CN106521023B

CN106521023B - 一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN106521023B
Application number: CN201710014971.5A
Authority: CN
Inventors: 骆明勇; 王继成; 胡听听; 秦丹卿; 梁驹卿; 张艳霞; 袁腾龙; 王奕霞; 杜丽; 尹爱华
Original assignee: Guangdong Maternal and Child Health Hospital
Current assignee: Guangdong Maternal and Child Health Hospital
Priority date: 2016-11-23
Filing date: 2017-01-09
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2037-01-09
Also published as: CN106521023A

Abstract

本发明公开了一种检测中国人HPFH和δβ‑地中海贫血的试剂盒及方法。该试剂盒包括如SEQ ID NO.1～8所示的引物。本发明能在一管反应中同时检测3种中国人常见的HPFH和δβ‑地中海贫血常见缺失类型：东南亚型HPFH、中国型和云南型δβ‑地贫；整个检测体系只设计了一个共用的正常对照，从而使扩增体系更稳定可靠。

Description

一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种地中海贫血的基因诊断试剂盒和方法，特别涉及一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒及方法。

背景技术

地中海贫血(Thalassemia)，简称地贫，是一种因珠蛋白合成障碍所致的遗传性溶血性疾病，分α-地中海贫血(简称α-地贫)和β-地中海贫血(β-地贫)两种类型。本病主要见于地中海沿岸国家和东南亚各国,是全球分布最广、累积人群最多的一种单基因病，全世界约有九千万徵患与基因携带者。我国以南方地区多见，是我国长江以南各省发病率最高、影响最大的遗传病之一，尤以广西、广东和海南为甚。目前对本病尚无有效的治疗方法，重型α地贫患儿在出生的24－48小时之内死亡，而且产妇因胎儿水肿、大胎盘，极易导致死产，另一方面，重型β地贫以及部分中间型α地贫患者在出生后半年起始出现进行性贫血，只能靠输血维持生命，多在童年夭折，给家庭和社会带来沉重负担，严重影响人口素质。因此，在全国甚至东南亚地贫高发地区有效开展婚前、孕前以及产前地贫基因检测，对防止重型地贫患儿出生，减少出生缺陷以及优生优育具有重要意义。

β-地中海贫是由于β珠蛋白链合成异常的一类地贫，重型β-地贫患儿因为在出生时与正常婴儿相同，一般在半岁左右出现进行性的加重性的贫血才被发现，后续就必须靠输血维持生命；而重型α地中海贫血(Bart's水肿胎)在妊娠中可以被超声影像发现，并往往在妊娠晚期流产或出生后数小时死亡。所以重型β-地贫具有更严重的危害性，对家庭和社会造成更为严重的后果。目前200多种引起β-地贫的突变被鉴定，其中大部分为点突变，而10％左右的突变为β-珠蛋白基因簇大片段缺失，这些缺失可能引起β⁰-地贫，(δβ)⁰-地贫，^Gγ⁺(^Aγδβ)⁰-地贫和遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(hereditary persistence offetal hemoglobin，HPFH)等。这些缺失如果结合其它β珠蛋白基因点突变可能导致重型β-地贫。由于现在临床用试剂盒未覆盖到这些缺失的检测，所以临床往往被漏诊，可能导致重型β-地贫患儿的出生，所以在地贫高危人群中要重视此类地贫的筛查和检测。

目前国际常规的实验室诊断方法是血常规检测分析红细胞参数的基础上，对可疑人群直接进行基因检测，而国内常规做法是在血红蛋白电泳筛查的基础上，对可疑人群进行基因诊断，β地贫的基因诊断是应用PCR结合反向斑点膜杂交(RDB)的技术(简称PCR-RDB)进行。已有商品化的β地贫基因检测试剂盒只要覆盖到了上述的17种点突变，而没有包括HPFH和δβ-地中海贫血相关突变的检测。部分实验室只能自己建立检测HPFH和δβ-地中海贫血常见突变类型的方法，而在检测临床标本的时候各种可能的突变只能分开单独检测，费时费力、检测效率低。鉴于HPFH和δβ-地中海贫血在临床上漏诊可能导致严重的后果，应该高度重视此类地贫突变的检测，临床需要一种高效、准确的检测此类地贫的方法。

