CN104531876A - 用于检测人apoc3基因突变的引物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测人APOC3基因突变的引物，其序列为：正向引物：APOC3-PF5’-GACCCAGCTAAGGTTCTAC-3’，如SEQ ID No.3所示；反向引物：APOC3-PR5’-AGGCTGAAGAGGCACAG-3’，如SEQ ID No.4所示。此外，本发明还公开了一种用于检测人APOC3基因突变的PCR扩增试剂盒，其包含2×Taq Master Mix，所述引物对和去离子水ddH2O。本发明无需抽提基因组DNA，而从血液直接通过PCR方法扩增APOC3基因，经测序后鉴别APOC3突变位点，可以直接以全血作为PCR模板，减少检测费用，同时避免操作污染。

Description

用于检测人APOC3基因突变的引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测人APOC3基因突变的引物及试剂盒。
背景技术
高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia，HTG)是高血脂症的一种，会引起动脉粥样硬化，造成血管堵塞和形成血栓，严重的还能引发冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronaryatherosclerotic heart disease,CHD)。然而在轻度和中度时期，甘油三酯高症状并不明显，可能患者丝毫没有感觉，当甘油三酯高症状逐渐出现时，却已发展到了血管堵塞变窄，影响机体血流供应和机体内部供血不足的情况了，此时病情已到了较严重的程度。人一旦被检测为高甘油三酯血症患者，他必须改变其生活方式，拒绝高油高糖高脂等三高食物，增加锻炼和戒烟。所以，定期血液生化检查显得非常重要，但是如果能从基因的角度来早期筛查人们患高甘油三酯血症的风险，从源头就开始杜绝患病隐患，改变不良的生活习惯，对人们日常生活方式的选择，疾病的个性化治疗尤其有现实意义。
许多研究表明，载脂蛋白CⅢ(ApoCⅢ)的表达水平与高甘油三酯血症呈正相关。载脂蛋白CⅢ由APOC3(apolipoprotein CⅢ)基因编码，是一个拥有99个氨基酸的糖蛋白，在人体内主要在肝脏合成，少量在小肠合成。载脂蛋白CⅢ在富含甘油三酯的脂蛋白(triglyceride-richlipoprotein,TRL)代谢中起关键作用，具有抑制脂蛋白脂酶和肝脂酶活性的功能，干扰载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)介导的富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)与肝脂酶的结合，影响脂质代谢的平衡，从而容易导致高甘油三酯血症。在正常人空腹血浆中载脂蛋白CⅢ主要与高密度脂蛋白HDL(约70％)结合，而高甘油三酯血症患者血浆载脂蛋白CⅢ水平显著升高，其主要(约86％)与极低密度脂蛋白VLDL结合。
研究发现，人群中至少存在4种APOC3基因突变类型，分别为无义突变(R19X，C>T)，剪切位点突变(IVS2+1G>A)，错义突变(A43T，G>A)，剪切位点突变(IVS3+1G>T)，这些突变与高甘油三酯血症和冠状动脉粥样硬化性心脏病相关，只要携带任意一个APOC3变异体的人群不但在他们的血液中具有较低水平的载脂蛋白CⅢ和甘油三酯含量，同时他们罹患冠心病的风险也大大降低了，属于不易发生心脏疾病的人群。
目前还没有检测APOC3基因突变的试剂盒。全血中存在一些抑制PCR反应的物质，一般需要抽提人基因组DNA后才能进行PCR反应，这样需要额外购买DNA抽提试剂盒，增加检测费用，同时增加检测步骤，容易造成样本污染。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种用于检测人APOC3基因突变的引物。
本发明要解决的技术问题之二是提供了一种无需抽提基因组DNA，而从血液直接通过PCR方法扩增APOC3基因，经测序后鉴别APOC3突变位点的试剂盒。本发明采用特殊的Taq酶和缓冲液配方，能够避免血液中的抑制因子对PCR造成的影响，可以直接以全血作为PCR模板，减少检测费用，同时避免操作污染。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供一种用于检测人APOC3基因突变的引物，其序列为：
正向引物：APOC3-PF 5’-GACCCAGCTAAGGTTCTAC-3’，如SEQ ID No.3所示；
反向引物：APOC3-PR 5’-AGGCTGAAGAGGCACAG-3’，如SEQ ID No.4所示。
