CN105695592A - Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查引物及试剂盒 - Google Patents

Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查引物及试剂盒，属于生物技术领域。本发明提供了全新设计的三条引物，建立了依靠普通Taq酶的多重PCR体系，可以通过一次PCR和分析电泳图谱即可鉴定出样本是XIX突变阴性、阳性还是杂合子，准确、简单、快速且费用低。利用本发明的筛查引物及试剂盒，无需DNA测序，简单快速、成本低，检测结果直接、可靠，在检测时间和成本上显著优于已有方法，利用简单常见设备即可完成，适用于各地医疗和检测机构对SLC25A13基因高频XIX型突变的快速检测及大规模人群筛查。

Description

Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查引物及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查引物及试剂盒。
背景技术
Citrin蛋白是由SLC25A13基因编码的一种位于线粒体内膜上的钙调节载体蛋白，主要在肝脏中表达。SLC25A13基因突变导致其所编码的citrin蛋白功能不足或丧失，引发一系列生化代谢紊乱，并最终形成临床表型及预后各不相同的以肝脏损害为突出临床表现的常染色体隐性遗传病-Citrin缺陷病(CitrinDeficiency，CD)。CD主要临床表型可分为三种，分别为Citrin缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症(NeonatalIntrahepaticCholestasiscausedbyCitrinDeficiency，NICCD，OMIM#605814)、成人发病瓜氨酸血症II型(Adult-onsetCitrullinemiaTypeII，CTLN2，OMIM#603471)和Citrin缺陷导致的生长发育落后和血脂异常(FailuretoThriveandDyslipidemiacausedbyCitrinDeficiency，FTTDCD)。NICCD主要发病于新生儿或小婴儿，以圆胖脸、肝大、黄疸及肝功能异常为主要表现，若早期干预治疗大部分预后良好；CTLN2主要发病于11岁以上的儿童或是成人，以高氨血症导致的神经精神症状为突出临床表现，往往预后不良，需要肝脏移植；FTTDCD是不同于NICCD及CTLN2的一种新的临床表现型，它主要表现为生长发育落后和血脂异常。
Citrin缺陷病的临床表现复杂多样，至今尚未建立成熟的临床和生化诊断标准，SLC25A13基因突变分析被认为是诊断该病的必要手段。在已发现的SLC25A13基因突变类型中，I型(851del4)，III型(1638-1660dup)，X型(c.615+5G>A)和XIX型(IVS16ins3kb)这四种突变类型为我国人群的高频突变类型。其中XIX型突变为大片段插入突变，传统的检测方法主要是在插入位点两侧设计引物，进行长片段PCR，然后电泳，如无XIX型突变则只扩增出一条短带，而XIX型纯合子则扩增出一条长带，长度是正常短带长度加上插入片段长度，而杂合子标本(一条染色体携带突变，而另外一条正常)则扩增出一条短带和一条长带。这种方法需要使用LA-PCR技术，PCR运行时间长达7个小时以上，且对操作者的要求较高，检测实践中经常出现假阴性而导致误判漏诊。另外，有文献报道使用套式PCR检测XIX突变，两条上游引物设计在插入位点前正常序列，两条下游引物设计在插入序列内，两次扩增后电泳如果有目的条带则说明包含XIX型突变。这一种方法不能区别纯合子与杂合子，且套式PCR非常容易出现污染，导致假阳性结果。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查引物。本发明提供了全新设计的三条引物，建立了依靠普通Taq酶的多重PCR体系，可以通过一次PCR和分析电泳图谱即可鉴定出样本是XIX突变阴性、阳性还是杂合子，准确、简单、快速且费用低。
本发明的另一目的在于提供Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查引物，所述的筛查引物为：
MuXIX-2UF：5'-gccaaaccacttacagcggagt-3'；
MuXIX-2UR：5'-ttatgacagagagcagcactggttc-3'；
MuXIX-1R：5'-tccctacgacaacagagcattagc-3'；
正常基因扩增片段长度为335bp，突变后扩增片段长度为564bp。
一种Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查试剂盒，包括上述三条引物(MuXIX-2UF、MuXIX-2UR和MuXIX-1R)、dNTPs、DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液组件。
所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查试剂盒还包括XIX型突变的正常对照DNA，扩增产物电泳显示为335bp的条带，XIX型突变纯合子对照DNA，扩增产物电泳显示为564bp的条带，XIX型突变杂合子对照DNA，扩增产物电泳显示为564bp和335bp的两条带。
