CN107257857B - 用于ivt后rna纯化的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本文涉及核酸纯化的方法，该方法包括：(a)将包含至少一种核酸的样品与结合缓冲液相组合以形成溶液，所述结合缓冲液包含至少一种磁性颗粒且具有约为4‑10的pH；(b)用结合缓冲液孵育样品，持续的时间足以使得所述至少一种核酸与所述至少一种磁性颗粒可逆结合，以形成至少一种经修饰的磁性颗粒；(c)从溶液分离所述至少一种经修饰的磁性颗粒；(d)用至少一种清洗缓冲液清洗所述至少一种经修饰的磁性颗粒；以及(e)使所述至少一种经修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液相结合。本文还揭示了包含这些缓冲液和磁性颗粒的试剂盒。

Description

用于IVT后RNA纯化的方法和试剂盒
本申请根据34U.S.C.§119，要求2014年11月14日提交的美国临时申请系列第62/079854号的优先权，本文以该申请为基础并将其全文通过引用结合于此。
技术领域
本文一般地涉及用于核酸纯化的方法和试剂盒，更具体地，涉及用于含RNA样品在体外转录之后的纯化的基于磁性颗粒的试剂盒和方法。
技术背景
核酸纯化(例如DNA或RNA的分离)对于各种生物化学和诊断过程会是重要的步骤。RNA可用于许多应用，例如，基因表达研究，分子研究和/或生物化学研究，例如RNA干扰、显微注射、感染、体外转录和/或核酸酶保护测定程序。转录是基因表达中的第一个步骤，其中，采用RNA聚合酶从DNA模板合成互补和反平行RNA链。体外转录(IVT)可以提供一种从DNA中体外转录具有所需序列或修饰(例如封端或放射标签)的核苷酸的方法。
存在各种设计成驱动转录的IVT试剂盒，例如，T7、T3或SP6促进剂。但是，在继续开展下游应用之前，可能需要对IVT后样品进行纯化，以去除一种或多种污染物，例如，盐、蛋白质、酶和寡核苷酸等。存在此类污染材料会阻碍或阻止许多下游工艺。因此，从IVT后混合物有效地分离核酸以确保所需的终端使用功能是至关重要的。
在一些情况下，选择的核酸纯化方法影响分离产物的各种性质，包括核酸样品的产率、质量和/或纯度。虽然已经建立了许多方法用于核酸纯化，但是这些方法可能具有一种或多种缺陷，包括例如，高成本、高复杂度、缓慢的速度、低产率、低纯度、污染、毒性和/或低效。可以采用常规沉淀过程，例如苯酚/氯仿萃取从IVT混合物分离较高纯度的RNA；但是，此类方法会是耗时且复杂的。
基于固相的方法，例如采用磁性珠、旋转柱和/或过滤系统的方法，作为替代解决方案而存在。在这些方法中，基于磁性颗粒的纯化系统可具有各种优势，例如，由于缺少离心和/或真空步骤所以增强了简单程度。然而，使用磁性颗粒的方法仍受多种缺点的困扰，如低速、高复杂程度和/或总产率差。
因此，提供如下用于核酸纯化的基于磁性颗粒的方法和试剂盒会是有利的，其可以是更为快速、较不复杂、较不昂贵和/或在产物纯度和/或产率方面得到改善。所得到的经纯化的核酸可用于各种基因表达、分子和/或生物化学应用。
发明内容
在各种实施方式中，本文涉及对核酸进行纯化的方法，该方法包括：(a)将包含至少一种核酸的样品与结合缓冲液相组合以形成溶液，所述结合缓冲液包含至少一种磁性颗粒且具有约为4-10的pH；(b)用结合缓冲液孵育样品，持续的时间足以使得所述至少一种核酸与所述至少一种磁性颗粒可逆结合，以形成至少一种经修饰的磁性颗粒；(c)从溶液分离所述至少一种经修饰的磁性颗粒；(d)用至少一种清洗缓冲液清洗所述至少一种经修饰的磁性颗粒；以及(e)使所述至少一种经修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液相结合。
根据各种实施方式，结合缓冲液可以包括至少一种离液剂(存在的浓度范围约为0.2-6M)、至少一种醇(存在的浓度范围约为0.1-5M)以及任选的至少一种盐(存在的浓度范围约为10-100mM)。在其他实施方式中，清洗缓冲液可包含至少一种醇和任选的至少一种盐。根据其他实施方式，洗脱缓冲液可以选自水和低盐溶液，其包含例如约为0.1-10mM的至少一种离子螯合剂和/或约为10-100mM的至少一种缓冲化合物。磁性颗粒可选自例如羧基涂覆的磁性颗粒、基于二氧化硅的磁性颗粒，及其组合。本文还揭示了包含这些缓冲液和磁性颗粒的核酸纯化试剂盒。
