CN107058530A - 用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了本发明公开了一种用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒及其使用方法，以人类血液为模板，分别加入检测MTHFR C677T和MTHFR A1298C多态性的对应特性引物和荧光探针，以及扩增核酸反应试剂中的血液高耐受taq聚合酶(Blood Resistance Taq)buffer和血液高耐受taq聚合酶，构成实时荧光定量PCR体系。经过Real time PCR反应，本领域技术人员通过荧光定量PCR仪所收集的数据确定MTHFR的基因型。具有不用进行核酸提取、快速省时、灵敏易判断、成本低廉等优点，适合临床的检测和推广。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测领域，更具体的说是涉及一种用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒及其使用方法。
背景技术
近年来，随着生物、医学、法医学等各相关领域的发展，荧光PCR技术得到了越来越广泛的应用。血液作为一种重要的生物分析样本，其内含有大量的DNA聚合酶抑制物质，如血液中含有血红素、杂蛋白、脂肪等。因此，基于现有技术，无法实现荧光PCR方法直接对血液中的核酸进行扩增。通常，为了完成血液样本核酸的荧光PCR扩增，必须先从血液中对核酸物质进行纯化处理。一般包括以下三个过程：一是破裂细胞膜和核膜；二是纯化核酸即去除蛋白质等影响后续PCR反应的杂质；三是洗脱核酸。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过程往往会导致80-90％以上的核酸损失，同时繁琐的提纯步骤增加了样本间交叉污染的风险，从而增加了后续荧光PCR扩增失败的可能。此外，由于提取过程耗时长，成本高，且需借助苯酚等有害试剂，增加了操作者感染的风险，且难以实现高通量检测。因此，血液样本能够直接作为模板或经过简单处理就能够作为模板进行荧光PCR扩增检测，成为血液荧光PCR扩增亟待解决的难题。
科学研究发现，叶酸利用能力受遗传结构(基因)影响，如果与叶酸代谢相关的酶活性偏低(即相关基因功能异常)，这一人群如按常量(400微克和天)补充叶酸，机体叶酸水平也会不足。遗传体质的差异导致了机体对叶酸利用能力的差异，因此，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。
科学研究已经证实，与甲基类维生素(叶酸及维生素B12)代谢密切相关的基因是MTHFR。MTHFR编码蛋白5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶，其基因变异会引起相应的酶活性降低，阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，从而增加新生儿出生缺陷风险或自发性流产等风险。
MTHFR全称5，10-methylenetetrahydrofolatereductase(5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶)，位于一号染色体lp36.3位置。MTHFE全长19.3kb，mRNA全长7105bp，共有外显子12个，编码共有657个氨基酸编码子的蛋白。亚甲基四氢叶酸还原酶催化5，10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之能为同型半胱氨酸提供甲基甲硫氨酸。该酶是人体叶酸代谢中的一个十分重要的酶。
目前针对基因多态性的检测方法最常见方法为测序法，该方法适合高通量多位点的检测，但操作耗时长且灵敏度低，不适合快速临床检测；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，它的临床推广存在一定的困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种扩增效率高、成本低的一种用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒，旨在解决现有技术对血液进行荧光定量PCR扩增时，需要预先对血液进行核酸提取纯化处理，从而导致核酸大量损失、且增加了交叉污染以及有毒试剂使用的问题，并快速得到MTHFR的SNP分型指导叶酸用药。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒，所述试剂盒含有下列组分：血液高耐受taq聚合酶、血液高耐受taq聚合酶专用buffer、血液样本、引物对、探针对、dNTPs、双蒸水；
所述引物为MTHFRC677T引物和MTHFRA1298C引物，
所述MTHFRC677T引物包括：
正向引物：MTHFRC677T-F：5’-GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT-3’；
反向引物：MTHFRC677T-R：5’-TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT-3’；
所述MTHFRA1298C引物包括：
正向引物：MTHFRA1298C-F：5’-GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG-3’；
反向引物：MTHFRA1298C-R：5’-CCCGAGAGGTAAAGAACAAAGACTT-3’；
所述探针为MTHFRC677T探针和MTHFRA1298C探针
MTHFRC677T探针包括：
MTHFRC677T野生型探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGGCTCCCGC-MGB-3’；
MTHFRC677T突变型探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB-3’；
所述MTHFRA1298C探针包括：
MTHFRA1298C野生型探针：5’-荧光基团-CAAAGACACTTTCTTC-MGB-3’；
