CN102071186A - 一种从生物样品中快速分离病毒核酸的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

一种从生物样品中快速分离病毒核酸的试剂盒及方法，从无细胞生物样品中快速分离病毒核酸。本发明的试剂盒包括裂解缓冲液、磁珠、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液。方法是将生物材料进行裂解，使磁珠与核酸形成复合物，在外加磁场作用下进行分离，并洗涤去除杂质，然后洗脱回收核酸。本方法提取核酸操作简便、安全，成本低廉，核酸完整、纯度高，可直接用于后续实验。可配合自动化核酸提取仪器进行高效的病毒核酸提取，也可用于手工操作提取核酸。

Description

一种从生物样品中快速分离病毒核酸的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及从生物样品中分离核酸的方法。具体而言，本发明提供了一种从无细胞生物样品中快速纯化病毒核酸的试剂盒及方法。
背景技术
目前，在生物医学的很多研究领域都离不开核酸纯化。从生物材料中高效、简便地分离纯化得到完整、高纯度的目标核酸则是研究病毒性疾病的基础。
传统的核酸纯化方法步骤繁琐，耗时长，提取效率低，已经很难满足高通量的实验需求。同时传统方法使用酚/氯仿等试剂对人体产生巨大毒害作用且污染环境。磁珠在外加磁场的作用下可快速地分离核酸，简单、快捷、成本低廉且安全。
目前已有很多公司生产出专门为核酸磁性分离纯化而设计的配套自动化系统，这些仪器使得磁珠法纯化核酸实现了自动化，极大地提高了样品处理的通量，易于高通量的筛选，同时也提高了提取操作的可重复性。而已商品化的磁珠法病毒核酸提取试剂盒价格昂贵，且不同仪器之间通用性较差，迫切需要开发价格便宜、高效、稳定和简便的病毒核酸提取试剂盒。
本发明中基于自动化核酸提取仪的磁珠法核酸纯化试剂盒具有操作简便快捷、省时省力、成本低廉等特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够从生物样本中快速分离病毒核酸的试剂盒及方法，并且适用于自动化核酸提取仪。该方法操作简便，试剂盒成本低廉，所提取的核酸完整、纯度高，有助于后续实验的进行。
具体而言，本发明提供了一种通过磁性颗粒来纯化病毒核酸的试剂盒，该试剂盒包括以下组分：
(1)裂解缓冲液：6M盐酸胍，150mM Tris-HCl，50mM EDTA，200mM NaCl，5％Triton，0.5mM DTT，pH值＝7.4；
(2)磁珠；
(3)洗涤缓冲液I：6M盐酸胍，100mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM EDTA，pH值＝7.4；
(4)洗涤缓冲液II：70％乙醇；
(5)洗涤缓冲液III：水；
(6)洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0。
根据上述试剂盒进行病毒核酸提取，该方法的具体步骤包括：
(1)样品裂解：在含病毒的样品中加入裂解缓冲液，使样品中的病毒粒子裂解；
(2)将步骤(1)得到的混合溶液中加入适量磁珠，样品中的核酸与磁珠结合，然后在外加磁场条件下进行分离，收集磁珠-核酸复合物；
(3)向步骤(2)得到的磁珠-核酸复合物中加入洗涤缓冲液I，去除未结合物质，然后在外加磁场条件下进行分离，收集磁珠-核酸复合物；
(4)向步骤(3)得到的磁珠-核酸复合物中加入洗涤缓冲液II，去除杂质，然后在外加磁场条件下进行分离，收集磁珠-核酸复合物；
(5)向步骤(4)得到的磁珠-核酸复合物中加入洗涤缓冲液III，然后在外加磁场条件下进行分离，收集磁珠-核酸复合物；
(6)向步骤(5)得到的磁珠-核酸复合物中加入洗脱缓冲液，将结合在磁珠上的核酸洗脱下来，回收上清液即为纯化的病毒核酸。
本方法中，生物样品应该无细胞成分，最好是血浆或血清。如果从细胞培养物中获取病毒，需要从培养基中取出培养的细胞，留下无细胞的上清液。
本发明所提取的核酸可以直接进行PCR及RT-PCR等分子生物学实验研究及临床检测。
本试剂盒可用配合自动化仪器，高通量提取病毒核酸。
附图说明
图1为病毒含量与Ct值的相关性曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种直接用于快速纯化病毒核酸的试剂盒及方法。
本发明中所述核酸包括RNA和DNA。
本发明中核酸提取试剂盒包括以下组分：
裂解缓冲液：6M guanidine，150mM Tris-HCl，50mM EDTA，200mM NaCl，5％Triton，0.5mM DTT，pH值＝7.4；
磁珠；
洗涤缓冲液I：6M guanidine，100mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM EDTA，pH值＝7.4；
洗涤缓冲液II：70％乙醇；
洗涤缓冲液III：水；
洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH 8.0。
(1)取含病毒的血清样品100μl置于离心管内，加入裂解缓冲液100μl，充分混匀，55℃放置10分钟。
(2)向上述混合液中加入20μl磁珠悬浮液(用前充分摇匀)，充分混匀，室温下柔和混匀10分钟。
(3)将离心管置于磁力架上，磁力分离30秒，吸弃上清。
(4)加入250μl洗涤缓冲液I，振荡使磁珠充分悬浮，1分钟后磁力分离，吸弃上清。
(5)加入250μl洗涤缓冲液II，振荡使磁珠充分悬浮，1分钟后磁力分离，吸弃上清。
(6)离心管仍置于磁力架上，并保证磁珠被吸附，加入300μl洗涤缓冲液III，1分钟后移走洗涤缓冲液III。
(7)加入50μl洗脱缓冲液，轻弹使磁珠悬浮，60℃水浴l0分钟，其间轻轻晃动使核酸洗脱出来。
(8)将离心管置于磁力架1分钟，将洗脱液转移至干净的离心管。磁力分离30-60秒，使磁珠被吸附，吸取洗脱液到新的离心管中。洗脱液即为纯化的病毒核酸。
本发明提供了一种提取完整、高纯度病毒核酸的试剂盒及方法，该试剂盒成本低廉、操作简便，可配合自动化仪器，快速高通量提取病毒核酸。所提取的核酸可直接用于后续PCR或RT-PCR及基因克隆等分子生物学实验研究及临床检测。
实施例1：HEVRNA的提取
取含有HEV的血清样品，进行10倍梯度稀释，然后用本试剂盒提取HEV RNA，同时用Chemagen的病毒核酸提取试剂盒作为对照。按照下述操作步骤提取HEV RNA：
(1)取经梯度稀释的含HEV血清样品100μl置于离心管内，加入5ul(20μg/μl)ProteinaseK、裂解缓冲液100μl，充分混匀，55℃放置10分钟。
(2)向上述混合液中加入20μl磁珠悬浮液(用前充分摇匀)，充分混匀，室温下柔和充分混匀10分钟。
(3)将离心管置于磁力架上，磁分离30秒，吸弃上清。
(4)加入250μl洗涤缓冲液I，振荡使磁珠充分悬浮，1分钟后用磁力架分离，吸弃上清。
(5)加入250μl洗涤缓冲液II，振荡使磁珠充分悬浮，1分钟后用磁力架分离，吸弃上清。
(6)离心管仍置于磁力架上，并保证磁珠被吸附，从离心管的另一侧缓慢加入300μl洗涤缓冲液III，尽量不要冲起磁珠，1分钟后移走洗涤缓冲液III。
(7)加入50μl洗脱缓冲液，轻弹使磁珠悬浮，60℃水浴10分钟，其间轻轻晃动使RNA洗脱出来。
(8)将离心管置于磁力架1分钟，将洗脱液转移至干净的离心管。磁力分离30-60秒，使磁珠被吸附，吸取洗脱液到新的EP管中，即为纯化的RNA。
取上述RNA提取液2μl作为模板，进行荧光定量PCR检测。检测结果见下表和图1。
Figure B2009102239016D0000041
表中为不同稀释度时RNA的荧光定量PCR Ct值。Ct值越低，核酸量及纯度越高。

