CN103060441A

CN103060441A - Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒

Info

Publication number: CN103060441A
Application number: CN201210556771XA
Authority: CN
Inventors: 宋元宗; 张占会
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2012-12-19
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明公开了Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒，所述的四种突变是I型、III型、X型和XIX型突变，属于生物技术领域。Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查引物的序列如SEQ ID NO.1～8所示。Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒包括上述引物、dNTPs、DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液和Tas Ⅰ限制性内切酶组件；所述试剂盒还包括从全血样本中提取基因组DNA的试剂、四种突变类型的正常、纯合子和杂合子对照DNA、核酸电泳用琼脂糖、DNA Maker和核酸染料。本发明的引物和试剂盒能够后简单、快速、准确的筛查上述SLC25A13基因的上述四种高频突变。

Description

Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变(I型、III型、X型和XIX型)筛查引物及试剂盒。

背景技术

Citrin蛋白是由SLC25A13基因编码的一种位于线粒体内膜上的钙调节载体蛋白，主要在肝脏中表达。Citrin蛋白作为钙结合性线粒体溶质载体(Aspaetate-Glutamate Carrier,AGC)，其功能一是作为天冬氨酸的运载体向细胞质内转运天冬氨酸，提供尿素、蛋白及核苷酸合成材料；二是作为线粒体内膜上天冬氨酸-苹果酸屏障的组成部分向线粒体内提供还原型烟酰胺腺嘌吟二核甙酸(NADH)应用于糖的分解代谢；三是通过调节还原型烟酰胺腺嘌吟二核甙酸(NADH)的比例参与糖异生过程。

SLC25A13基因突变导致其所编码的citrin蛋白功能不足或丧失，引发一系列生化代谢紊乱，并最终形成临床表型及预后各不相同的以肝脏损害为突出临床表现的常染色体隐性遗传病-Citrin缺陷病(Citrin Deficiency,CD)。CD主要临床表型可分为三种，分别为Citrin缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症(NeonatalIntrahepatic Cholestasis caused by Citrin Deficiency,NICCD,OMIM#605814)、成人发病瓜氨酸血症II型(Adult-onset CitrullinemiaType II,CTLN2,OMIM#603471)和Citrin缺陷导致的生长发育落后和血脂异常(Failure to Thrive andDyslipidemia caused by Citrin Deficiency,FTTDCD)。NICCD主要发病于新生儿或小婴儿，以圆胖脸、肝大、黄疸及肝功能异常为主要表现，若早期干预治疗大部分预后良好；CTLN2主要发病于11岁以上的儿童或是成人，以高氨血症导致的神经精神症状为突出临床表现，往往预后不良，需要肝脏移植；FTTDCD是不同于NICCD及CTLN2的一种新的临床表现型，它主要表现为生长发育落后和血脂异常。

流行病学调查研究显示SLC25A13基因变异频率在中国分布呈现明显的地区差异，长江以南地区人群SLC25A13基因突变携带率(1/48)明显高于长江以北地区(1/940)，提示该病在我国有较高的发病率，尤其是长江以南及长江沿线地区。在已发现的SLC25A13基因突变类型中，I型(851del4)、III型(1638-1660dup)、X型(IVS6+5G>A)和XIX型(IVS16ins3kb)这四种突变类型约占总突变的85%，为我国人群的高频突变类型。

Citrin缺陷病的临床表现复杂多样，至今尚未建立成熟的临床和生化诊断标准，SLC25A13基因突变分析被认为是诊断该病的必要手段。以往此基因的分析主要依靠基因测序，耗时且费用高。

发明内容

本发明的首要目的在于提供Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变(I型、III型、X型和XIX型)筛查引物。

本发明的另一目的在于提供一种Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查引物，所述的高频突变为I型、III型、X型和XIX型突变，

I型突变的筛查引物为：

IF：5’-ggtatatttgttgcttgtgtttg-3’，IA：5’-tcttccagaggagcaatccg-3’；正常扩增片段长度为82bp，突变后扩增片段长度为78bp。

III型突变的筛查引物为：

IIIF：5’-tgttgtgtctctcctgcagg-3’，IIIA：5’-gcagtctatcactccgctgt-3’；正常扩增片段长度为123bp，突变后扩增片段长度为146bp。

X型突变的筛查引物为：

XF：5’-tgagggcttgttagatcaagat-3’，XA：5’-ttacccagacaacaaattaacct-3’；正常扩增片段长度为467bp，突变后扩增片段长度为467bp。

XIX型突变的筛查引物为：

XIXF：5’-gtatgcctgcagcatctttag-3’，XIXA：5’-tgcttcattcccaggaggga-3’；正常扩增片段长度为881bp，突变后扩增片段长度为3565bp。