本发明中，人APOC3蛋白序列，如SEQ ID No.1所示。APOC3基因组序列(如SEQ ID No.2所示)：划横线为引物结合区域，斜体大写字母为外显子区域，黑色粗体小写字母为内含子区域，粗体加划横线为基因非编码区，“/”为突变位置，()内为PCR产物区。
tctccactggtcagcaggtgacctttgcccagcgccctgggtcctcagtgcctgctgccctggagatgatataaaacaggtcagaaccctcctgcctgtcTGgtaatgccctctggggaggggaaagaggaggggaggaggatgaagaggggcaagaggagctccctgcccagcccagccagcaagcctggagaagcacttgctagagctaaggaagcctcggagctggacgggtgccccccacccctcatcataacctgaagaacatggaggcccgggaggggtgtcacttgcccaaagctacacagggggtggggctggaagtggctccaagtgcaggttcccccctcattcttcaggcttagggctggaggaagccttagacagcccagtcctaccccagacagggaaactgaggcctggagagggccagaaatcacccaaagacacacagcatgttggctggactggacggagatcagtccagaccgcaggtgccttgatgttcagtctggtgggttttctgctccatcccacccacctccctttgggcctcgatccctcgcccctcaccagtcccccttctgagagcccgtattagcagggagccggcccctactccttctggca(cttaggggccacgccacctccccagggaggggtccagaggcatggggacctggggtgcccctcacaggacacttccttgcag taagcacttggtgggactgggctgggggcagggtggaggcaacttggggatcccagtcccaatgggtggtcaagcaggagcccagggctcgtccagaggccgatccaccccactcagccctgct tacacccgctggcctccctccccatcccccctgccagctgcctccattcccacccgcccctgccctggtgagatcccaacaatggaatggaggtgctccagcctcccctgggccctctttcctcacagggcctttgtcaggctgctgcgggagagatgacagagttgagactgcattcctcccaggtccctcctttctccccggagcagtcctagggcgtgccgttttagccctcatttccattttcctttcctttccctttctttctctttctatttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttcctttctttctttcctttctttctttcctttctttctttctttcctttctttctctttctttctttctttcctttttctttctttccctctcttcctttctctctttctttcttcttcttttttttttaatggagtctccctctgtcacctaggctggagtgcagtggtgccatctcggctcactgcaacctccgtctcccgggttcaacccattctcctgcctcagcctcccaagtagctgggattacaggcacgcgccaccacacccagctaatttttgtatttttagcagagatggggtttcaccatgttggccaggttggtcttgaattcctgacctcaggggatcctcctgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcatgagccactgcgcctggccccattttccttttctgaaggtctggctagagcagtggtcctcagcctttttggcaccagggaccagttttgtggtggacaatttttccatgggccagcggggatggttttgggatgaagctgttccacctcagatcatcaggcattagattctcataaggagccctccacctagatccctggcatgtgcagttcacaatagggttcacactcctatgagaatgtaaggccacttgatctgacaggaggcggagctcaggcggtattgctcactcacccaccactcacttcgtgctgtgcagcccggctcctaacagtccatggaccagtacctatctatgacttgggggttggggacccctgggctaggggtttgccttgggaggccccacctgacccaattcaagcccgtgagtgcttctgctttgttctaagacctggggccagtgtgagcagaagtgtgtccttcctctcccatcctgcccctgcccatcagtactctcctctcccctactcccttctccacctcaccctgactggcattagctggcatagcagaggtgttcataaacattcttagtccccagaaccggctttggggtaggtgttattttctcactttgcagatgagaaaattgaggctcagagcgattaggtgacctgccccagatcacacaactaatcaatcctccaatgactttccaaatgagaggctgcctccctctgtcctaccctgctcagagccaccaggttgtgcaactccaggcggtgctgtttgcacagaaaacaatgacagccttgacctttcacatctccccaccctgtcactttgtgcctcaggcccaggggcataaacatctgaggtgacctggagatggcagggtttgacttgtgctggggttcctgcaaggatatctcttctcccagggtggcagctgtgggggattcctgcctgaggtctcagggctgtcgtccagtgaagttgagagggtggtgtggtcctgactggtgtcgtccagtggggacatgggtgtgggtcccatggttgcctacagaggagttctcatgccctgctctgttgcttcccctgactgatttag Gagtgggccgtcgcaagtgtgccatctgtgtctgggcatgggaaagggccgaggctgttctgtgggtgggcactggacagactccaggtcaggcaggcatg
在本发明的另一方面，提供一种用于检测人APOC3基因突变的PCR扩增试剂盒，其包含2×Taq Master Mix，上述引物对和去离子水ddH2O。
作为本发明优选的技术方案，所述2×Taq Master Mix的配方是：0.05U/μl HaemoTaq酶、0.5mM dNTP，60mM Tricine，5mM(NH4)2SO4，3.5mM MgCl2，5-10％甘油，200ng/μl BSA。
作为本发明优选的技术方案，所述HaemoTaq酶是截短后的Taq DNA聚合酶，它缺失了5'-3'外切酶活性。
作为本发明优选的技术方案，该试剂盒进行PCR扩增的PCR模板为全血，PCR反应程序为：95℃5min预变性；然后95℃15sec变性，55℃30sec退火，72℃20sec延伸，72℃5min延伸循环30次。
作为本发明优选的技术方案，该试剂盒进行PCR扩增时，一次PCR反应能同时检测4个突变位点，分别为无义突变(R19X，C>T)，剪切位点突变(IVS2+1G>A)，错义突变(A43T，G>A)，剪切位点突变(IVS3+1G>T)。
在本发明的另一方面，提供上述引物在制备检测人APOC3基因突变的试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明特别设计的基因特异性引物，以及经过改造的Taq酶和PCR缓冲液配方可以有效消除血液中的抑制因子。该试剂盒20μlPCR反应体系最多可以加入6μl血液，可以满足绝大多数人的血液样本，特别对高脂人群也同样有效。
2、PCR条件宽泛，无需预实验，适用于多数普通PCR仪。
3、PCR模板为全血，无论是EDTA抗凝，肝素抗凝还是柠檬酸钠抗凝，都适用。无需抽提基因组DNA，所以不需要额外购买基因组DNA抽提试剂盒，节约成本，同时减少污染机会，适合大规模样本的检测。
4、一次PCR反应，一次测序可以同时检测4个突变位点，并且可以判断位点是纯合突变还是杂合突变，比荧光定量PCR ARMS检测基因突变更简单便捷，费用更低。
5、PCR产物直接外送商业化公司测序，无需电泳纯化，减少工作量。同时，在测序图上分析突变位点，一目了然，准确率100％。操作简单，成本低廉，快捷准确高通量，满足二三线城市普通医院的检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中的电泳图。
图2是本发明实施例1中的测序结果示意图，其中，图2A是突变位点为无义突变(R19X，C>T)的C/C野生型测序结果示意图；图2B是突变位点为无义突变(R19X，C>T)的C/T杂合突变型测序结果示意图；图2C是突变位点为无义突变(R19X，C>T)的T/T纯合突变型测序结果示意图；图2D是突变位点为剪切位点突变(IVS2+1G>A)的G/G野生型测序结果示意图；图2E是突变位点为剪切位点突变(IVS2+1G>A)的G/A杂合突变型测序结果示意图；图2F是突变位点为剪切位点突变(IVS2+1G>A)的A/A纯合突变型测序结果示意图；图2G是突变位点为错义突变(A43T，G>A)的G/G野生型测序结果示意图；图2H是突变位点为错义突变(A43T，G>A)的G/A杂合突变型测序结果示意图；图2I是突变位点为错义突变(A43T，G>A)的A/A纯合突变型测序结果示意图；图2J是突变位点为剪切位点突变(IVS3+1G>T)的G/G野生型测序结果示意图；图2K是突变位点为剪切位点突变(IVS3+1G>T)的G/T杂合突变型测序结果示意图；图2L是突变位点为剪切位点突变(IVS3+1G>T)的T/T纯合突变型测序结果示意图。
