JP6980907B2 - 無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布を生成する方法、及びそれを利用して無細胞核酸から変異を検出する方法 - Google Patents

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Description

本発明は、無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布を生成する方法及びその装置、前記方法による背景対立因子の頻度分布マトリックス、及びそれを利用して無細胞核酸から変異を検出する方法及びその装置に関する。
遺伝体（genome）とは、一生物が有する全ての遺伝情報を言う。ある一個人の遺伝体のシーケンシング（sequencing）または配列分析のために、ＤＮＡチップ及び次世代配列分析（ＮＧＳ：next generation sequencing）、次々世代配列分析（ＮＮＧＳ：next next generation sequencing）のような多くの技術が開発されている。該ＮＧＳは、研究及び診断の目的に広く活用されている。該ＮＧＳは、装備の種類によって異なるが、大きく見れば、試料の採取、ライブラリーの製造、及び核酸配列分析の遂行の総３段階に区分することができる。該核酸配列分析後には、生産された配列分析データに基づいて、遺伝子変異いかんを検出する。
現在のＮＧＳは、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction；ＰＣＲ）時、重合酵素によって発生するエラー、核酸配列分析過程中、蛍光感知過程で発生するエラーなどにより、配列分析エラー率が０．１ないし１％に達するが、そのようなエラーは、配列分析エラー率以下の頻度に存在するまれな変異感知を阻害するという問題点がある。そのような問題点を克服するためには、配列分析時、変異分析が必要な試料の数を増やすか、あるいは何回か配列分析を進めなければならない。しかし、そのような方法は、配列分析コストが非常にかかり、多量の試料が要求される。
一方、ライブラリーを制作する方法において、アダプダー配列及び／またはバーコード配列を改良し、リードの数を顕著に高めることにより、まれな変異を検出する方法が知られている（大韓民国公開番号１０−２０１６−０１４１６８０Ａ）。しかし、ライブラリー制作段階及び配列分析段階以外の段階で発生しうるエラーを低減させることができる方法については、知られたところが不十分である。
従って、コスト消耗を最小化させながら、まれな変異を正確に検出することができる方法が要求される。
一様相は、無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布を生成する方法を提供する。
他の様相は、無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布を生成する装置を提供する。
他の様相は、無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布マトリックスを提供する。
他の様相は、無細胞核酸から変異を検出する方法を提供する。
他の様相は、無細胞核酸から変異を検出する装置を提供する。
無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布を生成する方法及びその装置、前記方法による背景対立因子の頻度分布マトリックス、及びそれを利用して無細胞核酸から変異を検出する方法及びその装置によれば、正常人において、血液、細胞または無細胞核酸から、配列分析データを得る過程を省略することができ、時間及びコストが節約されるという利点がある。また、前記背景対立因子の頻度分布を利用し、無細胞核酸から変異を検出する場合、極少量存在する変異の検出において、検出結果に対する信頼度及び正確度が向上する。
ＰＢＬ ＤＮＡ試料及び血漿ＤＮＡ試料において、背景対立因子の塩基、及び全体対立因子の塩基それぞれのフレッド（Phred）塩基品質点数（quality score）に係わる分布を示す。 品質点数３０未満の塩基を除去した後、ＰＢＬ ＤＮＡ試料において、参照対立因子の塩基、及び背景対立因子の塩基それぞれに係わる塩基品質点数分布を示す。 品質点数３０未満の塩基を除去した後、血漿ＤＮＡ試料において、参照対立因子の塩基、及び背景対立因子の塩基それぞれに係わる塩基品質点数分布を示す図面である。 １９個の血漿ＤＮＡ試料、及び１９個のＰＢＬ ＤＮＡ試料において、背景対立因子の頻度、すなわち、試料別平均背景対立因子エラーの比率を示す。バーは、標準偏差を示す。 血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料において、背景対立因子エラーがない位置（error-free position）の比率を示す。バーは、標準偏差を示す。 血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料において、１２種の塩基置換に対し、背景対立因子が発生する頻度分布を示す。ｙ軸は、前処理されたＰＢＬ ＤＮＡ試料及び血漿ＤＮＡ試料において、各塩基置換に係わる背景対立因子の頻度を示す。 血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料において、１２種の塩基置換について、背景対立因子エラーの比率を示す。 血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料において、１２種の塩基置換について、背景対立因子エラーの比率を示す。 多様な断片化条件において、ゲノムＤＮＡを断片化させ、前記断片化されたゲノムＤＮＡを投入（input）ＤＮＡとして利用して生成された配列分析データから、背景対立因子エラーの比率を示す。 図３Ａに使用された断片化条件の細部条件、及びそれによって生成された断片の大きさを示す。 被検個体である患者の末梢血液白血球から得られた配列分析データを利用し、生殖細胞変異を除去し、背景対立因子エラーの比率分布マトリックスを生成した後、血漿内無細胞核酸から変異を検出する方法を示したフローチャートである。