珠蛋白基因测序虽然是诊断地贫的金标准，也是国外普遍应用于地贫基因诊断的方法，但不适用于基因大片段缺失的检测。一些基于PCR技术的方法如限制性内切酶(RE)、Southern blotting以及多重连接探针扩增(MLPA)等技术应用于了β珠蛋白基因簇未知和罕见型大片段缺失的检测。然而应用最广泛的是跨越断裂点PCR(Gap-PCR)技术，其原理是：引物与缺失序列的两侧翼序列互补，由于缺失两端相接，使本来在正常DNA序列中相距很远的这一对引物之间的距离，因断端连接而靠近，以至于能扩增出特定长度的片段；另一条引物则位于缺失区域，这样仅在杂合子或完全正常情况下，正常等位基因才会被扩增出来；该法可以准确检出大片段缺失突变，是目前最常用的针对己知缺失型突变的检测方法。1994年Craig等建立了九种单重Gap-PCR的方法，可以检测引起(δβ)⁰-地贫和HPFH的九种缺失，包括：HPFH-1，HPFH-2，HPFH-3，Spanish(δβ)⁰-地贫，Hb Lepore，Sicilian(δβ)⁰-地贫，中国型^Gγ(^Aγδβ)⁰-地贫，Asian-Indian inversion-缺失型^Gγ(^Aγδβ)⁰-地贫和Turkishinversion-缺失型(δβ)⁰-地贫等。该方法促进了这几种缺失型的分子诊断,但是只能进行单重检测，所以只能每种逐一地进行检测，费时费力。

中国人群中导致HPFH和δβ-地贫的缺失型突变主要有3种，其中3种为^Gγ(^Aγδβ)⁰-地贫，分别为中国型和云南型，另一种为东南亚缺失HPFH。这三种突变目前还没有在一管中同时进行检测的相关报道，所以目前各实验室只能单独进行检测，费时费力，检测效率低。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，包括如表1所示的引物：

表1 PCR引物序列(均为5’-3’)

表中的For表示上游引物，Rev表示下游引物；SEA表示东南亚HPFH，Yun表示云南型δβ-地贫，Chi表示中国型δβ-地贫，Nor表示正常对照。

所述的试剂盒还包括用于PCR的酶、用于PCR的缓冲液、dNTP、甜菜碱和用于PCR的水中的一种或至少两种。

优选地，所述的试剂盒包含含有上述引物的预混液，预混液的组成如下：SEA For、SEA Rev、Yun For、Yun Rev、Chi For、Chi Rev、Nor For、Nor Rev、甜菜碱、dNTP、PCR反应缓冲液、用于PCR的酶。

所述的预混液中各成分的浓度以最终使用时各成分的终浓度如下计算：SEA For0.3μM、SEA Rev 0.3μM、Yun For 0.2μM、Yun Rev 0.2μM、Chi For 0.3μM、Chi Rev 0.3μM、Nor For 0.2μM、Nor Rev 0.2μM、甜菜碱1M、dNTP 0.8mM、1×PCR反应缓冲液、用于PCR的酶0.1U/μl。

所述的用于PCR的酶优选为Taq DNA聚合酶。

所述的用于PCR的水优选为双蒸水或超纯水。

一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的方法，是采用上述试剂盒进行，包括如下步骤：

(1)对待检测样本提取基因组DNA；

(2)配制PCR反应体系；每25μl反应体系的组成如下：10×PCR反应缓冲液2.5μl、浓度为10mM的dNTP 2μl、浓度为10μM的引物SEA For 0.75μl、浓度为10μM的引物SEA Rev0.75μl、浓度为10μM的引物Yun For 0.50μl、浓度为10μM的引物Yun Rev 0.50μl、浓度为10μM的引物Chi For 0.75μl、浓度为10μM的引物Chi Rev 0.75μl、浓度为10μM的引物Nor For0.50μl、浓度为10μM的引物Nor Rev 0.50μl、浓度为5M的甜菜碱(betaine)5μl，浓度为5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl、浓度20～40ng/μl的基因组DNA 1～2μl，用于PCR的水补足至25μl；

(3)进行PCR扩增，PCR条件如下：95℃5min；95℃45s、56℃90s、72℃3min，10个循环；95℃45s、56℃45s、72℃3min，25个循环；72℃5min；

(4)电泳检测；

(5)结果判读：

①若只是出现156bp条带(即引物Nor For和Nor Rev扩增得到的带)，则排除3种中国人常见的HPFH和δβ-地中海贫血常见缺失类型：东南亚型HPFH、中国型δβ-地贫和云南型δβ-地贫；