一种Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒，包括上述四对引物、dNTPs、DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液和TasⅠ限制性内切酶组件。所述的TasⅠ限制性内切酶组件包括TasⅠ限制性内切酶和TasⅠ限制性内切酶缓冲液。

所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒还包括从全血样本中提取基因组DNA的试剂(一般全血DNA小量提取试剂盒即可，可选配)和四种突变类型的正常、纯合子和杂合子对照DNA。I型突变的正常对照DNA为82bp的条带，I型突变纯合子对照DNA为78bp的条带，I型突变杂合子为78bp和82bp的条带；III型突变的正常对照DNA为123bp的条带，III型突变纯合子对照DNA为146bp的条带，III型突变杂合子为123bp、146bp和约160bp的条带；X型突变的正常对照DNA为225bp、119bp和72bp的条带，X型突变纯合子对照DNA为180bp、119bp和72bp的条带，X型突变杂合子为225bp、180bp、119bp和72bp的条带；XIX型突变的正常对照DNA为881bp的条带，XIX型突变纯合子对照DNA为3565bp的条带，XIX型突变杂合子为881bp和3565bp的条带。

所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒还包括：核酸电泳用琼脂糖；所述的核酸电泳用琼脂糖为普通电泳级琼脂糖和低熔点电泳级琼脂糖。

所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒还包括DNAladder Maker和核酸染料。所述的DNA Ladder Maker优选为20bp和200bp DNALadder Marker；所述的核酸染料优选为Goldview。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明就Citrin缺陷病致病基因SLC25A13的四种高频突变(I型、III型、X型和XIX型)，建立了依靠PCR和PCR-限制性长度片段多态性(PCR-RFLP)技术的筛查引物和试剂盒，依靠本发明的引物和试剂盒能够后简单、快速、准确的筛查上述四种高频突变。

附图说明

图1是I型突变正常对照、突变纯合子和突变杂合子的PCR产物电泳图。

图2是III型突变正常对照、突变纯合子和突变杂合子的PCR产物电泳图。

图3是X型突变正常对照、突变纯合子和突变杂合子的PCR产物电泳图。

图4是图3所示PCR产物的的TasⅠ酶切产物电泳图。

图5是XIX型突变正常对照、突变纯合子和突变杂合子的PCR产物电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)样本基因组DNA的提取

已知I型、III型、X型和XIX型四种突变类型Citrin缺陷病患者(每种突变类型各包括突变纯合子和突变杂合子各一例)和无Citrin缺陷病的正常人(正常对照)外周抗凝血标本400μL，使用Simgen公司的全血DNA小量试剂盒按照其说明书提取样本的基因组DNA，得到浓度在50～150ng/μL的基因组DNA。

(2)SLC25A13I型、III型和X型突变的检测

1)以(1)所提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，所用引物见表1，DNA聚合酶为TaKaRa的rTaq酶。

表1四种SLC25A13突变检测引物和扩增片段长度

50μL PCR反应体系：DNA模板(50-150ng/μL)1μL，rTaq酶(5U/μL)0.25μL，10×Buffer(Mg²⁺Plus)5μL，dNTP s(各2.5mM)4μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，灭菌双蒸水37.75μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火40s，72℃延伸50s，40个循环；72℃ 10min，4℃保存。

2)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳：

I型突变的PCR产物在4%低熔点(Bio-Rad)琼脂糖凝胶中电泳，于凝胶成像系统中观察DNA条带，结果如图1所示(A：20bp DNA Ladder Marker；B：正常对照；C：I型突变纯合子；D：I型突变杂合子。)，正常对照为基因组DNA中两个等位基因均无I型突变，PCR产物为单一82bp条带；I型突变纯合子为两个等位基因均包含I型突变，PCR产物为单一78bp条带；I型突变杂合子为两个等位基因中一个包含I型突变，PCR产物为78bp和82bp两条带(因为DNA杂交带，所以带型不会很清晰)。

III型突变的PCR产物在3%低熔点(Bio-Rad)琼脂糖凝胶中电泳，于凝胶成像系统中观察DNA条带，结果如图2所示(A：20bp DNA Ladder Marker；B：正常对照；C：III型突变纯合子；D：III型突变杂合子。)，正常对照为基因组DNA中两个等位基因均无III型突变，PCR产物为单一123bp条带；III型突变纯合子为两个等位基因均包含III型突变，PCR产物为单一146bp条带；III型突变杂合子为两个等位基因中一个包含III型突变，PCR产物包含123bp、146bp和一条约160bp(因为杂交泡，所以电泳速度较慢，显示为较大的一条带)的杂交带。

X型突变的PCR产物在1.5%普通琼脂糖（西班牙）凝胶中电泳，于凝胶成像系统中观察DNA条带，结果如图3所示(A：20bp DNA Ladder Marker；B：正常对照；C：X型突变纯合子；D：X型突变杂合子)，正常对照、X型突变纯合子和X型突变杂合子的PCR产物均为单一467bp条带。

