细胞上进行该方法。例如,某些固定剂(例如,THINPREPTM或SUREPATHTM检验系统中使用的那些运送培养基)可以导致特定细胞的蛋白质沉淀或聚集,由此使得那些蛋白质不能溶解并难于或不可能通过常规方法,例如利用酶联免疫吸附测定(ELISA)或其他免疫学检验,得到可靠的检测。
因此,存在着对从固定的细胞中,以这样的方式提取蛋白质的方法和组合物的巨大需要,所述方式容许提取的蛋白质适合于在分子测定,例如免疫学检测测定中使用。本文描述的发明满足了这一需要以及其他需要。文献
感兴趣的文献包括:美国专利6,890,729,6,337,189和公布的美国专利申请20050032105。
发明概述
本发明提供了用于从细胞,优选固定的细胞中产生蛋白质提取物的方法。概括地,该方法包括:增高所述细胞的pH到至少约pH 10.0,从而产生中间组合物,和然后,在非离子型洗涤剂的存在下,中和所述中间组合物的pH,从而产生所述蛋白质提取物。该方法可以包括:a)使所述细胞与提取试剂相接触,从而产生具有至少约pH 10.0的pH的中间组合物;和b)使所述中间组合物与中和试剂相接触,从而中和所述中间组合物的pH,并产生蛋白质提取物。所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者含有所述非离子型洗涤剂。在某些实施方案中,固定的细胞可以是固定的脱落子宫颈细胞。
定义
除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中普通技术人员的通常理解相同的含义。尽管如此,为了清楚和容易参考的好处,在下文中定义了某些要素。
当用于本文时,术语“细胞样品”涉及含有一种或多种目的细胞的液体组合物。细胞样品可以是含有从个体取出(例如,切除或剥离)的细胞的临床样品,所述细胞包括但不仅限于,例如,来自血浆、血清、脊髓液、精液、淋巴液、皮肤表面部分、呼吸道、肠道、和生殖泌尿道、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、或器官的细胞。在其他实施方案中,细胞样品可以包含体外生长的细胞(包括但不仅限于在细胞培养基中的细胞、病毒感染的细胞、重组细胞、等)。在某些实施方案中,细胞样品可以包含最容易被HPV感染的细胞。在这些实施方案中,可以从子宫颈、外阴、阴道、肛门、阴茎、口腔或喉咙中获得细胞。在某些实施方案中,细胞来自粘膜,并可以是上皮来源的。除剥离或切除的细胞外,细胞样品可以或可以不包含污染物。例如,粘液细胞、或细菌细胞、酵母细胞或血细胞可以存在于细胞样品中。
“HPV”是人乳头瘤病毒属,其包括但不限于HPV毒株4、11、20、24、28、36、48、50、16、18、31、35、30、39、45、51、52、56、59、58、33、66、68、69、26、53、73、和82。
“致癌HPV毒株”是已知为如由国家癌症研究所(NCI,2001)确定的引起子宫颈癌的HPV毒株。
“致癌E6蛋白”是由致癌HPV毒株编码的E6蛋白。示范性的致癌毒株是:HPV 26、HPV 53、HPV 66、HPV 73、HPV 82、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 35、HPV 30、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 59、HPV 58、HPV 33、HPV 66、HPV 68、HPV 69、和HPV 82。致癌E6蛋白的氨基酸序列存放在NCBI基因库(NCBI′s GenBank)数据库中。虽然不希望受到理论的限制,但是通常认为HPV毒株4、11、20、24、28、36、48、和50不是致癌的。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。术语“多肽”包括这样的多肽和肽,在所述多肽中用非-天然存在的或合成的主链替换常规主链,且在所述肽中用一个或多个非-天然存在的或合成的氨基酸替换一个或多个常规氨基酸。
术语“融合蛋白”或其语法等价物指由许多多肽成分组成的蛋白质,所述多肽成分在不以它们的天然状态附着时,由它们各自的氨基和羧基末端通过肽键连接,从而形成单一连续多肽。融合蛋白可以是2、3或甚至4或更多个不同蛋白质的组合。术语多肽包括融合蛋白,其包括但不仅限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合、具有或不具有N-末端的甲硫氨酸残基的融合;免疫学标记的蛋白质;具有能检测的融合配偶体的融合蛋白,例如包括荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等作为融合配偶体的融合蛋白。
通常,多肽可以是任意长度,例如多于2个氨基酸,多于4个氨基酸,多于约10个氨基酸,多于约20个氨基酸,多于约50个氨基酸,多于约100个氨基酸,多于约300个氨基酸,通常多达约500或1000或更多个氨基酸。“肽”通常多于2个氨基酸,多于4个氨基酸,多于约10个氨基酸,多于约20个氨基酸,通常多达约50个氨基酸。在一些实施方案中,肽为5-30个氨基酸长。多肽可以是天然的,其中它们可以由生物体或病毒的基因组编码,或是非-天然的,其中它们非天然存在。
术语“捕获剂”指通过这样的相互作用结合蛋白质的试剂,所述相互作用足以允许该试剂结合和浓缩来自不同蛋白的均匀混合物中的蛋白质。因此,术语“捕获剂”指这样的分子或多分子复合物,其能够以低于约10-6M的解离常数(KD),特异性结合分析物,例如,特异性结合关于所述捕获剂的分析物,而不结合其他靶标。该结合相互作用可以由捕获剂的亲合区域介导。代表性的捕获剂包括抗体(包括其片段和模拟)和含有PDZ结构域的蛋白质,等。
术语“特异性结合”指捕获剂优先结合存在于不同蛋白质的均匀混合物中的特定蛋白质的能力。在某些实施方案中,特异性结合相互作用应该区分样品中的特定蛋白质和其他蛋白质,在一些实施方案中,超过约10-100倍或更多(例如,超过约1000-或10,000-倍)。
术语“捕获剂/蛋白质复合物”是由捕获剂与蛋白质的特异性结合产生的复合物,即“结合配偶体对”。捕获剂和关于该捕获剂的蛋白质在“适合于特异性结合的条件”下,彼此特异性结合,其中所述条件是容许在处于溶液中的捕获剂和待结合的蛋白质之间发生结合的那些条件(在盐浓度、pH、洗涤剂、蛋白质浓度、温度、等方面)。该条件,特别是关于抗体和它们的抗原,是本领域中众所周知的(见,例如,Harlow和Lane,抗体:冷泉港实验室实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Laboratory),冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约(1989))。在某些实施方案中,特异性结合在捕获剂/蛋白质复合物中的捕获剂和蛋白质之间的亲和性由KD(解离常数)表征,所述KD低于10-6M,低于10-7M,低于10-8M,低于10-9M,或低于约10-10M。