②若只是出现156bp条带和376bp条带(即引物SEA For和SEA Rev扩增得到的带)，则为东南亚型HPFH杂合缺失；

③若只是出现376bp条带，则为东南亚型HPFH纯合缺失；

④若只是出现156bp条带和292bp条带(即引物Yun For和Yun Rev扩增得到的带)，则为云南型杂合缺失；

⑤若只是出现292bp条带，则为云南型纯合缺失；

⑥若只是出现156bp条带和508bp条带(即引物Chi For和Chi Rev扩增得到的带)，则为中国型杂合缺失；

⑦若只是出现508bp条带，则为中国型纯合缺失。

步骤(1)中所述的标本包括外周血、脐带血、绒毛和羊水。

步骤(1)中所述的基因组DNA的纯度优选为OD₂₆₀/OD₂₈₀的值在1.7-2.0之间。

步骤(4)中所述的电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

所述的琼脂糖凝胶的浓度优选为质量体积比1.5％。

所述的琼脂糖凝胶电泳的条件优选为在5V/cm电压下电泳60分钟。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

①一管反应可以同时检测3种中国人常见的HPFH和δβ-地中海贫血常见缺失类型：东南亚型HPFH、中国型和云南型δβ-地贫；

②整个检测体系只设计了一个共用的正常对照，从而使扩增体系更稳定可靠。

附图说明

图1是本发明的检测结果图，其中，泳道1为空白对照，泳道2-5为临床标本，泳道M为DNA Marker。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明建立了一种检测中国人HPFH和δβ-地贫常见缺失类型的多重PCR方法。本发明利用gap-PCR技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对β-珠蛋白基因的中国人HPFH和δβ-地贫常见缺失类型进行序列分析，设计出针对东南亚型HPFH、中国型和云南型δβ-地贫3种中国人常见的HPFH和δβ-地贫常见缺失类型的PCR引物。然后将设计得到的东南亚型HPFH、云南型和中国型δβ-地贫引物，以相应的已知突变的基因组DNA为模板，分别进行单管扩增，分别得到东南亚型、云南型和中国型引物的最佳浓度；接着在已经确定最佳浓度的引物中再加入不同浓度的正常对照引物，如在已经确定最佳浓度的东南亚型引物中加入不同浓度的正常对照引物，分别得到东南亚型HPFH、云南型和中国型δβ-地贫引物最佳引物浓度的两重扩增体系；再在两重扩增体系中加入不同浓度的另外两种突变类型的引物，如在东南亚型两重扩增体系中加入不同浓度的云南型和中国型引物，最终得到扩增东南亚型HPFH的4种引物最佳浓度的4重扩增体系；同样实验设计，分别获得扩增中国型和云南型δβ-地贫的4种引物最佳浓度的4重扩增体系；综合分析上述分别获得的3组4重扩增体系最佳引物浓度，初步确定最终可以一管扩增东南亚型HPFH、云南型和中国型δβ-地贫的4重扩增体系最佳引物浓度；最后采用3种类型的样本进行实验验证。得到的4重扩增体系接着进行反应体系和条件的优化，得到各个成分优化的反应体系和反应条件。

本发明中所使用的基因组模板为从外周血提取基因组得到。

实施例1

(一)引物设计和优选

查阅文献获得已经报道的东南亚型HPFH、中国型δβ-地贫和云南型δβ-地贫单重检测PCR引物序列。同时从NCBI的GenBank上下载东南亚型HPFH、中国型δβ-地贫和云南型δβ-地贫3种的核酸序列，对缺失的位置在基因组的分布进行分析，自行设计PCR引物。备选引物见表2。

表2备选PCR引物序列(均为5’-3’)

将各个引物配制成10μmol/L，备用。以东南亚型HPFH引物描述整个过程，其他引物也是类似筛选过程。

1、以已确认东南亚型HPFH的基因组为模板，以SEA For和SEA Rev为引物组，以SEAFor-2和SEA Rev为引物组，以SEA For和SEA Rev-2为引物组，以SEA For-2和SEA Rev-2为引物组，设计不同浓度，进行PCR，得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以电泳照片中得到唯一一条带为最佳的引物组合和引物浓度。

PCR反应体系如下：基因组DNA(20～40ng/μl)2μl、上游引物依据实验设计添加、下游引物依据实验设计添加、甜菜碱(5M)5μl、dNTP(10mM)2μl、10×PCR反应缓冲液2.5μl、TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.5μl、水补足至25μl。