一様相は、無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布を生成する方法を提供する。
前記方法は、無細胞核酸から、染色体内１以上の位置に係わる第１配列分析データを得る段階と、細胞から分離された核酸から、前記染色体内１以上の位置に係わる第２配列分析データを得る段階と、第２配列分析データに基づいて、前記染色体内１以上の位置に係わる背景対立因子の頻度分布を生成する段階と、前記背景対立因子の頻度分布を、第１配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布として予測する段階と、を含むものでもある。
前記方法は、無細胞核酸から、染色体内１以上の位置に係わる第１配列分析データを得る段階と、細胞から分離された核酸から、前記染色体内１以上の位置に係わる第２配列分析データを得る段階と、を含むものでもある。前記方法は、細胞から分離された核酸、及び無細胞核酸から、染色体内１以上の位置に係わる配列分析データを得る段階を含むものでもある。前記第１配列分析データを得る段階、及び第２配列分析データを得る段階は、同時にまたは順次に遂行されるものでもある。
前述の「シーケンシング（sequencing）または配列分析」は、次世代配列分析（ＮＧＳ：next generation sequencing）でもある。前記次世代配列分析は、大規模並列配列分析（massive parallel sequencing）または２世代配列分析（second-generation sequencing）と相互交換的に使用されるものでもある。前記ＮＧＳは、大量の断片の核酸を同時多発的に配列分析する技法であり、チップ（chip）基盤であり、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）基盤の対末端（paired end）形式で、全長遺伝体を切り、前記切片とに対して、混成化反応（hybridization）に基づいて、超高速で配列分析を行うものでもある。前記ＮＧＳは、ＮＧＳ基盤の標的配列分析（targeted sequencing）、標的ディープ配列分析（targeted deep sequencing）またはパネル配列分析（panel sequencing）を含むものでもある。前記ＮＧＳは、例えば、４５４プラットホーム（Roche）、ＧＳ ＦＬＸチタン、Illumina ＭｉＳｅｑ、Illumina ＨｉＳｅｑ、Illumina ＨｉＳｅｑ ２５００、Illumina Genome Analyzer、Solexa platform、ＳＯＬｉＤ System（Applied Biosystems）、Ion Proton（Life Technologies）、Complete Genomics、Helicos Biosciences Heliscope、Pacific Biosciencesの単一分子実時間（ＳＭＲＴＴＭ）技術、またはそれらの組み合わせによっても遂行される。
前記配列分析データは、前記シーケンシングまたは配列分析によって得られたデータを意味し、配列分析対象になる染色体内１以上の位置、または全ての位置に係わる、対立因子及びその頻度を含むものでもある。第１配列分析データは、無細胞核酸において、染色体内１以上の位置について得られた配列分析データを意味し、第２配列分析データは、細胞から分離された核酸において、染色体内１以上の位置について得られた配列分析データを意味する。前記配列分析データは、例えば、ＢＡＭ（binary version of ＳＡＭ）フォーマット及び／またはＳＡＭ（Sequence Alignment/Map）フォーマットのデータから得られたものでもある。当該のＢＡＭフォーマット及び／またはＳＡＭフォーマットは、一般的に短いリード（short reads）に係わるデータを敍述するフォーマットに利用されるものでもある。ＢＡＭフォーマット及び／またはＳＡＭフォーマットのデータには、リード（read）の開始ポイント、リードの方向（direction）、マッピング（mapping）品質、整列（alignment）の次数を示すＦＬＡＧ、ＣＩＧＡＲ（compact idiosyncratic gapped alignment report）ストリングなどに係わるテキストデータが含まれる。多様な整列対を生成することにより、多様なサポーティングリード（supporting readｓ）を確保することができる。
前記核酸は、遺伝体（genome）、またはその断片でもある。用語「遺伝体（genome）」は、染色体、染色質または遺伝子の全体を意味する。前記核酸は、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）、ＲＮＡ（ribonucleic acid）、またはそれらの組み合わせでもある。
前記細胞から分離された核酸は、細胞、または細胞株から分離された核酸でもある。前記細胞から分離された核酸は、血液、血清、尿、唾液、粘膜分泌物、喀痰、大便、涙、またはそれらの組み合わせに存在する細胞から分離されたものでもある。前記細胞から分離された核酸は、血球細胞、口腔上皮細胞、毛嚢細胞、皮膚線維芽細胞、またはそれらの組み合わせから分離されたものでもある。前記血球細胞は、例えば、白血球、具体的には、末梢血液白血球（ＰＢＬ：peripheral blood leukocyte）、さらに具体的には、末梢血液単核球及び／または末梢血液リンパ球を含む末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ：peripheral blood mononuclear cell）、及び／または多形核白血球（ＰＭＬ：polymorphonuclear leukocyte）でもある。前記無細胞核酸（cell free nucleic acid）は、細胞で遊離された核酸でもある。前記無細胞核酸は、血液、血漿、血清、尿、唾液、粘膜分泌物、喀痰、大便、涙、またはそれらの組み合わせに存在するものでもある。前記無細胞核酸は、循環腫瘍核酸（ｃｔ nucleic acid：circulating tumor nucleic acid）でもある。前記無細胞核酸は、例えば、無細胞ＤＮＡ（cf ＤＮＡ：cell free ＤＮＡ）でもある。核酸を抽出または分離する方法は、当業者に公知された方法によっても遂行される。