“结合配偶体”和等价物指能够存在于捕获剂/分析物复合物中的,即表现出彼此间特异性结合的分子对。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用,指具有至少一个抗体表位结合结构域的捕获剂。这些术语是本领域技术人员所熟知的,且指含有一种或多种与抗原特异性结合的多肽,一种抗体形式构成抗体的基本结构单位。该形式是四聚物,且由两对相同的抗体链组成,每对具有一条轻链和一条重链。在每对中,轻链和重链可变区共同负责与抗原的结合,且恒定区负责抗体效应器功能。
识别的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链和α、γ(IgG1,IgG2,IgG3,IgG4)、δ、ε和μ重链或其他物种中的等价物。全长免疫球蛋白“轻链”(约25kDa或约214个氨基酸)包括位于NH2-末端的约110个氨基酸的可变区和位于COOH-末端的κ和λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”(约50kDa或约446个氨基酸),类似地包括可变区(约116个氨基酸)和一个上述重链恒定区,例如λ(约330个氨基酸)。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体和免疫球蛋白,保持与抗原特异性结合的抗体片段,其包括但不仅限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、以及包括抗体的抗原-结合部分和非-抗体蛋白的融合蛋白。可以例如利用放射性同位素,产生可检测产物的酶、荧光蛋白等,可检测地标记所述抗体。抗体可以进一步与其他部分,诸如特异性结合对成员,例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的成员)等缀合。抗体还可以与固相支持体结合,所述固体支持体包括但不仅限于聚苯乙烯平板或珠,等。该术语还包括Fab′、Fv、F(ab′)2和或其他保持与抗原特异性结合的抗体片段。
抗体可以以多种其他形式存在,所述其它形式包括例如,Fv、Fab、和(Fab′)2、以及双-功能(即,双-特异性)杂种抗体(Lanzavecchia等,欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)17,105(1987)),并且以单链存在(例如,Huston等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),85,5879-5883(1988)和Bird等,科学(Science),242,423-426(1988),将其引入本文作为参考)。(参见,通常,Hood等,“免疫学”("Immunology"),Benjamin,N.Y.,第2版.(1984),和Hunkapiller和Hood,自然(Nature),323,15-16(1986))。单克隆抗体和“噬菌体展示”抗体在本领域中众所周知,且包含在术语“抗体”中。
术语“评估”包括任何形式的测量,并包括确定元素是否存在。术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”和“测定”可互换使用,并且可以包括定量和/或定性的确定。评估可以是相对的或绝对的。“评估……的存在”包括确定某物存在的量,和/或确定其是存在还是不存在。
“远程位置”意指除了获得细胞并将其存放在含有固定剂的液体中的位置以外的位置。例如,远程位置可能是在获得细胞的同一建筑物中的不同房间(例如,另一个实验室),在获得细胞的同一建筑群中的不同建筑物,或同一城市、州或国家中不同的位置,等。例如,当显示细胞样品是从远程位置“接收”的时,该细胞样品可以从远程位置获得,或从远程位置交送、邮寄或信使递送。
“传达“信息指从一个位置到另一个位置获得信息的任何方法,无论是通过实体传送包含该信息的打印材料,还是通过计算机可读媒体(例如,通过邮寄),或通过传输信息。如果传输信息,则通过合适的通讯通道(例如,私人的、公共的或无线网络)传输代表该信息的数字或模拟信号(例如,电磁信号,诸如光或电信号)。可以使用任何便利的方法传输数据,例如传真、调制解调器、因特网、电子邮件、等。
用于本文时,术语“运送培养基”用于描述适合于收集细胞和以某种方式保存那些细胞的液体,所述方式是容许它们适合于基于-液体的细胞学研究。Pap检验中普遍使用运送培养基。可以或不可以将运送培养基中存放的细胞在该培养基中,从一个位置运输到另一个位置。运送培养基含有固定剂。将细胞存放在运送培养基中固定该细胞,从而产生固定的细胞。典型的运送培养基包括SUREPATHTM或PRESERVCYTTM运送培养基。
“固定的细胞”是用化学固定剂处理或通过化学固定剂细胞学保存的细胞。固定的细胞通常适合于染色和随后通过光学显微镜法进行的形态学和/或细胞学分析。
作为参考的引入
以如同每篇单独出版物或专利申请特别和分别指出进行参考引用的相同的程度,通过参考将本说明书提及的所有出版物和专利申请引入本文。
发明详述
尽管在本文中显示和描述了本发明的优选实施方案,但是所述实施方案仅以举例的方式提供,这对于本领域技术人员而言是显然的。现在,在不偏离本发明的条件下,本领域技术人员应该想到许多变体、改变、和替换。应该理解本文中所述发明的实施方案的不同备选方案可以用在本发明的实践中。下列权利要求意欲定义本发明的范围,且这些权利要求范围内的方法和结构以及它们的等价物包括在其中。
本发明提供了用于从固定的细胞中产生蛋白质提取物的方法。概括地,该方法包括:增高固定的细胞的pH到至少约pH10.0的pH,从而产生中间组合物,并且然后,在非离子型洗涤剂的存在下,中和中间组合物的pH,从而产生蛋白质提取物。该方法可以包括:a)使固定的细胞与提取试剂接触,从而产生具至少约pH 10.0的pH的中间组合物,和b)使所述中间组合物与中和试剂接触,从而中和中间组合物的pH,并产生蛋白质提取物。所述提取试剂和中和试剂之一或二者含有非离子型洗涤剂。在某些实施方案中,固定的细胞可以是固定的脱落的子宫颈细胞。本发明还提供了用于实施本主题方法的试剂盒和组合物。本主题方法用于多种不同的应用,包括在由此产生的蛋白质提取物中检测特殊蛋白质的诊断检验中。
进一步描述本发明前,应该理解本发明不受限于以下所述的本发明的特殊实施方案,因为可以产生所述特殊实施方案的变体,并且其仍然属于所附权利要求的范围。还应该理解,所使用的术语是为了描述特殊实施方案的目的,且不意欲进行限制。替代地,本发明的范围应该由所附权利要求确定。
在该说明书和所附权利要求中,单数形式“一”("a")、“一”("an")和“这”("the")包括复数参考,除非上下文另外明确指示。
在提供数值范围时,除非上下文另外明确指示,应该理解为本发明包括在该范围上限和下限之间的每个介于其间的数值,直到下限单位的1/10,和该指定范围内的任何其他指定的或介于其间的数值。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该较小的范围内,并也包括在本发明内,服从于该指定范围内的任何明确排除的界限。当该指定范围包括所述界限中之一或二者时,排除那些包括的界限之一或二者的范围也包括在本发明中。