在以下的详细描述中提出了本发明的附加特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言根据所作描述即容易理解，或者通过实施包括以下详细描述、权利要求书以及附图在内的本文所述的本发明而被认识。
应理解，前面的一般性描述和以下的详细描述都表示本文的各种实施方式，用来提供对于权利要求的性质和特性的总体理解或框架性理解。包括的附图提供了对本文的进一步的理解，附图被结合在本说明书中并构成说明书的一部分。附图举例说明了本文的各种实施方式，并与描述一起用来解释本发明的原理和操作。
附图说明
结合以下附图阅读本说明书，便可以最好地理解下文中的发明详述，图中相同的结构用相同的附图标记表示：
图1的流程图显示根据本文一个实施方式的核酸纯化方法；
图2显示根据本文各种实施方式的方法相比于现有技术方法的RNA产率；
图3显示采用根据本文各种实施方式的方法和采用现有技术方法纯化的RNA的琼脂糖凝胶电泳分析；
图4显示根据本文各种实施方式的方法相比于现有技术方法的RNA产率；
图5A-B显示采用根据本文各种实施方式的方法和采用现有技术方法纯化的RNA的琼脂糖凝胶电泳分析；
图6显示根据本文各种实施方式的方法相比于现有技术方法的RNA产率；
图7显示采用根据本文各种实施方式的方法和采用现有技术方法纯化的核酸的琼脂糖凝胶电泳分析；以及
图8显示采用根据本文各种实施方式的方法和采用现有技术方法纯化的小核酸片段的琼脂糖凝胶电泳分析。
具体实施方式
方法
本文揭示了核酸纯化的方法，该方法包括：(a)将包含至少一种核酸的样品与结合缓冲液相组合以形成溶液，所述结合缓冲液包含至少一种磁性颗粒且具有约为4-10的pH；(b)用结合缓冲液孵育样品，持续的时间足以使得所述至少一种核酸与所述至少一种磁性颗粒可逆结合，以形成至少一种经修饰的磁性颗粒；(c)从溶液分离所述至少一种经修饰的磁性颗粒；(d)用至少一种清洗缓冲液清洗所述至少一种经修饰的磁性颗粒；以及(e)使所述至少一种经修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液相结合。
下面将参照图1讨论本文的实施方式，图1显示根据本文非限制性实施方式的核酸纯化方法的流程图。以下一般性描述旨在提供对于所要求保护方法的总览，本文全文将参照非限制性实施方式更具体地讨论各个方面，在下文的一般性方法中，这些实施方式是可相互交换的。
如图1所示，在步骤IVT中，会产生含有RNA分子110与不需要的污染物105(例如，盐、蛋白质、酶、寡核苷酸、碳水化合物、DNA模板和三磷酸核苷酸(NTP))的样品。在步骤I中，样品会与结合缓冲液组合并孵育，所述结合缓冲液包含至少一种磁性颗粒115等。在孵育过程中，样品中的RNA分子110可以与磁性颗粒115的表面可逆地结合。然后，在步骤S中，可以使用磁体120来吸引磁性颗粒115并从余下的溶液分离。在步骤W中，可以使用一种或多种清洗缓冲液清洗磁性颗粒115以除去未结合的污染物105。然后，在步骤E中，可以使用一种或多种洗脱缓冲液将RNA 110从磁性珠上洗脱解脱下来。最后，在步骤P中，可以从RNA 110分离磁性颗粒115，以产生随后可用于各种应用的纯化产物。
如本文所用术语“包含至少一种核酸的样品”及其变化形式旨在表示可含有至少一种核酸(例如，DNA分子、RNA分子或DNA/RNA混合分子)的任意材料。所述至少一种核酸可包括例如基因组DNA、染色体DNA(cDNA)、质粒DNA(pDNA)、总RNA、信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)和/或RNA/DNA杂交体。在各种实施方式中，样品可以是包含RNA的IVT后的混合物。根据其他实施方式，待纯化的所述至少一种核酸可以是RNA，例如总RNA。
根据本文所揭示的各种方法，包含至少一种核酸的样品(例如，包含RNA的IVT后样品)可以与结合缓冲液(B1)组合(参见，例如图1的步骤B)。结合缓冲液B1可包含至少一种离液剂(C1)、至少一种醇(A1)、和任选的至少一种盐(Z1)。样品与结合缓冲液B1之间的体积比可以是如下范围，例如，约为1:1.5至1:3，例如约为1:1.8-1:2.5，或者约为1:2-1:2.2，包括其间的所有范围和子范围。在某些实施方式中，样品与结合缓冲液B1之间的体积比可以约为1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、或1:3，包括其间的所有范围和子范围。