前記染色体内１以上の位置は、遺伝子変異が存在するか否かということを検出する染色体内位置（position）を意味する。前記染色体内位置は、例えば、変異が存在すると予測される位置であり、標的配列分析において、標的領域になるものでもある。染色体内１以上の位置に係わる配列分析データを得て、染色体内位置ごとに、対立因子、対立因子の頻度、及び対立因子の頻度分布を得ることができる。前記染色体内位置は、染色体番号、例えば、ｃｈｒ８：１９，９３９，０７０−１９，９６７，２５８または１７ｐ１３．１のような形式で表記されるものでもある。
前記方法は、第２配列分析データに基づいて、前記染色体内１以上の位置に係わる背景対立因子の頻度分布を生成する段階を含むものでもある。前記方法は、細胞から分離された核酸から得られた配列分析データに基づいて、前記染色体内１以上の位置に係わる背景対立因子の頻度分布を生成する段階を含むものでもある。
前記背景対立因子（background allele）は、（１）参照遺伝体の対立因子ではないもの、（２）生殖細胞変異による対立因子ではないもの、及び／または（３）被検個体自身の遺伝子型ではないことでもある。前記背景対立因子は、背景対立因子エラーと相互交換的に使用されるものでもある。前記背景対立因子は、技術的なエラーによって誤って分析された塩基でもあり、例えば、配列分析を行うための全般的な過程で発生するエラーにより、誤って分析された塩基でもある。
前記背景対立因子頻度は、背景対立因子が検出される頻度、背景対立因子が発生する頻度、背景対立因子エラーの比率、または背景対立因子エラーが発生する比率を意味する。前記背景対立因子頻度分布は、背景対立因子が検出された頻度の最小及び最大を含む範囲を意味する。前記背景対立因子の比率は、各対立遺伝子の個数を計数することによって計算されるものでもある。
参照遺伝体データは、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）、ＧＥＯ（Gene Expression Omnibus）、ＦＤＡ（Food and Drug Administration）、My Cancer Genome、ＴＣＧＡ（The Cancer Genome Atlas）のような、当該技術分野においてすでに公知されたデータベースから獲得されるか、あるいは対照群、すなわち、正常人の生物学的サンプルから獲得されたものでもある。前記正常人は、特定疾病、例えば、腫瘍などが発見されていない健康人でもある。前記参照遺伝体は、ヒト参照遺伝体でもあり、ｈｇ１８またはｈｇ１９でもある。
前記方法は、前記背景対立因子の頻度分布を、第１配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布として予測する段階を含むものでもある。前記段階は、細胞から分離された核酸から生成された背景対立因子の頻度分布を、無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布として適用する段階を含むものでもある。図４は、被検個体である患者の末梢血液白血球から得られた配列分析データを利用し、生殖細胞変異を除去し、背景対立因子エラーの比率分布マトリックスを生成した後、血漿内無細胞核酸から変異を検出する方法を示したフローチャートである。従来、被検個体に由来する無細胞核酸から変異を検出する場合、対照群である正常人の核酸から得られた配列分析データに基づいて、染色体内１以上の位置に係わる背景対立因子の頻度分布を生成し、被検個体に由来する無細胞核酸から得られた配列分析データにおいて、任意の対立因子の頻度と、正常人の核酸から生成された背景対立因子の頻度との分布を比較し、それより大きい場合、前記対立因子は、有意味な変異であると決定し、そうではない場合、前記対立因子は、有意味な変異ではないと定めた。その場合、従来の被検個体が変異を有するか否かということを検出するために、対照群である正常人の核酸から得られた配列分析データが要求されたので、時間及びコストが追加して消耗された。しかし、生殖細胞変異を除去するために、被検個体に由来する細胞から分離された核酸から、配列分析データを得て変異を検出する過程が要求され、前記方法によれば、すでに得られた被検個体自身の細胞から分離された核酸から得られた配列分析データに基づいて、無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布を生成することができるので、コスト及び時間を節約することができるという利点がある。
前記方法は、前記第２配列分析データを得る段階前、細胞から分離された核酸を断片化する段階を含むものでもある。前記断片化（fragmentation）は、遺伝体を、物理的、化学的、熱的、光的、超音波的または酵素的に切断するものでもある。例えば、前記化学的に切断するということは、制限酵素と反応させて切断するものでもある。前記超音波的に切断するということは、超音波を加えるものでもある。前記超音波的に切断するということは、約５０Ｗないし約１６０Ｗ、約６０Ｗないし約１６０Ｗ、約７０Ｗないし約１６０Ｗ、約８０Ｗないし約１６０Ｗ、約９０Ｗないし約１６０Ｗ、または約１００Ｗないし約１５０Ｗで超音波を加えるものでもある。前記超音波的に切断するということは、約１０秒ないし約３００秒、約２０秒ないし約２５０秒、約２０秒ないし約２００秒、約３０秒ないし約１５０秒、約４０秒ないし約１００秒、または約４５秒ないし約９０秒間超音波を加えるものでもある。