MTHFRA1298C突变型探针：5’-荧光基团-AGACACTTGCTTCACT-MGB-3’。
作为本发明的进一步改进，所述血液高耐受taq聚合酶为：浙江中迪生物科技有限公司自主研发的BR Taq。
作为本发明的进一步改进，所述血液高耐受taq聚合酶buffer工作体系为：15mMTris pH 8.8，95mM KCl，2.5mM MgCl2，0.02％Tween-20，2％DMSO。
试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)准备待测人的血液样品；
2)每个PCR体系为包含下列组分：BR Taq酶、BR Taq酶专用buffer、血液样本、引物对、探针对、dNTPs、双蒸水；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-time PCR检测；反应条件为：95℃3分钟预变性；循环阶段，95℃15秒，60℃1分钟并在此采集荧光信号，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
作为本发明的最优选方案，主要包括以下步骤：
1)准备待测人的血液样品；
2)每个PCR体系为30μL体积：BR Taq酶0.15μL，BR Taq酶专用buffer 3μL，血液样本3μL，正向反向引物各1μL，野生型和突变型荧光探针各1μL，dNTPs 2μL，双蒸水17.85μL；其中血液样品占PCR反应体系的5％-15％，正向反向引物浓度100-1000nM，野生型和突变型荧光探针浓度100-1000nM；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-time PCR检测；反应条件为：95℃3分钟预变性；循环阶段，95℃15秒，60℃1分钟并在此采集荧光信号，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
以人血液为模板，分别加入检测MTHFR A1298C和MTHFR C677T型多态性的对应特异引物和荧光探针，以及血液高耐受taq聚合酶buffer和血液高耐受taq聚合酶，构成实时荧光定量PCR体系，经过Real-timePCR反应，通过荧光定量PCR仪所收集的数据确定MTHFR的基因型。
本发明的有益效果，本发明所用的血液高耐受taq聚合酶及其专用buffer均进行了合理配制，添加了特异的协同组分，使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等DNA聚合酶抑制物变性，以降低其对后续荧光PCR的抑制作用；同时，促进DNA聚合酶活性，使得荧光PCR扩增能直接以血液为模版、在抗血液抑制作用的突变型DNA聚合酶的作用下进行高效和特异的荧光PCR扩增。所述试剂盒的使用，省去了对血液样本进行荧光PCR扩增时进行核酸提取纯化的步骤，直接通过定量PCR对SNP位点进行分型，能够省时省力，节约成本，避免了核酸的损失，显著提高了荧光PCR扩增的效率和成功率；同时，避免了核酸提取纯化中交叉污染的可能和有毒试剂的使用，符合环保理念。
另外，本发明与现有技术中的直接测序法相比，不需要复杂的设备，本身就是对人体基因组中的一个序列进行检测。通过MTHFRC677T的引物：
MTHFRC677T-F：5’-GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT-3’；
MTHFRC677T-R：5’-TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT-3’；
和MTHFRA1298C的引物：
MTHFRA1298C-F：5’-GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG-3’；
MTHFRA1298C-R：5’-CCCGAGAGGTAAAGAACAAAGACTT-3’；
MTHFRC677T的探针：
MTHFRC677T野生型探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGGCTCCCGC-MGB-3’；
MTHFRC677T突变型探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB-3’；
和MTHFRA1298C的探针：
MTHFRA1298C野生型探针：5’-荧光基团-CAAAGACACTTTCTTC-MGB-3’；
MTHFRA1298C突变型探针：5’-荧光基团-AGACACTTGCTTCACT-MGB-3’。
用荧光PCR法直接血液进行检测，具有较高的分辨度，不需要测序仪器，就可以实现对于叶酸用药敏感型相关基因的检测。同时，大大缩短了检测时间，在判断上也十分直观，从最终导出的数据图中就可以直接得出结论，在判断上更加容易。
本发明的主要优点有：
1、血液成分复杂，里面含有很多抑制PCR反应的因子，血浆、血红蛋白和乳铁蛋白等会抑制Taq酶活性，扩增效率下降，对此我们使用经过改造的Taq酶和减少血液中抑制因子影响的PCR缓冲液，配制了适合全血PCR的反应体系，使之耐受全血中PCR抑制剂。
2、PCR条件宽泛，无需预实验，适用于多数定量PCR仪。
3、PCR模板为全血，无论是EDTA抗凝，肝素抗凝还是柠檬酸钠抗凝，都适用。无需抽提基因组DNA，所以不需要额外购买基因组DNA抽提试剂盒，节约成本，同时减少污染机会，适合大规模样本的检测。
4、所需全血样本极少，最少只需2μl，且对在4度冰箱保存7天内的血液样本，检测结果稳定，有利于复查，或者可以利用病人其他检测的血液样本，无需病人专门采血，减轻病人痛苦。
5、本发明用血液直接荧光定量PCR法进行检测，不需要测序仪器，就可以实现对于叶酸用药敏感型相关基因的检测，操作简单，成本低廉，不仅具有较高的分辨度，还大大缩短了检测时间，在判断上也十分直观，从最终导出的数据图中就可以直接得出结论，在判断上更加容易，更适合临床的检测和推广。
附图说明
图1为MTHFRA1298C位点野生型(G和G)样品荧光定量PCR曲线图；
图2为MTHFRA1298C位点杂合突变型(G和A)样品荧光定量PCR曲线图；
图3为MTHFRA1298C位点纯合突变型(A和A)样品荧光定量PCR曲线图；
