CN107893116B - 用于检测基因突变的引物对组合、试剂盒以及构建文库的方法 - Google Patents
用于检测基因突变的引物对组合、试剂盒以及构建文库的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于检测基因突变的引物对组合、试剂盒以及构建文库的方法。所述试剂盒可与二代测序仪和数据分析一体机配合使用，用于检测人类33个基因的89个热点区域的突变。所述构建文库的方法包括：将本发明的引物对组合与DNA模板结合后，用高保真DNA聚合酶以脱氧核苷酸为底物，对待检基因特定区域进行体外扩增，并对扩增产物添加特定的核苷酸序列，从而获得DNA文库。
Description
技术领域
本发明涉及核酸测序技术领域，特别涉及用于检测基因突变的引物对组合及试剂盒，以及构建二代测序DNA文库的方法。
背景技术
据世卫组织估计，2005年至2015年期间有8400万人死于癌症，超过70％的癌症死亡发生在低收入和中等收入国家。预计2030年形势将进一步恶化，估计将有1200万人死于癌症，按此趋势，发展中国家的癌症病例将增加81％，每年用于癌症的费用将达到4580亿美元。癌症是全世界首要的死因之一，在中国近年来随着环境污染，癌症发病率近年来呈逐年上升趋势，据全国肿瘤登记中心2011年监测的统计分析，当年新增癌症病例337万，相当于每分钟就有6.4人得癌，因此加强对癌症的防治迫在眉睫。
癌症的主要治疗手段还集中在以手术、化疗、放疗为主的传统治疗，以及近来的免疫疗法和靶向治疗。近年来，伴随癌症驱动基因EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA等与多种靶向药物小分子之间的关系被发现后，肿瘤治疗的新药越来越多，尤其是分子靶向药物，催生着肿瘤治疗已经步入基因时代。美国奥巴马总统提出“精准医疗”计划，中国也高度重视并相应地提出计划。
随着基因测序时代的来临，二代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)以它高通量测序以及精准快速的分析结果赢来广泛的临床应用。然而，上市产品中多以单基因检测试剂盒为主，检测基因套餐则需多种试剂盒才能完成，而针对多基因进行检测的二代高通量测序技术因其单次测序可同时分析几十至数百个基因信息，从而使得对患者肿瘤基因进行更为细致全貌的分析成为可能。单次检测可在2天内完成，提取微量DNA即可，效率高，有效节约成本，适合临床大规模应用。
此外，目前的NGS数据分析系统涉及大量的人工操作，造成时间周期长、成本高、假阳性率高。因此，有必要开发一种尽可能减少人工操作、缩短检测时间、提高检测数据一致性的全自动数据分析系统。
发明内容
为了提高突变检测的特异性及准确性，并且提高检测效率，本发明针对人类33个基因的89个热点区域(表1)的突变，设计了一套引物对组合。
表1.人类33个基因的89个热点区域
所述引物对组合如下：
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MET_19引物：SEQ ID No：155～156；
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ABL1_5引物：SEQ ID No：169～170；
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ABL1_6B引物：SEQ ID No：173～174；
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NOTCH1_26引物：SEQ ID No：177～178。
上述引物的名称含义为：前面字母是基因名称，后面的数字是外显子号，例如，NRAS_4表示NRAS基因的外显子4。
上述引物的具体序列如下(表2)：
本发明还涉及上述引物对组合在制备用于检测基因突变的试剂盒中的用途，所述试剂盒可以检测人类33个基因的89个热点区域的突变。
本发明还公开了一种用于检测基因突变的试剂盒，其包括本发明的引物对组合，具体地说，其包括：
扩增引物组分、文库制备通用试剂组分、接头和标签引物组分、文库纯化磁珠组分；其中
