CN104807928B - 采用sle法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，包括以下步骤：步骤1：样品预处理；收集猪尿，首先加入β‑盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4倍猪尿体积的Ph范围为6.5～7.0的磷酸缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液；步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2～4分钟；步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有沙丁胺醇的洗脱液。本发明的目的在于提供一种分离效率高、操作简单、检出限低的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法。
Description
技术领域
本发明涉及沙丁胺醇检测领域，特别是一种采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法。
背景技术
样品前处理是分析检测过程的关键环节，是浓缩被测定的痕量组分，提高方法的灵敏度，及除去对分析系统有干扰的物质的重要手段。萃取是从样品集体中分离出目标化合物的一项技术，是样品预处理中最重要的方法之一。目前，液液萃取仍然是应用最广泛的样品制备方法之一，但是，传统的液液萃取的操作繁琐费时、有机溶剂消耗量大，而且容易出现乳化现象的缺陷，使得在实际应用中具有一定的局限性。
1998年，科学家提出了在传统的液液萃取的基础上，利用一种具有吸附性和较大的比表面积的惰性多空填料作为介质，建立的一种新型高效样品的制备方法-介质液液萃取(supported liquid extraction简称SLE)，SLE萃取技术就是选用一种多孔性惰性材料-煅烧硅藻土作为介质，取代分液漏斗，增大了两相接触时的作用面积，实现高效、快速的萃取过程。
当水溶液样品加样到固定的聚丙烯注射管中的煅烧硅藻土上后，经过一定时间(一般分为几分钟)，水相溶液以一层薄薄的液膜形式分布在填料表面，之后，将有机溶剂从柱管上端加入，当互不相溶的两相在硅藻土表面接触的同时萃取立即发生，最后萃取液在重力作用下流出，必要情况下，可以施加较小的压力，而水相保留在介质中。盛接的流出液直接将溶剂吹干，复溶后，即可用于下一步分析检测。
农业部1025号公告-11-2008公开了猪尿中β-受体激动剂多残留检测，其采用酶解后异丙醇-乙酸乙酯进行萃取，并通过内标法可以得到相关的检测结果，但是在实际应用中，为了使沙丁胺醇与蛋白质分离，需要采用酶解的方式，然后在采用传统方法萃取后通过色谱检测，有时无法检出残留项。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离效率高、操作简单、检出限低的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法。
本发明的技术方案为：一种采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，包括以下步骤：
步骤1：样品预处理；收集猪尿，首先加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4倍猪尿体积的pH范围为6.5～7.0的磷酸缓冲液，漩涡混合器混合0.5～1.5分钟后离心，将经混合处理的溶液在离心机中以9000～11000转/分钟的速度离心0.5～1.5分钟；取离心后的上清液；步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2～4分钟；
步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有沙丁胺醇的洗脱液；
其中，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙腈的混合物，其中乙酸乙酯和乙腈的重量比为1:0.8～1.1。
在上述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法中，所述的猪尿为1ml，缓冲溶液为4ml，步骤2中所取的上清液为0.5ml，所述的步骤3中，每次洗脱时所用的洗脱剂为0.5ml。
在上述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法中，每毫升的尿液中加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶12μL。
在上述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法中，所述的三氯乙酸和猪尿的质量比为1:98～100
在上述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法中，所述的SLE柱为奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE柱。
本发明的有益效果如下：
采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇，先进行酶解使蛋白质和沙丁胺醇分离，采用缓冲溶液进行混合，然后通过SLE柱分离出沙丁胺醇，萃取剂为乙酸乙酯和乙腈，本发明的分离效率好、分离时间短、检出限低有利于后期的测量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
步骤1：收集猪尿1ml，首先加入12μLβ-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，酶解时间为3-4小时，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4ml的pH为6.5的磷酸缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液0.5ml；三氯乙酸和猪尿的质量比为1:99。
步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置3分钟；SLE柱为奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE柱。
步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱2次，接收洗脱液，得到含有沙丁胺醇的洗脱液；每次消耗的洗脱剂为0.5ml，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙腈的混合物，其中乙酸乙酯和乙腈的重量比为1:1。
实施例2
步骤1、收集猪尿1ml，首先加入12μLβ-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，酶解时间为3-4小时，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4ml的pH为7的磷酸缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液0.5ml；三氯乙酸和猪尿的质量比为1:98。
步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置4分钟；SLE柱为奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE柱。
步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱2次，接收洗脱液，得到含有沙丁胺醇的洗脱液；每次消耗的洗脱剂为0.5ml，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙腈的混合物，其中乙酸乙酯和乙腈的重量比为1:1.1。
标准样的制备
称取沙丁胺醇标准品(纯度≥99％)0.0100g，置于1000ml容量瓶中，用重量比为1:1的乙酸乙酯和乙腈的混合物的溶剂溶解定容，其浓度为10μg/ml；
取上述浓度为10μg/ml的沙丁胺醇溶液于1000ml容量瓶中，配制成为2μg/L、5μg/L、8μg/L、10μg/L、20μg/L的标准样。
对比例1
与实施例1大体相同，不同的地方在于，步骤3中，洗脱剂为异丙醇与乙酸乙酯的混合物，其体积比为60:40。
分析：
检测方法具体为：
仪器：LC-2010型高效液相色谱仪(日本岛津)
色谱柱：C18柱，150mm*3.9mmID
柱温：室温
流动相：水：乙腈＝100:12(体积比)；
检测器：UV检测器；
检测波长：220nm；
进样量：20μL
以2μg/L、5μg/L、8μg/L、10μg/L、20μg/L的标准样进行测试，回归方程为Y＝17250X+1.5，R2＝0.9993，X为待测物浓度，Y为峰面积。
取同一份猪尿1kg，按照实施例1的方法制备10份萃取样品A标号为A1-A10，按照对比例1的方法制备10份萃取样品B标号为B1-B10。
按照上述检测方法进样检测，得到如下的检测结果：
通过上表可以看出，本发明的方案的萃取率要高于对比例1的萃取率。
本发明还采用液液萃取法(LLE)进行萃取试验，当采用体积比为60:40异丙醇与乙酸乙酯的混合提取剂时，如果以高效液相色谱法进行检测难于检出。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：样品预处理；收集猪尿，首先加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，酶解结束后加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4倍猪尿体积的pH范围为6.5～7.0的磷酸缓冲液，漩涡混合器混合0.5～1.5分钟后离心，将经混合处理的溶液在离心机中以9000～11000转/分钟的速度离心0.5～1.5分钟；取离心后的上清液；
步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2～4分钟；
步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有沙丁胺醇的洗脱液；
其中，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙腈的混合物，其中乙酸乙酯和乙腈的重量比为1:0.8～1.1。
2.根据权利要求1所述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，其特征在于，所述的猪尿为1ml，缓冲溶液为4ml，步骤2中所取的上清液为0.5ml，所述的步骤3中，每次洗脱时所用的洗脱剂为0.5ml。
3.根据权利要求1所述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，其特征在于，每毫升的尿液中加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶12μL。
4.根据权利要求1所述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，其特征在于，所述的三氯乙酸和猪尿的质量比为1:98～100。
5.根据权利要求1至4任一所述的采用SLE法分离猪尿中的沙丁胺醇的方法，其特征在于，所述的SLE柱为奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE柱。
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