除非另外定义,本文中使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员普遍理解的相同的含义。尽管类似于或等价于本文所述内容的任何方法、装置和材料能够用在本发明的实践或检验中,现在描述优选的方法、装置和材料。
出于描述和公开在可以与本文所述的方法联合使用的公布中所描述的要素的目的,将本文提及的全部出版物引入本文作为参考。
如上总结,本主题发明提供用于从固定的细胞中产生蛋白质提取物的方法和组合物。在对本发明更详细的描述中,首先描述了该方法,随后描述在实践本主题方法中使用的试剂盒和系统。
蛋白质提取的方法
如上所示,本发明提供用于从固定的细胞中产生蛋白质提取物的方法。通常,该方法包括两个步骤:a)使所述固定的细胞与具有高于约pH10.0的pH的提取试剂相接触,从而产生中间组合物,和b)使所述中间组合物与中和试剂相接触。所述提取试剂和/或中和试剂含有非离子型洗涤剂。由此产生的蛋白质提取物含有非离子型洗涤剂,并具有中性pH(即,约pH 7.0-约pH 8.0)。该方法通常产生含有这样的蛋白质的蛋白质提取物,所述蛋白质容易通过利用有关那些蛋白质的捕获剂检测。同样地,由本方法产生的蛋白质提取物通常适合用于为了检测那些蛋白质的结合测定,例如免疫学测定。
在某些实施方案中,所述方法可以包括:增高固定的细胞的pH到至少约pH 10.0的pH,从而产中间组合物,和然后,在非离子型洗涤剂的存在下,中和所述中间组合物的pH,从而产生所述蛋白质提取物。由于,如上所述,非离子型洗涤剂可以存在于提取试剂或中和试剂(或提取试剂和中和试剂的二者)中,所以本方法的某些实施方案包括:a)使固定的细胞与提取试剂相接触,从而产生具有至少约pH 10.0的pH的中间组合物;和b)使所述中间组合物与包含非离子型洗涤剂的中和试剂相接触;从而中和所述中间组合物的pH并产生蛋白质提取物。在其他实施方案中,本方法可以包括:a)使固定的细胞与包含非离子型洗涤剂的提取试剂相接触,从而产生具有至少约pH 10.0的pH的中间组合物;和,b)使所述中间组合物与中和试剂相接触;从而中和所述中间组合物的pH并产生蛋白质提取物。
在某些实施方案中,由本方法产生的蛋白质提取物可以比利用其他方法,例如不使用:高pH提取步骤(即,增高pH到高于约pH 10.0或pH11.0的步骤)、中和步骤(即,增高pH到约pH 7.0-约pH 8.0的步骤)和非离子型洗涤剂的方法生成的蛋白质提取物含有更多易受捕获剂影响的蛋白质。单独的高pH和单独的非离子型洗涤剂都不产生这样的蛋白质提取物。在特殊的实施方案中,高pH提取试剂溶解在固定的细胞中的蛋白质,而非离子型洗涤剂防止中间组合物中溶解的蛋白质在中和所述中间组合物的pH时再-聚集或沉淀。
以下更详细地描述了本方法中使用的试剂和由本方法产生的蛋白质提取物,并描述了可以如何使用所述试剂产生蛋白质提取物。如下文中所讨论地,本方法中使用的试剂的最适浓度和pH可以根据使用哪种试剂而变化。然而,通过试验或经验的方法,容易确定试剂的最适浓度和pH。通过利用本发明的方法从中提取蛋白质的细胞
本发明所述的方法学能够用于从细胞样品中提取靶蛋白或目的蛋白。细胞样品可以是同源细胞群、或不同类型细胞的异源混合物。样品细胞还可以含有“污染物”,诸如粘液、血液细胞和炎性细胞,所述污染物不是靶蛋白提取目的的兴趣或不含有靶蛋白。
在一些实施方案中,靶蛋白是在受到病毒、优选地病理学病毒感染的细胞中存在的病毒蛋白,并且所述细胞优选地是从哺乳动物,例如人中分离的细胞。
致病病毒可以是在人或其他动物中引起致病作用或疾病的任何致病病毒。所述致病病毒可以是人免疫缺陷病毒(HIV)的不同毒株,诸如HIV-1和HIV-2。病毒蛋白可是HIV糖蛋白(或表面抗原)诸如HIV GP120和GP41,或衣壳蛋白(或结构蛋白)诸如HIV P24蛋白。
致病病毒可以是依波拉或马尔堡病毒。病毒蛋白可以是依波拉糖蛋白或表面抗原,诸如依波拉GP 1或GP2蛋白。
致病病毒可以是肝炎病毒,诸如甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒。例如,病毒蛋白可以是乙型肝炎病毒的表面抗原或核心蛋白,诸如小乙型肝炎表面抗原(SHBsAg)(也称为澳大利亚抗原(Australia antigen)),中乙型肝炎表面抗原(MHBsAg)和大乙型肝炎表面抗原(LHBsAg)。病毒抗原可以是丙型肝炎病毒的表面抗原或核心蛋白,诸如NS3、NS4和NS5抗原。
致病病毒可以是呼吸道合胞病毒(RSV)。例如,RSV病毒蛋白可以是RSV的糖蛋白(G-蛋白)或融合蛋白(F-蛋白)。
致病病毒可以是单纯疱疹病毒(HSV),诸如HSV-1和HSV-2。例如,HSV病毒抗原可以是来自HSV-2的糖蛋白D。
靶蛋白可以是肿瘤抗原,诸如乳腺癌细胞的Her2和淋巴瘤细胞上的CD20,靶蛋白可以是病毒致癌基因诸如人乳头状瘤病毒的E6和E7,或是细胞致癌基因诸如突变的ras。
在一些实施方案中,细胞样品含有其中存在靶蛋白的固定的细胞。本方法中使用的固定的细胞通常通过将细胞(例如,通过解剖、剥离或灌洗从受试者切除细胞而获得)样品存放在液体培养基中获得。可以将细胞样品存放在已经包含化学固定剂的液体培养基中,或在将细胞置于所述培养基后,可以向所述液体培养基中添加化学固定剂。含有固定剂和固定的细胞的液体培养基在本文中称为"细胞样品"。
本方法中可以使用的典型化学固定剂包括:醇(例如,甲醇或乙醇),醛(例如,戊二醛(gluteraldehyde)或甲醛)和酮(例如,丙酮),以及四氧化锇,乙酸,苦味酸和重金属离子盐。本方法可以使用的其他固定剂的实例包括基于亚硫酸氢盐的固定剂(其可以还包括乙酸),基于-PVP的固定剂(其可以还含有丙二醇和甲醇)以及美国专利号3,546,334、4,578,282、4,857,300、5,104,640、5,256,571、5,432,056和5,196,182中记述的那些。本方法可能使用的固定剂的实例,包括那些固定剂的工作浓度,可以参见Baker,(生物学显微技术原理:固定和染色的研究(Principles of BiologicalMicrotechnique:A Study of Fixation and Dyeing),1959)和Williams(“用于免疫细胞化学的组织制备”("Tissue preparation forimmunocytochemistry"),临床病理学杂志(J Clin Pathol)1997 50:422)。
本方法中特别感兴趣的是被称为"运送培养基"并常规作为妇科检查一部分的,用于收集、保存(即,固定)和运送子宫颈阴道细胞(例如,脱落的子宫颈细胞)的液体培养基。FDA批准的运送培养基是特别感兴趣的。
可以使用的可商购运送培养基的实例包括:例如,基于甲醇的PRESERVCYTTM运送培养基(其作为Mass.莫尔伯勒(Marlborough)Cytyc,公司,的THINPREPTM妇科取样试剂盒的一部分出售),基于乙醇的、正式称为CYTORICHTM的SUREPATHTM运送培养基(TriPath,公司.Burlington,N.C.),和基于甲醇的CYTOLYTTM运送培养基(Cytyc,公司,莫尔伯勒(Marlborough),Mass.).
