CN108624656A - 一种核酸扩增方法 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明提供一种高效、简便的荧光定量核酸扩增反应体系及方法，扩增反应体系包含：采用上述反应体系，能够有效克服全血对扩增反应的抑制、解决荧光信号干扰问题，整个反应无需任何提取、纯化步骤，操作简单，检测成本低。

Description

一种核酸扩增方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种核酸扩增法。
背景技术
核酸是生命的最基本物质之一，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，起着储存和传递遗传信息的作用。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。聚合酶链式反应简称PCR(Polymerase Chain Reaction)，PCR反应模拟DNA的天然复制过程，通过体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，使目的DNA得以迅速扩增，进而进行检测，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断。
随着精确诊疗的要求逐步提高，基因检测、个性化用药、产前诊断等技术手段的普及，高通量测序、荧光定量PCR、基因芯片等以核酸为检测对象的分子生物学技术的应用越来越广泛，各类PCR技术也发展迅速，对于样本中的核酸扩增通常包括核酸分离纯化和PCR两个阶段，而核酸提取，即从各种生物样品中提取和纯化核酸，作为核酸检测的关键环节之一，核酸提取效率和纯度对下游的核酸扩增和检测能否成功起至关重要的作用。
然而，核酸提取过程也存在诸多问题，第一、提取过程费时、费力，增加了提取时间和和提取试剂的耗费，提高了检测成本和检测时间；第二、提取过程中需要开盖操作，而且往往设计加热、震荡等操作，容易造成核酸的损耗，当样本量较少或目标核酸含量微量的时候，引入核酸提取步骤可能会造成扩增失败；第三、提取过程可能会带入污染，干扰后续PCR过程，并且不可控。因而市面上也出现了一些直接对全血样本进行扩增的方法，然而全血样本中的成分复杂，有大量抑制PCR反应的组分存在，而且其中的色素会干扰对荧光的检测，直接影响扩增结果的读取，这些技术难题困扰着全血直接作为起始检测模板的应用，特别是在荧光定量PCR上的应用。
发明内容
为了克服现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种高效、简便的荧光定量核酸扩增反应体系及方法，能够有效克服全血对扩增反应的抑制、解决荧光信号干扰问题。
本发明所提供的荧光定量核酸扩增方法，其反应体系包含：
优选的，本发明所提供的荧光定量核酸扩增方法，其反应体系包含：
进一步的，本发明所提供的荧光定量核酸扩增方法，其反应体系包含：
本发明所提供的荧光定量核酸扩增方法，其反应体系优选包含：
进一步的，本发明所提供的荧光定量核酸扩增方法，其反应体系优选包含：
更进一步的，本发明所提供的荧光定量核酸扩增方法，其反应体系中还包含上、下游引物及探针，所述引物用量为50nM—1000nM，优选为200nM—800nM，进一步优选为600nM；所述探针用量为25nM—300nM，优选为150nM—250nM，进一步优选为200nM。
进一步的，本发明所提供的荧光定量核酸扩增方法，其核酸扩增程序为：
进一步的，本发明所提供的荧光定量核酸扩增方法，其核酸扩增程序中还包含预循环程序。
本发明所提供的荧光定量核酸扩增方法，所述预循环程序为：95℃3min，55℃2min。
在一个优选的实施方案中，本发明所提供的荧光定量核酸扩增方法，所述预循环程序的循环数为1-10，优选为1-5，进一步优选为3。
更进一步的，本发明所提供的荧光定量核酸扩增方法，所述反应体系中还可以包含添加剂。
本发明所提供的荧光定量核酸扩增方法，所述添加剂选自甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱、TMAC、BSA中的一种或多种。
本申请发明人惊奇的发现，通过调整荧光定量核酸扩增反应体系中各组分的用量关系，能够有效减少非特异性扩增、反应抑制及荧光干扰，大大提高荧光定量核酸扩增反应的反应效率及定量准确性，其中部分实验数据如下。
本发明中用于实验的检测基因为MTHFR，上游引物序列为AGAAGGTGTCTGCGGGACC，下游引物序列为CACAAAGCGGAAGGAATGTGTCA，荧光探针为TTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGG，荧光基团为FAM。本发明中所述的方法适用范围包括但不限于该基因。