图3是本发明实施例2中的电泳图。其中，图3-1是EDTA抗凝血的PCR结果示意图；图3-2是肝素钠抗凝血的PCR结果示意图；图3-3是柠檬酸钠抗凝血的PCR结果示意图。
图4是本发明实施例3中的电泳图。
图5是本发明实施例4中的电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：全血直接PCR,以血液抽提基因组DNA为模板的PCR，以pUC19-APOC3质粒为模板的PCR的结果比较
1、设计引物
APOC3基因特异性引物序列如下：
正向引物：APOC3-PF 5’-GACCCAGCTAAGGTTCTAC-3’，如SEQ ID No.3所示，反向引物：APOC3-PR 5’-AGGCTGAAGAGGCACAG-3’，如SEQ ID No.4所示。对应的PCR产物大小为559bp。引物委托苏州金唯智公司合成。
2、抽提血液基因组DNA
按照凯杰血液DNA提取试剂盒(货号158422)说明书，200ul新鲜采集的血液可以获得1-5ug人全基因组DNA，稀释到100ng/ul待用，-20度长期保存。
3、以抽提好的含有野生型APOC3基因和突变型APOC3基因的质粒为模板作为全血PCR的对照：全基因合成野生型APOC3基因，序列为1，以及含有APOC34个突变位点基因，序列为2。将合成好的基因分别连到pUC19载体中，测序验证正确后，野生型标记为pUC19-APOC3，突变型标记为pUC19-APOC3-M。
提取质粒pUC19-APOC3和pUC19-APOC3-M，稀释到浓度100ng/ul待用，-20度长期保存。
4、PCR反应液的配制
按以下方法配制PCR反应液,见表1：
表1
成分 全血 血液基因DNA 质粒
模板 2μl 1μl 0.5μl
2×Taq Master Mix 10μl 10μl 10μl
引物APOC3-PF/APOC3-PR 1-5pMol 1-5pMol 1-5pMol
ddH2O 至20ul 至20ul 至20ul
其中，2×Taq Master Mix的配方是：0.05U/μl HaemoTaq酶、0.5mM dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)，60mM Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸)，5mM(NH4)2SO4，3.5mM MgCl2，5-10％甘油，pH 8.725℃，200ng/μl BSA(牛血清白蛋白)。(HaemoTaq酶，该酶是截短后的Taq DNA聚合酶，它缺失了5'-3'外切酶活性，购自上海近岸科技有限公司)。实验表明，5-10％甘油和200ng/μl BSA可以对Taq酶起保护作用，抑制血液中的脂肪，血红蛋白等对酶和引物的降解，具体对比试验见实施例4。
5、PCR反应：
使用杭州晶格KF960PCR仪进行反应，具体的PCR反应程序设置如表2所示：
表2
6、实验结果
如图1电泳图所示，血液PCR的结果与血液抽提基因组DNA后再PCR的结果一致。图1中，M：DNA分子MARKER,从上到下分别为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。其中750bp是亮带泳道。泳道1：全血；泳道2：质粒pUC19-APOC3；泳道3：质粒pUC19-APOC3-M；泳道4：质粒pUC19-APOC3与pUC19-APOC3-M 1:1混合模板；泳道5：以ddH2O为模板的空白对照；泳道:6：以血液抽提基因组DNA为模板的阳性对照。结果表明，直接血液PCR与抽提血液基因组DNA后再PCR，以及与含有APOC3基因的质粒模板的阳性对照的PCR产物大小一致，条带单一无杂带。
其中，泳道3：质粒pUC19-APOC3-M中插入的野生型APOC3基因序列(如SEQ ID No.5所示)：粗体为突变位点。