3)用TasⅠ限制性内切酶酶切X型突变的PCR产物，酶切条件如下：X型突变的PCR产物10μL，TasⅠ酶(10U)0.5μL，Buffer B 2μL，灭菌蒸馏水19.5μL，混合均匀后65℃水浴4小时。酶切产物在3%普通琼脂糖凝胶中电泳后于凝胶成像系统中观察DNA条带，结果如图4所示(A：20bp DNA Ladder Marker；B：正常对照；C：X型突变纯合子；D：X型突变杂合子)，正常对照的PCR产物经Tas Ⅰ酶切后电泳得到三条(225bp+119bp+72bp)可见带；X型突变纯合子的PCR产物经Tas Ⅰ酶切后225bp条带消失，出现一条180bp可见条带；X型突变杂合子的PCR产物经Tas Ⅰ酶切后为上述两种带型的组合(225bp+180bp+119bp+72bp)。

(3)SLC25A13 XIX型突变的检测

1)以（1）所提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，所用引物见表1，DNA聚合酶为TaKaRa的LA-Taq酶。

50μL PCR反应体系：DNA模板(50-150ng/μL)1μL，LA-Taq酶(5 U/μL)0.5μL，10×LA-Buffer(Mg²⁺Plus)5μL，dNTP s(各2.5mM)4μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，灭菌双蒸水37.5μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；98℃变性10s，退火+延伸68℃10min，40个循环；72℃10min，4℃保存。

XIX型突变的PCR产物在1%普通琼脂糖凝胶中电泳后于凝胶成像系统中观察DNA条带，结果如图5所示(A：200bp DNA Ladder Marker；B：正常对照；C：XIX型突变纯合子；D：XIX型突变杂合子)，正常对照为基因组DNA中两个等位基因均无XIX型突变，PCR产物为单一881bp条带；XIX型突变纯合子为两个等位基因均包含XIX型突变，PCR产物为单一3565bp条带；XIX型突变杂合子为两个等位基因中一个包含XIX型突变，PCR产物包含881bp和3565bp两条带。

上述结果表明本发明引物及试剂盒可以对Citrin缺陷病致病基因SLC25A13四种高频突变(I型、III型、X型和XIX型)进行简单、快速、准确的筛查。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查引物，所述四种高频突变为I型、III型、X型和XIX型突变，其特征在于：

I型突变的筛查引物为：

IF：5’-ggtatatttgttgcttgtgtttg-3’，IA：5’-tcttccagaggagcaatccg-3’；

III型突变的筛查引物为：

IIIF：5’-tgttgtgtctctcctgcagg-3’，IIIA：5’-gcagtctatcactccgctgt-3’；

X型突变的筛查引物为：

XF：5’-tgagggcttgttagatcaagat-3’，XA：5’-ttacccagacaacaaattaacct-3’；

XIX型突变的筛查引物为：

XIXF：5’-gtatgcctgcagcatctttag-3’，XIXA：5’-tgcttcattcccaggaggga-3’。

2.一种Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的四对引物、dNTPs、DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液和TasⅠ限制性内切酶组件。

3.根据权利要求2所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒，其特征在于：所述的TasⅠ限制性内切酶组件包括TasⅠ限制性内切酶和TasⅠ限制性内切酶缓冲液。

4.根据权利要求2所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括全血样本中提取基因组DNA的试剂和四种高频突变类型的正常、纯合子和杂合子对照DNA。

5.根据权利要求4所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒，其特征在于所述四种高频突变类型的正常、纯合子和杂合子对照DNA如下：

I型突变的正常对照DNA为82bp的条带，I型突变纯合子对照DNA为78bp的条带，I型突变杂合子为78bp和82bp的条带；

III型突变的正常对照DNA为123bp的条带，III型突变纯合子对照DNA为146bp的条带，III型突变杂合子为123bp、146bp和约160bp的条带；

X型突变的正常对照DNA为225bp、119bp和72bp的条带，X型突变纯合子对照DNA为180bp、119bp和72bp的条带，X型突变杂合子为225bp、180bp、119bp和72bp的条带；

XIX型突变的正常对照DNA为881bp的条带，XIX型突变纯合子对照DNA为3565bp的条带，XIX型突变杂合子为881bp和3565bp的条带。

6.根据权利要求2所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括核酸电泳用琼脂糖。

7.根据权利要求6所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒，其特征在于：所述的核酸电泳用琼脂糖为普通电泳级琼脂糖和低熔点电泳级琼脂糖。

8.根据权利要求2所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括DNA Ladder Maker和核酸染料。

9.根据权利要求8所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频突变筛查试剂盒，其特征在于：所述的DNA Ladder Maker为20bp和200bp DNA LadderMarker；所述的核酸染料为Goldview。