实验一
以全血为荧光定量PCR反应模板，反应体系为：
加超纯水补足体积至100μl
根据表1中的用量配制反应体系，PCR反应程序为：95℃3min；95℃20sec、60℃30sec、72℃20sec 45个循环，在60℃退火阶段采集荧光信号，各组的扩增结果见图1-6。
表1不同模板用量实验组
1 2 3 4 5 6
模板量 0.5％ 1％ 2％ 3％ 4％ 5％
根据图1-6中的结果可以看出：当模板量为0.5％-1％时，荧光增量较高，扩增效率较高，但扩增曲线抖动明显，复孔间重复性略差；当模板用量为2％-3％时，荧光增量较高，扩增效率高，且扩增曲线平滑，复孔间重复性好，其中，当用量为3％时，荧光增量高于2％；当模板用量为4％时，荧光增量稍低，扩增效率较好，且扩增曲线平滑，复孔间重复性好；当模板用量大于4％时，荧光增量低，扩增效率差，且扩增曲线抖动明显，复孔间重复性差，因此，模板用量为0.5％-4％，优选为2-3％，进一步优选为3％。
实验二
以全血为荧光定量PCR反应模板，反应体系为：
加超纯水补足体积至100μl
根据表2中的用量配制反应体系，PCR反应程序为：95℃3min；95℃20sec、60℃30sec、72℃20sec 45个循环，在60℃退火阶段采集荧光信号，各组的扩增结果见图7-12。
表2不同MgCl2用量实验组
7 8 9 10 11 12
Mgcl2用量 1mM 1.5mM 2.5mM 3.75mM 4.5mM 5.5mM
根据图7-12可以看出：当Mgcl2用量为1.0mM时，仅在40个循环之后有翘尾，形成S形扩增曲线，扩增几乎失败；当Mgcl2用量为1.5mM时，扩增曲线有抖动，不平滑，且复孔间重复性略差。当Mgcl2用量在2.5mM-5.5mM之间时，扩增曲线平滑，呈标准的S形曲线，复孔间的重复性较好，当Mgcl2用量为3.75mM时，扩增效果最好，经发明人反复试验发现，当镁离子浓度高于5.5mM，容易产生非特异性扩增。
实验三
以全血为荧光定量PCR反应模板，反应体系为：
加超纯水补足体积至100μl
根据表3中的用量配制反应体系，PCR反应程序为：95℃3min；95℃20sec、60℃30sec、72℃20sec 45个循环，在60度退火阶段采集荧光信号，各组的扩增结果见图13-18。
表3不同聚合酶用量实验组
13 14 15 16 17 18
聚合酶用量 1U/test 2U/test 3U/test 4U/test 5U/test 6U/test
根据图13-18可以看出：当Taq酶用量为1U/test时，扩增曲线较趴，且复孔间的重复性略差；当Taq酶用量为2-4U/test时，扩增效果较好，扩增曲线形态平滑，复孔间重复性较好，当Taq酶用量为3U/test时，扩增效果最好，荧光曲线形态平滑，复孔间重复性最好，当Taq酶用量为5U/test时，扩增曲线略有抖动，复孔间的重复性略差；而当Taq酶用量为大于5U/test时，扩增曲线抖动明显，复孔间的重复性差。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、采用本发明中的反应体系，能够大大减少荧光信号干扰，能够保证检测结果及定量准确性。
2、本发明可直接对全血进行检测，且无需任何预处理或者去干扰步骤，操作简便。
3、本发明方法扩增效率高，能够有效非特异性扩增及反应抑制，特异性高。
4、本发明反应体系成分简单，生产成本低。
附图说明
附图1-6为实验1中实验组1-6的扩增曲线图
附图7-12为实验2中实验组7-12的扩增曲线图
附图13-18为实验2中实验组13-18的扩增曲线图
附图19为对比实施例1中的扩增曲线图
附图20为对比实施例2中的扩增曲线图
附图21为实施例1中的扩增曲线图
附图22为实施例2中的扩增曲线图
附图23为实施例3中的扩增曲线图
附图24为实施例4中的扩增曲线图
附图25为实施例5中的扩增曲线图
附图26为实施例6中的扩增曲线图
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例及本发明的附图对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
对比实施例1：
以全血为荧光定量PCR反应模板，反应体系为：
加超纯水补足体积至100μl
反应程序为：
对比实施例2：
以全血为荧光定量PCR反应模板，反应体系为：
加超纯水补足体积至100μl
反应程序为：
实施例1：
以全血为荧光定量PCR反应模板，反应体系为：
加超纯水补足体积至100μl反应程序为：
按照上述条件，对全血样本进行实时荧光定量扩增，在60度退火阶段采集荧光信号，对比实施例1的结果见图19，对比实施例2的结果见图20，实施例1的结果见图21，通过图19、20、21的对比可以发现，当不添加KCl时，无S形扩增曲线，扩增几乎失败。添加预循环程序后，荧光信号强度更高，复孔间的重复性也更好。