可以本领域已知的任何方式组合样品和结合缓冲液B1，例如，可以将结合缓冲液B1加入到样品并混合(例如通过颠倒进行)。在某些实施方式中，可将混合物颠倒数次，例如至少五次、至少十次或更多次。样品可以在结合缓冲液B1中孵育一段时间，其足以使得所述至少一种核酸与所述至少一种磁性颗粒结合。该时间段的范围可以是例如约1分钟至约30分钟，如约2分钟至约25分钟、约3分钟至约20分钟、约4分钟至约15分钟或约5分钟至约10分钟，包括其间的所有范围和子范围。
存在于结合缓冲液B1中的所述至少一种离液剂C1的浓度范围可以是例如：约为0.2M至约为6M，例如约为0.3M至约为5M，约为0.5M至约为4M，约为0.7M至约为3.5M，约为1M至约为3M，约为1.2M至约为2.5M，或约为1.5M至约为2M，包括其间的所有范围和子范围。例如，C1浓度可以约为0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M、2M、2.1M、2.2M、2.3M、2.4M、2.5M、2.6M、2.7M、2.8M、2.9M、3M、3.1M、3.2M、3.3M、3.4M、3.5M、3.6M、3.7M、3.8M、3.9M、4M、4.1M、4.2M、4.3M、4.4M、4.5M、4.6M、4.7M、4.8M、4.9M、5M、5.1M、5.2M、5.3M、5.4M、5.5M、5.6M、5.7M、5.8M、5.9M、或6M，包括其间的所有范围和子范围。根据各种实施方式，所述至少一种离液剂C1可以选自：胍盐(例如，盐酸盐(GuHCl)和硫氰酸胍(GuSCN))；锂盐(例如，乙酸锂和高氯酸锂)；及其组合。在某些非限制性实施方式中，所述至少一种离液剂C1可选自GuHCl和GuSCN。在各个实施方式中，所述至少一种离液剂C1可用于促进所述至少一种核酸与所述至少一种磁性颗粒的结合。
存在于结合缓冲液B1中的所述至少一种醇A1的浓度范围可以是例如：约为0.1M至约为5M，例如约为0.3M至约为4.5M，约为0.5M至约为4M，约为0.7M至约为3.5M，约为1M至约为3M，约为1.2M至约为2.5M，或约为1.5M至约为2M，包括其间的所有范围和子范围。例如，A1浓度可以约为0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M、2M、2.1M、2.2M、2.3M、2.4M、2.5M、2.6M、2.7M、2.8M、2.9M、3M、3.1M、3.2M、3.3M、3.4M、3.5M、3.6M、3.7M、3.8M、3.9M、4M、4.1M、4.2M、4.3M、4.4M、4.5M、4.6M、4.7M、4.8M、4.9M、或5M，包括其间的所有范围和子范围。
在非限制性实施方式中，所述至少一种醇A1可以占据了结合缓冲液B1的总体积的约为20-50体积％，例如，约为25-45体积％或者约为30-40体积％，包括其间的所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种醇A1可选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇，及其组合。在一些实施方式中，所述至少一种醇A1可以是异丙醇。在各个实施方式中，所述至少一种醇A1可以是离液的(chaotropic)，并且可用于使样品中的蛋白质变性。
如果存在的话，在结合缓冲液B1中存在的所述至少一种盐Z1的浓度可以是例如约为10-100mM，例如约为20-90mM，约为30-80mM，约为40-70mM，或者约为50-60mM，包括其间的所有范围和子范围。例如，Z1浓度可以约为10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、或100mM，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种盐Z1可以选自磷酸盐，例如磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)，及其组合。
根据各个实施方式，结合缓冲液B1的pH范围可以约为4-10，例如约为4.5-9.5，约为5-9，约为5.5-8.5，约为6-8，或者约为6.5-7.5，包括其间的所有范围和子范围。例如，结合缓冲液B1的pH可以约为4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1 5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或10，包括其间的所有范围和子范围。