gagggccagaaatcacccaaagacacacagcatgttggctggactggacggagatcagtccagaccgcaggtgccttgatgttcagtctggtgggttttctgctccatcccacccacctccctttgggcctcgatccctcgcccctcaccagtcccccttctgagagcccgtattagcagggagccggcccctactccttctggcacttaggggccacgccacctccccagggaggggtccagaggcatggggacctggggtgcccctcacaggacacttccttgcagCAACAGAGGTGCCATGCAGCCCCGGGTACTCCTTGTTGTTGCCCTCCTGGCGCTCCTGGCCTCTGCCtaagcacttggtgggactgggctgggggcagggtggaggcaacttggggatcccagtcccaatgggtggtcaagcaggagcccagggctcgtccagaggccgatccaccccactcagccctgctctttcctcagGAGCTTCAGAGGCCGAGGATGCCTCCCTTCTCAGCTTCATGCAGGGTTACATGAAGCACGCCACCAAGACCCCAAGGATGCACTGAGCAGCGTGCAGGAGTCCCAGGTGGCCCAGCAGGCCAGtacacccgctggcctccctccccatcccccctgccagctgcctccattcccacccgcccctgccctggtgagatcccaacaatggaatggaggtgctccagcctcccctgggccctctttcctcacagggcctttgtcaggctgctgcgggagagatgacagagttgagactgcattcctcccaggtccctcctttctccccggagcagtcctagggcgtgccgttttagccctcatttcc
泳道3：质粒pUC19-APOC3-M中插入的突变型APOC3基因序列(如SEQ ID No.5所示)：粗体为突变位点。
gagggccagaaatcacccaaagacacacagcatgttggctggactggacggagatcagtccagaccgcaggtgccttgatgttcagtctggtgggttttctgctccatcccacccacctccctttgggcctcgatccctcgcccctcaccagtcccccttctgagagcccgtattagcagggagccggcccctactccttctggcacttaggggccacgccacctccccagggaggggtccagaggcatggggacctggggtgcccctcacaggacacttccttgcagCAACAGAGGTGCCATGCAGCCCCGGGTACTCCTTGTTGTTGCCCTCCTGGCGCTCCTGGCCTCTGCCtaagcacttggtgggactgggctgggggcagggtggaggcaacttggggatcccagtcccaatgggtggtcaagcaggagcccagggctcgtccagaggccgatccaccccactcagccctgctctttcctcagGAGCTTCAGAGGCCGAGGATGCCTCCCTTCTCAGCTTCATGCAGGGTTACATGAAGCACGCCACCAAGACCCCAAGGATGCACTGAGCAGCGTGCAGGAGTCCCAGGTGGCCCAGCAGGCCAGtacacccgctggcctccctccccatcccccctgccagctgcctccattcccacccgcccctgccctggtgagatcccaacaatggaatggaggtgctccagcctcccctgggccctctttcctcacagggcctttgtcaggctgctgcgggagagatgacagagttgagactgcattcctcccaggtccctcctttctccccggagcagtcctagggcgtgccgttttagccctcatttcc
上述PCR产物交由上海美吉生物科技有限公司测序，根据测序结果，可以很容易的判断APOC3基因的突变类型。测序结果示意图如图2A-2L所示，图2A是突变位点为无义突变(R19X，C>T)的C/C野生型测序结果示意图；图2B是突变位点为无义突变(R19X，C>T)的C/T杂合突变型测序结果示意图；图2C是突变位点为无义突变(R19X，C>T)的T/T纯合突变型测序结果示意图；图2D是突变位点为剪切位点突变(IVS2+1G>A)的G/G野生型测序结果示意图；图2E是突变位点为剪切位点突变(IVS2+1G>A)的G/A杂合突变型测序结果示意图；图2F是突变位点为剪切位点突变(IVS2+1G>A)的A/A纯合突变型测序结果示意图；图2G是突变位点为错义突变(A43T，G>A)的G/G野生型测序结果示意图；图2H是突变位点为错义突变(A43T，G>A)的G/A杂合突变型测序结果示意图；图2I是突变位点为错义突变(A43T，G>A)的A/A纯合突变型测序结果示意图；图2J是突变位点为剪切位点突变(IVS3+1G>T)的G/G野生型测序结果示意图；图2K是突变位点为剪切位点突变(IVS3+1G>T)的G/T杂合突变型测序结果示意图；图2L是突变位点为剪切位点突变(IVS3+1G>T)的T/T纯合突变型测序结果示意图。
实施例2：不同抗凝来源的血液样本和不同血液浓度的PCR
1、采集全血
