CN106868180A - 全血直接扩增核酸检测叶酸代谢相关基因多态性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用全血直接扩增核酸检测叶酸代谢相关基因多态性的方法，包括取全血样本为起始材料，分别加入扩增MTHFR C677T和MTHFR A1298C多态性区域片段的引物，以及扩增核酸反应试剂中的血液高耐受taq聚合酶(Blood Resistance Taq)buffer和血液高耐受taq聚合酶，构成PCR体系直接进行核酸扩增反应，PCR产物直接外送商业化公司测序，减少工作量。结果判定只需在测序图上分析突变位点，一目了然，准确率100％。操作简单，成本低廉，快捷准确高通量，满足二三线城市普通医院的检测，适合临床的检测和推广。

Description

全血直接扩增核酸检测叶酸代谢相关基因多态性的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测，尤其涉及一种全血直接扩增核酸检测叶酸代谢相关基因多态性的引物、引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

PCR是一种利用DNA聚合酶将极微量的标本百亿倍甚至千亿倍扩大的现代技术，其起始模板通常是基因组DNA。人类基因组DNA主要来源于血液，需要对其进行提取，除了商品化试剂盒外，还有很多其他的提取方法，如：酚/氯仿抽提法、碘化钾法、直接煮沸法、高盐沉淀法等。这些方法虽然有效，但是操作步骤繁琐，容易造成污染，而且基本上都需要用到恒温水浴锅、低温高速离心机等装置，对仪器设备和试剂的要求都比较多。如果不经过DNA提取而直接进行PCR，则可以大大节约实验时间和成本，同时也避免了因多步操作可能造成的样本间交叉污染。已有文献报道采用全血直接进行DNA扩增。如：McCusker J.等人对一定量的全血标本95℃预处理15分钟，以降低血液中的PCR抑制成份对扩增的影响；Mercier B在全血扩增前利用3个循环的预变性程序来去除血液中的PCR抑制成分等。这些方法虽然以全血为起始模板直接扩增DNA，但操作不够简便，条件难以控制，重复性不好，不能形成商品化试剂盒，不利于推广使用，且相关研究未见后续进一步报道。

科学研究发现，叶酸利用能力受遗传结构(基因)影响，如果与叶酸代谢相关的酶活性偏低(即相关基因功能异常)，这一人群如按常量(400微克/天)补充叶酸，机体叶酸水平也会不足。遗传体质的差异导致了机体对叶酸利用能力的差异，因此，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。

科学研究已经证实，与甲基类维生素(叶酸及维生素B12)代谢密切相关的基因是MTHFR。MTHFR编码蛋白5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶，其基因变异会引起相应的酶活性降低，阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，从而增加新生儿出生缺陷风险或自发性流产等风险。

MTHFR全称5，10-methylenetetrahydrofolatereductase(5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶)，位于一号染色体1p36.3位置。MTHFE全长19.3kb，mRNA全长7105bp，共有外显子12个，编码共有657个氨基酸编码子的蛋白。亚甲基四氢叶酸还原酶催化5，10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之能为同型半胱氨酸提供甲基甲硫氨酸。该酶是人体叶酸代谢中的一个十分重要的酶。

目前市面上检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)的两个SNP位点多态性的方法都是需要从人全血或口腔上皮组织中抽提人基因组DNA，然后在荧光定量PCR仪上，利用荧光探针或荧光染料法进行荧光定量PCR，根据荧光信号强弱或溶解曲线来判断突变类型。这些方法虽然可以做到当天出结果，但是不适合国内二三线城市的医院或妇幼保健院内检测。原因如下：

1、荧光定量PCR仪价格昂贵，国产仪器售价也超过几十万元，不是所有医院都能配备；

2、试剂盒在不同厂家或不同型号的荧光定量PCR仪上判读方法或结果不一致，需要做预实验或测序验证后才能大规模检测；

3、需要抽提基因组DNA，额外增加检测人员工作量及检测成本，并且容易造成样本污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于二三线城市的医院或妇幼保健院内检测的叶酸代谢相关基因多态性的方法。

一种利用全血直接扩增核酸检测叶酸代谢相关基因多态性的方法，包括取全血样本为起始材料，加入核酸扩增反应试剂，加入扩增目的基因引物，直接进行核酸扩增反应，测定扩增产物，扩增核酸反应试剂为BR Taq聚合酶，所述基因引物的引物和探针序列如下：

用于MTHFR C677T型多态性位点检测的引物：

MTHFR C677T-seq-F：5’-GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT-3’；

MTHFR C677T-seq-R：5’-TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT-3’；

2)用于MTHFR A1298C型多态性位点检测的引物：

MTHFR A1298C-seq-F：5’-GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG-3’；