所述扩增引物组分是含本发明的引物对组合、dNTP的溶液；
所述文库制备通用试剂组分包含高保真DNA聚合酶、超纯水、LTE缓冲液、连接酶缓冲液、连接酶、文库扩增缓冲液；
所述接头和标签引物组分包含接头和标签引物。
使用所述试剂盒可以检测人类33个基因的89个热点区域的突变。
本发明的试剂盒中的特异性引物同DNA模板结合后，用高保真DNA聚合酶以脱氧核苷酸(dNTP)为底物，对待检基因特定区域进行体外扩增，并对扩增产物添加特定的核苷酸序列(接头和标签)，从而获得DNA文库。不同的标签用于区分不同的待测文库。获得的文库经磁珠法纯化后，可使用Illumina Nextseq二代测序仪进行序列测定，并通过测序结果的分析，最终确定各基因的突变情况。
当使用Illumina Nextseq二代测序仪进行序列测定时，试剂盒中除引物对组合外的其他组分可根据测序仪的使用说明书或本领域技术人员公知常识确定。
优选地，本发明的试剂盒的检测数据是用数据分析一体机处理的，所述数据分析一体机专为本发明的检测试剂盒进行生物信息学分析、报告出具及数据存储而设计，是将高性能计算机硬件、生物信息软件的完美集成，与测序仪建立安全数据通道，可自动对测序仪下机数据进行分析，并进行结果解读，最终以完整报告形式进行展示。
所述数据分析一体机包括软件以及硬件服务器。其中软件可以实现IlluminaNextSeq500测序仪或者Ion TorrentTMPGM测序仪下机数据的自动传输、对测序数据进行生物信息学分析、生成分析报告，结合导入的样本信息后，生成涵盖样本信息、检测结果和用药指导建议的临床分析报告。硬件服务器支持数据运算和数据存储。
所述数据分析一体机可以装配Linux系统，软件应用Python语言及R语言开发，整合GATK及Speedseq工具包，采用面向对象的开发方法开发。其中应用的成熟算法包括用于序列比对的BWT算法和用于检测突变位点的隐马模型。
所述数据分析一体机的结构分为应用程序层、服务层、基础层(图1)。应用程序层提供客户操作界面。服务层实现任务管理、权限管理、文献管理和数据管理功能。基础层分为计算系统和存储系统，其中计算系统实现生物信息分析、临床注释解读、报告出具和数据查询功能；存储系统实现测序数据的自动抓取或者人工操作的数据管理以及数据安全管理。
所述数据分析一体机的核心数据分析流程包括6大模块：
第一个为原始数据自动同步模块，实现从测序仪抓取Bam文件；
第二个为Bam至Fastq转化模块，将从测序仪抓取的Bam文件提取Fastq文件重新进行基因组比对，用于去除测序仪自带服务器产生的比对错误；
第三个为突变鉴定模块，其中进一步分为点突变检测亚模块，插入缺失检测亚模块，热点突变重点检查亚模块三个不同的亚模块进行平行处理，并汇总后给出突变报告；
第四个为模型判定模块，该模块基于机器学习原理对鉴定出来的突变进行决策分类，根据产生的可信度评分，过滤前期分子实验带来的假阳性，例如FFPE样本常见假阳性和测序过程中产生的假阳性；
第五个为临床解读模块，从定期更新的临床知识库中提取突变对应的临床信息；
第六个为报告模块。
所述数据分析一体机可以实现的临床功能如下：
软件可在无人为干预的情况下，自动对测序仪的下机数据进行同步，并自动启动分析、生成初步分析报告，人为导入样本信息后即可生成涵盖样本信息、检测结果、用药指导的完整报告。
作为对自动分析的补充，当只想对某几个样本或者某一个样本进行分析时，可采用手动分析。
按照时间段，可对项目信息、样本信息、突变结果信息进行筛选统计。
对临床功能模块进行描述的用户界面关系图见图2。
所述数据分析一体机的硬件拓扑图见图3。其中测序仪服务器通过网络连接软件服务器，通用计算机在任一浏览器上通过IP地址、账号及密码链接软件服务器，即可访问应用程序界面，可部署在局域网内访问也可允许整个互联网进行访问。
本发明还公开了一种构建二代测序DNA文库的方法，该方法包括：将本发明要求保护的引物对组合与DNA模板结合后，用高保真DNA聚合酶以脱氧核苷酸为底物，对待检基因特定区域进行体外扩增，并对扩增产物添加特定的核苷酸序列(接头和标签)，从而获得DNA文库。
在一个优选的实施方案中，所述文库是通过连接反应增加接头制备的，文库的制备方法包括：
(I)待检基因靶向扩增；
(II)接头连接；
