CN108624586A - 一种核酸提取试剂盒及其应用方法 - Google Patents

一种核酸提取试剂盒及其应用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108624586A
CN108624586A CN201810240821.0A CN201810240821A CN108624586A CN 108624586 A CN108624586 A CN 108624586A CN 201810240821 A CN201810240821 A CN 201810240821A CN 108624586 A CN108624586 A CN 108624586A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
cracking
liquid
magnetic bead
added
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810240821.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108624586B (zh
Inventor
陈威
刘松林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd filed Critical Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201810240821.0A priority Critical patent/CN108624586B/zh
Publication of CN108624586A publication Critical patent/CN108624586A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108624586B publication Critical patent/CN108624586B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种核酸提取的试剂盒，包括裂解结合液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，其中的裂解结合液包括0.5％‑2％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠和3％‑5％的磁珠，在其中的洗涤缓冲液中加入了少量硅油，减少了整个核酸提取的时间，减少了废液的残留，提高了核酸提取纯化的效果，同时也提高了核酸检测的精密度以及灵敏度。

Description

一种核酸提取试剂盒及其应用方法
技术领域
本发明设计生物技术领域，具体的，本发明涉及磁珠提取核酸的方法。
背景技术
核酸是生命的最基本物质之一，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)，起着储存和传递遗传信息的作用。
随着基因检测、个性化用药、产前诊断等的普及，高通量测序、荧光定量PCR、基因芯片等以核酸为检测对象的分子生物学技术的应用越来越广泛。核酸检测的关键环节之一，即从各种生物样品中提取和纯化核酸，核酸提取效率和纯度对下游的核酸检测能否成功起至关重要的作用。
核酸分离纯化技术发展迅速，目前主流的核酸提取方法为磁珠法，依据与硅胶膜离心柱相同的原理，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合，在胍盐和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA，可应用在临床疾病诊断，具有较高的临床应用价值。磁珠颗粒拥有比表面积大、沉降慢、磁响应快等传统的柱式核酸提取方法无法比拟的优势，便于自动化、操作简便、提取时间短、安全无毒。
在采用磁珠法提取核酸的方法中会用到裂解液、洗涤液和洗脱液，用到的这些液体对细胞中的核酸的充分暴露非常重要，当然这也决定了核酸的提取量的多少，不能很好地去除其他杂质，磁珠面粘附杂质，导致后续洗涤过程变得繁琐，需要两次甚至三次洗涤。
磁珠法的自动化应用主要有两类，一类应用于半自动核酸提取仪上，通过棒状磁铁和一次性磁棒套的配合使用，完成磁珠的收集，磁珠收集完成后将磁珠逐排从一种试剂转移到另一种试剂，从而完成核酸的提取；另一类应用于全自动提取纯化系统上，将深孔板每个孔内的磁珠通过磁性分离装置吸附到侧壁或底部，借助移液机械臂将试剂添加或丢弃来完成不同试剂的处理，进而在同一孔内完成一个样本的核酸提取。
目前，国内有较多的生物技术公司，如圣湘、之江、科华、艾康、天隆、奥盛等，以及全球著名的生物技术公司，如Roche、Qiagen、BioMerieux、ThermoFisher、Abbott、Promega、Chemagen、Ambion等均有基于磁珠法原理的半自动核酸提取仪或全自动提取纯化系统。
第一类自动化应用在磁珠转移过程，磁珠上存在“挂液”现象，会残留少量的杂质进入下一种试剂，特别是最终进入洗脱液中，影响后续分子生物学反应，特别是影响痕量核酸的检测；第二类自动化应用在磁珠吸附去除废液时不容易弃净，同样导致残留影响后续分子生物学反应。
因此，有必要提出一种新的裂解结合液以及磁珠提取核酸的方法来解决上述问题。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供了一种能够提高提取效率、提取纯化效率的核酸提取试剂盒以及其使用的方法。