MTHFR A1298C-seq-R：5’-CCCGAGAGGTAAAGAACAAAGACTT-3’。

作为本发明的进一步改进，所述BR Taq聚合酶位于缓冲液条件下，所述缓冲液的pH值为8.8，钾离子浓度为95mmol/L。

作为本发明的进一步改进，所述缓冲液为15mM Tris pH 8.8，95mM KCl，2.5mMMgCl2，0.02％Tween-20，2％DMSO。

作为本发明的进一步改进，全血样本为液体血液。

作为本发明的进一步改进，液体血液中包括有抗凝剂，所述抗凝剂包括EDTA抗凝、肝素抗凝、柠檬酸钠抗凝。

作为本发明的进一步改进，核酸扩增反应是聚合酶链式反应。

作为本发明的进一步改进，包括下述具体步骤：

1)获得含有抗凝剂的血液样本；

2)每个PCR体系为30μL，包含10×BR Taq Buffer 3μL，BR Taq 0.2μ L，血液样品3μL，正向反向引物各1μL，dNTP 2.4μL，ddH2O19.4μL；

3)将配置好的PCR体系放入PCR仪中，进行PCR反应；反应条件为：

98℃3分钟预变性；循环阶段，98℃30秒变性，58℃30秒退火，72℃30秒延伸，40个循环；

4)将PCR仪中反应完成的产物直接送测序或进行DNA凝胶电泳后将目的片段切下送测序。

无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂贵的荧光定量PCR仪，检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133号SNP位点的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物。

无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂贵的荧光定量PCR仪，检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801131号SNP位点的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物。

无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂贵的荧光定量PCR仪，同时检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133号和rs1801131号SNP位点、通过PCR产物测序来判断的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒(BR Taq及专用buffer)。

无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂贵的荧光定量PCR仪，同时检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133号和rs1801131号SNP位点、通过PCR产物测序来判断的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的检测方法。

血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其包括以下引物对：

(1)正向引物MTHFR-C677T-seq-F，其核苷酸序列SEQ ID N0.1：GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT；

反向引物MTHFR-C677T-seq-R，其核苷酸序列SEQ ID N0.2：TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT；

(2)由正向引物MTHFR-C677T-seq-F或反向引物MTHFR-C677T-seq-R的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；

上述引物对应的目的基因为5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801133号SNP位点。

本发明设定并合成特定的所述特异性引物，可检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133号SNP位点。

血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其包括以下引物对：

(1)正向引物MTHFR-A1298C-seq-F，其核苷酸序列SEQ ID N0.3：GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG；

反向引物MTHFR-A1298C-seq-R，其核苷酸序列SEQ ID N0.4：CCCGAGAGGTAAAGAACAAAGACTT：

(2)由正向引物MTHFR-A1298C-seq-F或反向引物MTHFR-A1298C-seq-R的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；

上述引物对应的目的基因为5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801131号SNP位点。

本发明设定并合成特定的所述特异性引物，可检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801131号SNP位点。

血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒，试剂盒包括叶酸代谢相关基因引物对、dNTP、BR Taq及其专用buffer和ddH₂O。

BR Taq为浙江中迪生物科技有限公司研发的血液耐受DNA聚合酶。

BR Taq专用buffer工作体系为：15mM Tris pH 8.8，95mM KCl，2.5mM MgCl2，0.02％ Tween-20，2％DMSO。

血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的检测方法，其所述方法包括利用本发明试剂盒进行PCR反应，将所得的PCR反应产物测序，在测序图上分析突变位点。

本发明检测试剂盒有如下优点：

1、血液成分复杂，里面含有很多抑制PCR反应的因子，血浆、血红蛋白和乳铁蛋白等会抑制Taq酶活性，扩增效率下降，还有一些成分会使引物发生降解，

从而造成全血直接PCR的失败。我们设计了特异性PCR引物，使用经过改造的Taq酶和减少血液中抑制因子影响的PCR缓冲液，配制了适合全血PCR的反应体系，使之耐受全血中PCR抑制剂。

2、PCR条件宽泛，无需预实验，适用于多数普通PCR仪。

3、PCR模板为全血，无论是EDTA抗凝，肝素抗凝还是柠檬酸钠抗凝，都适用。无需抽提基因组DNA，所以不需要额外购买基因组DNA抽提试剂盒，节约成本，同时减少污染机会，适合大规模样本的检测。