前記断片化は、遺伝体に、物理的、化学的、熱的、光的、超音波的または酵素的に加えるエネルギーを減少させながら切断するものでもある。前記エネルギーが、所定臨界値以上である場合、核酸断片の塩基対形成にあたり、プリン系（purine）塩基がプリン系塩基と塩基対を形成したり、ピリミジン系（primidine）塩基がピリミジン系塩基と塩基対を形成したりしてしまう。例えば、前記断片化に加えるエネルギーが過度である場合、グアニン（Ｇ）に酸化的損傷が起こり、チミン（Ｔ）に転換され、転換されたチミン（Ｔ）は、アデノシン（Ａ）と塩基対を形成してしまう。そのような誤った塩基対が形成されることを防止するために、断片化に加えるエネルギーを低下させることにより、酸化的損傷を低減させることができる。断片化された核酸の大きさが２００ｂｐ以上になるように、物理的、化学的、熱的、光的、超音波的または酵素的に加えるエネルギーを低下させながら切断する場合、酸化的損傷を低減させ、誤った塩基対の形成を防止することができる。その結果、無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布と、細胞から分離された核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布とが類似した様相を示し、細胞から分離された核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布を、無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布として予測して適用することができる。
前記方法は、断片化された核酸の大きさを選別する段階をさらに含むものでもある。前記断片化された核酸の大きさは、２００ｂｐ以上のものでもある。前記断片化された核酸の大きさは、２００ｂｐ以上、２５０ｂｐ以上、３００ｂｐ以上、３１０ｂｐ以上、３２０ｂｐ以上、３３０ｂｐ以上、３４０ｂｐ以上、３５０ｂｐ以上、３６０ｂｐ以上、３７０ｂｐ以上、３８０ｂｐ以上、３９０ｂｐ以上、４００ｂｐ以上、４１０ｂｐ以上、４２０ｂｐ以上、４３０ｂｐ以上、４４０ｂｐ以上、４５０ｂｐ以上、４６０ｂｐ以上、４７０ｂｐ以上、４８０ｂｐ以上、４９０ｂｐ以上または５００ｂｐ以上のものでもある。無細胞核酸の大きさは、一般的に、１５０ないし２００ｂｐであるが、細胞から分離された断片化された核酸の大きさは、２００ｂｐ以上のものでもあり、例えば、無細胞核酸の大きさより大きいものでもある。
前記細胞から分離された核酸、及び無細胞核酸は、同一個体または異なる個体に由来するものでもある。前述のように、無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布は、被検個体自身、または同一種（species）に属する他個体の核酸から得られた配列分析データに基づいて生成されたものでもある。前記個体は、疾患を有している個体、腫瘍を有している個体、正常人、またはそれらの組み合わせでもある。前記個体は、ヒト、牛、馬、豚、羊、山羊、犬、猫及び齧歯 類を含んだ哺乳類でもある。
他の様相は、前記方法による無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布マトリックスを提供する。前記背景対立因子の頻度分布マトリックスは、配列分析対象になる染色体内１以上の位置、または全ての位置に係わる対立因子、対立因子の頻度、及び対立因子の頻度分布を統合的に示すものでもある。
他の様相は、無細胞核酸から変異を検出する方法を提供する。
前記方法は、無細胞核酸から、染色体内１以上の位置に係わる第１配列分析データを得る段階と、細胞から分離された核酸から、前記染色体内１以上の位置に係わる第２配列分析データを得る段階と、第２配列分析データに基づいて、前記染色体内１以上の位置に係わる背景対立因子の頻度分布を生成する段階と、前記第１配列分析データにおいて、前記染色体内１以上の位置に係わる任意の対立因子の頻度と、それと対応する位置に係わる前記背景対立因子の頻度との分布を比較し、変異を検出する段階と、を含むものでもある。
前記無細胞核酸から、染色体内１以上の位置に係わる第１配列分析データを得る段階と、細胞から分離された核酸から、前記染色体内１以上の位置に係わる第２配列分析データを得る段階と、第２配列分析データに基づいて、前記染色体内１以上の位置に係わる背景対立因子の頻度分布を生成する段階と、については、前述の通りである。
前記変異は、染色体の構造的変異（structure variation）であり、遺伝子変異を意味し、共通変異（common and/or polygenic variant）、まれな変異（rare variant）、またはそれらの組み合わせを含むものでもある。前記遺伝子変異は、疾患の危険度、または疾患の誘発性について説明する指標またはマーカーにもなる。前記まれな変異は、変異を示す対立因子の頻度が、５％以下、４．５％以下、４％以下、３．５％以下、３％以下、２．５％以下、２％以下、１．５％以下、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．２％以下、０．１％以下、０．０９％以下、０．０８％以下、０．０７％以下、０．０６％以下、０．０５％以下、０．０４％以下、０．０３％以下、０．０２％以下または０．０１％以下の変異を意味するものでもある。
前記変異は、塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸の変更（alteration）を含むものでもあり、塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸の、置換（substitution）、挿入（insertion）、重複（duplication）、欠失（deletion）（挿入及び欠失を「ＩｎＤｅｌ（insertion and deletion）」とする）などを含むものでもある。前記変異は、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ：single nucleotide variant）、単一ヌクレオチド多形成（ＳＮＰ：single nucleotide polymorphism）、またはそれらの組み合わせでもある。
前記方法は、前記第１配列分析データにおいて、前記染色体内１以上の位置に係わる任意の対立因子の頻度と、それと対応する位置に係わる前記背景対立因子の頻度との分布を比較し、変異を検出する段階を含むものでもある。