本发明提供了一种用于核酸提取的试剂盒，其包括裂解结合液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，其特征在于：所述裂解结合液包括0.5％～2％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠和3％-5％的磁珠。
进一步的，所述的裂解结合液包括1％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠。
进一步的，所述裂解结合液包括4％的磁珠。
进一步的，所述磁珠为100-500nm的超顺磁性羧基氧化硅纳米微球。
进一步的，所述的裂解结合液还包括如下成分：异硫氰酸胍或盐酸胍1～5M，乙酸钠或乙酸钾1～5M，乙基苯基聚乙二醇1％～3％，蛋白酶K 10％～20％，所述裂解结合液的PH值为7.0～9.0。
进一步的，所述的裂解结合液还包括如下成分：异硫氰酸胍或盐酸胍4M，乙酸钠或乙酸钾2M，乙基苯基聚乙二醇1.5％，蛋白酶K 15％，所述裂解结合液的PH值为8.0。
进一步的，所述的试剂盒还包括硅油。
进一步的，所述的洗涤缓冲液还包括如下成分：碘化钠或碘化钾1～10mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～50mM，乙醇75％，所述洗涤缓冲液的PH值为5.0～7.0。
进一步的，所述的洗涤缓冲液还包括如下成分：碘化钠或碘化钾5M，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐40mM，乙醇75％，所述洗涤缓冲液的PH值为6.0。
进一步的，所述的洗脱缓冲液包括如下成分：乙二胺四乙酸1-5mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10-50mM，所述洗脱缓冲液的PH值为7.4-8.0。
进一步的，所述的洗脱缓冲液包括如下成分：乙二胺四乙酸1mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mM，所述洗脱缓冲液的PH值为8.0。
本发明还提供了一种采用所述的用于核酸提取的试剂盒提取核酸的方法，其包括如下步骤：
①在生物样品中加入如前所述的裂解结合液，在25-60℃下裂解2-10min，在外部磁场作用下，纳米磁珠聚集，形成磁珠-核酸复合物；
②向磁珠-核酸复合物中加入如前所述的洗涤缓冲液，再加入硅油，洗涤除去磁珠-核酸复合物上附带的杂质，并且更有利于磁性微球吸附核酸；
③在进行洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入如前所述的洗脱缓冲液，在60-90℃下洗脱1-5min，即得到提取的核酸。
进一步的，在步骤③中的详细步骤为：在进行洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入如权利要求6所述的洗脱缓冲液，在80℃下洗脱2min。
进一步的，在步骤①中的详细步骤为：在生物样品中加入如前所述的裂解结合液，在55℃下裂解4min，在外部磁场作用下，纳米磁珠聚集，形成磁珠-核酸复合物。
进一步的，所述的生物样品包括细胞、菌液、全血、动物组织匀浆液、植物组织匀浆液、血清、血浆、组织提取液、拭子洗液、尿液、病毒培养液。
进一步的，所述的生物样品与裂解结合液的体积比为1:1-1:5。
进一步的，步骤①中所述生物样品与裂解结合液的体积比为1:2.5。
进一步的，所述的硅油与裂解结合液的体积比为：1:5-2:5。
进一步的，所述的硅油与裂解结合液的体积比3:10。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
1)减少提取时间以及废液的残留：在提取时采用了少量的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠，并且在洗涤缓冲液中加入了一定量的硅油，两者组合在一起，减少了废液洗涤的时间，大大减少了核酸的提取时间，在半自动核酸提取仪上提取32个生物样品仅需10分钟，在全自动提取纯化系统上提取96个生物样品仅需60分钟。
2)减少提取时间以及废液的残留，提高了核酸提取纯化的效果，在洗涤步骤中加入一定量的硅油，减少了目标物-核酸上面的废液的残留，大大的提高了核酸提取纯化的效果。
3)减少提取的时间以及废液的残留，在裂解吸附液中加入少量的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠，减少了废液洗涤的次数以及时间，大大的减少了核酸的提取时间。
4)提高核酸检测的精密度以及灵敏度。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为HBV 100IU/mL标准品奥盛仪器半自动提取过程加入硅油的扩增图；
图2为HBV 100IU/mL标准品奥盛仪器半自动提取过程不加硅油的扩增图；
图3为HBV 10IU/mL标准品奥盛仪器半自动提取过程加入硅油的扩增图；
图4为HBV 10IU/mL标准品奥盛仪器半自动提取过程不加硅油的扩增图；
图5为HBV 100IU/mL标准品天隆仪器半自动提取过程加入硅油的扩增图；
图6为HBV 100IU/mL标准品天隆仪器半自动提取过程不加硅油的扩增图；
图7为HBV 10IU/mL标准品天隆仪器半自动提取过程加入硅油的扩增图；
图8为HBV 10IU/mL标准品天隆仪器半自动提取过程不加硅油的扩增图；
图9为HBV 100IU/mL标准品全自动提取过程加入硅油的扩增图；
图10为HBV 100IU/mL标准品全自动提取过程不加硅油的扩增图；
图11为HBV 10IU/mL标准品全自动提取过程加入硅油的扩增图；
图12为HBV 10IU/mL标准品全自动提取过程不加硅油的扩增图；
图13为HCV 100IU/mL标准品奥盛仪器半自动提取过程加入脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠的扩增图；