4、所需全血样本极少，最少只需2μl，且对在4度冰箱保存7天内的血液样本，检测结果稳定，有利于复查，或者可以利用病人其他检测的血液样本，无需病人专门采血，减轻病人痛苦。

5、PCR产物可以不经电泳纯化直接外送商业化公司测序，减少工作量。同时，在测序图上分析突变位点，一目了然，准确率100％。操作简单，成本低廉，快捷准确高通量，满足二三线城市普通医院的检测。

附图说明

图1是本发明PCR检测方法凝胶电泳结果图；

图2是本发明实施例一不同抗凝来源的血液PCR凝胶电泳结果图；

图3是本发明实施例二检测7份不同来源的人血液样本的检测结果图；

图4是本发明实施例三对同一个样本的血液进行重复5次的检测结果图。

具体实施方式

以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。

叶酸代谢有关基因多态性

PCR检测方法凝胶电泳结果图见图1，其中，

M：100bp DNA ladder，从上到下依次为1500bp，1200bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp。其中500bp是亮带；

1：MTHFR-C677T突变-血样1；

2：MTHFR-A1298C突变-血样1；

3：MTHFR-C677T突变-血样2；

4：MTHFR-A1298C突变-血样2。

电泳结果表明，PCR产物大小与预期一致，条带清晰，无明显杂带，说明PCR体系、反应条件以及引物特异性非常好。

PCR产物交由上海祥音生物科技有限公司测序。各种突变类型的测序结果如下：其中，PCR产物序列两端为引物结合部位，斜体部分为基因外显子，加粗下划线部位为SNP位点。

MTHFR C677T：

TGCTCAAGGCAGGACA ATTCTTCCGCTTTGTG

MTHFR A1298C：

TCTTCCCCTGCCTTTG GGGAGAACCAAACCGG

实施例一

不同抗凝来源的血液样本的PCR：用不同抗凝剂采集同一人的新鲜血液，分别收集在EDTA抗凝管，柠檬酸抗凝管和肝素抗凝管内。

按以下方法配制PCR反应液，

组分	体积μl
		10×BR Taq Buffer	3
dNTP	2.4
		正反向引物混合物20μM	2
ddH20	19.4
		血液样品	3
BR Taq	0.2

PCR反应条件如下：

98℃3min；

98℃30s，58℃30s，72℃30s，40cycle；

72℃10min，

4℃hold.

不同抗凝来源的血液PCR电泳图见图2，其中

M：100bp DNA ladder，从上到下依次为1500bp，1200bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，其中500bp是亮带；

1：肝素抗凝血样品一的MTHFR-C677T；

2：肝素抗凝血样品二的MTHFR-C677T；

3：柠檬酸抗凝血样品一的MTHFR-C677T；

4：柠檬酸抗凝血样品二的MTHFR-C677T；

5：EDTA抗凝血样品一的MTHFR-C677T；

6：EDTA抗凝血样品二的MTHFR-C677T。

电泳结果表明：不同抗凝方法来源的血液在该PCR反应体系中都能获得预期的结果，PCR条带清晰，无杂带。测序结果验证这三种抗凝方法来源的血液突变位点一致。

实施例二

检测7份不同来源的人血液样本，按以下方法配制PCR反应液，

组分	体积μl
		10×BR Taq Buffer	3
dNTP	2.4
		正反向引物混合物20μM	2
ddH20	19.4
		血液样品	3
BR Taq	0.2

PCR反应条件如下：

98℃ 3min；

98℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，40 cycle；

72℃ 10min，

4℃ hold.

检验7份不同来源的人血液样本的PCR电泳图见图3，其中

M：100bp DNA ladder，从上到下依次为1500bp，1200bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp。其中500bp是亮带。

1：柠檬酸抗凝血样品一的MTHFRC677T位点

2：柠檬酸抗凝血样品二的MTHFRC677T位点

3：柠檬酸抗凝血样品三的MTHFRC677T位点

4：柠檬酸抗凝血样品四的MTHFRC677T位点

5：柠檬酸抗凝血样品五的MTHFRC677T位点

6：柠檬酸抗凝血样品六的MTHFRC677T位点

7：柠檬酸抗凝血样品七的MTHFRC677T位点

8：柠檬酸抗凝血样品一的MTHFRAl298C位点

9：柠檬酸抗凝血样品二的MTHFRAl298C位点

10：柠檬酸抗凝血样品三的MTHFRAl298C位点

11：柠檬酸抗凝血样品四的MTHFRAl298C位点

12：柠檬酸抗凝血样品五的MTHFRAl298C位点

13：柠檬酸抗凝血样品六的MTHFRAl298C位点

14：柠檬酸抗凝血样品七的MTHFRAl298C位点

电泳结果表明：7份不同来源的人血液样本在该PCR反应体系中都能获得预期的结果，PCR条带清晰，无杂带。测序结果验证7份不同来源的血液突变位点与已知结果一致。

实施例三

对同一个样本的血液进行重复5次的检测，按以下方法配制PCR反应液，

组分	体积μl
		10×BR Taq Buffer	3
dNTP	2.4
		正反向引物混合物20μM	2
ddH20	19.4
		血液样品	3
BR Taq	0.2