所述的MuXIX-2UF、MuXIX-2UR和MuXIX-1R的终浓度比为(5～6)：(4～5)：1。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)本发明就Citrin缺陷病致病基因SLC25A13的高频XIX型突变，建立了依靠PCR技术的检测引物和试剂盒，依靠本发明的引物和试剂盒能够简单、快速、准确的检测上述XIX型高频突变。
(2)本发明提供一种新型快速诊断该突变的基因诊断方法，属于生物技术领域。检测步骤包括：(1)以Citrin缺陷病疑似患者或筛查人群血液标本提取的gDNA为模板，使用三条分别针对XIX型突变的特定引物和程序，进行多重PCR扩增，得到PCR反应产物；(2)将PCR产物琼脂糖凝胶中电泳，分析条带，直接判定标本来源人是否携带XIX型突变、杂合子还是纯合子。本检测方法无需DNA测序，简单快速、成本低，检测结果直接、可靠，在检测时间和成本上显著优于已有方法，利用简单常见设备即可完成，适用于各地医疗和检测机构对SLC25A13基因高频XIX型突变的快速检测及大规模人群筛查。
附图说明
图1是疑似Citrin缺陷病患者家庭SLC25A13基因XIX型突变筛查电泳图。
图2是SLC25A13基因XIX型突变筛查验证电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
具体实施时需要疑似患者家庭或大规模筛查人群的外周血提取的基因组DNA(一般全血DNA小量提取试剂盒即可，用户自配)，浓度在50～150ng/μL。同时，应具有PCR仪和电泳设备及普通电泳制胶试剂。
SLC25A13基因XIX突变的PCR扩增
以一组疑似Citrin缺陷病疑似患者和父母的血液基因组DNA为模板，进行XIX型突变的PCR扩增。同时，以10份已知SLC25A13基因XIX型突变杂合子DNA样本，10份已知无携带SLC25A13基因XIX型突变DNA样本和4份已知SLC25A13基因XIX型突变纯合子DNA样本为另一组检测标本，以验证试剂盒的可靠性。所需试剂(推荐TaKaRarTaq酶)和PCR程序如下：
A)PCR体系(总体积25μL)
B)PCR程序
C)电泳
突变XIX(IVS16in3kb)PCR扩增产物经1.5％普通琼脂糖凝胶中电泳(一般130V，20min)后于凝胶成像系统中观察DNA条带。
D)结果说明
图1是疑似Citrin缺陷病患者家庭XIX型突变筛查电泳图，说明：泳道M，DNALadderMarker；N，正常对照；Ho，XIX型突变纯合子；He，XIX型突变杂合子；P，Citrin缺陷病疑似患者；F，疑似患者父亲；Mu，疑似患者母亲；C，空白对照。如基因组DNA中两个等位基因均无XIX型突变，则PCR产物为单一335bp条带；如两个等位基因均包含XIX型突变(纯合子)，则PCR结果为单一564bp条带；如果两个等位基因中一个包含XIX型突变(杂合子)，则产物包含881bp和3565bp两条带。从检测结果可以看出，疑似患者和父母均为SLC25A13基因XIX型突变杂合子。
图2是XIX型(IVS16ins3kb)筛查验证电泳图。随机选取了10份已知SLC25A13基因XIX型突变杂合子DNA样本，10份已知无携带SLC25A13基因XIX型突变DNA样本和4份已知SLC25A13基因XIX型突变纯合子DNA样本对试剂盒进行可靠性检测。结果显示检测结果与预想一致。
对上述SLC25A13基因XIX型突变检测实施例说明本发明试剂盒可以对简单、快速和准确的判定该突变，使得对Citrin缺陷这一高频且易于漏诊突变的临床准确诊断具有可靠检测手段，同时，可以针对大规模人群进行该突变的低成本快速筛查。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查引物，其特征在于：所述的筛查引物为：
MuXIX-2UF：5'-gccaaaccacttacagcggagt-3'；
MuXIX-2UR：5'-ttatgacagagagcagcactggttc-3'；
MuXIX-1R：5'-tccctacgacaacagagcattagc-3'。
2.Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的筛查引物、dNTPs、DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液组件。
3.根据权利要求2所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查试剂盒，其特征在于：还包括XIX型突变的正常对照DNA，扩增产物电泳显示为335bp的条带；XIX型突变纯合子对照DNA，扩增产物电泳显示为564bp的条带；XIX型突变杂合子对照DNA，扩增产物电泳显示为564bp和335bp的两条带。
4.根据权利要求1所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查引物，其特征在于：
所述的MuXIX-2UF、MuXIX-2UR和MuXIX-1R终浓度比为(5～6)：(4～5)：1。
5.根据权利要求2或3所述的Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频XIX型突变筛查试剂盒，其特征在于：
所述的MuXIX-2UF、MuXIX-2UR和MuXIX-1R的终浓度比为(5～6)：(4～5)：1。
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