采集同一人的新鲜血液，分别收集在EDTA抗凝管，肝素钠抗凝管和柠檬酸钠抗凝管内，各编号为A,B,C。
2、PCR反应液的配制
按以下方法配制PCR反应液：
浓度1：每20μul反应液加入2μul全血，见表3所示。
表3
成分 反应管A1 反应管B1 反应管C1
模板全血 2μl 2μl 2μl
2×Taq Master Mix 10μl 10μl 10μl
引物APOC3-PF/APOC3-PR 1-5pMol 1-5pMol 1-5pMol
ddH2O 至20ul 至20ul 至20ul
浓度2：每20μul反应液加入:4μul全血，见表4所示。
表4
成分 反应管A2 反应管B2 反应管C2
模板全血 4μl 4μl 4μl
2×Taq Master Mix 10μl 10μl 10μl
引物APOC3-PF/APOC3-PR 1-5pMol 1-5pMol 1-5pMol
ddH2O 至20ul 至20ul 至20ul
浓度3：每20μul反应液加入:6μul全血，见表5所示。
表5
成分 反应管A3 反应管B3 反应管C3
模板全血 6μl 6μl 6μl
2×Taq Master Mix 10μl 10μl 10μl
引物APOC3-PF/APOC3-PR 1-5pMol 1-5pMol 1-5pMol
ddH2O 至20ul 至20ul 至20ul
3、PCR反应：
使用杭州晶格KF960PCR仪进行反应，具体的PCR反应程序设置如表6所示：
表6
4、实验结果如下：
如图3-1、图3-2、图3-3所示，其中，M：DNA分子MARKER,从上到下分别为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。其中750bp是亮带泳道。泳道1:2μl全血，泳道2:4ul全血，泳道3:6ul全血，泳道4：质粒。实验结果表明，本试剂盒对不同抗凝来源的血液以及不同浓度的血液样本均有效。
实施例3：不同PCR反应程序对实验结果的影响
因为，虽然实验人员在PCR仪上设置了相同的PCR程序，但由于不同的PCR仪升降温速度会有差异，这种差异会导致各温度反应时间的差异，从而影响PCR结果。影响PCR结果关键的步骤是退火，所以我们采用晶格梯度PCR仪来验证不同的PCR反应条件，主要是退火温度对PCR结果的影响，来检测本试剂盒对不同PCR仪的适应性。
将新鲜采集的EDTA抗凝血按照实施例2方法配制PCR反应液。
20μl反应体系，如表7所示：
表7
成分 反应管
模板全血 2μl
2×Taq Master Mix 10μl
引物APOC3-PF/APOC3-PR 1-5pMol
ddH2O 至20ul
PCR反应程序如下表8：
表8
电泳结果如图4所示，图4中，M：DNA分子MARKER，从上到下分别为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1：50℃退火温度，泳道2：52℃退火温度，泳道3：54℃退火温度，泳道4：56℃退火温度，泳道5：58℃退火温度，泳道6：60℃退火温度。本试剂盒试剂可以适应很宽泛的实验温度，满足不同PCR仪的升降温，不影响实验结果。
实施例4不同缓冲液配方以及Taq酶对血液直接PCR的影响
用普通Taq酶(未经改造，购自TAKALA公司)替代本发明试剂盒中的截短型HaemoTaq酶，使用未加BSA和甘油保护剂PCR缓冲液，来验证本发明的试剂配方有利于血液直接PCR。表9是不同缓冲液配方。
表9
成分 1 2 3
模板(全血) 2μl 2μl 2μl
2×PCR缓冲液 10μl 10μl 10μl
引物APOC3-PF/APOC3-PR 1-5pMol 1-5pMol 1-5pMol
普通Taq酶 0.2μl / /
截短型HaemoTaq酶 / 0.2μl 0.2μl
BSA+甘油 / 1μl /
ddH2O 至20ul 至20ul 至20ul
PCR反应程序如实施例1所述，电泳结果如图5所示，图5中，泳道1：普通Taq酶的血液直接PCR，M：DL2000分子MARKER，泳道2：使用发明试剂盒的缓冲液和酶配方的血液直接PCR；泳道3：HaemoTaq酶但无保护剂的血液直接PCR。电泳结果表明，使用普通Taq酶以及不加BSA和甘油保护剂的PCR配方，直接血液PCR不能获得条带，说明本发明采用的改造型Taq酶以及缓冲液配方可以降低血液中的PCR抑制因子的作用，获得PCR产物。

Claims (7)

1.用于检测人APOC3基因突变的引物，其特征在于，其序列为：
正向引物：APOC3-PF 5’-GACCCAGCTAAGGTTCTAC-3’，如SEQ ID No.3所示；
反向引物：APOC3-PR 5’-AGGCTGAAGAGGCACAG-3’，如SEQ ID No.4所示。
2.一种用于检测人APOC3基因突变的PCR扩增试剂盒，其特征在于，其包含2×TaqMaster Mix，权利要求1所述引物对和去离子水ddH2O。
