CN101348831A

CN101348831A - 一种快速检测空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药突变点的荧光定量pcr方法

Info

Publication number: CN101348831A
Application number: CNA200810048093XA
Authority: CN
Inventors: 袁宗辉; 郝海红; 戴梦红; 王玉莲; 黄玲利; 彭大鹏; 王旭; 陈冬梅; 陶燕飞; 魏亚静; 郭文韬
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2008-06-19
Filing date: 2008-06-19
Publication date: 2009-01-21
Anticipated expiration: 2028-06-19
Also published as: CN101348831B

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种检测空肠弯曲杆菌大环内酯类药物耐药相关基因突变的方法。本发明利用实时荧光定量PCR TaqMan探针技术，依据空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药突变区23S rDNA中V区的核酸序列，设计特异性的引物和探针，通过优化TaqMan实时荧光定量PCR反应体系和反应条件，以准确检测靶基因的相关耐药突变点。本发明能够快速准确地同时检测出空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药的两个主要突变位点，比目前已经报道的相关分子生物学检测方法具有更好的特异性和更高的灵敏度，比传统的测序和药敏实验方法操作简便、准确快速。本发明为耐大环内酯类空肠弯曲杆菌分子流行病学监测提供了有力的技术手段。

Description

一种快速检测空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药突变点的荧光定量PCR方法

技术领域

本发明属于动物兽药残留检测技术领域，具体涉及一种用荧光定量聚合酶链式法检测空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药相关基因变异的方法，具体检测弯曲杆菌23S rDNA中的2074位和2075位的基因是否发生变异。

背景技术

弯曲菌病(Campylobacteriosis)是由弯曲菌属(Campylobacter)细菌感染引起的一系列疾病的总称。弯曲杆菌有很多种，其中的空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)均为革兰氏阴性、高度可运动、微需氧性和嗜热性细菌，现已被认为是世界各地人类急性细菌性肠炎的主要病原菌。有研究表明，在一些发达国家，空肠弯曲杆菌感染引起的腹泻甚至超过沙门氏菌、志贺氏菌或者大肠埃希氏杆菌O157:H7引起的腹泻的2～7倍。

大环内酯类和氟喹诺酮类药物被列为抗弯曲杆菌感染的首选药物。然而，随着大环内酯类药物在兽医临床和人医临床的广泛使用，其引起的细菌耐药性问题也日益呈现。虽然在美国、日本等国家，耐红霉素弯曲杆菌的检出率并不高(低于四环素类和氟喹诺酮类)，但是在大环内酯类药物使用较多的国家，如新西兰和澳大利亚等，弯曲杆菌对大环内酯类的耐药问题较为严重。在我国，大环内酯类药物被广泛用于动物临床和人医临床，其所引发的耐药弯曲杆菌问题不得不引起我们的忧虑。建立简便快速、准确可靠的耐药性监测手段是控制弯曲杆菌耐药性流行和传播的关键。

弯曲杆菌对大环内酯类抗菌药物的耐药机制主要是药物作用靶位改变。据一项调查显示在23株大环内酯类耐药弯曲杆菌中78％的耐药菌株是由于其23S rDNA V区发生了A2075G(相当于E.coli A2059G)的突变引起，13％的耐药弯曲杆菌发生了A2074C的突变，虽然A2074G的突变也在耐大环内酯类弯曲杆菌中被检测出来，但是稳定性实验发现，这种耐药因子是很不稳定的。

目前，细菌耐药性的检测方法有很多。微生物学方法有纸片法、MIC法(常规方法+特殊判断标准)，双纸片办同试验，三相试验，E-test，自动化仪器等。生物化学方法主要是等电聚焦电泳。分子生物学方法主要有PCR方法、DNA探针和DNA序列分析等。

分子生物学方法中聚合酶链式反应(PCR)，聚合酶链式反应-特异性片断长度多态性分析法(PCR-RFLP)，聚合酶链式反应-单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)，PCR-线性探针分析(LiPA)，PCR-通用型异源双倍体发生器分析(HDF)，生物芯片分析，自动DNA序列测定和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)等常用于检测耐药基因的突变。

目前已经建立的检测弯曲杆菌对大环内酯类突变的方法有：限制性内切酶多态性分析(PCR-RFLP)，线性探针(Line Probe Assay，PCR-LIPA)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)技术等。