(III)文库纯化；
(IV)文库扩增；
(V)文库纯化。
在另一个优选的实施方案中，上述文库是通过PCR增加接头制备的，所述文库的制备方法包括：
(I)待检基因靶向扩增；
(II)文库扩增；
(III)文库纯化。
上述方法的具体步骤见本文的具体实施方案部分。
本发明采用NGS技术进行检测，具有很高的特异性及准确性，且方法简便高效、成本较低。
附图说明
图1显示本发明的数据分析一体机的结构图。
图2显示本发明的数据分析一体机的用户界面关系图。
图3显示本发明的数据分析一体机的硬件拓扑图。
图4显示本发明的数据分析一体机的检测流程图。
图5显示比对到人基因组和目标区域的序列比例。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述实施例仅是例示性。
一.试剂盒组成
本发明实施例示出一种检测试剂盒，所述试剂盒包括扩增引物组分、文库制备通用试剂组分、接头和标签引物组分、文库纯化磁珠组分，分别如以下表格所示：
表3.扩增引物组分
| 名称 | 储存条件 |
| 突变扩增引物 | -25℃～-10℃ |
注：扩增引物是含本发明的引物对组合、dNTP的溶液。当需要通过PCR反应增加接头序列时，可将引物的3’端设计为基因特异性序列，同时在5’端增加接头序列。
表4.文库制备通用试剂组分
表5.接头和标签引物组分
| 名称 | 储存条件 |
| 接头 | -25℃～-10℃ |
| 标签引物 | -25℃～-10℃ |
注：接头是含有特定序列的双链DNA。不同孔/管中所含的标签引物各不相同，在文库扩增时给不同样本增加标签。
表6.文库纯化磁珠组分
| 名称 | 成分 | 储存条件 |
| 文库纯化磁珠 | 磁珠 | 2℃～8℃ |
表7.需要另外准备的试剂：
二.样品要求
(一)新鲜组织、石蜡包埋样本
1.组织处理：使用中性缓冲福尔马林固定，避免使用酸性或含重金属离子的固定液。活检组织标本一般固定6～12小时，手术切除标本一般固定6～48小时。需确定新鲜组织、石蜡包埋组织样本中含有癌组织细胞，并且不少于整个样本的25％。
2.DNA提取及定量：可以使用常规的核酸提取分析仪及配套提取试剂，推荐使用Autostation N16核酸提纯分析仪及配套提取试剂(北京雅康博生物科技有限公司生产)，按照使用说明书进行新鲜组织、石蜡包埋组织样本DNA提取。提取DNA后，推荐使用DNA定量及质量(DQI)检测试剂盒(荧光PCR法)(北京雅康博生物科技有限公司生产)检测DNA浓度和质量。将新鲜组织或石蜡包埋样本DNA稀释至2ng/μl。
3.样本保存：石蜡包埋组织样本在室温下保存时限不超过3年。组织DNA样品在-20℃冷冻条件下保存时限不超过6个月。
(二)血浆样本
1.全血采集：使用如下两种方法之一采集5～10ml全血：(1)使用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的专用常温采血管采集全血后轻摇混匀，常温(6～30℃)放置不超过5～7天。(2)使用常规EDTA抗凝采血管(不可使用肝素抗凝采血管)采集全血后，2h内分离血浆。
2.分离血浆：将全血采血管2000g离心10分钟，推荐4℃(常温也可)；将上清小心取出(避免吸到中间絮状白细胞层)，进行第二次离心，15000g离心10分钟，4℃；分离上清得到不含细胞成分的血浆样本，放置于-70℃冻存直至DNA提取，或直接进行DNA提取。
3.DNA提取：可以使用常规的核酸提取试剂，推荐使用Circulating DNA Kit(北京雅康博生物科技有限公司生产)，按照使用说明书，提取2ml血浆中游离DNA。提取DNA之后应立即检测。根据验证数据，从2ml血浆中提取的游离DNA可直接按原浓度检测。
4.样本保存：血浆游离DNA样品在-20℃冷冻条件下保存时限不超过3个月。
三.检测方法之第一种方法：通过连接反应增加接头
I.待检基因靶向扩增
1.提取临床样本DNA，按上述要求稀释至待检浓度。
2.取突变扩增引物至冰上融化后短暂离心。
3.取1.5mL离心管(由使用者自备，低DNA吸附性，无DNase、RNase，推荐使用Eppendorf公司生产，货号：30108051)。根据待检DNA样品的数量，按照每个人份突变扩增引物和高保真DNA聚合酶的体积比为9.85∶0.15的比例，取突变扩增引物与高保真DNA聚合酶混合均匀，置于冰上备用，不要使用漩涡振荡仪。