3.如权利要求2所述的用于检测人APOC3基因突变的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述2×Taq Master Mix的配方是：0.05U/μl HaemoTaq酶、0.5mM dNTP，60mM Tricine，5mM(NH4)2SO4，3.5mM MgCl2，5-10％甘油，200ng/μl BSA。
4.如权利要求3所述的用于检测人APOC3基因突变的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述HaemoTaq酶是截短后的Taq DNA聚合酶，它缺失了5'-3'外切酶活性。
5.如权利要求2所述的用于检测人APOC3基因突变的PCR扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒进行PCR扩增的PCR模板为全血，PCR反应程序为：95℃5min预变性；然后95℃15sec变性，55℃30sec退火，72℃20sec延伸，72℃5min延伸循环30次。
6.如权利要求2所述的用于检测人APOC3基因突变的PCR扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒进行PCR扩增时，一次PCR反应能同时检测4个突变位点，分别为无义突变(R19X，C>T)，剪切位点突变(IVS2+1G>A)，错义突变(A43T，G>A)，剪切位点突变(IVS3+1G>T)。
7.如权利要求1所述的引物在制备检测人APOC3基因突变的试剂盒中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636442A (zh) * 2017-02-23 2017-05-10 上海鼎晶生物医药科技股份有限公司 一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒
CN107022614A (zh) * 2017-04-21 2017-08-08 唐旌生物科技（上海）有限公司 一种检测基因突变的方法和试剂盒
CN112779322A (zh) * 2021-02-06 2021-05-11 杭州迪安生物技术有限公司 一种基于非荧光标记探针的高分辨熔解曲线的基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533953A (zh) * 2010-12-16 2012-07-04 广州益善生物技术有限公司 一种lpl基因snp检测特异性引物和液相芯片
CN102533950A (zh) * 2010-12-16 2012-07-04 广州益善生物技术有限公司 一种apoC3基因SNP检测特异性引物和液相芯片
CN103290135A (zh) * 2013-06-26 2013-09-11 北京迈基诺基因科技有限责任公司 一种自闭症基因的筛查方法
CN103820545A (zh) * 2014-02-11 2014-05-28 上海鼎晶生物医药科技有限公司 用于检测人abcg2基因突变的探针、引物及试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533953A (zh) * 2010-12-16 2012-07-04 广州益善生物技术有限公司 一种lpl基因snp检测特异性引物和液相芯片
CN102533950A (zh) * 2010-12-16 2012-07-04 广州益善生物技术有限公司 一种apoC3基因SNP检测特异性引物和液相芯片
CN103290135A (zh) * 2013-06-26 2013-09-11 北京迈基诺基因科技有限责任公司 一种自闭症基因的筛查方法
CN103820545A (zh) * 2014-02-11 2014-05-28 上海鼎晶生物医药科技有限公司 用于检测人abcg2基因突变的探针、引物及试剂盒

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636442A (zh) * 2017-02-23 2017-05-10 上海鼎晶生物医药科技股份有限公司 一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒
CN107022614A (zh) * 2017-04-21 2017-08-08 唐旌生物科技（上海）有限公司 一种检测基因突变的方法和试剂盒
CN112779322A (zh) * 2021-02-06 2021-05-11 杭州迪安生物技术有限公司 一种基于非荧光标记探针的高分辨熔解曲线的基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用

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