图4为MTHFRC677T位点野生型(G和G)样品荧光定量PCR曲线图；
图5为MTHFRC677T位点杂合突变型(G和A)样品荧光定量PCR曲线图；
图6为MTHFRC677T位点纯合突变型(A和A)样品荧光定量PCR曲线图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种用于血液直接荧光PCR扩增检测人体MTHFR基因多态性的试剂盒，包括下列组分：血液高耐受taq聚合酶、血液高耐受taq聚合酶专用buffer、血液样本、引物对、探针对、dNTPs、双蒸水；
所述引物为MTHFRC677T引物和MTHFRA1298C引物，
所述MTHFRC677T引物包括：
正向引物：MTHFRC677T-F：5’-GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT-3’；
反向引物：MTHFRC677T-R：5’-TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT-3’；
所述MTHFRA1298C引物包括：
正向引物：MTHFRA1298C-F：5’-GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG-3’；
反向引物：MTHFRA1298C-R：5’-CCCGAGAGGTAAAGAACAAAGACTT-3’；
所述探针为MTHFRC677T探针和MTHFRA1298C探针
MTHFRC677T探针包括：
MTHFRC677T野生型探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGGCTCCCGC-MGB-3’；
MTHFRC677T突变型探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB-3’；
所述MTHFRA1298C探针包括：
MTHFRA1298C野生型探针：5’-荧光基团-CAAAGACACTTTCTTC-MGB-3’；
MTHFRA1298C突变型探针：5’-荧光基团-AGACACTTGCTTCACT-MGB-3’。
作为本发明的进一步改进，所述血液高耐受taq聚合酶为：浙江中迪生物科技有限公司自主研发的BR Taq。
作为本发明的进一步改进，所述血液高耐受taq聚合酶buffer工作体系为：15mMTris pH 8.8，95mM KCl，2.5mM MgCl2，0.02％Tween-20，2％DMSO。
试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
作为本发明的最优选方案，主要包括以下步骤：
1)准备待测人的血液样品；
2)每个PCR体系为30μL体积：BR Taq酶0.15μL，BR Taq酶专用buffer 3μL，血液样本3μL，正向反向引物各1μL，野生型和突变型荧光探针各1μL，dNTPs 2μL，双蒸水17.85μL；
其中血液样品占PCR反应体系的5％-15％，正向反向引物浓度100-1000nM，野生型和突变型荧光探针浓度100-1000nM；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-time PCR检测；反应条件为：95℃3分钟预变性；循环阶段，95℃15秒，60℃1分钟并在此采集荧光信号，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
以最优方案进行检测，选取样本为MTHFR A1298C位点野生型(A和A)样品、MTHFRA1298C位点杂合突变型(A和C)样品、MTHFR A1298C位点纯合突变型(C和C)样品、MTHFRC677T位点野生型(C和C)样品、MTHFR C677T位点杂合突变型(C和T)样品、MTHFR C677T位点纯合突变型(T和T)样品进行检测。检测结果如图1至图6所示
通过图1至图6的数据显示，本发明的试剂盒在检测叶酸用药敏感型相关基因MTHFR时，具有快速、灵敏、容易判断等优点，适合临床的检测和推广。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江中迪生物科技有限公司
<120> 用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒及其使用方法
<130> 2017
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 416
<212> DNA
<213> R plasmid
<400> 1
tgctcaaggc aggacagtgt gggagtttgg agcaatccac ccccactctt ggaactgggc 60
tctgagccac ctcccctgag agtcatctct ggggtcagaa gcatatcagt catgagccca 120
gccactcact gttttagttc aggctgtgct gtgctgttgg aaggtgcaag atcagagccc 180
ccaaagcaga ggactctctc tgcccagtcc ctgtggtctc ttcatccctc gccttgaaca 240
ggtggaggcc agcctctcct gactgtcatc cctattggca ggttacccca aaggccaccc 300
cgaagcaggg agctttgagg ctgacctgaa gcacttgaag gagaaggtgt ctgcgggagc 360
tcgatttcat catcacgcag cttttctttg aggctgacac attcttccgc tttgtg 416
<210> 2
<211> 160
<212> DNA
<213> 人类
<400> 2
tcttcccctg cctttgggga gctgaaggac tactacctct tctacctgaa gagcaagtcc 60
cccaaggagg agctgctgaa gatgtggggg gaggagctga ccagtgaaga caagtgtctt 120
tgaagtcttc gttctttacc tctcgggaga accaaaccgg 160