PCR反应条件如下：95℃、5min；95℃45s、56℃90s、72℃3min，35循环；72℃3min。

2、在最佳的引物浓度中加入不同浓度的正常对照引物，得到二重PCR反应体系，分别以东南亚型HPFH的基因组和正常人基因组为模板，进行PCR，得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以电泳照片中得到特异目的条带为最佳的引物组合和引物浓度。PCR反应体系和反应条件如步骤1。

3、在确定的最佳引物浓度的二重PCR反应体系中加入不同浓度的云南型引物和中国型引物，得到四重PCR反应体系，以东南亚型HPFH的和正常人基因组为模板进行PCR，得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以电泳照片中得到特异目的条带为最佳的引物组合和引物浓度。PCR反应体系和反应条件如步骤1。

4、得到扩增东南亚型HPFH的4种引物最佳浓度的4重扩增体系，初步掌握不同浓度云南型引物和中国型引物对东南亚型HPFH和正常对照扩增的干扰影响情况；

同样实验设计，分别获得扩增中国型和云南型δβ-地贫的最佳的引物组合和4种引物最佳浓度的4重扩增体系，初步掌握其他两种引物对目的基因扩增的干扰影响情况；再综合分析上述分别获得的3组4重扩增体系最佳引物浓度，初步确定最终可以一管扩增东南亚型HPFH、云南型和中国型δβ-地贫的4重扩增体系最佳引物浓度；最后采用3种类型的样本进行实验验证。

最终，获得4重PCR反应体系中最佳引物和最佳引物浓度为：25μl反应体系中，SEAFor 0.75μl、SEA Rev 0.75μl、Yun For 0.5μl、Yun Rev 0.5μl、Chi For0.75μl、Chi Rev0.75μl、Nor For 0.5μl、Nor Rev 0.5μl。

(二)反应体系和条件的优化

1、甜菜碱浓度的优化

在四重PCR扩增体系中分别加入终浓度为0、0.5、1.0、1.5M的甜菜碱，对东南亚型HPFH、中国型和云南型δβ-地贫3种突变类型的标本分别进行检测，发现不加入甜菜碱扩增往往失败，终浓度在1.0M时扩增效果最好。

PCR反应体系如下：基因组DNA(20～40ng/μl)2μl、SEA For 0.75μl、SEA Rev 0.75μl、Yun For 0.5μl、Yun Rev 0.5μl、Chi For 0.75μl、Chi Rev 0.75μl、Nor For0.5μl、NorRev 0.5μl、甜菜碱(5M)依据实验设计而定、dNTP(10mM)2μl、10×PCR反应缓冲液2.5μl、TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.5μl、水补足至25μl。

2、PCR扩增条件的优化

PCR反应体系如下：基因组DNA(20～40ng/μl)2μl、SEA For 0.75μl、SEA Rev 0.75μl、Yun For 0.5μl、Yun Rev 0.5μl、Chi For 0.75μl、Chi Rev 0.75μl、Nor For0.5μl、NorRev 0.5μl、甜菜碱(5M)5μl、dNTP(10mM)2μl、10×PCR反应缓冲液2.5μl、Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl、水补足至25μl。

用温度梯度PCR获得4重PCR扩增的最佳退火温度为56℃，采用如表3所示的扩增条件进行PCR扩增。

表3

采用此扩增条件可以获得满意的扩增效果，但是整个PCR循环时间太长，所以我们对此进行了优化，将35个循环中退火的时间分为两阶段(退火90秒和45秒)，分别按照退火90秒30个循环+退火45秒5个循环、退火90秒20个循环+退火45秒15个循环、退火90秒10个循环+退火45秒25个循环，退火90秒5个循环+退火45秒30个循环几种组合进行实验，最后采用退火90秒10个循环+退火45秒25个循环这种组合可以保证良好的扩增效果，同时又可以减少PCR反应时间，优化后的PCR反应条件如表4所示：

表4

(三)标本检测

对50例外周血标本提取到的基因组DNA进行检测，其中30例标本为地贫阴性或其它类型的地贫阳性标本，20例已经确定为东南亚型HPFH、中国型和云南型δβ-地贫(东南亚型HPFH有11例、中国型δβ-地贫7例、云南型δβ-地贫2例)。

