CN102925429A

CN102925429A - 一种聚合酶链式反应产物纯化试剂盒及纯化方法

Info

Publication number: CN102925429A
Application number: CN2012104703276A
Authority: CN
Inventors: 徐士霞; 刘继来; 李鹏
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2012-11-19
Filing date: 2012-11-19
Publication date: 2013-02-13

Abstract

本发明涉及一种聚合酶链式反应产物纯化试剂盒及纯化方法。所述PCR产物纯化试剂盒包括：（1）PCR过滤管，（2）1.5ml离心管，（3）2ml离心管，（4）DNA结合溶液，（5）洗涤液，（6）洗脱液。所述纯化方法操作步骤：a.将待纯化样品溶液与3倍体积的DNA结合溶液混匀后，转移到带2ml离心管的过滤管中，离心，弃滤液；b.加洗涤液到带2ml离心管的过滤管中，离心，弃滤液；c.将过滤管置于洁净的1.5ml离心管中，在过滤管膜中央加30-40μl洗脱液，室温静置2-3min，离心，洗脱DNA。本发明提供的试剂盒及纯化方法成本低、实用强、回收效率高且稳定、操作简单方便。

Description

一种聚合酶链式反应产物纯化试剂盒及纯化方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域核酸纯化技术在生产实践中的应用，具体涉及一种聚合酶链式反应产物纯化试剂盒及纯化方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)产物纯化是分子生物学实验中进行核酸PCR扩增、核酸酶切反应或测序反应后常需进行一项工作。PCR产物中一般都含有过量的引物、Taq-DNA酶、dNTP及核苷酸等，有时还有一些引物二聚体，这些成分将直接影响后续的质粒连接、酶切、PCR测序反应等实验过程，因此必须去除这些杂质。目前核酸的纯化试剂盒和纯化方法很多，市场上大多数的PCR产物纯化试剂盒均是采用吸附法的原理，即结合→洗涤→洗脱，然后回收获得纯化产物。然而，已有的一些PCR产物纯化试剂盒和纯化方法亦存在诸多的问题，例如一些纯化方法往往因需时较长或回收率太低而影响下一步的操作。一些PCR产物纯化试剂盒因价格高昂而令多数实验室难以承受，一些试剂盒虽然价格低廉但过滤膜易破损且回收效率不够稳定或所用的异丙醇、酚和氯仿等试剂对人体有一定的危害。因此，开发一些成本低、实用强、回收效率高而稳定、操作简单方便的PCR产物纯化试剂盒及纯化方法是很有必要的。

目前很多商品化的纯化试剂盒中所用的DNA结合溶液基本配方都是由异硫氰酸胍（Guanidine isothiocyanate）和乙醇组成，因此，在纯化过程溶液浓度的改变会影响溶液的pH值，进而影响纯化效率的稳定性，降低核酸的回收率。本发明通过反复试验，改变DNA结合溶液的配方，在原有的异硫氰酸胍和无水乙醇配比基础上增加了磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）和磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）并通过科学配比。过滤柱采用silica膜，异硫氰酸胍对蛋白有强的变性作用，它提供DNA结合到膜上的条件；而无水乙醇同样具有促进DNA结合的作用，并且提高溶液体系体积，延长膜的吸附反应时间；磷酸盐组成的缓冲系统，可保证pH值维持在5.0左右的弱酸性。从而使PCR产物纯化保持高而稳定的DNA回收率。

