CN101993952A - Slc25a13基因突变筛查探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药和生物技术领域，涉及SLC25A13基因的突变筛查探针及其应用。本发明提供了一种SLC25A13基因突变筛查探针，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO 4所示。本发明还提供了上述探针的应用，即一种SLC25A13基因突变筛查方法，该方法以样本中的基因组DNA为模板，加入SLC25A13基因突变位点上游引物、下游引物以及标记过的正常序列探针和突变筛查探针，进行聚合酶链反应，并通过检测反应产物中确定样本是否突变。本方法具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。

Description

SLC25A13基因突变筛查探针及其应用

技术领域

本发明属于医药和生物技术领域，涉及SLC25A13基因的突变筛查探针及其应用。

背景技术

SLC25A13基因突变可导致至少2种常见的疾病类型，分别为成人II型瓜氨酸血症(CTLN2)和婴儿期肝内胆汁淤积症(NICCD)。

成人II型瓜氨酸血症以神经系统症状为主要表现，如定向力丧失、癫痫发作、神智异常等，有些患者还伴有胰腺炎或肝脏肿瘤。绝大多数患者在发病数年后死于进行性脑水肿，内科保守治疗效果差，目前最有效治疗方法是肝移植。

婴儿期肝内胆汁淤积症(NICCD)发病于新生儿或婴儿时期，患儿主要表现为黄疸、肝功能异常、生长发育迟缓，多种生化指标异常，以及氨基酸代谢异常。多数患儿的症状和生化指标异常可在1岁以前逐渐恢复正常，然而仍有少数患儿在1岁前由于肝功能衰竭而不得不进行肝移植，随访发现少数患儿在症状缓解后十或数十年后发展为致命性的CTLN2。

对NICCD的及早诊断和干预，有助于疾病的尽早恢复。并能通过密切的随访及时发现病情变化，有助由于改善NICCD的长期预后。但由于NICCD的临床表现复杂，目前尚无明确的诊断方案，确诊依赖于基因检测。根据人群筛查结果推测，超过100,000东亚人应为SLC25A13基因突变的纯合或复合杂合。因此对肝内胆汁淤积症患儿进行SLC25A13基因最常见突变的筛查，可帮助临床医师及早发现病人，其意义尤为重要。

关于SLC25A13基因突变，国际上已报道36种突变类型，其中851del4为最常见的突变类型，约占所有突变类型的70％以上。通过对该突变的筛查，可有效地发现病人。

以往对突变851del4的检测和筛查方法主要有两种，1、普通PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳方法检测；2、基因扫描。即PCR后产物经纯化、测序和软件分析后根据峰图分析结果。

由于该突变仅仅缺失四个碱基，以琼脂糖凝胶电泳方法观测片段，差异微小，结果的判定高度依赖于电泳的质量和个人经验，因此不宜推广。基因扫描筛查方法成本昂贵，耗时，且操作流程多。因此，需要更加合适的探针和筛查方法。

发明内容

本发明的目的是提供SLC25A13基因突变筛查探针。

本发明的另一个目的是提供上述突变筛查探针的应用，即SLC25A13基因突变筛查方法，以便准确、简捷、经济、直观地判断最常见SLC25A13基因突变类型。

本发明提供了一种SLC25A13基因突变筛查探针，该探针的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 4所示。

在此基础上，本发明还提供了一种SLC25A13基因突变筛查的探针组合物，该探针组合物还包括突变位点上游引物、下游引物，正常序列探针。

本发明的探针组合物中，所述的上游引物和下游引物的核苷酸编码序列可以分别如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。

本发明的探针组合物中，所述的正常序列探针的核苷酸编码序列如SEQ IDNO 3所示。

上述引物和探针可以从特定组织中克隆，也可以用化学合成的方法人工合成。

本发明还提了一种SLC25A13基因突变筛查方法，该方法包括如下步骤：

(1)设计SLC25A13基因突变位点上游引物、下游引物，正常序列探针和突变筛查探针，并分别用不同的指示剂标记正常序列探针和突变筛查探针；

(2)提取样本中的基因组DNA；

(3)以样本中的基因组DNA为模板，加入(1)所得的SLC25A13基因突变位点上游引物、下游引物以及标记过的正常序列探针和突变筛查探针，进行聚合酶链反应；

(4)检测聚合酶链反应的反应产物中的标记物。

上述方法中，正常序列探针和突变筛查探针可以分别采用不同的指示剂进行标记，以便在检测PCR反应产物中两者的含量和比例。例如，正常序列探针使用FAM和TAMRA标记，突变筛查序列用HEX和TAMRA标记。

其中，荧光发射基因FAM即6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518nm处；荧光淬灭基团TAMRA即6-羧基四甲基若丹明，荧光发射峰值在582nm处；HEX即六氯-6-甲基荧光素。

聚合酶链反应简称为PCR，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。本发明中，退火温度可以采用56摄氏度。