图14为HCV 100IU/mL标准品奥盛仪器半自动提取过程加入SDS的扩增图；
图15为HCV 15IU/mL标准品奥盛仪器半自动提取过程加入脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠的扩增图；
图16为HCV 15IU/mL标准品奥盛仪器半自动提取过程加入SDS的扩增图；
图17为HCV 100IU/mL标准品天隆仪器半自动提取过程加入脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠的扩增图；
图18为HCV 100IU/mL标准品天隆仪器半自动提取过程加入SDS的扩增图；
图19为HCV 15IU/mL标准品天隆仪器半自动提取过程加入脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠的扩增图；
图20为HCV 15IU/mL标准品天隆仪器半自动提取过程加入SDS的扩增图；
图21为HCV 100IU/mL标准品全自动提取过程加入脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠的扩增图；
图22为HCV 100IU/mL标准品全自动提取过程加入SDS的扩增图；
图23为HCV 10IU/mL标准品全自动提取过程加入脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠的扩增图；
图24为HCV 15IU/mL标准品全自动提取过程加入SDS的扩增图。
具体实施方式
实施例1本发明所述的磁珠法提取方法在半自动核酸提取仪上对乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测的应用
一、实验材料
1、样本：HBV核酸定量国际标准品NIBSC 10/264(8.5E+05IU/mL，genotype A2)，来自英国国家生物制品检定所(National Institute for Biological Standards andControl，NIBSC)；阴性人血清，来自seracare公司。
2、试剂：
2.1裂解结合液：脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠0.5％、异硫氰酸胍1M、乙酸钠1M、乙基苯基聚乙二醇1％、蛋白酶K 10％、磁珠3％，所述裂解结合液的PH值为7.0；
2.2洗涤缓冲液：碘化钠1mM、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mM、乙醇75％，所述洗涤缓冲液的PH值为5.0；
2.3硅油；
2.4洗脱缓冲液：乙二胺四乙酸1mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mM，所述洗脱缓冲液的PH值为7.4；
3、仪器：奥盛Auto-Pure32A核酸提取仪，天隆NP968-C核酸提取仪，ABI 7500荧光定量PCR仪。
二、具体实施方式
1、样本处理：将HBV核酸定量国际标准品NIBSC 10/264(8.5E+05IU/mL，genotypeA2)用阴性人血清稀释至100IU/mL和10IU/mL；
2、核酸提取：分别采用奥盛Auto-Pure32A核酸提取仪和天隆NP968-C核酸提取仪对100IU/mL和10IU/mLHBV标准品进行提取。
2.1、向96孔深孔板的第1列和第7列加入500μL裂解结合液，然后加入200μL样本，向第3列和第9列加入500μL洗涤缓冲液，然后加入100μL硅油，向第6列和第12列加入50μL洗脱缓冲液，96孔深孔板的第2列、第4列、第5列、第8列、第10列和第11列不加入任何试剂，96孔深孔板的试剂布局如表1所示。
表1 96孔深孔板的试剂布局表
2.2、将96孔深孔板放入奥盛Auto-Pure32A核酸提取仪中，按表2的程序进行核酸提取；或放入天隆NP968-C核酸提取仪中，按表3的程序进行核酸提取。
表2奥盛核酸提取程序
表3天隆核酸提取程序
2.3、等待10分钟左右，程序运行结束，取下96孔深孔板，此时96孔深孔板的第6列和第12列中的洗脱产物即为含纯化的HBV DNA的溶液，吸取洗脱产物进行PCR扩增反应。
3、核酸检测：采用ABI 7500荧光定量PCR仪进行扩增，检测HBV DNA。
3.1、扩增总体系为50μL，其中HBV反应液25μL，核酸提取产物25μL，PCR扩增反应液使用Axygen 0.2mL平盖八联管。
3.2、扩增程序见下表2，其中“*”表示荧光信号采集点，采集通道设置为FAM和VIC，Passive Reference设置为ROX。
表4 HBV扩增程序
4、实验结果：HBV标准品半自动提取检测数据及统计分析见下表5-8、附图1、附图
3、附图5与附图7。
对比实施例1
其实验材料与实施例1所采用的实验材料一致，其实验方法与实施例1的区别之处在于：在2.1步骤中，在洗涤缓冲液中不加硅油，即96孔深孔板的第3列和第9列不加入100μL硅油，其检测试剂及统计分析见下表5-8、附图2、附图4、附图6与附图8。
表5 HBV 100IU/mL标准品奥盛仪器半自动提取检测数据及统计分析
表6 HBV 10IU/mL标准品奥盛仪器半自动提取检测数据及统计分析
注：表6中NoCt即无扩增，未检测到靶标核酸片段。下同。
表7 HBV 100IU/mL标准品天隆仪器半自动提取检测数据及统计分析
表8 HBV 10IU/mL标准品天隆仪器半自动提取检测数据及统计分析