前記方法は、前記第１配列分析データにおいて、前記染色体内１以上の位置に係わる任意の対立因子の頻度が、それと対応する位置に係わる前記背景対立因子の頻度の分布より大きい場合、前記対立因子は、有意味な変異であると決定し、前記第１配列分析データにおいて、前記染色体内１以上の位置に係わる任意の対立因子の頻度が、それと対応する位置に係わる前記背景対立因子の頻度の分布より小さいか、あるいはそれと同じである場合、前記対立因子は、有意味な変異ではないと決定する段階を含むものでもある。
すなわち、前記無細胞核酸から得られた配列分析データにおいて、前記染色体内１以上の位置に係わる任意の対立因子の頻度が、細胞から分離された核酸から得られた配列分析データにおいて、それと対応する位置に係わる背景対立因子の頻度分布より大きい場合、前記対立因子は、有意味な変異であると決定し、そうではない場合、前記対立因子は、有意味な変異ではないと決定する段階を含むものでもある。前記方法によれば、無細胞核酸から得られた配列分析データにおいて、前記染色体内１以上の位置に係わる任意の対立因子の頻度が有意味な変異であるか、あるいはエラーであるかということを正確に区分することができる。
一様相による、無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布を生成する方法、及び前記無細胞核酸から変異を検出する方法は、個人誂え診断、または治療する方法、または精密治療する方法にも使用される。具体的には、本明細書は、前記方法により、背景対立因子の頻度分布を生成するか、あるいは核酸変異を検出した後、検出された変異の種類により、個人誂え診断を行うか、あるいは治療（例えば、精密治療）を行う段階をさらに含む個人誂え診断、または治療する方法、または精密治療する方法を追加して提供する。
他の様相は、無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布を生成する装置を提供する。
前記装置は、メモリとプロセッサとを含む。
前記メモリは、コンピュータ装置内で処理されるデータ、及び処理が完了した結果を保存するためのハードウェアであり、ＲＡＭ（random access memory）、ＲＯＭ（read-only memory）のようなメモリチップ、またはＨＤＤ（hard disk drive）、ＳＳＤ（solid state drive）などのストレージを含む。すなわち、該メモリは、プロセッサによって得られた第１配列分析データ、第２配列分析データ、背景対立因子の頻度分布データを保存することができる。
前記プロセッサは、無細胞核酸から、染色体内１以上の位置に係わる第１配列分析データを得るように構成された第１収得部と、細胞から分離された核酸から、前記染色体内１以上の位置に係わる第２配列分析データを得るように構成された第２収得部と、第２配列分析データに基づいて、前記染色体内１以上の位置に係わる背景対立因子の頻度分布を生成するように構成された生成部と、前記背景対立因子の頻度分布を、第１配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布として予測するように構成された予測部と、を含んでもよい。
前記プロセッサの収得部は、シーケンシングまたは配列分析装置から得られるものでもある。
また、前記プロセッサの遂行は、前述の方法のように遂行される。
前記プロセッサは、１以上のプロセッシングユニットによって具現されたモジュールであり、多数の論理ゲートのアレイを有するマイクロプロセッサと、該マイクロプロセッサによって実行されるプログラムが保存されたメモリモジュールとの組み合わせによっても具現される。該プロセッサは、応用プログラムのモジュール形態にも具現される。
他の様相は、無細胞核酸から変異を検出する装置を提供する。
前記装置は、メモリとプロセッサとを含む。
前記メモリについては、前述の通りである。
前記プロセッサは、無細胞核酸から、染色体内１以上の位置に係わる第１配列分析データを得るように構成された第１収得部と、細胞から分離された核酸から、前記染色体内１以上の位置に係わる第２配列分析データを得るように構成された第２収得部と、第２配列分析データに基づいて、前記染色体内１以上の位置に係わる背景対立因子の頻度分布を生成するように構成された生成部と、前記第１配列分析データにおいて、前記染色体内１以上の位置に係わる任意の対立因子の頻度と、それと対応する位置に係わる前記背景対立因子の頻度との分布を比較し、変異を検出するように構成された検出部と、を含むものでもある。
以下、本発明を実施例を介して、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
実施例１．無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布の生成
１．細胞から分離された核酸、及び無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布の生成及び比較
（１）血漿及び末梢血液リンパ球（ＰＢＬ：peripheral blood lymphocytes）収集及びＤＮＡ抽出
健康な正常人２人及び膵臓癌患者１７人から血液を採取した。血液試料を、無細胞ＤＮＡＴＭ ＢＣＴチューブ（Streck Ｉｎｃ．，Omaha，ＮＥ，米国）に収集した。収集された血液試料は、採取６時間以内に、２５℃で、８４０ｇで１０分間、１，０４０ｇで１０分間、続いて、５，０００ｇで１０分間、３段階で遠心分離した。末梢血液リンパ球（ＰＢＬ：peripheral blood lymphocytes）は、遠心分離１段階で得た。血漿は、遠心分離各段階ごとに新たなチューブに移した。血漿試料及びＰＢＬ試料は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ：cell free ＤＮＡ）を抽出するまで−８０℃で保管した。