如本文所用术语“磁性颗粒”及其变化形式旨在表示具有磁性(例如顺磁性或超顺磁性)芯的颗粒，芯涂覆有至少一种表面可与核酸可逆结合的材料。合适的磁性颗粒可包括例如羧基涂覆的顺磁性颗粒以及基于二氧化硅的顺磁性颗粒等。在一些实施方式中，基于二氧化硅的磁性颗粒可以包括涂覆了硅石氧化物的顺磁性芯，从而提供了含水硅石氧化物吸附表面(例如，包含硅烷醇基团的表面)，核酸可以与其结合。在其他实施方式中，磁性颗粒可以经表面修饰以产生功能化的表面，例如带弱或强正电荷、带弱或强负电荷或疏水性表面等。
市售可得的磁性颗粒的非限制性例子包括购自MagQu有限公司的Q珠和购自W.R.Grace&Co公司的Grace珠等。磁性颗粒可以具有适合与核酸结合的任意尺寸，包括市售可得的尺寸，例如直径范围约为0.3-10μm的直径，例如，直径约为0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10μm，包括其间的所有范围和子范围。例如，Q珠的平均直径范围可以约为4μm至约5μm，Grace珠的平均直径范围可以约为5μm至约10μm。
在结合缓冲液中存在的所述至少一种磁性颗粒的浓度范围可以是例如，约为0.5μg/μL至约为60μg/μL、例如约为0.75μg/μL至约为55μg/μL、约为1μg/μL至约为50μg/μL、约为2μg/μL至约为45μg/μL、约为3μg/μL至约为40μg/μL、约为4μg/μL至约为35μg/μL、约为5μg/μL至约为30μg/μL、约为6μg/μL至约为25μg/μL、约为7μg/μL至约为20μg/μL、约为8μg/μL至约为15μg/μL、或约为9μg/μL至约为10μg/μL，包括其间的所有范围和子范围。作为非限制性实施方式，所述至少一种磁性颗粒可以选自Q珠，并且在结合缓冲液B1中存在的浓度范围约为0.5-5μg/μL。在替代性实施方式，所述至少一种磁性颗粒可以选自Grace珠，并且在结合缓冲液B1中存在的浓度范围约为2-60μg/μL。
不希望受限于理论，相信通过结合缓冲液B1引入的较高浓度的离液剂、醇和/或盐可以增强核酸(例如RNA)与磁性颗粒的表面(例如二氧化硅表面)发生可逆(例如非共价)结合的能力。随后，能够将如此修饰的磁性颗粒(例如包含可逆结合的核酸)与未结合的污染物分离(参见例如图1的步骤S)。例如，可以将磁体放置在靠近经修饰的磁性颗粒，并用于将颗粒拉到一起，例如从而形成团聚体或球粒。在某些实施方式中，可以将含有经组合的溶液(其包含了经修饰的磁性颗粒)的容器(例如，管)放在磁性台上，其可以在去除剩余溶液的同时聚集并略微固定颗粒。
在将核酸与磁性颗粒结合之后以及采用磁体使得经修饰的磁性颗粒分离之后，然后可以用一种或多种清洗缓冲液对颗粒进行结合、冲洗或清洗(参见例如图1的步骤W)。清洗缓冲液(W1)可以包括例如至少一种醇(A2)和任选的至少一种盐(Z2)。然后可以用清洗缓冲液W1对经修饰的磁性颗粒冲洗一次或多次，任意额外清洗可以采用相同或不同的组成、浓度和/或体积量。
存在于清洗缓冲液W1中的所述至少一种醇A2的浓度范围可以是，例如约70％至约100体积％，例如约75-95体积％或约80-90体积％，包括其间的所有范围和子范围。例如，A2浓度可以约为70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，包括其间的所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种醇A2可选自异丙醇、甲醇、乙醇、丁醇，及其组合。在某些非限制性实施方式中，所述至少一种醇A2可以是乙醇。
如果存在的话，在清洗缓冲液W1中存在的所述至少一种盐Z2的浓度可以是例如约为10-100mM，例如约为20-90mM，约为30-80mM，约为40-70mM，或者约为50-60mM，包括其间的所有范围和子范围。例如，Z2浓度可以是约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种盐Z2可选自硫酸铵((NH4)2SO4)、乙酸铵(NH4Ac)、乙酸锂(LiAc)、乙酸钾(KAc)、乙酸钠(NaAc)、氯化钠(NaCl)，及其组合。在某些非限制性实施方式中，所述至少一种盐Z2可选自NaAC和NH4AC。