PCR反应条件如下：

98℃ 3min；

98℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，40cycle；

72℃ 10min，

4℃ hold.

该样本的血液进行重复5次检验的PCR电泳图见图4，其中

M：100bp DNA ladder，从上到下依次为1500bp，1200bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp。其中500bp是亮带。

1-5：该样本的血液进行重复5次MTHFRC677T位点检验。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江中迪生物科技有限公司

<120> 全血直接扩增核酸检测叶酸代谢相关基因多态性的方法

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 416

<212> DNA

<213> R plasmid

<400> 1

tgctcaaggc aggacagtgt gggagtttgg agcaatccac ccccactctt ggaactgggc 60

tctgagccac ctcccctgag agtcatctct ggggtcagaa gcatatcagt catgagccca 120

gccactcact gttttagttc aggctgtgct gtgctgttgg aaggtgcaag atcagagccc 180

ccaaagcaga ggactctctc tgcccagtcc ctgtggtctc ttcatccctc gccttgaaca 240

ggtggaggcc agcctctcct gactgtcatc cctattggca ggttacccca aaggccaccc 300

cgaagcaggg agctttgagg ctgacctgaa gcacttgaag gagaaggtgt ctgcgggagc 360

tcgatttcat catcacgcag cttttctttg aggctgacac attcttccgc tttgtg 416

<210> 2

<211> 160

<212> DNA

<213> 人类

<400> 2

tcttcccctg cctttgggga gctgaaggac tactacctct tctacctgaa gagcaagtcc 60

cccaaggagg agctgctgaa gatgtggggg gaggagctga ccagtgaaga caagtgtctt 120

tgaagtcttc gttctttacc tctcgggaga accaaaccgg 160

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人类

<400> 3

gcacttgaag gagaaggtgt ct 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人类

<400> 4

tgtgtcagcc tcaaagaaaa gct 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人类

<400> 5

ggaggagctg ctgaagatgt g 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人类

<400> 6

cccgagaggt aaagaacaaa gactt 25

Claims (7)

1.一种全血直接扩增核酸检测叶酸代谢相关基因多态性的方法，其特征在于：包括取全血样本为起始材料，加入核酸扩增反应试剂，加入扩增目的基因引物，直接进行核酸扩增反应，测定扩增产物，扩增核酸反应试剂为BR Taq聚合酶，所述基因引物的引物和探针序列如下：

用于MTHFR C677T型多态性位点检测的引物：

MTHFR C677T-seq-F：5’-GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT-3’；

MTHFR C677T-seq-R：5’-TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT-3’；

2)用于MTHFR A1298C型多态性位点检测的引物：

MTHFR A1298C-seq-F：5’-GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG-3’；

MTHFR A1298C-seq-R：5’-CCCGAGAGGTAAAGAACAAAGACTT-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述BR Taq聚合酶位于缓冲液条件下，所述缓冲液的pH值为8.8，钾离子浓度为95mmol/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为15mM Tris pH 8.8，95mMKCl，2.5mM MgCl2，0.029％ Tween-20，2％DMSO。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于全血样本为液体血液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：液体血液中包括有抗凝剂，所述抗凝剂包括EDTA抗凝、肝素抗凝、柠檬酸钠抗凝。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于核酸扩增反应是聚合酶链式反应。

7.根据权利要求6所述的方法，包括下述具体步骤：

1)获得含有抗凝剂的血液样本；

2)每个PCR体系为30μL，包含10×BR Taq Buffer 3μL，BR Taq 0.2μL，血液样品3μL，正向反向引物各1μL，dNTP 2.4μL，ddH2019.4μL；

3)将配置好的PCR体系放入PCR仪中，进行PCR反应；反应条件为：

98℃3分钟预变性；循环阶段，98℃30秒变性，58℃30秒退火，72℃30秒延伸，40个循环；

4)将PCR仪中反应完成的产物直接送测序或进行DNA凝胶电泳后将目的片段切下送测序。