注意：扩增试剂混合后应立即使用。
4.将与酶混合后的扩增试剂按照10μl/孔分别分装至8联管中(由使用者自备，低DNA吸附性，无DNase、RNase)，将待检DNA样本按照5μl/孔加入扩增试剂中。盖紧管盖后，短暂离心，使试剂保持在管底，并立即进行PCR上机操作。
5.PCR操作程序(表8)：
在DNA浓度低于要求时，可适当增加循环数1～2轮。
6.PCR反应结束后，将8联管取出，颠倒混匀5次，短暂离心后，置于冰上备用。
II.接头连接
1.取接头、连接酶缓冲液、超纯水至室温融化后立即短暂离心，置于冰上备用。
注意：需确认连接酶缓冲液中无沉淀后，方可置于冰上。
2.直接向步骤I-6中获得的靶向扩增产物中依次加入2μl接头、3μl连接酶缓冲液、8μl超纯水，轻轻吹打混匀，置于冰上。
3.取试剂盒中的连接酶，按照2μl/孔，依次加入各孔中，轻轻吹打混匀(注意：不要使用涡旋振荡仪)。盖好管盖后，短暂离心，使试剂保持在管底，并立即进行后续操作。
4.连接反应程序(表9)：
5.连接反应结束后，将8联管取出，颠倒混匀5次，短暂离心后，置于冰上备用。
III.文库纯化
1.取文库纯化磁珠，置于室温条件下放置至少30分钟。使用涡旋振荡仪最大速度涡旋1分钟，备用。
2.小心地打开步骤II-5中装有各待测样本连接产物的8联管管盖，按照45μl/孔向其中加入磁珠，充分吹打混匀(约10次)，短暂离心后，于室温条件下静置5分钟。
3.将静置后的8联管转移至磁力架上(动作应缓慢，避免扰动磁珠)，静置2分钟或直至溶液澄清。
4.打开管盖，小心地吸取70μl上清液并弃去，移取过程中应尽量避免扰动磁珠。
5.向各孔中依次加入150μl新鲜配制的70％乙醇(分子生物学级，由使用者自备，现用现配)，盖紧管盖；将8联管在磁力架的磁力条两侧之间转换8次以清洗磁珠(注意：每转换一次需至少停留2～3秒，并确保磁珠已完全移动至另一侧)。静置2分钟或直至溶液澄清后，尽可能多地吸取上清液并弃去，但应注意，不要触碰磁珠。
6.重复步骤III-5，以便充分清洗磁珠。
7.盖紧管盖，短暂离心后将8联管置于磁力架上静置30秒。
8.打开管盖，小心地移除剩余的乙醇(移除量约2～5μl/管)；并使8联管保持开盖状态，在空气中干燥5分钟(注意：此步骤应避免磁珠过度干燥)。
9.将8联管从磁力架上取下，向各孔中加入50μl文库扩增缓冲液，吹打混匀(约15次)后盖好管盖，并在室温条件下静置1分钟。
10.短暂离心后，放置于磁力架上静置2分钟。
11.吸取47.5μl上清液至新的8联管中，盖好管盖。
IV.文库扩增
1.向步骤III-11得到的上清液中依次加入0.5μl高保真DNA聚合酶、2μl标签引物，盖紧管盖后，短暂离心，使试剂保持在管底，并立即进行PCR上机操作。
2.PCR操作程序(表10)：
3.PCR反应结束后，将8联管取出，颠倒混匀5次，短暂离心后，置于冰上备用。
V.文库纯化
1.取文库纯化磁珠，置于室温条件下放置至少30分钟。使用涡旋振荡仪最大速度涡旋1分钟，备用。
2.小心地打开步骤IV-3中装有各待测文库扩增产物的8联管管盖，按照25μl/孔向其中加入磁珠，充分吹打混匀(约10次)，短暂离心后，于室温条件下静置5分钟。
3.将静置后的8联管转移至磁力架上(动作应缓慢，避免扰动磁珠)，静置2分钟或直至溶液澄清。
4.将步骤V-3中的所有上清液转移至新的8联管中，再向其中加入60μl/孔的磁珠，充分吹打混匀(约10次)，短暂离心后，于室温条件下静置5分钟。
5.将静置后的8联管转移至磁力架上(动作应缓慢，避免扰动磁珠)，静置2分钟或直至溶液澄清。
6.打开管盖，小心地吸取上清液并弃去，移取过程中应尽量避免扰动磁珠。
7.向各孔中依次加入150μl新鲜配制的70％乙醇(分子生物学级，由使用者自备，现用现配)，盖紧管盖；将8联管在磁力架的磁力条两侧之间转换8次以清洗磁珠(注意：每转换一次需至少停留2～3秒，并确保磁珠已完全移动至另一侧)。静置2分钟或直至溶液澄清后，尽可能多地吸取上清液并弃去，但应注意，不要触碰磁珠。
8.重复步骤V-7，以便充分清洗磁珠。
9.盖紧管盖，短暂离心后将8联管置于磁力架上静置30秒。