Claims (3)

1.一种可自动化提取病毒核酸的试剂盒，其特征在于：包括以下组分：
(1)裂解缓冲液：6M盐酸胍，150mM Tris-HCl，50mM EDTA，200mM NaCl，5％Triton，0.5mM DTT，pH值＝7.4；
(2)磁珠；
(3)洗涤缓冲液I：6M盐酸胍，100mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM EDTA，pH值＝7.4；
(4)洗涤缓冲液II：70％乙醇；
(5)洗涤缓冲液III：水；
(6)洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0。
2.一种根据权利要求1所述试剂盒进行病毒核酸提取的方法，其特征在于具体步骤包括：
(1)样品裂解：在含病毒的样品中加入裂解缓冲液，使样品中的病毒粒子裂解；
(2)将步骤(1)得到的混合溶液中加入适量磁珠，样品中的核酸与磁珠结合，然后在外加磁场条件下进行分离，收集磁珠-核酸复合物；
(3)向步骤(2)得到的磁珠-核酸复合物中加入洗涤缓冲液I，去除未结合物质，然后在外加磁场条件下进行分离，收集磁珠-核酸复合物；
(4)向步骤(3)得到的磁珠-核酸复合物中加入洗涤缓冲液II，去除杂质，然后在外加磁场条件下进行分离，收集磁珠-核酸复合物；
(5)向步骤(4)得到的磁珠-核酸复合物中加入洗涤缓冲液III，然后在外加磁场条件下进行分离，收集磁珠-核酸复合物；
(6)向步骤(5)得到的磁珠-核酸复合物中加入洗脱缓冲液，将结合在磁珠上的核酸洗脱下来，回收上清液即为纯化的病毒核酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中病毒核酸为DNA或RNA。
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