生殖細胞ＤＮＡ（germline ＤＮＡ）は、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニプレップキット（Qiagen，Santa Clarita，ＣＡ，米国）を利用し、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ：peripheral blood mononuclear cell）から分離された。循環ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キットＫｉｔ（Qiagen）を利用し、１ないし５ｍｌの血漿から分離した。ＤＮＡの濃度と純度は、Qubit ２．０蛍光光度計（Life Technologies，Grand Island，ＮＹ，米国）と、Qubit ｄｓＤＮＡ ＨＳ分析キット及びＢＲ分析キット（Thermo Fisher Scientific，Waltham，ＭＡ，米国）とを利用し、PicoGreen蛍光分析法で分析した。ＤＮＡの濃度と純度は、ナノドロップ８０００ ＵＶ−Ｖｉｓ分光器（Thermo Fisher Scientific）及びPicogreen蛍光分析法を利用して定量した。断片の大きさ分布は、２２００ TapeStation Instrument（Agilent Technologies，Santa Clara，ＣＡ，米国）及びリアルタイム重合酵素連鎖反応（real-time ＰＣＲ）Ｍｘ３００５ｐ（Agilent Technologies）を利用し、製造社の指示に従って測定した。
（２）ライブラリー制作
ＰＢＬ試料中のゲノムＤＮＡは、Covaris Ｓ２２０（Covaris Ｉｎｃ．Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，米国）を、製造社の指示に従って使用し、衝撃係数（duty factor）１０％、ピーク入射電力（peak incident power）１７５Ｗ、２００回／burstの条件で、６分間超音波を加えた。血漿試料中にあるＤＮＡは、断片化されていないものを使用した。
配列分析ライブラリーを制作するために、ＰＢＬ ＤＮＡ試料は、２００ｎｇ、血漿ＤＮＡ試料は、３７．３０ｎｇを利用した。ＰＢＬ ＤＮＡ試料及び血漿ＤＮＡ試料のライブラリーは、ＫＡＰＡ Hyperプレップキット（Kapa Biosystems，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，米国）を利用して制作した。各ＤＮＡに対し、製造社の指示により、末端修繕（end-repair）、アデノシンテイリング（Ａ tailing）及びアダプダリゲーション（adapter ligation）の過程を遂行し、重合酵素連鎖反応で増幅した。このとき、各過程を終え、ＡＭPureビード（Beckman Coulter，Indiana，米国）を利用し、精製過程を遂行した。アダプダリゲーションは、あらかじめ標識化された（pre-indexed）PentAdapterＴＭ（PentaBase ＡｐＳ，Denmark）を利用し、４℃で一晩遂行した。
（３）標的領域増幅、配列分析及び配列分析データ加工
下記表１に記載された８３種の腫瘍と関連ある遺伝子のエクソンを含み、およそ〜４９９ｋｂのヒトゲノムを標的にするＲＮＡベイト（bait）プールを制作した。８種の精製されたライブラリーを集め（pooling）、最終的に７５０ｎｇに調整し、混成化選別反応（hybrid selection reaction）に使用した。標的領域は、あらかじめ標識化された（pre-indexed）アダプダに対して、ブロッキングオリゴヌクレオチドを、ＩＤＴｘＧｅｎブロッキングオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ，Santa Clara，ＣＡ，米国）で代替する変形を有するSureSelectベイト混成化プロトコルにより、標的濃縮（target enrichment）した。
該標的領域を濃縮した後、キャプチャＤＮＡ断片を、Ｐ５及びＰ７のオリゴヌクレオチドを使用し、ＰＣＲ反応を介して増幅した。増幅されたライブラリーは、ＡＭPureビードに精製し、ｄｓＤＮＡ ＨＳ分析キットとQubit ２．０蛍光光度計とを利用し、PicoGreen蛍光分析法で定量した。断片の大きさ分布は、２１００Bioanalyzer（Agilent Technologies）を利用して分析した。ＤＮＡ濃度及び平均断片サイズに基づいて、ライブラリーを２ｎＭの濃度になるように標準化させ、同一体積に合わせた。０．２ＮのＮａＯＨを利用し、ＤＮＡを変性させた後、変性されたライブラリーを混成化バッファ（Illumina，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）に希釈し、２０ｐＭになるようにした。変性されたテンプレートは、製造社（Illumina）の指示に従り、クラスタ増幅（cluster amplification）した。フローセル（flow cells）を、ＨｉＳｅｑ ２５００ ｖ３ Sequencing-by-Synthesisキット（Illumina）を利用し、１００ｂｐの対・末端モードで配列分析し、ＲＴＡソフトウェア（ｖ．１．１２．４．２以上）を使用して分析した。ＢＷＡ−ｍｅｍ（ｖ０．７．５）を使用し、全ての原データを、ｈｇ１９ヒト参照遺伝体に整列させ、ＢＡＭファイルを生成した。ＳＡＭＴＯＯＬＳ（ｖ０．１．１８）、Picard（ｖ１．９３）及びＧＡＴＫ（ｖ３．１．１）を使用し、ＳＡＭ／ＢＡＭファイルを分類し、ローカル再整列（local realignment）を行い、重複を表示した。前記加工過程を介して、重複、不一致対、及び標的から脱したリードを除去した。
Figure 0006980907
血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料で生成された総リードの平均は、それぞれ５６．３ｘ１０６及び２，０００ｘ１０６個であった。また、血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料において、リード整列の比率（alignment rate）は、それぞれ８７．３％及び９３．７％であった。配列分析データからＰＣＲ複製を除外した後、血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料において、デプスの平均は、それぞれ１，９６４ｘ（１，２１０−３，０６９ｘ）及び１，７１７ｘ（１，０４２−２，３６１ｘ）であった。