实验结果分析：从表5-8以及附图1-8中可以看出在半自动提取过程加入硅油后，100IU/mL HBV标准品的Ct均值从减少，Ct值的CV值降低，说明洗脱产物中杂质浓度降低，导致Ct值提前，精密度提高；10IU/mLHBV标准品的检出率增加，说明灵敏度也有所提升。因此，采用本发明所述的磁珠法提取方法，在半自动核酸提取仪上的应用具有很大的优势。
实施例2本发明所述的磁珠法提取方法在全自动核酸提取系统上对乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测的应用
一、实验材料
1、样本：与实施例1中的样本一致；
2、试剂：
2.1裂解结合液：脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠2％、盐酸胍5M、乙酸钾5M、乙基苯基聚乙二醇3％、蛋白酶K 20％、磁珠5％，所述裂解结合液的PH值为9.0；
2.2洗涤缓冲液：碘化钾10mM、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐50mM、乙醇75％、所述洗涤缓冲液的PH值为7.0；
2.3硅油；
2.4洗脱缓冲液：乙二胺四乙酸5mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐50mM，所述洗脱缓冲液的PH值为8.0。
3、仪器：中元生物ZS9600全自动核酸提取系统，ABI 7500荧光定量PCR仪。
二、具体实施方式
1、样本处理：与实施例1中的样本处理一致；
2、核酸提取：采用中元生物ZS9600全自动核酸提取系统进行100IU/mL和10IU/mLHBV标准品的提取；
2.1、耗材准备：补齐台面上200μL、1000μL枪头耗材，在三位高位载架的96深孔板位放置一块新的96深孔板，将Axygen 0.2mL平盖八联管置于三位高位载架的PCR扩增管位；
2.2、样本准备：将样本管放在6*16的样本载架上，从里至外，从左至右，依次放置，并将装有样本的载架推至定位梢底部；
2.3、试剂准备：将裂解结合液、洗涤缓冲液、硅油和洗脱缓冲液按人份数分别添加到四个试剂槽中，将HBV反应液放入EP管载架最前面的两个孔位；其中一人份的裂解结合液、洗涤缓冲液、硅油和洗脱缓冲液的量分别为：500μL、600μL、200μL和50μL。
2.4、运行结束后，取下八联管，盖上八联管盖，每个管子中即为纯化的HBV DNA溶液与HBV反应液的混合液，可直接进行扩增检测；
3、核酸检测：HBV扩增程序按照上述实施例1的表4。
4、实验结果：HBV标准品全自动提取检测数据及统计分析见表9与表10、附图9与附图11。
对比实施例2
其实验材料与实施例1所采用的实验材料一致，其实验方法与实施例2的区别之处在于：在洗涤缓冲液中不加200μL硅油，其检测试剂及统计分析见下表9与表10、附图10与附图12。
表9 HBV 100IU/mL标准品全自动提取检测数据及统计分析
表10 HBV 10IU/mL标准品全自动提取检测数据及统计分析
实验结果分析：在全自动提取过程加入硅油后，100IU/mL HBV标准品的Ct均值从减少，Ct值的CV值降低，说明洗脱产物中杂质浓度降低，导致Ct值提前，精密度提高；10IU/mL HBV标准品的检出率从1/8(12.5％)提升至8/8(100％)，说明灵敏度大幅度提升。因此，采用本发明所述的磁珠法提取方法，在全自动核酸提取系统上的应用具有很大的优势。
实施例3本发明所述的磁珠法提取方法在半自动核酸提取仪上对丙型肝炎病毒(HCV)核酸定量检测的应用
一.实验材料
1、样本：HCV核酸定量国际标准品NIBSC 14/150(1.0E+05IU/mL，genotype 1a)，来自英国国家生物制品检定所(National Institute for Biological Standards andControl，NIBSC)；阴性人血清，来自seracare公司；
2、试剂：
2.1裂解结合液：脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠2％、盐酸胍5M、乙酸钾5M、乙基苯基聚乙二醇3％、蛋白酶K 20％、磁珠5％，所述裂解结合液的PH值为8.0；
2.2洗涤缓冲液：碘化钾10mM、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐50mM、乙醇75％、所述洗涤缓冲液的PH值为6.0；
2.3硅油；
2.3洗脱缓冲液：乙二胺四乙酸1mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mM，所述洗脱缓冲液的PH值为8.0。
3、仪器：与实施例1中的仪器一致。
二、具体实施方式
1、样本处理：将HCV核酸定量国际标准品NIBSC 10/264(1.0E+05IU/mL，genotype1a)用阴性人血清稀释至100IU/mL和15IU/mL；
2、核酸提取：分别采用奥盛Auto-Pure32A核酸提取仪和天隆NP968-C核酸提取仪对100IU/mL和10IU/mL HBV标准品进行提取，具体操作步骤与实施例1中核酸提取的操作步骤一致；
3、核酸检测：采用ABI 7500荧光定量PCR仪进行扩增，检测HCVRNA；
3.1扩增总体系为50μL，其中HCV反应液25μL，核酸提取产物25μL，PCR扩增反应液使用Axygen 0.2mL平盖八联管；
3.2扩增程序见下表11，其中“*”表示荧光信号采集点，采集通道设置为FAM和VIC，Passive Reference设置为ROX。
表11 HCV扩增程序
4、实验结果：HCV标准品半自动提取检测数据及统计分析见下表12-15、附图13、附图15、附图17与附图19。
对比实施例3
其实验材料与实施例1所采用的实验材料一致，其实验方法与实施例3的区别之处在于：其中裂解液中的表面活性剂为SDS 2％与乙基苯基聚乙二醇3％，其检测试剂及统计分析见下下表12-15、附图14、附图16、附图18与附图20。