可以通过常规方法,包括但不仅限于剥离(例如,刮)、解剖和灌洗,获得细胞。特别感兴趣的是子宫颈来源的上皮细胞,该细胞典型地是通过利用适合的刷子、抹刀或刮刀的剥离方法获得的,并将其存放在含有固定剂的液体培养基中。
提取试剂
本方法中使用的提取试剂含有以这样的量存在的成分,所述量在浓度上足以随着将该提取试剂加入到固定的细胞中,产生具有至少pH 10.0的pH的蛋白质提取物。因此,所述提取试剂通常具有至少约pH 10.0的pH。
使提取试剂与固定的细胞相接触,从而产生中间组合物。提取试剂和由此产生的中间组合物的pH通常是至少约pH 10.0,例如,在约pH 10.0-约pH 13.0或约pH 11.0-约pH 12.0的范围内。在某些实施方案中,提取试剂可以具有约pH 10.0-约pH 10.5、pH 10.5-约pH 11.0、pH 11.0-约pH 11.5、pH 11.5-约pH 12.0、pH 12.0-约pH 12.5或pH 12.5-约pH 13.0的pH。例如,提取试剂可以利用任何合适的氢氧离子,例如氢氧化钠或氢氧化钾,或碳酸钙来源制成。
在某些实施方案中,提取试剂可以不含有显著量的变性剂。然而,在其他实施方案中,除了具有至少10.0的pH外,提取试剂还可以含有变性剂,例如,离子型洗涤剂,诸如十二烷基硫酸钠(SDS)或十二烷基肌氨酸钠,或离液剂,诸如尿素。在这些实施方案中,变性剂,如果存在的话,可以以这样的浓度存在,所述浓度不显著降低将来测定的灵敏性。在某些实施方案中,在样品处理过程中,变性剂的浓度可以降低,例如,通过在使用前对蛋白质提取物使用中和缓冲剂或添加稀释剂,例如缓冲液或水而稀释变性剂。
根据所使用的变性剂的强度和提取缓冲液的pH,变性剂可以以约0.01M-约0.05M、约0.05M-约0.1M、0.1M-约0.2M、约0.2M-约0.5M、约0.5M-约1.0M、约1.0M-约2.0M、约2.0M-约4.0M、或约4.0M-约8.0M的浓度存在于提取缓冲液中。变性剂,如果存在于提取试剂中的话,可以以这样的浓度存在,所述浓度充分低于使蛋白质变性典型使用的变性剂浓度。换言之,提取试剂可以含有处于这样浓度的变性剂,所述浓度容许在按照本主题方法产生蛋白质提取物后,利用关于那种蛋白质的捕获剂检测蛋白质。所使用的变性剂浓度通常足以产生含有这样的蛋白质的蛋白质提取物,所述蛋白质是在使用捕获剂的结合测定,例如在抗体检测测定中可容易检测的。
本提取试剂中的示范性变性剂及其浓度:十二烷基硫酸钠(SDS):约0.01%-约2%,例如,0.05%,肌氨酰:约0.01%-约5%,例如,0.5%,胍:约0.1M-约6M,例如,约0.5M,和尿素:约0.1M-约8M,例如,约0.5M,重量/体积。
典型地使用浓度为0.1%-0.5%的SDS变性蛋白质,典型地使用浓度为2%w/v的肌氨酰变性蛋白质,典型地使用浓度为2M-8M的尿素变性蛋白质,典型地使用浓度为3M-8M的胍变性蛋白质,典型地使用浓度为5%w/v的N-十六烷基三甲基铵氯化物变性蛋白质,且典型地使用浓度为2%,w/v的N-辛基葡萄糖苷变性蛋白质(见蛋白质纯化手册(Proteinpurification Handbook),安玛西亚法玛西亚生物技术(Amersham PharmaciaBiotech),第71页(1999))。
如果提取试剂不存在变性剂,则该试剂可以具有至少约pH11.0的pH。如果提取试剂含有洗涤剂,则该提取试剂的pH可以具有至少约pH10.0的pH。
如在下文中更详细描述地,在某些实施方案中,提取试剂还可以含有非离子型洗涤剂。
在某些实施方案中,提取试剂可以含有缓冲剂,从而将该试剂维持在理想的pH。如果本主题提取试剂中存在缓冲剂,则该缓冲剂在25℃,可以具有约9.0-约12.5范围内的pKα。可以在主题蛋白质提取试剂中使用的示范性缓冲剂包括例如,CABS、哌啶、磷酸盐、CAPS、甘氨酸或乙醇胺。在高于约pH 10.0的pH处具有很小或不具有缓冲能力的缓冲剂(例如,tris、tricine、hepes、等)通常不用于缓冲提取试剂的pH,但是仍然可以存在于提取试剂中。
除上述成分外,本主题蛋白质提取试剂可以含有其他成分,例如盐离子螯合剂、蛋白酶抑制剂、等。
蛋白质提取试剂可以是液体或固体组合物,并且在某些实施方案中,可以含有不同变性剂的组合。
本提取缓冲液中可以使用的变性剂通常是强变性剂,且包括但不仅限于:离液剂(例如,尿素、盐酸胍、或硫氰酸盐诸如硫氰酸钠或硫氰酸胍、碘化钠、高氯酸钠等;参见K.Hamaguchi等,国家科学院学报(Proc Natl.Acad.Sci.)62:1129-1136,1962)和离子型洗涤剂(例如,十二烷基硫酸钠(SDS),十二烷基肌氨酸钠或N-十六烷基三甲基铵氯化物),其包括阳离子、阴离子和两性离子洗涤剂(诸如CHAPS或CHAPSO)。本方法中可以使用的其他变性剂列在美国专利6,488,671的第7和8栏中,将其全部内容引入本文作为参考。
在某些实施方案中,不使用弱变性剂,诸如LiCl、LiClO4、LiBr、CaCl2或NaCl作为提取缓冲液中的变性剂,尽管在提取缓冲液或蛋白质提取物中除了前段列出的变性剂外,可以存在这样的化合物。
如上所示,使提取试剂与固定的细胞相接触(例如,结合或混合)。在某些实施方案中,可以将含有固定的细胞的细胞样品(例如,含有固定的细胞的运送培养基)直接加入到提取试剂中。在其他实施方案中,可以在向蛋白质提取试剂添加固定的细胞之前,从细胞样品中分离(例如,通过沉降、离心、过滤或亲合方法)固定的细胞。在加入到提取试剂中前,可以清洗细胞,或使细胞与其他试剂相接触。
全部或一部分可用的固定的细胞可以与提取试剂相结合。例如,在某些实施方案中,一部分固定的细胞可以在细胞学检验中使用,并且一部分固定的细胞可以与提取试剂相接触,从而产生中间组合物。固定的细胞和提取试剂可以结合并被维持在合适的温度(例如,冰上,在约室温下或在约37℃)并且持续合适的时间(例如,10秒-24小时),从而产生中间组合物。在某些实施方案中,在使固定的细胞与提取试剂相接触后,立即使中和试剂和中间组合物相接触。
中和试剂
本方法中使用的中和试剂具有随着与所述中间组合物相接触,足以中和上述中间组合物pH的pH。换言之,中和试剂含有非离子型洗涤剂,并具有这样的pH,所述pH在该中和试剂与中间组合物相混合时,足以中和该中间组合物的pH。如在下文中更详细描述地,在某些实施方案中,中和试剂可以含有非离子型洗涤剂
中和试剂的pH足以中和通过使固定的细胞与主题提取试剂相接触产生的中间组合物。根据提取试剂的pH和是否使用缓冲剂,中和试剂的pH可以是pH 4.0-pH 8.0。在某些实施方案中,中和试剂可以具有约pH 4.0-约pH 4.5、pH 4.5-约pH 5.0、pH 5.0-约pH 5.5、pH 5.5-约pH 60、pH 6.0-约pH 6.5、pH 6.5-约pH 7.0或pH 7.0-约pH 7.5的pH。例如,中和试剂可以是利用任何合适的氢离子来源,例如盐酸或乙酸制成的。在某些实施方案中,中和试剂可以具有低于pH 4.0的pH。
中和试剂可以是缓冲的或非缓冲的。例如,如果所述中和试剂是缓冲的,则所述中和试剂可以是利用具有约6-约8的pKa的任何缓冲剂,例如,tris,hepes或tricine缓冲的。
如上所示,提取试剂和/或中和试剂可以含有非离子型洗涤剂