（４）配列分析データからの、標的領域内位置における背景対立因子（background allele）確認
ＰＢＬ ＤＮＡ試料と血漿ＤＮＡ試料との１セットに対し、次の条件が満足される場合、全体標的領域内位置での塩基を、背景対立因子と決定した：（１）塩基は、参照遺伝体の対立因子ではないこと、（２）１対のＰＢＬ ＤＮＡ試料及び血漿ＤＮＡ試料において、前記位置は、十分なデプスのカバレージを有すること（＞５００ｘ）、（３）ＰＢＬ ＤＮＡ試料及び血漿ＤＮＡ試料における塩基の頻度は、生殖細胞変異を示さないこと（＜５％）。癌患者の試料を使用したので、体細胞腫瘍変異に係わる対立因子候補を除去した。前記除去過程は、癌患者が治療を始める前、癌患者から血液を採取する時点と近いとき、癌患者から得られた細針吸引（ＦＮＡ：fine-needle aspiration）生検結果とマッチングする配列分析データを生成して遂行した。原発腫瘍（primary tumor）に係わる配列分析ライブラリーを制作するために、原発腫瘍投入（input）ＤＮＡは、２００ｎｇを利用し、（３）において述べたように、ＨｉＳｅｑ ２５００を使用して分析した。ＦＮＡ試料からの重複除去後、ＦＮＡ ＤＮＡ試料のデプスは、平均９８７．１５（７９０．３２−１４７６．５５ｘ）であった。ＰＢＬ ＤＮＡ試料及び血漿ＤＮＡ試料セットにおいて、ＦＮＡ ＤＮＡ試料の配列分析結果、１）当該位置でのデプスが２５０ｘ以下である場合、その位置を除き、２）対立因子が２．５％より高い頻度で存在する場合、その対立因子を除いた。
（５）背景対立因子の塩基品質点数分析
腫瘍由来単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ：single nucleotide variant）及び生殖細胞単一ヌクレオチド多形成（ＳＮＶ：single nucleotide polymorphisms）を除いた後、非参照背景対立因子のフレッド（Phred）塩基品質点数を分析して配列分析を行う間に発生する背景対立因子エラーを分析した。
図１Ａは、ＰＢＬ ＤＮＡ試料及び血漿ＤＮＡ試料において、背景対立因子の塩基、及び全体対立因子の塩基それぞれのフレッド（Phred）塩基品質点数に係わる分布を示す。図１Ｂは、品質点数３０未満の塩基を除去した後、ＰＢＬ ＤＮＡ試料において、参照対立因子の塩基、及び背景対立因子の塩基それぞれに係わる塩基品質点数分布を示す。図１Ｃは、品質点数３０未満の塩基を除去した後、血漿ＤＮＡ試料において、参照対立因子の塩基、及び背景対立因子の塩基それぞれに係わる塩基品質点数分布を示す。図１Ａないし図１Ｃに示されているように、ほとんどの背景対立因子は、２０未満塩基品質点数を示したが、少数の背景対立因子は、参照対立因子と区別することができないほどの塩基品質点数を示した。原配列分析データ（raw sequencing data）において、ＰＢＬ ＤＮＡ試料及び血漿ＤＮＡ試料セットにおいて、塩基品質点数が３０以上である塩基の比率は、それぞれ８７±３．３％及び８７±２．５％であった（平均±ＳＤ）。塩基品質点数が３０未満である塩基を除いた結果、全般的な塩基品質点数の分布は、対立対立因子と参照対立因子との間において、有意な違いを示していない。ただし、Ａ＞Ｃ及びＴ＞Ｇの転換によるＣ及びＧの塩基品質点数は、若干の違いを示した。そのような結果は、背景対立因子エラーは、配列分析を行う間に発生するエラー以外の他要因によって発生しうるということを意味する。
（６）背景対立因子エラーの様相分析
（５）で説明した通り、塩基品質点数が３０未満である塩基を除き、配列分析を行う間に発生するエラーを除いて分析した。
１９対の血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料に対し、全体標的領域にわたる背景対立因子の頻度を計算した。図２Ａは、１９個の血漿ＤＮＡ試料、及び１９個のＰＢＬ ＤＮＡ試料において、背景対立因子の頻度、すなわち、試料別平均背景対立因子エラーの比率を示す。図２Ａに示されているように、血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料において、試料別平均背景対立因子の頻度は、それぞれ０．００７％及び０．００８％であった。図２Ｂは、血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料において、背景対立因子エラーがない位置（error-free position）の比率を示す。図２Ｂに示されているように、全体標的領域にわたり、血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料において、エラーがない位置の比率は、それぞれ７７．２±１．４％及び７８．７±１．０％であった（平均±ＳＤ）。図２Ｃは、血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料において、１２種の塩基置換について、背景対立因子が発生する頻度分布を示す。ｙ軸は、前処理されたＰＢＬ ＤＮＡ試料及び血漿ＤＮＡ試料において、各塩基置換が発生する背景対立因子の頻度を示す。図２Ｄ及び図２Ｅは、血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料において、１２種の塩基置換について、背景対立因子エラーの比率を示す。図２Ｃないし図２Ｅに示されているように、血漿ＤＮＡ試料及びＰＢＬ ＤＮＡ試料において、Ｃ：Ｇ＞Ａ：Ｔヌクレオチド置換は、明確な違いを示した。特に、全てのヌクレオチド置換において、Ｃ：Ｇ＞Ａ：ＴとＣ：Ｇ＞Ｇ：Ｃとの転換エラーは、ＰＢＬ ＤＮＡ試料において、血漿ＤＮＡ試料に比べて有意に増加した。
２．細胞から分離された核酸の断片化条件の変更、及び核酸の断片化条件が背景対立因子エラーの比率に及ぼす影響の確認