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类
<400> 3
gcacttgaag gagaaggtgt ct 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类
<400> 4
tgtgtcagcc tcaaagaaaa gct 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类
<400> 5
ggaggagctg ctgaagatgt g 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类
<400> 6
cccgagaggt aaagaacaaa gactt 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类
<400> 7
atgaaatcgg ctcccgcmgb 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类
<400> 8
atgaaatcga ctcccgcmgb 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人类
<400> 9
caaagacact ttcttcmgb 19
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人类
<400> 10
agacacttgc ttcact 16
Claims (6)
1.一种用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中含有下列组分：MTHFR A1298C和MTHFR C677T型多态性的对应特性引物和荧光探针，以及扩增核酸反应试剂中的血液高耐受taq聚合酶buffer和血液高耐受taq聚合酶，构成实时荧光定量PCR体系，
所述MTHFRC677T引物包括：
正向引物：MTHFRC677T-F：5’-GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT-3’；
反向引物：MTHFRC677T-R：5’-TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT-3’；
所述MTHFRA1298C引物包括：
正向引物：MTHFRA1298C-F：5’-GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG-3’；
反向引物：MTHFRA1298C-R：5’-CCCGAGAGGTAAAGAACAAAGACTT-3’；
所述MTHFRC677T探针包括：
MTHFRC677T野生型探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGGCTCCCGC-MGB-3’；
MTHFRC677T突变型探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB-3’；
所述MTHFRA1298C探针包括：
MTHFRA1298C野生型探针：5’-荧光基团-CAAAGACACTTTCTTC-MGB-3’；
MTHFRA1298C突变型探针：5’-荧光基团-AGACACTTGCTTCACT-MGB-3’。
2.根据权利要求1所述的用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒，其特征在于，扩增核酸反应试剂中的血液高耐受taq聚合酶buffer工作体系为：15mM Tris pH 8.8，95mM KCl，2.5mM MgCl2，0.02％Tween-20，2％DMSO。
3.根据权利要求2所述的用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒，其特征在于，扩增核酸反应试剂中的血液高耐受taq聚合酶为：浙江中迪生物科技有限公司自主研发的BR Taq。
4.根据权利要求1所述的用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括下述组分：dNTPs、双蒸水，所述dNTPs的组成比例为：dATP∶dCTP∶dGTP∶dTTP＝1∶1∶1∶1∶1，所述dNTPs的浓度为所述每种dNTP为2.5mM。
5.如权利要求1至4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)准备待测人的血液样品；
2)每个PCR体系为包含下列组分：BR Taq酶、BR Taq酶专用buffer、血液样本、引物对、探针对、dNTPs、双蒸水；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-time PCR检测；反应条件为：95℃3分钟预变性；循环阶段，95℃15秒，60℃1分钟并在此采集荧光信号，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
6.如权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)准备待测人的血液样品；
2)每个PCR体系为30μL体积：BR Taq酶0.15μL，BR Taq酶专用buffer 3μL，血液样本3μL，正向反向引物各1μL，野生型和突变型荧光探针各1μL，dNTPs2μL，双蒸水17.85μL；样品占PCR反应体系的5％-15％，正向反向引物浓度100-1000nM，野生型和突变型荧光探针浓度100-1000nM；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-time PCR检测；反应条件为：95℃3分钟预变性；循环阶段，95℃15秒，60℃1分钟并在此采集荧光信号，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
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