在某些实施方案中,使用的非离子型洗涤剂可以是乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)、n-辛基葡萄糖苷、TRITONTM洗涤剂诸如TRITONTMX-100、辛基β-硫葡糖吡喃糖苷、TWEENTM洗涤剂诸如吐温-20、或NP-40。根据所用洗涤剂的强度,洗涤剂可以以约0.01M-约0.05M、约0.05M-约0.1M、01M-约0.2M、约0.2M-约0.5M、约0.5M-约1.0M、约1.0M-约2.0M、约2.0M-约4.0M、或约4.0M-约8.0M的浓度存在于提取缓冲液或中和缓冲液中。美国专利6,488,671的第7和8栏中列出了可以在本方法中使用的其他洗涤剂,将其全部内容引入本文作为参考。在某些实施方案中,洗涤剂可以存在于提取和中和缓冲液二者中。
本中和和/或提取试剂中的示范性洗涤剂及其浓度包括:Triton X-100:约0.1%-约10%,例如,约1%,NP40:约0.1%-约10%,例如,约1%,和吐温-20:约0.1%-约10%,例如,约1%,重量/体积。
如上所示,使中和试剂与中间组合物相接触(例如,结合或混合),从而产生具有中性pH(即,在约pH 6.5-约pH 8.0范围内,例如,在约pH 7.0-约pH 7.8范围内的pH)的蛋白质提取物。蛋白质提取物还含有来自固定的细胞的蛋白质、处于以上列出的浓度的非离子型洗涤剂,和在某些实施方案中,用于将蛋白质提取物维持在特定pH范围内的缓冲剂。如果将变性剂加入到固定的细胞中,则蛋白质提取物还可以含有该变性剂。pH、洗涤剂的选择和所用洗涤剂的浓度(和,如果使用变性剂,则变性剂的确定和浓度)足以容许蛋白质提取物直接用于结合测定,从而检测在蛋白质提取物中存在的蛋白质。
细胞提取物的中和还可以通过使该提取物流经充满中和试剂的过滤器或过滤嘴而实现。在提取物流过过滤材料时,中和试剂被溶解,且该提取物的pH接近中性。
用于中和细胞提取物的备选方法是使所述提取物流过经处于中性pH的溶液预-平衡的BioSpin柱(BioRad)。还可以将提取物置于容纳含有中和剂的凝胶(或过滤材料)的注射器或相似的装置中,并通过正压从所述注射器中递送。
在某些实施方案中,本主题蛋白质提取物含有溶解的HPV E6蛋白(特别是来自HPV致癌毒株的E6蛋白质),所述HPV E6蛋白在对蛋白质提取物不进行进一步处理的条件下(例如,在不进一步加入变性剂、改变pH或加热的条件下),容易被捕获剂接近和容易检测。蛋白质提取物还可以含有溶解的或不可溶的膜、除HPV E6蛋白外的蛋白质、和其他细胞内容物诸如DNA、RNA、碳水化合物、等。还可以存在其他污染物,诸如源自原始细胞样品的mucal污染的那些。蛋白质提取物成分通常不含有完整的(即,细胞学完整)细胞。
蛋白质提取物可以立即使用,或在使用前,例如,以冷冻形式对其进行保存。
在特殊的实施方案中,由上述方法产生的蛋白质提取物可以用在蛋白质检测方法中,下文中更加详细地描述了该方法。
如由上文明显地,在上述试剂中可以使用多种不同的变性剂、洗涤剂、缓冲剂、pH和组分浓度。任何试剂中的最佳变性剂、洗涤剂、缓冲剂或pH、或组分浓度是容易利用常规方法确定的。
中和细胞提取物后,通过用含有关于E6的粘合剂的粒子温育该提取物,可以从所述细胞提取物中浓缩E6蛋白。粘合剂可以包括PDZ、E6关联蛋白(E6AP)或其片段、或E6结合蛋白(E6BP)或其片段。在E6被该粒子捕获后,清洗该粒子,并且然后通过用处于高于10的pH的缓冲剂温育,将E6从所述粒子中释放出来。将粒子从洗脱溶液中分离出来,并且然后通过前述过程中和剩余的溶液。备选地,可以在不从所述捕获粒子中释放出来的条件下,检测E6蛋白。
蛋白质检测方法
由上述方法制成的蛋白质提取物可以直接或间接地(即,添加其他试剂后)用于评估在该蛋白质提取物中存在一种或多种蛋白质的方法中。蛋白质检测法通常包括特异性结合蛋白质的捕获剂。在进行所述方法时,待检测蛋白质的身份可以是已知的(即,预-确定的)或未知的身份。
可以利用本主题蛋白质检测方法检测的蛋白质包括这样的蛋白质,所述蛋白质是疾病或病症,例如癌症、炎症疾病、或由例如病毒、细菌或真菌引起的感染的诊断标记。在某些实施方案中,利用本主题方法检测的蛋白质是常规不可检测的,除非使用本主题蛋白质提取物方法。
可以利用本方法检测的示范性蛋白质包括由传染性介质,诸如人乳头状瘤病毒(HPV)编码的蛋白质。在特殊的实施方案中,本方法可以用于检测HPV的E6蛋白质,其是被证明在由固定的细胞制成的蛋白质提取物中通过其他方法很难或不可能检测的蛋白质。
概括地,蛋白质检测方法是本领域中众所周知的,且包括结合测定,即,检测蛋白质和关于该蛋白质的捕获剂之间结合的测定。所述测定包括免疫测定,即,使用与蛋白质特异性结合的抗体的结合测定,包括但不仅限于,利用诸如下列技术的竞争和非-竞争测定系统:仅指出一些,蛋白质印迹法、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、"夹心"免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体-固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、和蛋白质A免疫测定。所述测定是本领域中常规的和众所周知的(见,例如,Ausubel等,编,1994,分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology),卷1,John Wiley和Sons,公司,纽约,将其全部内容引入本文作为参考)。以下简要描述示范性免疫测定。
免疫沉淀方案通常包括产生蛋白质提取物,向蛋白质提取物中添加捕获剂,例如抗体,和在一段合适的时间和温度下,培养所述蛋白质提取物和捕获剂。捕获剂然后与固相支持体,例如,亲合基底诸如与蛋白质A和/或蛋白质G相连的珠子相结合,并温育和清洗该混合物。将固相支持体重新混悬在样品缓冲液中,并可以通过例如,蛋白质印迹法检测目的蛋白质。
ELISA可以包括制备蛋白质提取物,连接蛋白质提取物和固相支持体(例如,多孔微量滴定平板的孔),使该支持体-结合的蛋白提取物与捕获剂例如抗体相接触,和检测所述捕获剂和所述蛋白质之间的结合。在某些ELISA方法中,在使捕获剂与支持体-结合的蛋白提取物相接触前,可以用可检测部分如酶底物(例如,辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)可检测地标记捕获剂。然而,在其他实施方案中,通过可检测的第二捕获剂(例如,第二抗体),可以检测捕获剂与蛋白质提取物的结合,所述第二捕获剂结合与所述蛋白质提取物相接触的捕获剂。
在其它ELISA测定中,捕获剂可以与固相支持体相连接,且蛋白质提取物和与固相支持体结合的捕获剂相接触。利用关于该蛋白质的第二捕获剂,可以检测蛋白质提取物中的蛋白质和固相-支持体抗体的结合。所述"夹心测定"是本领域中众所周知的。
在其他测定中,在捕获剂的表面固定前,可以在溶液中发生该捕获剂和蛋白质之间的结合。