2003年，Vacher等(Vacher，S.，A.Menard，E.Bernard，and F.Megraud.2003.PCR-restrictionfragment length polymorphism analysis for detection of point mutations associated with macrolideresistance in Campylobacter spp.Antimicrob Agents Chemother 47：1125-8.)建立了PCR-RFLP方法来检测了30株临床分离弯曲杆菌属23S rDNA相关点突变。他们用BsaI and BceAI两种酶作为切割酶来切割PCR扩增片断，根据切割片断长度的多态性来鉴别两种不同突变类型。然而，此种方法涉及PCR扩增，酶切、胶回收和染色等一系列程序，操作繁琐，特异性较差。

NiWa等(Niwa，H.，T.Chuma，K.Okamoto，and K.Itoh.2001.Rapid detection of mutationsassociated with resistance to erythromycin in Campylobacter jejuni/coli by PCR and line probeassay.Int J Antimicrob Agents 18：359-64.)于2001年建立了PCR-LIPA法用于检测31株弯曲杆菌(6株药物诱导株，23株临床分离株)对大环内酯类耐药突变点，检测结果与测序结果完全相符，准确性很高。2003年(Niwa，H.，T.Chuma，K.Okamoto，and K.Itoh.2003.Simultaneousdetection of mutations associated with resistance to macrolides and quinolones in Campylobacterjejuni and C.coli using a PCR-line probe assay.Int J Antimicrob Agents 22：374-9.)他们又进一步优化了这种方法，可以同时检测弯曲杆菌对大环内酯类和氟喹诺酮类药物的耐药，即同时分析23S rDNA和gyrA上的突变点。然而这种方法中涉及到PCR扩增、线性探针胶条的制备和反向杂交等过程，对于操作的技术要求过高，并且反应过程中的影响因素太多，稳定性较差，不够方便快捷。

2005年，Vacher(Vacher S，Menard A，Bernard E，Santos A，Megraud F.Detection ofmutations associated with macrolide resistance in thermophilic Campylobacter spp.by real-timePCR.Microb Drug Resist.2005 Spring；11(1)：40-7)等建立了一种实时荧光定量多聚酶链式反应(Real-time PCR)方法来检测嗜热弯曲杆菌大环内酯类耐药突变，他们是通过比较野生型和突变型基因扩增产物的熔解曲线和Tm值的差异来判断样品中细菌基因是否存在变异，因此难以摆脱DNA结合染料的通病，即检测结果的判读不够直观，必须和溶解曲线联合分析，检测的特异性和准确性都有待提高。

荧光定量PCR实验中，荧光标记的探针有优于DNA结合染料的两大特征，第一，它们可以特异性地监测目标序列，防止非特异性产物的干扰而影响定量的准确性；第二，它们可以用于多重反应。同时，它们克服了传统测序技术技术耗时、实验繁琐、对序列进行专业比对等缺点。故荧光探针因为所具有的省时、简便、特异性强等优势而作为突变分析的一种手段被广泛使用。

发明内容

本发明的目的是为了克服传统检测方法的缺陷，提供一种简便、快速、准确率高的检测空肠弯曲杆菌耐药基因变异的方法，具体涉及一种用荧光定量聚合酶链式法检测空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药相关基因变异的方法。

本发明利用实时荧光定量PCR TaqMan探针技术，依据空肠弯曲杆菌大环内酯耐药主要突变区23S rDNA基因中结构域V区核酸序列，设计引物及探针检测23S rDNA中A2074C和A2075G的基因突变。

本发明利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入不同荧光(例如FAM，HEX)标记的三条探针，分别和同一基因的野生型和两种突变型基因序列相对应，三条探针的5’端标以荧光发射基团FAM或HEX标记，靠近3’端标以荧光淬灭基团(TAMRA)。反应体系中的每种探针可以与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，野生型探针只与野生型基因序列杂交，两种突变型探针可以分别与两种对应的突变序列杂交，每种探针对应每种碱基序列。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，检测波长处光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿着DNA模板移动，当移动到探针结合处切断探针，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放，结果中被检测到的荧光信号所标记的探针，对应于检测区域的突变基因类型。