表12 HCV 100IU/mL标准品奥盛仪器半自动提取检测数据及统计分析
表13 HCV 15IU/mL标准品奥盛仪器半自动提取检测数据及统计分析
表14 HCV 100IU/mL标准品天隆仪器半自动提取检测数据及统计分析
表15 HCV 15IU/mL标准品天隆仪器半自动提取检测数据及统计分析
实验结果分析：在奥盛仪器和天隆仪器的半自动提取过程中加入一定量的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠，100IU/mL HCV标准品的Ct均值减少，Ct值的CV值降低，精密度提高；15IU/mL HCV标准品的检出率增加，说明灵敏度也有所提升。因此，采用本发明所述的磁珠法提取方法，在半自动核酸提取仪上的应用具有很大的优势。
实施例4本发明所述的磁珠法提取方法在全自动核酸提取系统上对丙型肝炎病毒(HCV)核酸定量检测的应用
一、实验材料
1、样本：与实施例3中的样本一致；
2、试剂：与实施例2中的试剂一致；
3、仪器：与实施例2中的仪器一致；
二、具体实施方式
1、样本处理：与实施例3中的样本处理一致；
2、核酸提取：采用中元生物ZS9600全自动核酸提取系统进行100IU/mL和15IU/mL
HCV标准品的提取。试剂准备时所用的反应液为HCV反应液，运行结束后八联管中
为纯化的HCV RNA溶液与HCV反应液的混合液，其具体实施过程同实施例2；
3、核酸测试：HCV扩增程序见上表11；
4、实验结果：HCV标准品全自动提取检测数据及统计分析见下表16与表17、附图
21与附图23。
对比实施例4
其实验材料与实施例1所采用的实验材料一致，其实验方法与实施例4的区别之处在于：其中裂解液中的表面活性剂为SDS 2％与乙基苯基聚乙二醇3％，其检测试剂及统计分析见下下表16和表17、附图22与附图24。
表16 HCV 100IU/mL标准品全自动提取检测数据及统计分析
表17 HCV 15IU/mL标准品全自动提取检测数据及统计分析
实验结果分析：在全自动提取过程中加入了一定量的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠，100IU/mL HCV标准品的Ct均值减少，Ct值的CV值降低，精密度提高；15IU/mL HCV标准品的检出率从0/8(0％)提升至8/8(100％)，说明灵敏度大幅度提升。因此，采用本发明所述的磁珠法提取方法，在全自动核酸提取仪上的应用具有很大的优势。

Claims (10)

1.一种用于核酸提取的试剂盒，包括裂解结合液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，其特征在于：所述裂解结合液包括0.5％～2％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠和3％-5％的磁珠，优选的，所述裂解结合液包括1％的脂肪酸甲酯乙氧基化物磺酸钠，优选的，所述裂解结合液包括4％的磁珠，更优选的，所述磁珠为100-1000nm的超顺磁性羧基氧化硅纳米微球。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的裂解结合液还包括如下成分：异硫氰酸胍或盐酸胍1～5M，乙酸钠或乙酸钾1～5M，乙基苯基聚乙二醇1％～3％，蛋白酶K10％～20％，所述裂解结合液的PH值为7.0～9.0，优选的，所述的裂解结合液还包括如下成分：异硫氰酸胍或盐酸胍4M，乙酸钠或乙酸钾2M，乙基苯基聚乙二醇1.5％，蛋白酶K15％，所述裂解结合液的PH值为8.0。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括硅油。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的洗涤缓冲液还包括如下成分：碘化钠或碘化钾1～10mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～50mM，乙醇75％，所述洗涤缓冲液的PH值为5.0～7.0，优选的，所述的洗涤缓冲液还包括如下成分：碘化钠或碘化钾5M，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐40mM，乙醇75％，所述洗涤缓冲液的PH值为6.0。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的洗脱缓冲液包括如下成分：乙二胺四乙酸1-5mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10-50mM，所述洗脱缓冲液的PH值为7.4-8.0，优选的，所述的洗脱缓冲液包括如下成分：乙二胺四乙酸1mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mM，所述洗脱缓冲液的PH值为8.0。
6.一种采用如权利要求1-5任意一项所述的试剂盒提取核酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
①在生物样品中加入如权利要求1或2所述的裂解结合液，在25-60℃下裂解2-10min，在外部磁场作用下，纳米磁珠聚集，形成磁珠-核酸复合物；
②向磁珠-核酸复合物中加入如权利要求4所述的洗涤缓冲液，再加入硅油，洗涤除去磁珠-核酸复合物上附带的杂质；