特别地,本方法可以用于检测来自HPV致癌毒株的E6蛋白。在这些实施方案中,该检测方法中使用的捕获剂可以是,例如,包括与E6蛋白中包含的PDZ配体(即,关于PDZ结构域的结合位点)结合的PDZ结构域的抗体或多肽。例如,本E6检测结合方法可以使用包含PDZ结构域的蛋白质,所述蛋白质含有MAGI-1的第二PDZ、或DLG或TIP1的PDZ结构域,等,如在公开的申请US 20040018487(2004年1月29日公开)中所述,并将其全部内容引入本文作为参考。示范性的包含PDZ结构域的蛋白质和PDZ结构域序列显示在申请US 20040018487的表2和实施例4中。术语"PDZ结构域"还包括该序列的变体(例如,天然存在的变体)(例如,多形变体,具有保守取代的变体、等)和来自备选物种(例如,小鼠、大鼠)的结构域。典型地,PDZ结构域与美国专利申请系列号09/724,553中显示的那些基本相同,将该申请引入本文作为参考,例如,当为了最大一致性而进行比较和比对时,至少约70%,至少约80%,或至少约90%的氨基酸残基相同。本领域中认识到能够突变PDZ结构域,从而提供能够加强或削弱结合并改变特异性,但保持PDZ结构域的氨基酸变化(Schneider等,1998,自然生物技术(Nat.Biotech.)17:170-5)。除非另外指出,引用特殊PDZ结构域(例如,MAGI-1结构域2)意欲包括该特殊PDZ结构域及其HPV E6-结合变体。换言之,如果对特殊PDZ结构域作出引用,则也对结合HPV的致癌E6蛋白质的PDZ结构域变体作出引用,如下所述。在这方面,注意到蛋白质中PDZ结构域的编号可以改变。例如,如本文中所引用的MAGI-1结构域2(氨基酸序列为PSELKGKFIHTKLRKSSRGFGFTVVGGDEPDEFLQIKSLVLDGPAALDGKMETGDVIVSVNDTCVLGHTHAQWKIFQSIPIGASVDLELCRGYPLPFDPDDPN的),在其他文献中可以被引用为MAGI-1结构域1。同样地,当在本申请中引用蛋白质的特殊PDZ结构域时,应该鉴于如本文所述地,特别是在申请US20040018487的序列列表表2中的结构域的序列,对该引用进行理解,当合适时,申请US 20040018487的序列列表表2显示了所述序列列表的序列和关于不同结构域的名称和Genbank编号之间的关系。用于本文时,术语"PDZ蛋白质"指天然存在的含有PDZ结构域的蛋白质。示范性PDZ蛋白质包括CASK、MPP1、DLG1、DLG2、PSD95、NeDLG、TIP-33、SYN1a、TIP-43、LDP、LIM、LIMK1、LIMK2、MPP2、NOS1、AF6、PTN-4、prIL16、41.8kD、KIAA0559、RGS12、KIAA0316、DVL1、TIP-40、TIAM1、MINT1、MAGI-1、MAGI-2、MAGI-3、KIAA0303、CBP、MINT3、TIP-2、KIAA0561、和TIP-1。用于本文时,术语"PDZ-结构域多肽"指含有PDZ结构域的多肽,诸如包括PDZ结构域序列的融合蛋白、天然存在的PDZ蛋白质、或分离的PDZ结构域肽。因此,PDZ-结构域多肽可以是约60或更多个氨基酸的长度、约70或更多个氨基酸的长度、约80或更多个氨基酸的长度、约90或更多个氨基酸的长度、约100或更多个氨基酸的长度、约200或更多个氨基酸的长度、约300或更多个氨基酸的长度、约500或更多个氨基酸的长度、约800或更多个氨基酸的长度、约1000或更多个氨基酸的长度,通常多达约2000或更多个氨基酸的长度、约50-2000个氨基酸的长度、约50-1500个氨基酸的长度、约50-1000个氨基酸的长度、约60-1000个氨基酸的长度、约70-1000个氨基酸的长度。PDZ结构域肽通常不多于约200个氨基酸(例如,50-200个氨基酸、60-180个氨基酸、80-120个氨基酸、或90-110个氨基酸),并编码PDZ结构域。
例如,适合于检测HPV的E6蛋白质的抗体记述在20050142541(2005年6月30日公开的)中。在公开的美国专利申请US20040018487中找到用于识别来自HPV致癌毒株的E6蛋白的详细方法,将该方法的全部内容引入本文。这些公开的方法易于适合在本方法中使用。
在某些实施方案中,抗-E6抗体可以与固相支持体结合,并且使由本主题方法产生的蛋白质提取物和与固相支持体结合的抗体相接触。利用包含PDZ结构域的蛋白质,可以检测蛋白质提取物中的致癌E6蛋白的结合。在其他实施方案中,包含PDZ结构域的蛋白质可以与固相支持体结合,并且使由本主题方法产生的蛋白质提取物和与固相支持体结合的包含PDZ结构域的蛋白质相接触。利用抗-E6抗体,可以检测蛋白质提取物中的致癌E6蛋白的结合。在备选的方法中,在包含PDZ结构域的蛋白质的抗体之间的结合可以发生在溶液中(即,在缺乏抗体或包含PDZ结构域的蛋白质与固相支持体结合的条件下),并且,结合后,该抗体或包含PDZ结构域的蛋白质可以与固相支持体(例如,珠或类似物)结合。在这些实施方案中,包含PDZ结构域的蛋白质可以是具有亲合结构域的融合蛋白,所述亲合结构域与固相支持体相结合。利用识别E6蛋白的第二捕获剂,能够检测E6蛋白的存在。
可以将获自上述测定方法的结果与获自合适的对照,例如,阳性对照(其中,可以使用已知含有与捕获剂结合的蛋白质的蛋白质提取物)或阴性对照(例如,其中可以使用不与细胞样品相接触的蛋白质提取试剂)的结果进行比较。
获自上述测定方法的结果可以显示在蛋白质提取物中蛋白质的存在、缺乏、或在某些实施方案中,显示在蛋白质提取物中蛋白质的含量。
在某些实施方案中,可以将获自上述测定方法的结果传达回远程位置,例如,通过电话、传真、电子邮件、邮寄或任何其他方式。例如,可以将所述结果传达给受试者或受试者的医生。
以上蛋白质检测方法可以与不同的检验,诸如细胞学检验,例如用于确定癌或癌前子宫颈细胞的Pap检验、或其他分子检验联合进行。在这些实施方案中,在使用前,可以将细胞样品分为几部分。第一部分可以在细胞学测定中使用,且第二部分可以在上述方法中使用。
依照以上内容,本发明的某些实施方案还提供了用于产生蛋白质提取物的系统。该系统通常含有:a)包含固定的细胞的细胞样品;b)具有至少约pH 10.0的pH的提取试剂;和c)中和试剂,其中所述固定的细胞、提取试剂和中和试剂可以在以上方法中使用,从而产生适合于在结合测定中使用的蛋白质提取物。所述提取试剂和/或中和试剂含有非离子型洗涤剂。
试剂盒
在另一方面中,本发明提供用于实施本主题方法的试剂盒,例如,用于从固定的细胞中产生蛋白质提取物的试剂盒,在某些实施方案中,用于检验蛋白质提取物中蛋白质的存在的试剂盒。本主题试剂盒至少包括具有至少约pH 10.0的pH的提取试剂,和中和试剂。所述提取试剂和/或中和试剂含有非离子型洗涤剂。另外,该试剂盒可以包括用于检测蛋白质的捕获剂,和,在某些实施方案中,用于利用捕获剂检测蛋白质的试剂(例如,缓冲剂和检测试剂)。以上成分可以存在于分别的容器中或可以将一种或多种成分组合到一个容器,例如玻璃或塑料瓶中。
除以上成分外,本主题试剂盒还可以包括用于实施本主题方法的操作指南。这些操作指南可以以多种形式出现在本主题试剂盒中,在试剂盒中可以出现一种或多种形式。这些操作指南可以出现的一种形式是作为在试剂盒包装中、在包装插页等中的合适媒介或基底上印刷的信息,例如在一张或数张在其上印刷了该信息的纸上的印刷的信息。另一种方式是其上记录了该信息的计算机可读媒体,例如,磁盘、CD、等。再一种可以出现的方式是可以用来通过互联网访问处于远端的信息的网站地址。该试剂盒中可以存在任何便利的方法。
效用
上述方法和系统易于用于多种研究和诊断方法,包括诊断特殊疾病或病症、或由传染性媒介诸如病毒或细菌引起的感染的方法。在一个实施方案中,将本方法用作检测HPV感染的细胞诊断的一部分。由于HPV的致癌毒株的存在与癌和癌前细胞相关,所以本方法可以用于检测癌或癌前子宫颈细胞。
已知HPV是下列疾病中的病原体:疣状表皮发育不良(EV),即导致皮肤(例如,鳞状细胞的)癌高风险的终身皮肤病症;子宫颈瘤形成,诸如子宫颈上皮内瘤形成(CIN)和侵入性子宫颈癌(ICC);阴道瘤形成,诸如阴道上皮内瘤形成(VAIN)和阴道癌(VC);外阴瘤形成,诸如外阴上皮内瘤形成(VIN)和外阴癌;阴茎癌(包括,退行发育丘疹病(Bowenoidpapulosis));肛门(AC)和肛周癌(PC);口咽癌(OS);食管癌(EC);非-黑素瘤皮肤癌(例如,基细胞癌-BCC和鳞状细胞癌-SCC);和黑素瘤。同样,在一个实施方案中,本方法可以用作对任何这些疾病的诊断。
在一个实施方案中,从受试者获得(例如,剥离或切除)细胞,并将其存放在含有固定剂的液体培养基中,在某些实施方案中,所述液体培养基可以是用于细胞学检验的运送培养基。通常在医生的办公室或诊室中获得细胞,将细胞样品转送到检验机构并且由其接收,在所述机构中,进行了上述蛋白质检测方法和,任选地,细胞学测定。将来自该检验的结果传达给受试者,在一些实施方案中,通过医生及其同事传达。
其细胞被采用的受试者可以是哺乳动物,例如,狗或猫,啮齿动物(例如,小鼠、豚鼠、或大鼠),或灵长类动物(例如,人、黑猩猩、或猴)。在许多实施方案中,受试者应该是人,具体地,男性或女性。在某些实施方案中,受试者可以表现出HPV感染的症状(例如,可以在身体的一处或多处具有疣),可以被怀疑受到HPV的感染(例如,可以含有与所述感染在细胞学上一致的细胞)或可以已被检验出HPV阳性。在某些实施方案中,受试者可以不具有HPV感染的适应证,且以上方法可以用作常规筛查的一部分。
在一个实施方案中,本方法可以用于检测致癌HPV的任何毒株,例如,HPV 26、HPV 53、HPV 66、HPV 73、HPV 82、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 35、HPV 30、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 59、HPV 58、HPV 33、HPV 66、HPV 68或HPV 69,(特别地,任何最普遍的HPV毒株,例如,HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33和HPV 45),其通过检测来自所述毒株的E6蛋白而进行。在一个实施方案中,在本方法的起始点,尚不知固定的细胞是否含有致癌E6蛋白或致癌E6蛋白来自哪种毒株。如果检测测定显示出在固定的细胞中存在致癌E6蛋白,则感染那些细胞的HPV毒株的身份能够通过其他分子测定或通过病毒DNA测序而确定,分子测定例如使用对特殊E6蛋白或由病毒编码的其他蛋白质特异的抗体的那些。
通过举例说明而非限制的方式,提供了一些实施例。
实验
提取掺加的(spiked)临床样品
将受HPV16 E6基因(C33A+)转染的细胞用THINPREPTM培养基固定,并如下所列出地,将其添加(即,“掺加”)到部分THINPREPTM-固定的临床样品中。将细胞掺加到5种临床样品中每一种的一半中(每一半临床样品具有2千万个C33A+细胞)。
提取方案:
C33A(+)ThinPrep细胞/20M细胞/ml
1-将20M C33A(+)ThinPrep细胞添加到1/2临床阴性#229(1.0ml提取物)中
2-将20M C33A(+)ThinPrep细胞添加到1/2临床阴性#230(1.0ml提取物)中
3-将20M C33A(+)ThinPrep细胞添加到1/2临床阴性#231(1.0ml提取物)中
4-将20M C33A(+)ThinPrep细胞添加到1/2临床阴性#232(1.0ml提取物)中
5-将20M C33A(+)ThinPrep细胞添加到1/2临床阴性#233(1.0ml提取物)中
6-20M C33A(+)ThinPrep细胞(1.0ml提取物)
提取试剂:
Triton X-100/Lot 092K0171-(1%=250μl)
5M NaCl/Lot 5701-53-(0.15M=750μl)
0.5M Tris碱/Lot 5708-20-(0.1M=5ml)
05M 甘氨酸/Lot 5708-9-(0.1M=5ml)
10% SDS/Lot 5708-8-(0.05%=125μl)
8M尿素/Lot 5678-83-(0.25M=781μl)
加入RO/DI至20ml-(8.1ml)
5N NaOH/Lot A09522-(525μl)
加入RO/DI至25ml-(4.475ml)
最终pH-11.48
最终制剂:0.1M Tris/0.1M甘氨酸/0.15M NaCl/1%Triton X-100/0.05% SDS/0.25M尿素pH11.48
蛋白质提取程序:
1.将细胞混悬液加入到50ml离心管中
2.在3000rpm旋转10-15分钟
3.小心地去除上清液
4.将内容物转移到15ml nunc管中
5.在3000rpm旋转10-15分钟
6.小心地去除上清液
7.向沉淀加入需要量的提取试剂
8.重新混悬,从而打碎细胞沉淀
a.添加剂(处于1:100的DTT)
9.检查pH,调节到11.5
10.在RT(或对提取合适的温度)下混合30分钟
11.在14,000rpm旋转10-15分钟
12.去除澄清的上清液
13.以1:100加入DTT
14.用5N HCl中和到pH8.0,并在ELISA中检验
(用31.0μl5N HCl/1ml中和到pH8.0)
100mM DTT/NR 5701-90/DOM 2/7/05
ELISA方法
1-用5ug/ml处于PBS(lot 021405)中的GST-Magi-PDZ(lot88.18/0.65ug/ul)包被平板(Nunc 439454 Maxisorp F96/lot 542043)-100ul/孔
11ml x 5ug/ml=55ug x 1ul/0.65ug=84.6ul GST-Magi-PDZ
2-在4℃温育过夜
3-用平板清洗剂清洗3次(TBS-吐温)
4-用250ul封闭缓冲剂(lot033005)封闭平板
5-在25℃温育2小时
6-用平板清洗剂清洗3次(TBS-吐温)
7-将100ul MBP-E6/溶解产物样品加入到合适的孔中
8-在25℃温育1小时
9-用平板清洗剂清洗3次(TBS-吐温)
10-将100ul处于5ug/ml的抗-E6抗体(4C6-2.85mg/ml-lot02)加入到处于2% BSA HNTG缓冲液(lot 031805B)中的合适孔中。将N-末端肽(HPVl 6E6 lot#PN3952-2)以10ug/ml加入到合适的样品中,从而证实信号的特异性(在加入前,用抗-E6抗体预培养肽45分钟)
11-在25℃温育2小时
12-用板清洗剂清洗3次(TBS-突文)
13-在2%BSA/0.05%吐温20缓冲液(lot040505)中制备山羊抗-小鼠IgG-HRP(杰克逊(Jackson)GxM IgG-HRP/目录#115-035-062/lot 60988)的1:5000稀释液。
10.0ml x 1/5000=0.002ml x 1000ul/ml=2.0ul山羊抗-小鼠IgG-HRP
14-将100ul 1:5000山羊抗-小鼠IgG-HRP稀释液加入到合适的孔中
(去除TMB底物并置于室温下)
15-在25℃温育1小时
16-用平板清洗剂清洗5次(TBS-吐温)
17-加入100ul Neogen K-蓝TMB底物(lot041018)
18-在25℃温育30分钟
19-加入100ul终止溶液(lot 030705)并读取A450制剂:
2% BSA/0.05%吐温缓冲液-(lot 040505)
2% BSA封闭剂lot 033005(49.975ml)
吐温20 lot A016759301(0.025ml)
结果
如能够从上表中看到地,对所有掺加的临床样品检测E6结合。
由以上结果和讨论证明本主题方法为固定的细胞的分子分析提供许多独特的优势。具体地,本方法提供用于从固定的细胞中产生蛋白质提取物的常规方法,其中蛋白质提取物中的蛋白质是可以在结合测定中检测的。由于通常很难检测在固定的细胞中的某种蛋白质,所以,本主题发明表现出对本领域的显著贡献。