根据各个实施方式，清洗缓冲液W1的pH范围可以是例如约为4-8，例如约为5-7，约为6-6.5，或者约为6.4-6.8，包括其间的所有范围和子范围。可通过改变醇和/或盐的量来调节清洗缓冲液W1的pH，或者可使用一种或多种本文所述的缓冲化合物(例如冰醋酸或NaOH)来调节。
在添加和去除清洗缓冲液W1之后，可以提供表面可逆结合了核酸的经修饰的磁性颗粒，其可以不含或者基本不含污染物(例如，盐、蛋白质、酶等)。根据各个实施方式，然后可将如此产生的经修饰的磁性颗粒与一种或多种洗脱缓冲液(E1)组合以释放结合的核酸并将其与磁性颗粒分离(参见例如图1中的步骤E)。可将修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液E1孵育足够长的一段时间以释放核酸，如约30秒至约10分钟，例如如约45秒至约9分钟、约1分钟至约8分钟、约2分钟至约7分钟、约3分钟至约6分钟或约4分钟至约5分钟，包括其间的所有范围和子范围。洗脱缓冲液E1可以包括例如水或较低盐溶液，其包含例如，约为1-10mM的至少一种缓冲液(例如，Tris等)、约1-10mM的至少一种盐、和/或约0.1-10mM的至少一种离子螯合剂(例如，EDTA等)。根据非限制性实施方式，洗脱缓冲液E1可包含约1mM的EDTA和约10mM的Tris。
然后可以从溶液去除(不再与核酸附着的)磁性颗粒，例如采用磁体分离，得到溶液中的经纯化的核酸作为最终产物(参见例如图1的步骤P)。例如，本文所揭示的方法和试剂盒可用于提供经纯化的RNA产品。根据各个实施方式，本文所揭示的方法和试剂盒可用于在短时间段内有效地产生经纯化的RNA。例如，在非限制性实施方式中，本文公开的方法可在小于约30分钟的时间段内实施，如小于约20分钟。在某些实施方式中，本文所揭示的方法在约20分钟内提供了至少约90％的相对RNA产率。
应理解的是，在一些实施方式中，各种缓冲溶液的组分可互换使用，例如可以是相互相同或不同的。例如，醇A1和A2以及盐Z1和Z2可以分别是相同或不同的。类似地，这些组分的浓度可以发生改变，并且在一些情况下，可以是相同或相似的，这取决于所需的应用。
还应理解的是，本文所揭示的方法还可包括本领域已知的其他步骤，例如，离心和过滤等。在其他非限制性实施方式中，本文所揭示的方法不包括任何离心或过滤步骤，这可增强工艺的自动化能力。其他任选步骤可包括空气干燥，例如在用清洗缓冲液W1清洗经修饰的磁性颗粒后，可对颗粒进行空气干燥约1分钟至约10分钟的时间段，如约2分钟至约9分钟、约3分钟至约8分钟、约4分钟至约7分钟或约5分钟至约6分钟，包括其间的所有范围和子范围。如果需要或者希望的话，还可在本文公开的方法实施期间将多种样品、溶液或者样品或溶液的部分移出和/或转移至新容器(如管)中。
试剂盒
本文还涉及用于核酸纯化的试剂盒，该试剂盒包括：结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。在各个实施方式中，缓冲液可对应于上文关于纯化方法所揭示的缓冲液B1、W1和E1。应理解，可以任何方式并不受限制地结合相对于各缓冲液的上述多种实施方式以形成本文公开的试剂盒。
根据各个实施方式，供给到试剂盒中的每种缓冲液可以具有预定浓度，从而使得每种组分是即用型的。或者，可提供一种或多种浓缩溶液，待最终用户使用合适类型和量的溶剂稀释以产生即用型缓冲液。例如，在某些实施方式中，可以在试剂盒内提供浓缩的结合缓冲液，用户可以用醇(例如异丙醇)将其稀释至最高达1:1的体积比。根据其他实施方式，可以提供浓缩的清洗缓冲液W1，用于可以用醇(例如乙醇)将其稀释至大于或等于70％的最终浓度，以乙醇的体积计。在一些实施方式中，试剂盒还可包括关于纯化方案和/或任何稀释指令的最终用户的指示。根据其他实施方式，试剂盒还可包括各种其他组分或设备，例如磁性台、管、离心机和/或溶剂。
应理解，多个揭示的实施方式可涉及与特定实施方式一起描述的特定特征、元素或步骤。应理解的是，虽然结合一个具体的实施方式描述了具体特征、元素或步骤，但是不同实施方式可以以各种未示出的组合或变换形式相互交换或结合。
还应理解的是，本文所用的冠词“该”、“一个”或“一种”表示“至少一个(一种)”，不应局限为“仅一个(一种)”，除非明确有相反的说明。因此，例如，提到的“一个缓冲液”包括具有两个或更多个这样的“缓冲液”的例子，除非文中另行明确指明。