③在进行洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入如权利要求5所述的洗脱缓冲液，在60-90℃下洗脱1-5min，即得到提取的核酸，优选的，在进行洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入如权利要求5所述的洗脱缓冲液，在80℃下洗脱2min。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的生物样品包括细胞、菌液、全血、动物组织匀浆液、植物组织匀浆液、血清、血浆、组织提取液、拭子洗液、尿液、病毒培养液。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤①中的具体步骤为：在生物样品中加入如权利要求1或2所述的裂解结合液，在55℃下裂解4min，在外部磁场作用下，纳米磁珠聚集，形成磁珠-核酸复合物。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤①中所述生物样品与裂解结合液的体积比为1:1-1:5，优选的，步骤①中所述生物样品与裂解结合液的体积比为1:2.5。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤②中所述的硅油与裂解结合液的体积比为：1:5-2:5，优选的，步骤②中所述的硅油与裂解结合液的体积比3:10。
CN201810240821.0A 2018-03-22 2018-03-22 一种核酸提取试剂盒及其应用方法 Active CN108624586B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810240821.0A CN108624586B (zh) 2018-03-22 2018-03-22 一种核酸提取试剂盒及其应用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810240821.0A CN108624586B (zh) 2018-03-22 2018-03-22 一种核酸提取试剂盒及其应用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108624586A true CN108624586A (zh) 2018-10-09
CN108624586B CN108624586B (zh) 2022-08-16

Family

ID=63696211

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810240821.0A Active CN108624586B (zh) 2018-03-22 2018-03-22 一种核酸提取试剂盒及其应用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108624586B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109487008A (zh) * 2018-12-26 2019-03-19 重庆中元汇吉生物技术有限公司 呼吸道病原体的多重pcr检测试剂盒、用途及其使用方法
CN111607590A (zh) * 2020-06-08 2020-09-01 申翌生物科技(杭州)有限公司 适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取方法及试剂盒
CN112226432A (zh) * 2020-12-11 2021-01-15 北京健为医学检验实验室有限公司 一种磁珠法快速核酸提取试剂盒及其应用
CN112226490A (zh) * 2020-11-12 2021-01-15 苏州创澜生物科技有限公司 一种用于dna提取的裂解缓冲液
CN112458081A (zh) * 2020-12-02 2021-03-09 苏州海狸生物医学工程有限公司 一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒
CN112941067A (zh) * 2021-02-04 2021-06-11 天津诺道医学检验中心有限公司 一种全血核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用
CN113621605A (zh) * 2021-03-24 2021-11-09 深圳市莱孚生物科技有限公司 磁珠-核酸复合体洗涤液及应用
CN108624586B (zh) * 2018-03-22 2022-08-16 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种核酸提取试剂盒及其应用方法
WO2023098620A1 (zh) * 2021-12-02 2023-06-08 圣湘生物科技股份有限公司 免洗涤提取核酸的组合物、试剂盒、方法及用途

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006143855A (ja) * 2004-11-18 2006-06-08 Lion Corp 飲料シミ汚れ除去効果を向上させたアミラーゼ含有漂白性組成物
CA2680656A1 (en) * 2007-03-12 2008-09-18 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Endoglucanase ppce and cellulase preparation containing the same
CN102229925A (zh) * 2011-05-13 2011-11-02 薛昱 一种增强的磁珠法核酸提取方法
CN102839169A (zh) * 2012-09-03 2012-12-26 戴立忠 肠道病毒rna提取试剂盒及相应提取纯化肠道病毒rna的方法