本发明的SLC25A13基因突变筛查方法，可以使用实时荧光定量法检测聚合酶链反应的产物。

使用实时荧光定量法检测PCR产物，HEX标记的曲线起跳表明SLC25A13基因存在突变。具体而言，仅FAM标记的曲线起跳同时HEX标记的曲线不起跳表明无851del4突变；FAM、HEX标记的曲线均起跳表明有851del4突变，是杂合突变；仅HEX标记的曲线起跳表明是纯合突变；如果两条荧光标记曲线均未起跳，即为检测失败。

本发明中，未及详述的操作均参考冷泉港实验室的《分子克隆》，10-50bp的寡聚核苷酸序列采用人工合成方法，也可以从上海生工公司购买；生物试剂从上海赛尔新罗生物试剂制品贸易有限责任公司和上海华臣生物试剂有限公司或从北京天根公司购买。

本方法具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。

以往的方法需经PCR反应、琼脂糖凝胶电泳、紫外灯下观察目标片段情况、产物纯化、测序、再使用软件读图、人工分析等过程才能得到结果，操作步骤繁多，需要使用较多的仪器设备和实验耗材，成本高，耗时多。而且在操作过程中容易造成实验室污染。

本方法设计了荧光标记探针，以不同的探针序列对突变进行识别，仅通过一次PCR反应，即可快捷地完成实验全过程，实验结果的判定仅根据两条不同荧光标记探针的起跳情况即可，能够方便地得到准确明晰的结果。

由于本方法具有以上特点，所以既适合于科研项目中大规模的人群筛查，又适合于对临床对可疑NICCD患儿的初步检测，因此具有较高的科研和临床使用价值。

具体实施方式

实施例1实时荧光定量双标记探针PCR法

1、常规抽提外周血基因组DNA。

2、引物及探针设计

上游引物：TTGGTATATTTGTTGCTTGTGTTT(SEQ ID NO 1)

下游引物：TTAAAGGGCAGAGTTCCCTCT(SEQ ID NO 2)

正常序列探针：FAM-CCTACAGACGTATGACCTTAGCA-TAMRA(SEQ IDNO 3)

突变序列探针：HEX-CCTACAGACGACCTTAGCAGA-TAMRA.(SEQ IDNO 4)

3、反应体系(25ul)

2.5×Real Mix              10ul

上游引物(10Um)             0.5ul

下游引物(10UM)             0.5ul

FAM标记探针(10UM)          0.25ul

HEX(10UM)标记探针          0.25ul

20×Enhancer               1.25ul

ddH2O                      10.25ul

基因组DNA模板              2ul

4、反应条件

5、结果的判定

无851del4突变：仅FAM标记的曲线起跳，HEX标记的曲线不起跳

有851del4突变：杂合突变：FAM、HEX标记的曲线均起跳。

               纯合突变：仅HEX标记的曲线起跳

检测失败：如果两条荧光标记曲线均未起跳，即为检测失败。

实施例2

在复旦大学附属儿科医院筛查400例婴儿肝内胆汁淤积症患儿，共筛检出8例纯合突变，30例杂合突变，其余362例无851del4突变。

为进一步验证本方法的准确性，对筛查的4例纯合突变、20例杂合突变及14例正常序列重新进行普通PCR，产物进行直接测序，测序结果经软件读图和人工核对结合分析，所有的测序结果与双标记荧光探针PCR法的结果完全一致，证明本方法的准确性达到100％，通过本方法检测的结果未出现假阳性或假阴性。

序列表

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

ttggtatatt tgttgcttgt gttt                                       24

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ttaaagggca gagttccctc t                                          21

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

cctacagacg tatgacctta gca                                        23

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

cctacagacg accttagcag a                                          21

Claims (9)

1.SLC25A13基因突变筛查探针，其特征在于，该探针的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 4所示。

2.一种SLC25A13基因突变筛查的探针组合物，其特征在于，该探针组合物由突变位点上游引物、下游引物，正常序列探针和权利要求1所述的SLC25A13基因突变筛查探针组成。

3.如权利要求2所述的探针组合物，其特征在于，所述的上游引物和下游引物的核苷酸编码序列分别如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。

4.如权利要求2所述的探针组合物，其特征在于，所述的正常序列探针的核苷酸编码序列如SEQ ID NO 3所示。

5.一种SLC25A13基因突变筛查方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)设计SLC25A13基因突变位点上游引物、下游引物，正常序列探针和突变筛查探针，并分别用不同的指示剂标记正常序列探针和突变筛查探针；

(2)提取样本中的基因组DNA；

(3)以样本中的基因组DNA为模板，加入(1)所得的SLC25A13基因突变位点上游引物、下游引物以及标记过的正常序列探针和突变筛查探针，进行聚合酶链反应；

(4)检测聚合酶链反应的反应产物中的标记物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，正常序列探针使用FAM和TAMRA标记，突变筛查序列用HEX和TAMRA标记。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，聚合酶链反应中退火温度为56度。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)使用实时荧光定量法检测聚合酶链反应的反应产物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，HEX标记的曲线起跳表明SLC25A13基因存在突变。