1、PCR反应液配制

按照检测的样本数配制PCR反应液，每批标本同时需做空白对照、阴性对照。

预配的每个PCR反应体系如下：SEA For 0.75μl、SEA Rev 0.75μl、Yun For 0.5μl、Yun Rev 0.5μl、Chi For 0.75μl、Chi Rev 0.75μl、Nor For 0.5μl、Nor Rev 0.5μl、甜菜碱(5M)5μl、dNTP(10mM)2μl、10×PCR反应缓冲液2.5μl、Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl、水8μl，共计23μl。充分混匀后，分装于PCR反应管中。

2、PCR扩增

将上述分装的PCR反应液的PCR反应管做好标记，分别加入标本和对照DNA各2μl，混匀后，2000rpm离心10～15秒。然后置PCR仪上进行扩增，扩增条件如表4所示。

3.琼脂糖电泳检测

采用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，取3μl PCR扩增产物，加入0.5～1.0μl上样缓冲液(6×Loading buffer)，混均后上样，在5V/cm电压下电泳60分钟。

电泳结束后，利用凝胶成像系统观察结果并拍照，50例标本的检测结果与已知结果完全一致。将有代表性的标本再次进行电泳，结果如图1：泳道1为空白对照；泳道2为中国型δβ-地贫杂合突变；泳道3为东南亚型HPFH杂合突变；泳道4为云南型δβ-地贫杂合突变；泳道5为正常对照。

从上述实施实例看，本发明能准确地检测出东南亚型HPFH、中国型和云南型δβ-地贫3种中国人常见的HPFH和δβ-地贫常见缺失类型。检测在单管一次反应中完成，3种缺失共用一个正常对照，简化了PCR反应体系，从而具有较好的稳定性和准确性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省妇幼保健院

<120> 一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒及方法

<130> 1

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEA For

<400> 1

tgcagcagtt gccaacacaa g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEA Rev

<400> 2

tttcaaaagc ctcatggtag c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Yun For

<400> 3

ggagctagag acaagaaggt a 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Yun Rev

<400> 4

gcagttctcc ctggccttg 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chi For

<400> 5

atataaaatg ctgctaatgc ttc 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chi Rev

<400> 6

cccattaaat gcaggtagtt gt 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nor For

<400> 7

ttggccaatc tactcccagg ag 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nor Rev

<400> 8

ttctcctcag gagtcagatg cac 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEA For-2

<400> 9

tggtatctgc agcagttgcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEA Rev-2

<400> 10

agcctcatgg tagcagaatc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Yun For-2

<400> 11

ttccccacac tatctcaatg c 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Yun Rev-2

<400> 12

caaggctagg gagaactgc 19

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chi For-2

<400> 13

gctggacaca tataaaatgc tgc 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chi Rev-2

<400> 14

tgcaggtagt tgttcccctt ca 22

Claims

1.一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，其特征在于包括如下引物：

SEA For：5’- TGCAGCAGTTGCCAACACAAG -3’；

SEA Rev：5’- TTTCAAAAGCCTCATGGTAGC -3’；

Yun For：5’- GGAGCTAGAGACAAGAAGGTA -3’；

Yun Rev：5’- GCAGTTCTCCCTGGCCTTG -3’；

Chi For：5’- ATATAAAATGCTGCTAATGCTTC -3’；

Chi Rev：5’- CCCATTAAATGCAGGTAGTTGT -3’；

Nor For：5’- TTGGCCAATCTACTCCCAGGAG -3’；

Nor Rev：5’- TTCTCCTCAGGAGTCAGATGCAC -3’。

2.根据权利要求1所述检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：还包括用于PCR的酶、用于PCR的缓冲液、dNTP、甜菜碱和用于PCR的水中的一种或至少两种。

3.根据权利要求1所述检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含所述的引物的预混液，预混液的组成如下：SEA For、SEA Rev、Yun For、YunRev、Chi For、Chi Rev、Nor For、Nor Rev、甜菜碱、 dNTP、PCR反应缓冲液、用于PCR的酶。

4.根据权利要求3所述检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：所述的预混液中各成分的浓度以最终使用时各成分的终浓度如下计算：SEA For 0.3μM、SEARev 0.3μM、Yun For 0.2μM、Yun Rev 0.2μM、Chi For 0.3μM、Chi Rev 0.3μM、Nor For 0.2μM、Nor Rev 0.2μM、甜菜碱 1M、 dNTP 0.8mM、1×PCR反应缓冲液、用于PCR的酶0.1U/μl。

5.根据权利要求1～4任一项所述检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：所述的用于PCR的酶为Taq DNA聚合酶。

6.根据权利要求1所述检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：所述的用于PCR的水为双蒸水或超纯水。