CN103820431A (zh) * 2014-02-25 2014-05-28 苏州天隆生物科技有限公司 基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒
CN107015004A (zh) * 2017-03-21 2017-08-04 深圳市汇松科技发展有限公司 一种血清淀粉样蛋白a测定试剂盒及其制备方法
CN107603973A (zh) * 2017-11-01 2018-01-19 上海涛济医药科技有限公司 一种核酸提取保存液
CN108624656A (zh) * 2018-05-15 2018-10-09 重庆中元汇吉生物技术有限公司 一种核酸扩增方法
CN109456957A (zh) * 2018-12-19 2019-03-12 广州立白企业集团有限公司 蛋白酶变体、液体洗涤剂组合物及其应用
CN109487008A (zh) * 2018-12-26 2019-03-19 重庆中元汇吉生物技术有限公司 呼吸道病原体的多重pcr检测试剂盒、用途及其使用方法
CN111996190A (zh) * 2020-09-23 2020-11-27 常州市武进人民医院 一种全血基因组dna提取试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108624586B (zh) * 2018-03-22 2022-08-16 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种核酸提取试剂盒及其应用方法

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006143855A (ja) * 2004-11-18 2006-06-08 Lion Corp 飲料シミ汚れ除去効果を向上させたアミラーゼ含有漂白性組成物
CA2680656A1 (en) * 2007-03-12 2008-09-18 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Endoglucanase ppce and cellulase preparation containing the same
CN102229925A (zh) * 2011-05-13 2011-11-02 薛昱 一种增强的磁珠法核酸提取方法
CN102839169A (zh) * 2012-09-03 2012-12-26 戴立忠 肠道病毒rna提取试剂盒及相应提取纯化肠道病毒rna的方法
CN103820431A (zh) * 2014-02-25 2014-05-28 苏州天隆生物科技有限公司 基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒
CN107015004A (zh) * 2017-03-21 2017-08-04 深圳市汇松科技发展有限公司 一种血清淀粉样蛋白a测定试剂盒及其制备方法
CN107603973A (zh) * 2017-11-01 2018-01-19 上海涛济医药科技有限公司 一种核酸提取保存液
CN108624656A (zh) * 2018-05-15 2018-10-09 重庆中元汇吉生物技术有限公司 一种核酸扩增方法
CN109456957A (zh) * 2018-12-19 2019-03-12 广州立白企业集团有限公司 蛋白酶变体、液体洗涤剂组合物及其应用
CN109487008A (zh) * 2018-12-26 2019-03-19 重庆中元汇吉生物技术有限公司 呼吸道病原体的多重pcr检测试剂盒、用途及其使用方法
CN111996190A (zh) * 2020-09-23 2020-11-27 常州市武进人民医院 一种全血基因组dna提取试剂盒

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHAO X等: "Multifunctional sample preparation kit and on-chip quantitative nucleic acid sequence-based amplification tests for microbial detection", 《ANAL CHEM》 *
ZHU Z等: "Thiazide-like diuretics attenuate agonist-induced vasoconstriction by calcium desensitization linked to Rho kinase", 《HYPERTENSION》 *
张彪等: "表面活性剂在家用洗涤剂中的应用进展", 《应用化工》 *
徐星喜: "阴离子表面活性剂的应用于创新", 《中国洗涤用品工业》 *
李秋小等: "中国表面活性剂/洗涤剂领域技术进展", 《日用化学品科学》 *
许龙飞等: "磁性Fe_3O_4 SiO_2复合纳米颗粒的制备与表征", 《中国粉体技术》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108624586B (zh) * 2018-03-22 2022-08-16 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种核酸提取试剂盒及其应用方法
CN109487008A (zh) * 2018-12-26 2019-03-19 重庆中元汇吉生物技术有限公司 呼吸道病原体的多重pcr检测试剂盒、用途及其使用方法
CN109487008B (zh) * 2018-12-26 2022-03-29 中元汇吉生物技术股份有限公司 呼吸道病原体的多重pcr检测试剂盒、用途及其使用方法