本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值和/或到“约”另一个具体值的范围。当表述这种范围时，例子包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成另一个方面。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值有关和与另一个端点值无关时，都是有意义的。
除了在实施例中之外，无论是否写出来，本文所述的所有数值都解释为包括“约”，除非另有明显相反表示。然而，还应理解，无论是否表示为“约”某一数值，列出的各数值都是精确估计的。因此，“大于2M的浓度”和“大于约2M的浓度”都包括“大于约2M的浓度”以及“大于2M的浓度”的实施方式。
除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。
虽然会用过渡语“包括”来公开特定实施方式的各种特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语由“......构成”、“基本由......构成”描述在内的替代实施方式。因此，例如，对包含A+B+C的缓冲液的隐含的替代性实施方式包括缓冲液由A+B+C组成的实施方式和缓冲液主要由A+B+C组成的实施方式。
对本领域的技术人员而言，显而易见的是，可以在不偏离本文的范围和精神的情况下对本文进行各种修改和变动。因为本领域的技术人员可以想到所述实施方式的融合了本公开精神和实质的各种改良组合、子项组合和变化，应认为本文包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。
以下实施例是非限制性的且仅仅是示意性的，本发明的范围由权利要求书所限定。
实施例
示例性纯化方案
仅出于讨论的目的，下面提供了用于从样品(例如IVT样品)对RNA进行纯化的示例性方案。当然，该方案并不旨在限制且不应理解为对所附权利要求的限制。
a)结合缓冲液制备：采用1:1的体积比，将浓缩的结合缓冲液B1重悬浮在醇中；
b)清洗缓冲液制备：将醇添加到浓缩的清洗缓冲液中，至70％的最终体积浓度；
c)RNA结合：对于X体积的样品，添加3X体积的结合缓冲液B1，良好混合，并孵育5分钟；
d)结合了RNA的磁性颗粒的分离：采用磁性台以磁性方式分离具有可逆结合的RNA的磁性颗粒，直到液体是基本透澈的，以及去除透澈液体；
e)对结合了RNA的磁性颗粒进行清洗：用700μL的清洗缓冲液W1对包含可逆结合的RNA的磁性颗粒清洗一次；
f)去除清洗缓冲液：采用磁性台以磁性方式分离具有可逆结合的RNA的磁性颗粒，直到液体是基本透澈的，以及去除透澈液体；
g)重复步骤e)，400μL的清洗缓冲液W1；
h)重复步骤f)；
i)干燥：使得具有可逆结合的RNA的磁性颗粒在磁性台上进行空气干燥，持续5-10分钟；
j)RNA的洗脱：从磁性台取出管并添加所需体积的洗脱缓冲液E1(或多或少产生所需的样品浓度)，以及在室温下孵育至少2分钟；以及
k)RNA的纯化：将管放在磁性台上以分离磁性颗粒，直到液体是基本透澈的，以及去除和保存透澈液体。
比较例1
采用上文所述方案，用Q珠(62.5μg)或Grace珠(180、360、1080、3240μg)对含有RNA的样品进行纯化。还采用贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)的
Figure BDA0001349383510000111
RNACleanXP试剂盒对相同的样品进行纯化。量化每种方法的平均总RNA产率，参见表2。采用Q珠的本发明方法的相对总RNA产率是88.4％。采用Grace珠的本发明方法的相对总RNA产率是73.3％(3240μg)至82.0％((360μg)。比较例
Figure BDA0001349383510000112
试剂盒产率为81.5％RNA。
图3显示各种方法的RNA样品的琼脂糖凝胶电泳分析，显示通过每种方法产生的RNA的质量是相当的。因此，图2-3证实本发明的方法进行了约20分钟，提供了与基准比较例
Figure BDA0001349383510000121
试剂盒相当的RNA产率和质量。
比较例2