ＤＮＡ断片化が、背景対立因子エラーの比率に影響を及ぼす否かということを確認するために、ＤＮＡ断片化段階において、エネルギーを加える強度（intensity）及び／または時間（duration）を多様に調節したことを除き、１で述べたように、背景対立因子エラーの比率を分析した。具体的な断片化条件は、下記表の通りである。
Figure 0006980907
図３Ａは、多様な断片化条件で、ゲノムＤＮＡを断片化させ、前記断片化されたゲノムＤＮＡを、投入（input）ＤＮＡとして利用して生成された配列分析データから、背景対立因子エラーの比率を示す。図３Ｂは、図３Ａに使用された断片化条件の細部条件、及びそれによって生成された断片の大きさを示す。図３Ａに示されているように、断片化時、相対的に低いエネルギーを加えるほど、ＰＢＬ ＤＮＡ試料において、Ｃ：Ｇ＞Ａ：Ｔ及びＣ：Ｇ＞Ｇ：Ｃの転換比率が低下し、血漿ＤＮＡ試料のＣ：Ｇ＞Ａ：Ｔ及びＣ：Ｇ＞Ｇ：Ｃの転換比率と類似したレベルに逹した。図３Ｂに示されているように、断片化時、相対的に低いエネルギーを加えるほど、投入ＤＮＡの大きさは、増大した。ただし、配列分析のために挿入されたＤＮＡの大きさは、投入ＤＮＡの大きさが増大した程度に比べ、増大した程度が小さかった。
すなわち、ＤＮＡ断片化過程は、損傷を誘発し、Ｃ：Ｇ＞Ａ：Ｔ及びＣ：Ｇ＞Ｇ：Ｃの転換を誘発しうるが、細胞から分離された核酸の断片化に消耗さえるエネルギーを低減させることにより、背景対立因子エラーが発生する比率を低下させ、細胞から分離された核酸と無細胞核酸とから、背景対立因子の頻度分布を類似して生成することができる。それを介して、正常人の核酸から得られた配列分析データを利用せずに、まれな変異を正確に検出することができると判断される。
以上、本発明について、その望ましい実施例を中心に説明した。本発明が属する技術分野において当業者であるならば、本発明の本質的な特性から外れない範囲で変形された形態に具現されるということを理解することができるであろう。従って、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点から考慮されなければならない。本発明の範囲は、前述の説明ではなく、特許請求の範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての差異は、本発明に含まれるものと解釈されなければならないのである。

Claims (11)

  1. 無細胞核酸から得られた配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布を生成する方法であって、
    無細胞核酸から、染色体内１以上の位置に係わる第１配列分析データを得る段階と、
    細胞から分離された核酸から、前記染色体内１以上の位置に係わる第２配列分析データを得る段階と、
    第２配列分析データに基づいて、前記染色体内１以上の位置に係わる背景対立因子の頻度分布を生成する段階と、
    前記背景対立因子の頻度分布を、第１配列分析データに係わる背景対立因子の頻度分布として予測する段階と、を含み、
    前記背景対立因子は、（１）参照遺伝体の対立因子ではないもの、（２）生殖細胞変異による対立因子ではないもの、または（３）被検個体自身の遺伝子型ではないものである、方法。
  2. 前記第２配列分析データを得る段階前に、細胞から分離された核酸を断片化することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記断片化することは、細胞から分離された核酸を、物理的、化学的、熱的、光的、超音波的または酵素的に切断することである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記超音波的に切断することは、５０ないし１６０Ｗで、１０秒ないし３００秒間、超音波を加えることである、請求項３に記載の方法。
  5. 断片化された核酸の大きさは、２００ｂｐ以上である、請求項２に記載の方法。
  6. 細胞から分離された核酸、及び無細胞核酸は、同一被検個体または異なる被検個体に由来するものである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記細胞から分離された核酸は、血球細胞、口腔上皮細胞、毛嚢細胞、皮膚線維芽細胞、またはそれらの組み合わせから分離されたものである、請求項１に記載の方法。
  8. 前記無細胞核酸は、血液、血漿、血清、尿、唾液、粘膜分泌物、喀痰、大便、涙、またはそれらの組み合わせに存在するものである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記無細胞核酸は、循環腫瘍核酸である、請求項１に記載の方法。
  10. 無細胞核酸から変異を検出する方法であって、
    無細胞核酸から、染色体内１以上の位置に係わる第１配列分析データを得る段階と、
    細胞から分離された核酸から、前記染色体内１以上の位置に係わる第２配列分析データを得る段階と、
    第２配列分析データに基づいて、前記染色体内１以上の位置に係わる背景対立因子の頻度分布を生成する段階と、
    前記第１配列分析データにおける前記染色体内１以上の位置に係わる任意の対立因子の頻度と、それと対応する位置に係わる前記背景対立因子の頻度分布とを比較し、変異を検出する段階と、を含む、無細胞核酸から変異を検出する方法。
  11. 前記第１配列分析データにおける前記染色体内１以上の位置に係わる任意の対立因子の頻度が、それと対応する位置に係わる前記背景対立因子の頻度分布より大きい場合、前記対立因子は、有意な変異であると決定し、
    前記第１配列分析データにおける前記染色体内１以上の位置に係わる任意の対立因子の頻度が、それと対応する位置に係わる前記背景対立因子の頻度分布より小さいか、あるいはそれと同じである場合、前記対立因子は、有意な変異ではないと決定する段階を含む、請求項１０に記載の方法。
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