发明内容

本发明提供一种聚合酶链式反应产物纯化试剂盒及纯化方法。

本发明的基本原理是：（1）结合；利用silica膜在高盐环境下吸附DNA在低盐浓度下释放DNA的特性，并且在一定浓度和pH条件下对不同片段长度DNA结合能力的不同，结合PCR产物的的特点，发明了一种新型的DNA结合溶液；这种DNA结合溶液中的异硫氰酸胍（Guanidine isothiocyanate）对蛋白有强的变性作用，并且提供DNA结合到膜上的条件；而无水乙醇同样具有促进DNA结合的作用，并且提高溶液体系体积，延长膜的吸附反应时间；磷酸盐组成的缓冲系统，可保证pH值维持在5.0左右的弱酸性。（2）洗涤；silica膜上吸附留下的除了目的DNA外，还有高盐浓度的溶液，需要洗涤干净，三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris/HCl）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠（NaCl）和无水乙醇（Ethanol）按一定配比混合后可有效去除高盐溶液。（3）洗脱；经过洗涤的silica膜，含有乙醇，会对后续的实验产生影响，Tris/HCl和EDTA按一定配比混合后通过高速离心可有效去除残留的乙醇。最后，小于50bp的片度和变性的蛋白及引物二聚体等杂质均被透过silica膜被除去。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种新的聚合酶链式反应产物纯化试剂盒，由下述组成：（1）带silica膜PCR过滤管，（2）1.5ml离心管，（3）2ml离心管，（4）DNABinding Buffer（DNA结合溶液），（5）WashingBuffer（洗涤液），（6）Eluent Buffer（洗脱液）。

所述PCR产物纯化试剂盒中DNABinding Buffer（DNA结合溶液）配方为：1000ml DNABinding Buffer中包含4.5M异硫氰酸胍（Guanidine isothiocyanate），200ml无水乙醇（Ethanol），0.05M磷酸氢二钠（Na₂HPO₄），0.05M磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）。室温密闭贮存。

所述PCR产物纯化试剂盒中Washing Buffer（洗涤液）配方为：1000ml Washing Buffer中包含100mM氯化钠（NaCl），10mM乙二胺四乙酸（EDTA），50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl，pH7.5）。使用时与无水乙醇（Ethanol）按1：1.5混合均匀，室温密闭贮存。

所述PCR产物纯化试剂盒中Eluent Buffer（洗脱液）配方为：1000ml Eluent Buffer中包含10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris/HCl），1mM乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0）。室温密闭贮存。

本发明还公开了使用PCR产物纯化试剂盒的纯化方法，其操作步骤是：

a.在待纯化样品溶液中，加入3倍体积的DNA Binding Buffer（若DNA Binding Buffer不足100μl，加至100μl），混匀后，转移到带silica膜的过滤管中，将过滤管置于2ml离心管中，12000rpm离心1min，弃滤液；

b.将过滤管置于2ml离心管中，加700μl Washing Buffer，12000rpm离心1min，弃滤液；

c.（可选步骤）将过滤管置于离心管中，将过滤管置于2ml离心管，加400μl WashingBuffer，12000rpm离心1min，弃滤液；

d.将过滤管置于洁净的1.5ml离心管中，在过滤管膜中央加30-40μl Eluent Buffer，室温静置2-3min。12000rpm离心1min洗脱DNA。

本发明的有益效果是：本发明适合从PCR、酶切反应和测序反应等的反应液中纯化回收DNA，回收率为80-90%。小于50bp的片度和变性的蛋白及引物二聚体等透过膜被除去。本发明提供的PCR产物纯化试剂盒及纯化方法成本低、实用强、回收效率高而稳定、操作简单方便。很适合各科研院所实验室进行PCR产物纯化使用。本发明完全可实现生产转化并量产销售，具有广泛的市场前景和应用经济价值。

附图说明

图1.带silica膜的过滤管。

图2.PCR产物纯化流程图。

图3.PCR产物纯化前后比较（M：DL2000Plus Marker；泳道1.中华绒螯蟹热激蛋白90基因PCR产物纯化前；泳道2.中华绒螯蟹热激蛋白90基因PCR产物纯化后；泳道3.中华绒螯蟹锚蛋白基因PCR产物纯化前；泳道4.中华绒螯蟹锚蛋白基因PCR产物纯化后）。