采用上文所述示例性方案以结合缓冲液B1在变化的pH(4.3和6.3)和变化的RNA浓度((20μg RNA溶解在20μL或200μg溶液中)下对RNA进行纯化。还采用贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)的
Figure BDA0001349383510000122
RNAClean XP试剂盒对相同的样品进行纯化。量化每种方法的相对总RNA产率，参见表4。相比于采用pH 6.3的结合缓冲液的方法，采用pH 4.3的结合缓冲液的本发明的方法的相对总RNA产率得到改善。此外，相比于采用20μg/200μL RNA的方法，采用20μg/20μL RNA的本发明的方法的相对总RNA产率得到改善。
图5显示各种方法的RNA样品的琼脂糖凝胶电泳分析，显示相比于采用pH 6.3的结合缓冲液的本发明的方法，采用pH 4.3的结合缓冲液的本发明的方法所产生的RNA的质量降低。因此，图4-5证实本发明的方法进行了约20分钟，提供了相比于基准比较例
Figure BDA0001349383510000123
试剂盒得到改善或者相当的RNA产率和/或质量。
比较例3
采用上文所述示例性方案，以Q珠(62.5μg)或Grace珠(360μg)，从IVT样品纯化RNA。还采用贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)的
Figure BDA0001349383510000124
RNAClean XP试剂盒对相同的样品进行纯化。对每种方法的RNA产率进行量化和记录于图6中，结果相对于
Figure BDA0001349383510000125
产率进行了标准化。采用Q珠的本发明方法的相对总RNA产率是96.0％。采用Grace珠的本发明方法的相对总RNA产率是91.2％。
图7显示各种方法的核酸样品的琼脂糖凝胶电泳分析，显示通过每种方法产生的核酸的质量是相当的。图8显示寡核苷酸(30nt)的琼脂糖凝胶电泳分析，显示相比于比较例
Figure BDA0001349383510000126
方法，本发明方法与小片段核酸结合的能力得到了改善。
因此，图6-8证实本发明的方法进行了约20分钟，提供了与基准比较例
Figure BDA0001349383510000127
试剂盒相当的RNA产率和质量，同时还提供了改善的核酸小片段结合。

Claims (18)

1.一种对核酸进行纯化的方法，所述方法包括：
（a）将包含至少一种核酸的样品与pH为4-10的结合缓冲液相组合，以形成溶液；
其中，所述结合缓冲液包含至少一种包括购自MagQu有限公司的Q珠的磁性颗粒，存在的浓度为0.2-6 M的至少一种离液剂，存在的浓度为0.1-5 M的至少一种第一醇，以及存在的浓度为10-100 mM的至少一种第一盐；
（b）使所述溶液孵育一段时间，其足以使得所述至少一种核酸与所述至少一种磁性颗粒可逆结合，以形成至少一种经修饰的磁性颗粒；
（c）从经组合的溶液分离所述至少一种经修饰的磁性颗粒；
（d）用至少一种清洗缓冲液清洗所述至少一种经修饰的磁性颗粒，所述清洗缓冲液包含至少一种第二醇和任选的至少一种第二盐；以及
（e）使所述至少一种经修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液相组合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包含所述至少一种核酸的样品是包含RNA的IVT样品。
3. 如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种第一离液剂选自：盐酸盐胍（GuHCl）、硫氰酸胍（GuSCN））、锂盐，及其组合，
其中，所述至少一种第一醇选自异丙醇、甲醇、乙醇、丁醇，及其组合；以及
其中，所述至少一种第一盐选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，及其组合。
4.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种第二醇选自异丙醇、甲醇、乙醇、丁醇，及其组合；以及
其中，所述至少一种第二盐选自硫酸铵（(NH4)2SO4）、乙酸铵（NH4Ac）、乙酸锂（LiAc）、乙酸钾（KAc）、乙酸钠（NaAc）、氯化钠（NaCl），及其组合。