将本说明书中引用的全部出版物和专利申请引入本文作为参考,如同将每篇单独的出版物或专利申请特别地和个别地指定引入作为参考。任何出版物的引用是关于在提交日前的公开,并且不应该将其解释为承认本发明没有资格通过在先的发明先于所述出版物。
尽管为了清楚理解的目的,通过举例说明或实施例详细描述了前述发明,但是对于本领域中普通技术人员明显地是,根据本发明的教导,在不偏离所附权利要求的精神或范围的条件下,可以对其进行某些改变和改进。
Claims (44)
1.用于从固定的细胞产生蛋白质提取物的方法,所述方法包括:
a)使所述固定的细胞与提取试剂相接触,从而产生具至少约pH 10.0的pH的中间组合物,和
b)使所述中间组合物与中和试剂相接触,从而中和所述中间组合物的所述pH,并产生所述蛋白质提取物,
其中,所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者含有非离子型洗涤剂。
2.权利要求1的方法,其中所述方法包括:
a)使所述固定的细胞与提取试剂相接触,从而产生具有至少约pH10.0的pH的中间组合物;和
b)使所述中间组合物与包含非离子型洗涤剂的中和试剂相接触;
从而中和所述中间组合物的所述pH,并产生所述蛋白质提取物。
3.权利要求1的方法,其中所述方法包括:
a)使所述固定的细胞与包含非离子型洗涤剂的提取试剂相接触,从而产生具有至少约pH 10.0的pH的中间组合物;和
b)使所述中间组合物与中和试剂相接触;
从而中和所述中间组合物的所述pH,并产生所述蛋白质提取物。
4.权利要求1的方法,所述方法还包括:
在步骤a)前,接收包含所述固定的细胞的细胞样品。
5.权利要求1的方法,其中所述细胞是固定的子宫颈细胞。
6.权利要求1的方法,其中所述固定的细胞存在于SUREPATHTM、CYTOLYTTM或PRESERVCYTTM运送培养基中。
7.权利要求4的方法,其中从远程位置接收所述细胞样品。
8.权利要求1的方法,其中所述pH处于约pH 11.0-约pH 13的范围内。
9.权利要求1的方法,其中所述提取试剂包括变性剂。
10.权利要求9的方法,其中所述变性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素或肌氨酰。
11.权利要求1的方法,其中所述非离子型洗涤剂包括TRITONTM或TWEENTM洗涤剂。
12.用于检测蛋白质的方法,所述方法包括:
a)按照权利要求1的方法从固定的细胞中产生蛋白质提取物;和
b)检验在所述蛋白质提取物中的所述蛋白质的存在。
13.权利要求12的方法,其中所述检验使用关于所述蛋白质的捕获剂。
14.权利要求12的方法,其中所述检验包括免疫学测定。
15.权利要求12的方法,其中所述测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。
16.权利要求12的方法,其中所述蛋白质是人乳头状瘤病毒(HPV)蛋白。
17.权利要求12的方法,其中所述蛋白质是HPV E6蛋白。
18.权利要求12的方法,其中所述固定的细胞是脱落的子宫颈细胞。
19.权利要求12的方法,其中在所述接触步骤a)之前,从远程位置接收所述固定的细胞。
20.权利要求12的方法,所述方法还包括:
d)将所述检验的结果传达到远程位置。
21.用于产生蛋白质提取物的系统,所述系统包括:
a)包含固定的细胞的细胞样品,
b)具有至少约pH 10.0的pH的提取试剂,和
c)中和试剂,
其中所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者包括非离子型洗涤剂,且其中所述提取试剂和中和试剂可以在权利要求1的方法中使用,从而产生适合于在结合测定中使用的蛋白质提取物。
22.权利要求21的系统,所述系统还包括用于检测在所述蛋白质提取物中的蛋白质的试剂。
23.用于从固定的细胞中产生蛋白质提取物的试剂盒,所述试剂盒包括:
a)具有至少约pH 10.0的pH的提取试剂;
b)中和试剂;和
c)用于利用所述提取试剂和所述中和试剂进行权利要求1的方法的操作指南;
其中所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者包括非离子型洗涤剂。
24.权利要求23的试剂盒,所述试剂盒还包括用于检测所述蛋白质提取物中的蛋白质的试剂。
25.权利要求24的试剂盒,其中所述试剂包括关于所述蛋白质的捕获剂。
26.权利要求24的试剂盒,其中所述蛋白质是HPV E6蛋白。
27.用于从细胞样品中提取靶病毒蛋白的方法,所述方法包括:
a)使包含存在或怀疑存在靶病毒蛋白的细胞的细胞样品与提取试剂相接触,从而产生具有至少约pH 10.0的pH的中间组合物;和
b)使所述中间组合物与中和试剂相接触,从而中和所述中间组合物的所述pH,并产生所述靶病毒蛋白提取物。
28.权利要求27的方法,其中所述提取试剂和所述中和试剂之一或二者包括非离子型洗涤剂。
29.权利要求27的方法,其中所述细胞样品中的细胞用化学固定剂固定。
30.权利要求29的方法,其中所述化学固定剂选自由下列各项组成的组:醇、醛、酮、四氧化锇、乙酸、苦味酸、重金属离子盐、和丙二醇。
31.权利要求30的方法,其中所述醇是甲醇或乙醇;所述醛是戊二醛或甲醛;且所述酮是丙酮。
32.权利要求1的方法,所述方法还包括:
在步骤a)之前,接收包含固定的细胞的细胞样品。
33.权利要求27的方法,其中所述病毒蛋白由致病病毒编码。
34.权利要求33的方法,其中所述致病病毒是选自由下列各项组成的组:HIV、依波拉病毒、马尔堡病毒、肝炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头状瘤病毒(HPV)。
35.权利要求27的方法,其中所述病毒蛋白是HPV的E6或E7蛋白。
36.权利要求35的方法,其中所述HPV是HPV毒株4、11、20、24、28、36、48、50、16、18、31、35、30、39、45、51、52、56、59、58、33、66、68、69、26、53、73、或82。
37.权利要求35的方法,其中所述HPV是致癌HPV毒株,所述致癌HPV毒株选自由下列各项组成的组:HPV 26、HPV 53、HPV 66、HPV 73、HPV 82、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 35、HPV 30、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 59、HPV 58、HPV 33、HPV 66、HPV 68、HPV 69、和HPV 82。
38.权利要求27的方法,所述方法还包括:
检测在所述提取物中所述靶病毒蛋白的存在。
39.权利要求38的方法,其中所述检测使用关于所述靶病毒蛋白的捕获剂。
40.权利要求39的方法,其中所述病毒蛋白是HPV的E6蛋白;且所述捕获剂是针对所述E6蛋白的抗体。
41.权利要求39的方法,其中所述病毒蛋白是HPV的E6蛋白;且所述捕获剂包括包含PDZ结构域的多肽。
42.权利要求41的方法,其中所述PDZ结构域是MAGI-1的第二结构域、DLG或TIP 1的PDZ结构域。
43.权利要求27的方法,其中所述细胞样品还含有粘液或血液。
44.权利要求27的方法,其中所述细胞样品含有脱落的子宫颈细胞。
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