具体实施方式

实施例1

本发明实施例1提供一种利用本发明进行PCR反应溶液纯化的方法，下面进行详细说明：1.在待纯化的45μl中华绒螯蟹热激蛋白90基因的PCR扩增反应溶液中，加入135μl DNABinding Buffer，混匀后，转移到带silica膜的过滤管中（图1），将过滤管置于2ml离心管中，12000rpm离心1min，弃滤液；2.将过滤管置于2ml离心管中，加700μl Washing Buffer，12000rpm离心1min，弃滤液；3.将过滤管置于离心管中，将过滤管置于2ml离心管，加400μl Washing Buffer，12000rpm离心1min，弃滤液；4.将过滤管置于洁净的1.5ml离心管中，在过滤管膜中央加35μl Eluent Buffer，室温静置3min；12000rpm离心1min洗脱DNA（图2）。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测和使用Biophotometer（Eppendorf，Germany）进行DNA浓度与纯度检测，结果显示回收效率达90%且纯化效果非常好，没有其他杂质残留（见图3泳道2）。

实施例2

本发明实施例2提供一种利用本发明进行cDNA酶切反应溶液纯化的方法，下面进行详细说明：a.在待纯化的45μl中华绒螯蟹锚蛋白的PCR扩增反应溶液中，加入135μl DNABinding Buffer，混匀后，转移到带silica膜的过滤管中，将过滤管置于2ml离心管中，12000rpm离心1min，弃滤液；b.将过滤管置于2ml离心管中，加700μl Washing Buffer，12000rpm离心1min，弃滤液；c.将过滤管置于离心管中，将过滤管置于2ml离心管，加400μl WashingBuffer，12000rpm离心1min，弃滤液；d.将过滤管置于洁净的1.5ml离心管中，在过滤管膜中央加40μl Eluent Buffer，室温静置2min。12000rpm离心1min洗脱cDNA。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测和使用Biophotometer（Eppendorf，Germany）进行DNA浓度与纯度检测，结果显示回收效率达85%且纯化效果非常好，没有其他杂质残留（图3泳道4）。

以上对本发明实施例所提供的一种聚合酶链式反应产物纯化试剂盒及纯化方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1. 一种聚合酶链式反应产物纯化试剂盒，其特征在于包括：带silica膜PCR过滤管、1.5 ml离心管、2 ml离心管、DNA结合溶液、洗涤液和洗脱液；

其中，DNA结合溶液配方为：1000 ml DNA 结合溶液中包含4.5M异硫氰酸胍，200 ml无水乙醇，0.05M 磷酸氢二钠，0.05M磷酸二氢钠。

2.根据权利要求1中所述的一种聚合酶链式反应产物纯化试剂盒，其特征是所述洗涤液配方为：1000 ml 洗涤液中包含100mM 氯化钠，10mM乙二胺四乙酸，50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸、pH7.5。

3.根据权利要求1中所述的一种聚合酶链式反应产物纯化试剂盒，其特征是所述洗脱液配方为：1000 ml洗脱液中包含10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mM乙二胺四乙酸、pH8.0。

4.权利要求1中所述的聚合酶链式反应产物纯化试剂盒的使用方法，其特征是步骤如下：

a. 在待纯化样品溶液中，加入3倍体积的DNA 结合溶液，若DNA 结合溶液不足100 μl，加至100 μl，混匀后，转移到带silica膜的过滤管中，将过滤管置于2 ml 离心管中，12000 rpm离心1 min，弃滤液；

b. 将过滤管置于2 ml 离心管中，加700 μl 洗涤液，12000 rpm 离心1 min，弃滤液；

d. 将过滤管置于洁净的1.5 ml 离心管中，在过滤管膜中央加30-40 μl 洗脱液，室温静置2-3 min；12000 rpm 离心1 min 洗脱DNA。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于步骤d 前还有步骤c.将过滤管置于离心管中，将过滤管置于2 ml 离心管，加 400 μl 洗涤液，12000 rpm 离心1 min，弃滤液。