10.打开管盖，小心地移除剩余的乙醇(移除量约2～5μl/管)；并使8联管保持开盖状态，在空气中干燥5分钟(注意：此步骤应避免磁珠过度干燥)。
11.将8联管从磁力架上取下，按照50μl/孔，向各孔中加入LTE溶液，吹打混匀(约15次)后盖好管盖，并在室温条件下静置1分钟。
12.短暂离心后，放置于磁力架上静置2分钟。
13.吸取48μl上清液至新的8联管中，盖好管盖，置于冰上备用或保存于-20℃。
14.推荐使用文库定量检测试剂盒(荧光PCR法)(北京雅康博生物科技有限公司生产)对纯化后的文库进行定量。
VI.基因分析仪测序
1.将每例文库分别稀释至10nM，并对需要同批测试的所有文库进行混合。
2.使用Illumina公司的测序仪，按其说明书内容进行测序。
VII.检测结果的解释
依据软件进行待检样本突变情况的判定。
四.检测方法之第二种方法：通过PCR增加接头
I.待检基因靶向扩增
1.提取临床样本DNA，按上述要求稀释至待检浓度。
2.取突变扩增引物至冰上融化后短暂离心。
3.取1.5mL离心管(由使用者自备，低DNA吸附性，无DNase、RNase，推荐使用Eppendorf公司生产，货号：30108051)。根据待检DNA样品的数量，按照每个人份突变扩增引物和高保真DNA聚合酶的体积比为9.85∶0.15的比例，取突变扩增引物与高保真DNA聚合酶混合均匀，置于冰上备用，不要使用漩涡振荡仪。
注意：扩增试剂混合后应立即使用。
4.将与酶混合后的扩增试剂按照10μl/孔分别分装至8联管中(由使用者自备，低DNA吸附性，无DNase、RNase)，将待检DNA样本按照5μl/孔加入扩增试剂中。盖紧管盖后，短暂离心，使试剂保持在管底，并立即进行PCR上机操作。
5.PCR操作程序(表11)：
在DNA浓度低于要求时，可适当增加循环数1～2轮。
6.PCR反应结束后，将8联管取出，颠倒混匀5次，短暂离心后，置于冰上备用。
II.文库扩增
1.向各孔中依次加入32.5μl文库扩增缓冲液、0.5μl高保真DNA聚合酶、2μl标签引物，盖紧管盖后，短暂离心，使试剂保持在管底，并立即进行PCR上机操作。
2.PCR操作程序(表12)：
3.PCR反应结束后，将8联管取出，颠倒混匀5次，短暂离心后，置于冰上备用。
III.文库纯化
1.取文库纯化磁珠，置于室温条件下放置至少30min。使用涡旋振荡仪最大速度涡旋1分钟，备用。
2.小心地打开步骤II-3中装有各待测文库扩增产物的8联管管盖，按照25μl/孔向其中加入磁珠，充分吹打混匀(约10次)，短暂离心后，于室温条件下静置5分钟。
3.将静置后的8联管转移至磁力架上(动作应缓慢，避免扰动磁珠)，静置2分钟或直至溶液澄清。
4.将步骤III-3中的所有上清液转移至新的8联管中，再向其中加入60μl/孔的磁珠，充分吹打混匀(约10次)，短暂离心后，于室温条件下静置5分钟。
5.将静置后的8联管转移至磁力架上(动作应缓慢，避免扰动磁珠)，静置2分钟或直至溶液澄清。
6.打开管盖，小心地吸取上清液并弃去，移取过程中应尽量避免扰动磁珠。
7.向各孔中依次加入150μl新鲜配制的70％乙醇(分子生物学级，由使用者自备，现用现配)，盖紧管盖；将8联管在磁力架的磁力条两侧之间转换8次以清洗磁珠(注意：每转换一次需至少停留2～3秒，并确保磁珠已完全移动至另一侧)。静置2分钟或直至溶液澄清后，尽可能多地吸取上清液并弃去，但应注意，不要触碰磁珠。
8.重复步骤III-7，以便充分清洗磁珠。
9.盖紧管盖，短暂离心后将8联管置于磁力架上静置30秒。
10.打开管盖，小心地移除剩余的乙醇(移除量约2～5μl/管)；并使8联管保持开盖状态，在空气中干燥5分钟(注意：此步骤应避免磁珠过度干燥)。
11.将8联管从磁力架上取下，按照50μl/孔，向各孔中加入LTE溶液，吹打混匀(约15次)后盖好管盖，并在室温条件下静置1分钟。
12.短暂离心后，放置于磁力架上静置2分钟。
13.吸取48μl上清液至新的8联管中，盖好管盖，置于冰上备用或保存于-20℃。
14.推荐使用文库定量检测试剂盒(荧光PCR法)(北京雅康博生物科技有限公司生产)对纯化后的文库进行定量。
IV.基因分析仪测序
1.将每例文库分别稀释至10nM，并对需要同批测试的所有文库进行混合。