实施例2
以全血为荧光定量PCR反应模板，反应体系为：
加超纯水补足体积至100μl
实施例3
以全血为荧光定量PCR反应模板，反应体系为：
加超纯水补足体积至100μl
实施例4
以全血为荧光定量PCR反应模板，反应体系为：
加超纯水补足体积至100μl
实施例5
加超纯水补足体积至100μl
实施例6
加超纯水补足体积至100μl
2 3 4 5 6
模板 0.5％ 1％ 3％ 3.5％ 4％
Tris-HCl 10mM 30mM 50mM 80mM 100mM
MgCl2 1.5 2.5 3.75 4.5 5.5
KCl 30 50 80 100 120
Taq酶 1 2 3 4 5
引物1 50 200 600 800 1000
引物2 50 200 600 800 1000
探针 25 150 200 250 300
dNTP 50 100 200 300 400
上述实施例2-6所采用的PCR程序均为：
上述实施例2-6的扩增及检测结果分别见图22-26，从图中可以看出，实施例2中的反应条件下，扩增曲线略有抖动，但可以有效扩增；实施例3反应条件下，扩增曲线略有抖动较小，荧光强度较高，扩增效果较好；实施例4反应条件下，扩增效率最高，反应曲线平滑，反应重复性高；实施例5反应条件下，扩增曲线平滑、复孔间重复性较好，荧光强度稍低，扩增效果较好；实施例6反应条件下扩增曲线平滑，荧光强度稍低，复孔间重复性较弱，但也能有效扩增。

Claims (10)

1.一种核酸扩增方法，其特征在于，反应体系包含以下成分：
模板 0.5％-4％(v/v)
Tris-HCl 10mM-100mM
MgCl2 1.5mM-5.5mM
KCl 30mM-120mM
dNTP 50μM-400μM
Taq酶 1-5U/test。
2.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述反应体系优选包含以下成分：
模板 1％-3.5％
Tris-HCl 30mM-80mM
MgCl2 2.5mM-4.5mM
KCl 50mM-100mM
dNTP 100μM-300μM
Taq酶 2-4U/test
所述反应体系进一步的优选包含以下成分：
模板 3％
Tris-HCl 10mM-100mM
MgCl2 3.75mM
KCl 30mM-120mM
dNTP 50μM-400μM
Taq酶 3U/test。
3.根据权利要求2所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述反应体系优选包含以下成分：
模板 3％
Tris-HCl 30mM-80mM
MgCl2 3.75mM
KCl 50mM-100mM
dNTP 100μM-300μM
Taq酶 3U/test
进一步优选包含以下成分：
模板 3％
Tris-HCl 50mM
MgCl2 3.75mM
KCl 80mM
dNTP 200μM
Taq酶 3U/test。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述反应体系中还包含上、下游引物及探针。
5.根据权利要求4中所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述引物用量为50nM—1000nM，优选为200nM—800nM，进一步优选为600nM；所述探针用量为25nM—300nM，优选为150nM—250nM，进一步优选为200nM。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述核酸扩增方法的扩增程序为：
7.根据权利要求6中所述的核酸扩增方法，其特征在于，其核酸扩增程序中还包含预循环程序。
8.根据权利要求7中所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述预循环程序为：95℃3min，55℃2min。
9.根据权利要求8中所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述预循环程序的循环数为1-10，优选为1-5，进一步优选为3。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述反应体系中还可以包含添加剂；所述添加剂选自甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱、TMAC、BSA中的一种或多种。
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