5.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述清洗缓冲液包含至少70体积%的所述至少一种第二醇。
6. 如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述结合缓冲液中存在的所述至少一种磁性颗粒的浓度为0.5-60 µg/µL。
7.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，孵育时间段范围为1-30分钟。
8.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，含有所述至少一种核酸的样品与所述结合缓冲液的体积比为1:1.5至1:3。
9.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液选自水和包含至少一种缓冲化合物和/或至少一种离子螯合剂的溶液。
10.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种经修饰的磁性颗粒用所述洗脱缓冲液孵育，持续的时间段为30秒至10分钟。
11.一种用于核酸纯化的试剂盒，所述试剂盒包括：
（a）结合缓冲液，其pH范围为4-10，并且包含至少一种包括购自MagQu有限公司的Q珠的磁性颗粒，存在的浓度为0.2-6 M的至少一种离液剂，存在的浓度为0.1-5 M的至少一种第一醇，以及存在的浓度为10-100 mM的至少一种第一盐；
（b）清洗缓冲液，其包含至少一种第二醇和任选的至少一种第二盐；以及
（c）洗脱缓冲液。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，包含所述至少一种核酸的样品是包含RNA的IVT样品。
13.如权利要求11-12中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一种离液剂选自：盐酸盐胍（GuHCl）、硫氰酸胍（GuSCN））、锂盐，及其组合，
其中，所述至少一种醇选自异丙醇、甲醇、乙醇、丁醇，及其组合；以及
其中，所述至少一种第一盐选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，及其组合。
14.如权利要求11-12中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一种第二醇选自异丙醇、甲醇、乙醇、丁醇，及其组合；以及
其中，所述至少一种第二盐选自硫酸铵（(NH4)2SO4）、乙酸铵（NH4Ac）、乙酸锂（LiAc）、乙酸钾（KAc）、乙酸钠（NaAc）、氯化钠（NaCl），及其组合。
15.如权利要求11-12中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗缓冲液包含至少70体积%的所述至少一种第二醇。
16.如权利要求11-12中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述结合缓冲液中存在的所述至少一种磁性颗粒的浓度为0.5-60 µg/µL。
17.如权利要求11-12中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱缓冲液选自水和包含至少一种缓冲化合物和/或至少一种离子螯合剂的溶液。
18.一种用于核酸纯化的试剂盒，所述试剂盒包括：
（a）结合缓冲液，其pH范围为4-7，并且包含至少一种包括购自MagQu有限公司的Q珠的磁性颗粒；存在的浓度为0.3-2.5 M的至少一种离液剂，所述至少一种离液剂选自GuHCl、GuSCN及其组合；存在的浓度为2-5 M的异丙醇；以及存在的浓度为10-100 mM的至少一种第一盐，所述至少一种第一盐选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及其组合；
（b）清洗缓冲液，其包含70体积%的乙醇和存在的浓度为10-100 mM的任选的至少一种第二盐，所述至少一种第二盐选自乙酸钠、乙酸铵及其组合；以及
（c）洗脱缓冲液，其选自水和溶液，所述溶液包含存在的浓度为10-100 mM的至少一种缓冲化合物以及存在的浓度为0.1-10 mM的至少一种离子螯合化合物。
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