2.使用Illumina公司的测序仪，按其说明书内容进行测序。
V.检测结果的解释
依据软件进行待检样本突变情况的判定。
五.用数据分析一体机进行数据处理
软件运行所需的硬件配置如下：
处理器：2颗E5-2630v3(2.4GHz/8c)/8GT/20ML3
内存：64G DDR4内存
硬盘：2x2T 热插拔SATA硬盘+600GSSD硬盘
网络控制器：集成双口千兆网口，支持网络冗余、网络唤醒、负载均衡等高级网络特性DVD光驱：配置Slim DVDRW光驱
电源：双电源
软件环境：linux系统
网络条件：局域网或者互联网
实施例
1.本发明的检测系统在检测突变中的一个绝对优势是减少假阳性。NGS在同聚物区中具有高的假阳性率是众所周知的。本发明的NGS数据分析工具通过与临界值(cut-offlevel)(即1％的突变频率)比较，去除了大多数的假阳性突变，从而获得精确的体细胞突变结果。
选择54例已知突变结果的FFPE样本进行测序，其中包含99种热点突变位点，分别采用本发明的检测系统(表13)和另一家公司的检测系统(表14)进行数据分析，将分析结果与标准答案(真实数据)进行比对，结果如下：
表13
| 临床灵敏度 | 100.0％ |
| 阳性预测值 | 100.0％ |
| 假阳性 | 0 |
| 假阴性 | 0 |
表14
| 临床灵敏度 | 89.9％ |
| 阳性预测值 | 99.8％ |
| 假阳性 | 1 |
| 假阴性 | 11 |
本发明的数据分析结果，经比对，与标准答案一致率为100％。
2.本发明的检测系统能检测多个位点，可以实现高通量检测。
表15总结了利用直接扩增和连接扩增子样品文库制备，然后进行二代测序和使用本发明的NGS数据分析工具进行数据分析的实验。表15也提供了实验中使用的20例肠癌FFPE临床样品经检测后，输出的突变位点。
表15.肠癌样本突变结果
3.采用本发明的数据分析手段，从DNA到临床解读报告可以实现全流程优化，并实现本地化。除测序仪测序时间外，从DNA到有临床解读报告仅需4.5小时，纳入测序时间，是12-36小时。
与本发明相对照的是，ThermoFisher公司的Oncomine Dx检测(美国FDA批准的体外诊断产品)全流程需要4天(见ThermoFisher公司的如下网页：
https：//www.thermofisher.com/us/en/home/clinical/diagnostic-testing/condition-disease-diagnostics/oncology-diagnostics/oncomine-dx-target-test/oncomine-dx-target-test-us-only.html)。
另一种可与本发明相对照的产品是Illumina Extended Ras Panel(美国FDA批准的体外诊断产品)，其建库流程为8-22小时(见Praxis Extended RAS Panel的说明书)。
4.本发明的引物设计使得突变检测具有高特异性。
图5分别显示了比对到人基因组的序列比例(mapped reads)和比对到目标区域的序列比例，比对到人基因组序列的比例为100％，比对到目标序列的比例大于99％。
与本发明相对照的是，ThermoFisher公司的Oncomine检测的目标序列比对比例在95％-98.4之间(见如下参考文献：
http：//molecularmd.com/wp-content/uploads/2017/03/OCRP_simultaneous-detection-of-clinically-relevant-hotspot-mutations-CNVs-and-gene-fusions-in-solid-tumors_AACR2015.pdf)。
因此，本发明提供了快速、准确、一键式的测序数据分析手段，具有很高的特异性及准确性，且方法简便高效、成本较低。
采用本发明的一体机处理测序数据，可以在无人工干预情况下，自动传输生成报告，大量节省时间及人工操作，有利于实现流程标准化、质量控制标准化。
Claims (7)
1.一种用于检测基因突变的引物对组合，其包括：
NRAS_4引物：SEQ ID No：1～2；
NRAS_3引物：SEQ ID No：3～4；