CN111607590A (zh) * 2020-06-08 2020-09-01 申翌生物科技(杭州)有限公司 适用于全血、血清或血浆的磁珠法核酸提取方法及试剂盒
CN112226490A (zh) * 2020-11-12 2021-01-15 苏州创澜生物科技有限公司 一种用于dna提取的裂解缓冲液
CN112458081A (zh) * 2020-12-02 2021-03-09 苏州海狸生物医学工程有限公司 一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒
CN112226432A (zh) * 2020-12-11 2021-01-15 北京健为医学检验实验室有限公司 一种磁珠法快速核酸提取试剂盒及其应用
CN112226432B (zh) * 2020-12-11 2021-03-19 北京健为医学检验实验室有限公司 一种磁珠法快速核酸提取试剂盒及其应用
CN112941067A (zh) * 2021-02-04 2021-06-11 天津诺道医学检验中心有限公司 一种全血核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用
CN113621605A (zh) * 2021-03-24 2021-11-09 深圳市莱孚生物科技有限公司 磁珠-核酸复合体洗涤液及应用
WO2023098620A1 (zh) * 2021-12-02 2023-06-08 圣湘生物科技股份有限公司 免洗涤提取核酸的组合物、试剂盒、方法及用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN108624586B (zh) 2022-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108624586A (zh) 一种核酸提取试剂盒及其应用方法
CN103820431B (zh) 基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒
CN107043766A (zh) 一种即用型的核酸磁珠提取试剂
CN102776173B (zh) 使用聚多卡醇和衍生物的核酸分离
CN103725799B (zh) 一种检测风疹病毒rna的方法及试剂盒
JP3818416B2 (ja) 粒子担体を使用した核酸の抽出方法
CN106591297A (zh) 一种磁珠法核酸提取方法
CN103952397A (zh) 一种使用磁珠从血清或血浆样品中分离游离核酸的方法
US20180010168A1 (en) One-step procedure for the purification of nucleic acids
CN105695450A (zh) 基于磁珠法提取游离dna的试剂盒及其使用方法
WO2006123781A1 (ja) 微粒子を用いた微生物及び核酸の回収方法ならびにそれらに用いるキット
CN109402113A (zh) 基于聚苯乙烯磁珠的干血片基因组提取试剂盒及提取方法
CN111487404A (zh) 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒
CN101713002A (zh) 一步法病原体核酸荧光定量pcr检测方法
EP2171098B1 (en) Methods for extraction and purification of components of biological samples
CN112941067A (zh) 一种全血核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用
CN116004608B (zh) 一种核酸快速提取方法及组合物
CN108048454A (zh) 一种磁珠法骨骼基因组dna提取试剂盒
CN113322303A (zh) 一种石蜡切片样本核酸提取液及提取方法
JP2001139593A (ja) 粒子担体を使用する改良された核酸の抽出方法
JP2001078761A (ja) 核酸結合性磁性シリカ粒子担体
CN109652409A (zh) 一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法
CN102816866B (zh) 一种检测肠道病毒rna的方法及试剂盒
CN116875591A (zh) 提取血浆样本游离dna的试剂盒及提取方法
CN117210452A (zh) 全血dna的提取方法及提取试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Floor 1-4, building 30, no.6, Taikang Road, Zone C, Jianqiao Industrial Park, Dadukou District, Chongqing 400000

Applicant after: Zhongyuan Huiji Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: Floor 1-4, building 30, no.6, Taikang Road, Zone C, Jianqiao Industrial Park, Dadukou District, Chongqing 400000

Applicant before: CHONGQING ZHONGYUAN HUIJI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant