CN105441562A

CN105441562A - Carl基因缺失、插入突变的检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN105441562A
Application number: CN201511026921.6A
Authority: CN
Inventors: 王荣芳; 关明; 钱震斌; 施长根; 吴之源; 陈昊
Original assignee: DiaSys Diagnostic Systems (Shanghai) Co Ltd
Current assignee: DiaSys Diagnostic Systems (Shanghai) Co Ltd
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2016-03-30

Abstract

本发明提出了一种钙网蛋白(Calreticulin,CALR)基因第9外显子L367fs*46(c.1179-1230del)、K385fs*4(c.1234-1235insTTGTC)缺失、插入突变的检测方法，依据CALR基因第9外显子的缺失、插入突变区域设计通用扩增引物，依据所述扩增片段设计特异检测荧光探针，对待测样品进行实时荧光定量PCR(real？time？PCR)，通过单管多重反应鉴定CALR基因缺失、插入突变。本发明还提出了所述通用扩增引物及特异探测荧光探针在制备用于检测骨髓增殖性肿瘤的试剂中的应用。本发明还提出了用于检测骨髓增殖性肿瘤的试剂盒。

Description

CARL基因缺失、插入突变的检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，涉及一种钙网蛋白(Calreticulin,CARL)基因缺失、插入突变的检测方法，具体涉及一种基于CARL基因9号外显子(exon9)L367fs*46(c.1179-1230del)、K385fs*4(c.1234-1235insTTGTC)缺失、插入突变的核酸实时荧光PCR检测方法。

背景技术

骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferativeneoplasms，MPN)是一组以造血干细胞，粒细胞系统，红细胞系统、巨核细胞系统和肥大细胞过度增殖为特征的肿瘤疾病。一般的，MPN包括了：慢性髓性白血病(Chronicmyelogenousleukemia，CML)，真性红细胞增多症(Polycythemiavera，PV)，原发性血小板增多症(Essentialthrombocythemia，ET)，原发性骨髓纤维化(Primarymyelofibrosis，PMF)，慢性中性粒细胞白血病(chronicneutrophilicleukemia,CNL)，慢性嗜酸性粒细胞白血病非特质型(Chroniceosiophilicleukemia,CEL)，肥大细胞增多症(Mastocytosis)，和骨髓增殖性肿瘤未分类型(MPN-U)八个类型。基于Dameshek最初对骨髓增殖性疾病的归纳，PMF、PV、ET与CML合称为经典型MPN；而其余的在流行病学特点、临床表现及实验室特征均有别于上述四种的则被归类为“非经典MPN”。MPN的患者由于血细胞的过度增殖，会导致血液淤滞、粘稠度增加，而引发各种心脑血管疾病。目前MPN的发病率正逐年升高，而且发病年龄有逐步年轻化趋势，因此提高对此类疾病的诊断、治疗水平势在必行。

各个MPN在临床特征和远期预后都存在差异，治疗的目标和手段也有所不同；所以有必要在诊断时能够加以区分，以达到精准医疗的目的。常规的MPN检测诊断指标和方法包括血细胞计数，骨髓穿刺检测，环钻活检，动脉血氧饱和度，碳氧血红蛋白水平，嗜中性粒细胞碱性磷酸酶水平，血清尿酸，维生素B12水平。虽然在一般情况下这些指标可以在一定程度上指示MPN；但值得注意的是，对于其他的因机体自身应激性的骨髓增殖而导致的上述指标升高则无法与肿瘤性增生区分开，容易形成对MPN误诊。更重要的是，上述方法对于“非典型MPN”则无法区分和诊断。

在核酸水平检测诊断MPN是近年来一直发展的新指标。其中CML存在有100％特异性的BCR/ABL基因融合。鉴定后，可针对性的靶向使用受体酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。除CML之外其余各类型MPN可统称为BCR/ABL阴性MPN。对于BCR/ABL阴性的MPN，较为经典的分为3类：PV，ET和PMF。因其临床表现相似，需要排除复杂的继发因素，形态学诊断存在诸多难题和不足，而且易受医生主观因素影响。所以这类疾病的明确分子标志基因具有重要临床意义。目前有数个标记指示基因(Bio-marker)被报道。研究发现约81％～99％的PV、约41％～72％的ET和39％～57％的PMF患者带有铬氨酸蛋白激酶2(JanusKinase2,JAK2)JAK2-V617F突变，随后又证实约2％的JAK2-V617F突变PV患者有JAK2第12外显子异常(突变、缺失或插入)。因此，在2008年WHOMPN诊断标准中将存在JAK2-V617F突变或其他功能类似的突变(例如JAK2第12外显子突变)列为PV诊断主要标准之一。对于JAK2-V617F阴性的ET和PMF则可以通过鉴定血小板生成素受体(ThrombopoietinReceptor)突变区(MPL515)，MPL突变检测对于JAK2-V617F突变阴性的ET和PMF的诊断和治疗是十分必要的，所以MPL515突变检测也已经列入了WHO制定的诊断特发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化的指标之一。

值得注意的是，JAK2和MPL阴性约40％的原发性血小板增多症(ET)或原发性骨髓纤维化(PMF)仍然缺乏明确的诊断分子标记。2013年，Thorsten博士等两个研究组从WGS数据分析中发现，JAK2和MPL野生型的ET或PMF患者中存在CALR基因重复性的插入或缺失。具体为CALR9号外显子中52bp缺失的I型突变或一个5bp的插入的II型突变。与JAK2突变者相比，CALR突变的ET和PMF患者往往白细胞计数更低，血小板计数更高。无论ET或PMF，CALR突变者较JAK2突变者具有更好的总生存，而且具有CALR突变的ET患者较JAK2突变者具有较低的血栓发生率。综上，CALR基因突变主要见于JAK2和MPL突变阴性的MPN，对于CALR突变的检测有望进一步提高对MPN的诊断水平，可以为MPN的个体化治疗及最终的精准治疗提供重要依据。

目前基于血清样本的肿瘤核酸诊断技术主要包括：PCR-RFLP(PCR限制性片段多态性)，SSCP(单链构象多态性)，DGGE(变性梯度凝胶)，AFLP(扩增片段长度多态性)，基因测序，基因芯片，多重PCR，定量PCR等。定量PCR技术因简单、快捷、准确及灵敏度高被广泛发展和应用。在检测技术上主要包括了DNA结合染料(SYBRGreen/EvaGreen)，水解探针技术(Taqmanprobe)，杂交探针(Hybridizationprobe)技术。本发明首次提出一种新的多重Taqman探针法(MultiplexTaqman)通过一次性检测快速获得准确检测结果。

发明内容

本发明提出了一种CALR基因的PCR检测方法，所述方法能够同时检测CALR基因的野生型、插入型、缺失型中任意的一种或几种的组合。依据CALR基因9号外显子的缺失、插入突变区域设计以下通用扩增引物。其中，所述CALR基因9号外显子的缺失区域是L367fs*46(c.1179-1230del)，所述CALR基因9号外显子的插入区域是K385fs*4(c.1234-1235insTTGTC)。

上游引物5’-3’序列：CTGGTCCTGGTCCTGATGTCG；

下游引物5’-3’序列：TCTTCCTCCTTGTCCTCCTCA。

当特异检测荧光探针只有一种时，本发明所述方法能准确地检测其为野生型、插入突变、缺失突变三种中的哪一种基因型；即，

当特异检测荧光探针为：

野生型(WT)5’-3’序列：CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT时，本发明的方法能准确地检测CALR基因为野生型。

当特异检测荧光探针为：

缺失突变(DEL)5’-3’序列：TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT时，本发明的方法能准确地检测CALR基因为缺失突变(缺失型)。

当特异检测荧光探针为：

插入突变(INS)5’-3’序列：TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG时，本发明的方法能准确地检测CALR基因为插入突变(插入型)。

当特异检测荧光探针含有两种时，本发明所述方法能准确地检测出CALR基因分别为野生型和缺失突变，野生型和插入突变，或插入突变和缺失突变；即，

当特异检测荧光探针为：

野生型(WT)5’-3’序列：CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；和

缺失突变(DEL)5’-3’序列：TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT时，本发明的方法能准确地检测CALR基因分别为野生型和缺失突变(缺失型)。

当特异检测荧光探针为：

野生型(WT)5’-3’序列：CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；和

插入突变(INS)5’-3’序列：TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG时，本发明的方法能准确地检测CALR基因分别为野生型和插入突变(插入型)。

当特异检测荧光探针为：

缺失突变(DEL)5’-3’序列：TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT；和

插入突变(INS)5’-3’序列：TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG时，本发明的方法能准确地检测CALR基因为缺失突变(缺失型)和插入突变(插入型)。

当特异检测荧光探针包含三种时，本发明所述方法能准确地检测出三种CALR基因分别为野生型、插入突变、缺失突变；即，当特异检测荧光探针为：

野生型(WT)5’-3’序列：CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；

缺失突变(DEL)5’-3’序列：TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT；和

插入突变(INS)5’-3’序列：TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG时，本发明所述方法能准确地检测出三种CALR基因分别为野生型、插入突变(插入型)、缺失突变(缺失型)。

具体地，本发明提出了一种基于检测CALR缺失、插入突变相关的多重PCR检测方法。通过在CALR基因9号外显子含有的L367fs*46(c.1179-1230del)、K385fs*4(c.1234-1235insTTGTC)缺失、插入突变区域设计通用扩增引物，并依据扩增片段设计特异荧光探针，对待测样品进行实时荧光PCR(real-timePCR)检测。通过单管多重反应鉴定CALR基因的野生型、插入型和/或缺失型。本发明首次创新提出了，应用多重Taqman探针法，在一个改良的PCR反应体系中同时检测分辨CALR基因的9号外显子中的I型缺失突变和II型插入突变，对MPN样本(包括对JAK2/MPL阴性的MPN样本)是否与CALR突变相关提供了高效、快速、准确的检测评估，为进一步的靶向治疗提供信息支持。

其中，所述缺失、插入区域通用引物为：

上游引物5’-3’序列：CTGGTCCTGGTCCTGATGTCG

下游引物5’-3’序列：TCTTCCTCCTTGTCCTCCTCA

所述特异检测荧光探针(5'标记荧光基团，3'标记淬灭基团)为：

野生型(WT)5’-3’序列：CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT，

缺失突变(DEL)5’-3’序列：TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT，和

插入突变(INS)5’-3’序列：TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG中任意的一种或几种。

其中，所述探针序列上的两端化学修饰为：

5'端：FAM、HEX、VIC、JOE、TAMRA、Cy3、NED、ROX、TEXAS-Red、Cy5以上荧光染料基团中任意三种染料的组合；

3'端：BHQ1或BHQ2淬灭基团，与上述挑选的三种5'端荧光基团的任意组合。

本发明提出的CALR基因缺失、插入突变的检测方法，包括如下步骤：

1)样本DNA抽提：可选用经典酚-氯仿抽提法、或选用QIAGEN等公司的全基因组抽提试剂盒。

2)荧光PCR扩增：按照PCR操作流程配制PCR反应体系，在具有与探针匹配检测通道上的荧光PCR仪器上按照总变性、循环(含变性、退火、延伸步骤或含变性、退火延伸步骤)扩增并检测。

优选地，所述荧光PCR扩增为三色荧光PCR扩增：按照PCR操作流程配制PCR反应体系，在具有与探针匹配检测通道上的荧光PCR仪器上按照总变性、循环(含变性、退火、延伸步骤或含变性、退火延伸步骤)扩增并三色同步检测。

其中，所述实时荧光定量PCR中，退火温度在55-67℃之间，PCR扩增片段长度为120-200bp；扩增基因组DNA浓度范围为0.1-15ng之间。各条探针的终浓度范围为：5nM-100nM。

3)结果分析与判断：根据每份样本在各通道检测到的Ct值，通过具体探针标记基团判定其基因类型。

本发明还提出了所述基于CALR基因9号外显子的缺失、插入突变区域设计的通用扩增引物在制备用于检测骨髓增殖性肿瘤的试剂中的应用。

其中，所述通用扩增引物为：

上游引物5’-3’序列：CTGGTCCTGGTCCTGATGTCG；

下游引物5’-3’序列：TCTTCCTCCTTGTCCTCCTCA。

本发明还提出了所述基于CALR基因9号外显子的缺失、插入突变区域设计的特异检测荧光探针在制备用于检测骨髓增殖性肿瘤的试剂中的应用。

其中，所述特异检测荧光探针(Taqman探针，其中，5'端标记为荧光基团，3'端标记为淬灭基团)为：

野生型(WT)5’-3’序列：CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；

缺失突变(DEL)5’-3’序列：TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT；

插入突变(INS)5’-3’序列：TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG中的任意的一种或几种。

本发明还提出了基于CALR基因9号外显子的缺失、插入突变区域设计的特异检测荧光探针在制备用于检测骨髓增殖性肿瘤的试剂中的应用，其中，所述特异检测荧光探针(Taqman探针，其中，5'端标记为荧光基团，3'端标记为淬灭基团)为：

野生型(WT)5’-3’序列：CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；

缺失突变(DEL)5’-3’序列：TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT；

插入突变(INS)5’-3’序列：TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG。

所述探针序列上的两端化学修饰为：

本发明还提出了一种扩增引物，其特征在于，所述扩增引物为：

上游引物5’-3’序列：CTGGTCCTGGTCCTGATGTCG；

下游引物5’-3’序列：TCTTCCTCCTTGTCCTCCTCA。

本发明还提出了一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为：

CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；

TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT；和

TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG中任意的一种或几种的组合。

CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；

TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT；和

TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG中任意的一种或几种的组合；所述探针序列上的两端经化学基团修饰。

其中，所述探针序列上的两端化学修饰：

5'端：FAM、HEX、VIC、JOE、TAMRA、Cy3、NED、ROX、TEXAS-Red、Cy5以上荧光染料基团中任意的一种或几种染料的组合；

本发明还涉及一种试剂盒，其用于实施本发明所述的检测方法，并包含所述的试剂。本发明利用具有MPN特异性的CARL基因编码区突变，制备MPN的诊断试剂，在实时荧光定量PCR中，采用前述CARL基因9号外显子缺失、插入突变区域通用引物，并配合使用针对缺失、插入突变区域的3条特异Taqman水解探针。进一步包括，检测的含有9号外显子突变区的阳性质粒标准品；进一步还可以包括PCR反应的反应缓冲体系和相应的Hot-startTaq酶。

本发明提出的用于检测骨髓增殖性肿瘤的试剂盒/试剂，还包括基于CALR基因9号外显子的缺失、插入突变区域设计的通用扩增引物和特异检测荧光探针。

其中，所述通用扩增引物为：

上游引物5’-3’序列：CTGGTCCTGGTCCTGATGTCG；

下游引物5’-3’序列：TCTTCCTCCTTGTCCTCCTCA

其中，所述特异检测荧光探针为：

野生型(WT)5’-3’序列：-CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；

缺失突变(DEL)5’-3’序列：TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT；

插入突变(INS)5’-3’序列：TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG。

其中，所述探针序列上的两端化学修饰：

进一步地，本发明用于检测骨髓增殖性肿瘤的试剂盒/试剂包括含有9号外显子突变区的阳性质粒标准品。进一步地，所述试剂盒包括PCR反应的反应缓冲体系和相应的Hot-startTaq酶。

本发明中，进一步地，所采用的实时荧光定量PCR方法的优化过程包括Hot-startDNA聚合酶的运用以及PCR反应体系的优化。通过优化测试PCR反应体系优化指标包括：引物浓度范围(0.1～0.5mM)；引物长度范围(18～30bp)；探针长度范围(12～35bp)；反应时的退火温度(55℃～67℃)；扩增片段长度(120～200bp)；基因组DNA浓度范围为0.1～15ng；探针浓度(5nM～100nM)；优化反应缓冲液进一步提高PCR反应的专一性和扩增效率。

具体地，本发明的还包括针对血清或其他相关标本的试剂盒体系。其中试剂盒(20人份)主要组成如下表-1所示：

表-1

PCR反应试剂mix主要成分包括：5X缓冲液+dNTPs+Mg⁺⁺+hot-startTaq；

PCR引物探针mix主要成分包括：上下游引物+Taqman探针；

阳性野生型：含CALRexon9靶序列的质粒；

阳性插入突变：含插入突变的CALRexon9靶序列的质粒；

阳性缺失突变：含缺失突变的CALRexon9靶序列的质粒；

阴性对照：空载质粒。

适用的RealTimePCR扩增仪：

AppliedBiosystems7900HT/7300/7500Real-TimePCRSystem、7500FastReal-TimePCRSystem、StepOnePlus^TMReal-TimePCRSystem(AppliedBiosystems)、(RocheDiagnostics)、CFXTouch^TM(Bio-Rad)。

试剂运输及储存条件：

本试剂盒运输可在2～8℃环境下进行。储存时，须置-20℃保存。

有效期：本试剂盒有效期为18个月，请在有效期内使用。

试剂盒原理：

试剂盒使用了Hot-startTaq酶进行PCR扩增，通过反应液中Taq酶水解Taqman探针释放的荧光强度变化，达到检测PCR产物扩增的目的。以人基因组DNA中的CALR基因9号染色体区域进行PCR扩增。试剂盒中的DNA聚合酶由于使用了Hot-startTaq酶，从而抑制非特异性扩增，大大提高PCR扩增的准确率。

Taqman多重荧光检测法:

被FAM，TAMRA和CY5标记的Taqman探针与目的片段杂交后被Taq酶水解后发出荧光，通过检测反应体系中的特异荧光，达到检测、鉴定CALR基因型的目的。(TAMRA，FAM，CY5信号分别对应野生型，缺失突变和插入突变)

试剂盒特点:

适用于多种常规Real-TimePCR反应平台，可以快速、准确地对人基因组中CALR基因型进行检测、分析。PCR反应液配制时，在反应试剂中混入引物探针，再加入模板便可进行Real-TimePCR反应，操作简单方便。DNA聚合酶使用了Hot-startDNA聚合酶，可再与公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性的特点。

本发明有益效果包括：在方法学上，应用多重荧光探针，可实现即时观察检测结果。检测时间短为2～2.5小时，操作简便，有利于实践中的广泛推广及应用。本发明通过一对通用引物扩增所需检测的CALR基因突变区域，避免了现有技术中普通多重PCR反应中因多个引物而造成的非特异扩增。本发明通过设计3个特异水解探针，实现了在一管反应中检测出CALR的插入和缺失突变。本发明骨髓增殖性肿瘤的核酸实时荧光PCR检测方法及应用和试剂盒中，基于荧光PCR的检测钙网蛋白基因9号外显子缺失、插入突变，从而诊断、区分骨髓增殖性肿瘤类型的方法和试剂。

附图说明

图1：表示本发明中鉴定的CALR基因3种基因型(WT野生型、DEL缺失突变、INS插入突变)，用虚线框标示的特异检测Taqman探针位置，PCR通用引物(箭头标注)位置用斜线区域标出。

图2：表示本发明中各CALR基因型片段使用通用引物扩增后的凝胶电泳图。从左至右依次为DNAMarker，野生型，缺失突变和插入突变。

图3：表示本发明中阳性克隆质粒扩增曲线(Taqman探针)。其中，图3A表示阳性质粒野生型扩增曲线；图3B表示阳性质粒插入突变扩增曲线；图3C表示阳性质粒缺失突变扩增曲线。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图/表，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：

用阳性质粒样本对本发明方法的进行验证

本实施例中，用本发明方法对各阳性已知CALR基因型质粒进行PCR检测，验证本方法反应体系可通过单管多重反应一次性鉴定出CALR的野生型、插入突变和/或缺失突变。各次反应中包含了CALR9号外显子区的野生型，缺失或插入突变阳性质粒，将各CALR基因型阳性质粒单独或组合后配制成待检测样本(质粒浓度为10³拷贝/μL)。

一、实施方法：

1.准备CALR各基因型的标准阳性质粒

1.1.引物设计：分别参照已报道的人CALR基因9号外显子序列设计引物：

上游引物5’-3’序列：CTGGTCCTGGTCCTGATGTCG

下游引物5’-3’序列：TCTTCCTCCTTGTCCTCCTCA

1.2.采用以下PCR反应体系克隆CALR9号外显子突变区域：

在50μL微量PCR反应管内加入如表-2所示如下PCR体系：

表-2

加入去离子灭菌水至终体积50μl。

反应条件为总变性94℃5分钟，40个循环(94℃30秒，54℃1分钟，72℃1分钟)，72℃延伸10分钟。

1.3.PCR产物克隆：扩增出的PCR片段，经PCR产物回收试剂盒回收后用T4DNA聚合酶(T4DNApolymerase,NEBBioLabs公司)补平末端，再经琼脂糖凝胶电泳，将目标片段用胶回收试剂盒回收纯化，然后插入到pBluesecriptIISK(+)载体上的EcoRV位点中，详细方法见文献(Sambrooks,《分子克隆手册》)，将连接产物转化到DH5α菌株中，用PCR方法来筛选阳性克隆。

1.4.将阳性克隆进行DNA序列测定，其测序结果与基因库序列或报导突变类型序列一致。

1.Real-timePCR反应体系为：

水解探针*5nM(起始终浓度)

H₂O补平至终体积10μL

表-3

2.反应条件设定(标准两步法)

总变性95℃10分钟，35个循环(95℃30秒，62℃30秒)。

二、检测结果：

PCR反应结束后依据各通道荧光信号Ct值判定是否与加入的阳性样本基因型相符合，以此证明本发明体系对检测各CARL蛋白基因型的有效性。1号样本为阴性样品，2-4号样本为单一基因型CARL样本，5-8号为多基因型组合的混合质粒CALR样本。各实验结果如表-4所示：

表-4

NA：没有PCR扩增信号。

上述表中，有效检测信号(Ct值)的荧光通道已标出：TAMRA-WT(野生型)，FAM-DEL(缺失突变)，CY5-DEL(插入突变)。通过比对，1号为阴性样本，所以无扩增信号；而2，3，4号单一基因型样本均可见单一的特异通道的扩增信号且与加入的阳性质粒基因型完全符合，说明本发明体系特异性良好，可特异鉴定CARL各基因型。进一步的，对于多基因型组合的5，6，7，8号样本，如表中所示，本发明的多重检测系统可一次性同时准确分辨和检测任意的CARL基因野生型、缺失突变和插入突变三种基因型，而未出现任何错误如假阳性和假阴性。综上，本实施例显示本发明兼顾了特异性和灵敏度，可作为快速，便捷诊断CALR基因型的有效工具。

实施例2：

用已知的CALR基因型血液样本对本发明方法的验证性检测

本发明对已知的CALR基因型血液样本进行验证测定

本实施例中，对于测序后已知CALR基因型的血清样本，使用本发明所述试剂盒进行PCR验证。通过此实施例进一步证实本试剂盒适用于人血清基因组中的CALR基因的9号外显子插入和缺失突变的鉴定检测，适用于人CALR相关的MPN诊断。

一、实施方法：

1.对于待测已知CALR基因序列的血液样本(共27例)进行标记后，取血液150-500μL，用QIAGEN或其他相应公司血液DNA抽提试剂盒抽提DNA，测定260nmO.D.值，并将其稀释到约5-10ng/μL浓度。

2.real-timePCR反应体系为：

3.反应条件设定(标准两步法)

总变性95℃10分钟；40个循环(95℃15秒，62℃30秒)。

二、检测结果：

PCR反应结束后依据各通道荧光信号Ct值判定筛查血清中的CARL基因型(检测到效荧光信号的通道用“√”标示出，并据此判定样本的CARL基因型。其后与已知的测序结果比对计算得出本发明在此实施例中的阳性符合率，如表-5所示：

表-5

本次实施例样品共27例，经预先测序鉴定包含了三种CALR基因型。PCR反应结束后检查各通道有效的Ct值，以此判定CALR基因型：判定原则为：1.如果仅观测到单一通道信号则直接根据荧光通道探针对应基因型直接判定；2.如果在野生型(TAMRA)通道外还同时观测到其他通道信号，则依据其余两个通道信号判定CALR基因型。例如：“167”号样本仅观测到TAMRA信号则直接判定为野生型；而“31”号样本同时出现了TAMRA和FAM信号则根据FAM信号标示的基因型(缺失型)判定此血样为缺失突变；再如“172”样本，同时出现了TAMRA和CY5信号则根据CY5(插入突变)鉴定此血样为插入突变。由上表可知，经过本实例证实使用本发明试剂盒可以准确特异的从血清样本中一次性鉴定出CALR蛋白的插入，缺失和野生基因型。如表中所示，本实例共计27个经测序已确认的样本，用本发明的试剂盒及方法所得到的结果与已知的测序结果经比对后符合率达到了100％。由此可知，本发明适用于临床来源的人样本，可在临床应用于CALR相关的MPN筛查诊断中。

实施例3：

用随机挑选的未知CARL基因型的体检血液样本对本发明方法的验证性检测

本发明对随机挑选的体检未知血液样本进行CALR突变筛查

本实施例中，采用血清CALR突变相关的MPN诊断核酸扩增PCR荧光实时检测试剂盒。

一、实施方法：

1.对于待测血液样本进行标记后，取血液150-500μL，用QIAGEN或其他相应公司血液

DNA抽提试剂盒抽提DNA，测定260nmO.D.值，并将其稀释到约5-10ng/μL浓度。

2.real-timePCR反应体系为：

3.反应条件设定(标准两步法)

二、总变性95℃10分钟；40个循环(95℃15秒，62℃30秒)。

检测结果：

PCR反应结束后依据各通道荧光信号Ct值判定筛查血清中的CARL基因型。本实施例共收集未知CALR基因型血清样本7例(S1-S7)。每个反应管具有3个探针，均可同时检测CALR基因的野生型(TAMRA)，插入突变(CY5)和缺失突变(FAM)。纯化DNA后，使用本发明的试剂盒进行检测。筛查结果如下表-6所示：

表-6

由图表可知，本次实施例共筛查未知CALR基因型血清样本6例,；6个样本均只有TAMRA荧光通道出现有效信号，而其余的FAM和CY5通道无有效扩增信号，故所有随机挑选的体检血液样本中的CALR均判定为野生型，符合预期。本发明可以在实际中对血液中的CALR9号外显子相关的插入、缺失以及野生型进行鉴定检测，可作为CALR基因型的筛查工具并以此诊断MPN的类型。

进一步地证明，本发明的试剂盒可对CALR基因型进行准确分析，重复性好，可信度高，适用于人CALR相关的MPN诊断。试剂盒采用多重Taqman水解探针进行real-timePCR,PCR反应液的配制十分方便简单，使用Hot-startDNA聚合酶与最适缓冲液和引物、探针组合，可以有效抑制非特异性的扩增，达到高灵敏度、高特异的扩增反应。

Claims

1.CALR基因缺失、插入突变的检测方法，其特征在于，所述方法为，依据CALR基因9号外显子的L367fs*46(c.1179-1230del)、K385fs*4(c.1234-1235insTTGTC)缺失、插入突变区域设计通用扩增引物，依据所述扩增片段设计特异检测荧光探针，对待测样品进行实时荧光定量PCR，通过单管多重反应鉴定CALR基因的野生型、缺失型和插入型中任意的一种或几种的组合。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通用扩增引物为：

上游引物5’-3’序列：CTGGTCCTGGTCCTGATGTCG；

下游引物5’-3’序列：TCTTCCTCCTTGTCCTCCTCA。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异检测荧光探针为：

野生型(WT)5’-3’序列：CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；

缺失突变(DEL)5’-3’序列：TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT；和

插入突变(INS)5’-3’序列：TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG中任意的一种或几种的组合。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基于权利要求3所述探针序列上的两端化学修饰：5'端：FAM、HEX、VIC、JOE、TAMRA、Cy3、NED、ROX、TEXAS-Red、Cy5以上荧光染料基团中任意三种染料的组合；3'端：BHQ1或BHQ2淬灭基团，与上述挑选的三种5'端荧光基团的任意组合。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)样本DNA抽提；2)三色荧光PCR扩增；3)结果分析与判断。

6.基于CALR基因9号外显子的缺失、插入突变区域设计的通用扩增引物在制备用于检测骨髓增殖性肿瘤的试剂中的应用，其特征在于，所述通用扩增引物为：

上游引物5’-3’序列：CTGGTCCTGGTCCTGATGTCG；

下游引物5’-3’序列：TCTTCCTCCTTGTCCTCCTCA。

7.基于CALR基因9号外显子的缺失、插入突变区域设计的特异检测荧光探针在制备用于检测骨髓增殖性肿瘤的试剂中的应用，其特征在于，所述特异检测荧光探针如权利要求4所述为：

野生型(WT)5’-3’序列：CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；

缺失突变(DEL)5’-3’序列：TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT；和

8.基于CALR基因9号外显子的L367fs*46(c.1179-1230del)、K385fs*4(c.1234-1235insTTGTC)缺失、插入突变区域设计的特异检测荧光探针在制备用于检测骨髓增殖性肿瘤的试剂中的应用，其特征在于，基于权利要求3所述探针序列上的两端化学修饰：

5'端：FAM、HEX、VIC、JOE、TAMRA、Cy3、NED、ROX、TEXAS-Red、Cy5以上荧光染料基团中任意三种染料的组合；3'端：BHQ1或BHQ2淬灭基团，与上述挑选的三种5'端荧光基团的任意组合。

9.一种扩增引物，其特征在于，所述扩增引物为：

上游引物5’-3’序列：CTGGTCCTGGTCCTGATGTCG；

下游引物5’-3’序列：TCTTCCTCCTTGTCCTCCTCA。

10.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为：

CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；

TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT；和

TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG中任意的一种或几种的组合。

11.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为：

CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；

TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT；和

12.如权利要求11所述的探针，其特征在于，所述探针序列上的两端化学修饰：

5'端：FAM、HEX、VIC、JOE、TAMRA、Cy3、NED、ROX、TEXAS-Red、Cy5以上荧光染料基团中任意的一种或几种染料的组合；3'端：BHQ1或BHQ2淬灭基团，与上述挑选的三种5'端荧光基团的任意组合。

13.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括基于CALR基因9号外显子的L367fs*46(c.1179-1230del)、K385fs*4(c.1234-1235insTTGTC)缺失、插入突变区域设计的通用扩增引物和特异检测荧光探针；

所述通用扩增引物为：

上游引物5’-3’序列：CTGGTCCTGGTCCTGATGTCG；

下游引物5’-3’序列：TCTTCCTCCTTGTCCTCCTCA

所述特异检测荧光探针为：

野生型(WT)5’-3’序列：CCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTCCTCCT；

缺失突变(DEL)5’-3’序列：TTGTCCTGCTCCTCGTCTCCTGTTCCT；和插入突变(INS)

5’-3’序列：TCTCCTCCTCCTCCGTCTCCTGTTAACAG中任意的一种或几种的组合。

探针序列上的两端化学修饰：

14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括：含有CALR基因9号外显子突变区(c.1179-1230del及c.1234-1235insTTGTC)的阳性质粒标准品。

15.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括：PCR反应缓冲体系和Hot-startTaq酶。