NRAS_2引物：SEQ ID No：5～6；
DDR2_18引物：SEQ ID No：7～8；
RET_10引物：SEQ ID No：9～10；
RET_11引物：SEQ ID No：11～12；
RET_13引物：SEQ ID No：13～14；
RET_15引物：SEQ ID No：15～16；
RET_16引物：SEQ ID No：17～18；
PTEN_1引物：SEQ ID No：19～20；
PTEN_5引物：SEQ ID No：21～22；
PTEN_6引物：SEQ ID No：23～24；
PTEN_7引物：SEQ ID No：25～26；
FGFR2_12引物：SEQ ID No：27～28；
FGFR2_9引物：SEQ ID No：29～30；
FGFR2_7引物：SEQ ID No：31～32；
HRAS_4引物：SEQ ID No：33～34；
HRAS_3引物：SEQ ID No：35～36；
HRAS_2引物：SEQ ID No：37～38；
KRAS_4引物：SEQ ID No：39～40；
KRAS_3引物：SEQ ID No：41～42；
KRAS_2引物：SEQ ID No：43～44；
AKT1_4引物：SEQ ID No：45～46；
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ERBB4_7引物：SEQ ID No：101～102；
GNAS_8引物：SEQ ID No：103～104；
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CTNNB1_3引物：SEQ ID No：107～108；
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KIT_17引物：SEQ ID No：135～136；
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FBXW7_9引物：SEQ ID No：139～140；
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MET_14A引物：SFQ ID No：149～150；
MET_14B引物：SEQ ID No：151～152；
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ABL1_4引物：SEQ ID No：167～168；
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ABL1_6A引物：SEQ ID No：171～172；
ABL1_6B引物：SEQ ID No：173～174；
NOTCH1_27引物：SEQ ID No：175～176；和
NOTCH1_26引物：SEQ ID No：177～178。
2.一种用于检测基因突变的试剂盒，其包括：
扩增引物组分、文库制备通用试剂组分、接头和标签引物组分、文库纯化磁珠组分；其中
所述扩增引物组分是含权利要求1所述引物对组合、dNTP的溶液；
所述文库制备通用试剂组分包含高保真DNA聚合酶、超纯水、LTE缓冲液、连接酶缓冲液、连接酶、文库扩增缓冲液；
所述接头和标签引物组分包含接头和标签引物。
3.一种构建二代测序DNA文库的方法，该方法包括：将权利要求1中的引物对组合与DNA模板结合后，用高保真DNA聚合酶以脱氧核苷酸为底物，对待检基因特定区域进行体外扩增，并对扩增产物添加特定的核苷酸序列，从而获得DNA文库。
4.权利要求3的方法，其中所述文库是通过连接反应增加接头制备的。
5.权利要求4的方法，其中所述文库的制备方法包括：
(I)待检基因靶向扩增；
(II)接头连接；
(III)文库纯化；
(IV)文库扩增；
(V)文库纯化。
6.权利要求3的方法，其中所述文库是通过PCR增加接头制备的。
7.权利要求6的方法，其中所述文库的制备方法包括：
(I)待检基因靶向扩增；
(II)文库扩增；
(III)文库纯化。
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