本发明包括下述步骤：

a、根据空肠弯曲杆菌大环内酯耐药性相关突变位点的靶基因序列设计、合成一对引物，并通过PCR扩增大肠杆菌、沙门氏菌和粪肠球菌来考查引物的特异性；

b、根据靶基因序列在引物之间设计、合成三个荧光探针，并且保证每条探针可以特异性检测不同的变异基因(包括一种野生型和两种突变型基因)；

c、运用分子克隆和定点诱变方法人工构建三种对照质粒(见实施例2)。其中一个为野生型对照质粒，另外两个为突变型对照质粒(分别为A2074C、A2075G两种突变类型)；

d、使用步骤a中的引物和步骤b中的荧光探针及其他聚合酶链式反应成分组成荧光聚合酶链式反应体系。优化反应体系和反应条件，通过检测步骤c中人工构建的已知基因类型的三种对照质粒，以考查所优化的方法的特异性；

e、从空肠弯曲杆菌细菌培养液中采用煮沸法(Niwa，H.，T.Chuma，K.Okamoto，and K.Itoh.2001.Rapid detection of mutations associated with resistance to erythromycin inCampylobacter jejuni/coli by PCR and line probe assay.Int J Antimicrob Agents18：359-64)提取样本细菌DNA(见实施例5)，加入步骤d中的荧光聚合酶链式反应体系，在荧光定量PCR仪上进行扩增实验；

f、进行30-50个循环的荧光PCR反应，循环过程中读取荧光值，将扩增产物的荧光信号与域值进行比较，判定与探针对应的突变情况。

步骤a中所述的两个引物之间相距50-200个碱基，扩增的靶基因序列的长度为147bp。

步骤b中所述的荧光探针为TaqMan探针，5’端以FAM或HEX标记，3’端以TAMRA标记。

步骤a中所述的空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药性相关突变位点的特异性基因的核苷酸序列为：

CGAGATGGGAGCTGTCTCAAAGAGGGATCCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAGCTTGACACTGCTACTTGGATAAGAATGTGCAGGATAGGTGGG

步骤a中所述的引物对的核苷酸序列为：

引物1：5’CGA GAT GGG AGC TGT CTC AAA G 3’

引物2：5’CCC ACC TAT CCT GCA CAT TCT T 3’。

步骤b中所述的荧光探针的核苷酸序列为：

探针WT：FAM-TCCACGGGGTCTTTCCGTCTTG-TAMRA

探针A2074C：HEX-TCCACGGGGTCTTGCCGTCTT-TAMRA

探针A2075G：HEX-TCCACGGGGTCTCTCCGTCTTG-TAMRA。

步骤c中的三种对照质粒包括一个野生型对照质粒(命名为质粒WT)，两个突变型对照质粒(分别命名为质粒A2074C和质粒A2075G)。其中野生型对照质粒是采用2074和2075位点为野生型的TA克隆重组质粒(见实施例2)，是将包含2074和2075位点的一段308bp的野生型基因序列通过PCR扩增、产物回收后，使用大连宝生物有限公司生产的TA克隆试剂盒连接到pMD18-T载体(试剂盒中自带)中构建而成的。另外，使用上海赛百盛基因技术有限公司生产的“定点诱变试剂盒”和上海基康生物技术有限公司设计的突变引物(引物序列参见实施例2)，运用定点诱变试剂盒将野生型质粒(质粒WT)诱变成为含有2074和2075位点突变的重组质粒(即分别命名的质粒A2074C和质粒A2075G)(见实施例2)。

步骤d中的反应试剂使用大连宝生物有限公司生产的premix Ex Taq^TM混合液。此混合液中已经将DNA聚合酶、反应用Buffer、dNTPs等试剂预混在一起，是一种2×浓度的premixtype试剂。该混合液中的DNA聚合酶使用了改良后的热启动法用DNA聚合酶TaKaRa Ex TaqHS，与TaKaRa精心研制的Real Time PCR用buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的实时荧光定量PCR扩增反应。

本发明对各种影响反应特异性的因素进行了优化，经过优化的反应体系和反应条件具有更高的扩增效率，能快速准确检测出特定位点基因突变情况。

选取经克隆测序确认的空肠弯曲杆菌样本，用本发明进行检测，准确率为100％，结果具有可重复性，稳定性较好。

本发明优良效果如下：

本发明通过对弯曲杆菌23S rDNA基因比对，设计针对空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)的特异性扩增引物，可以特异性地将空肠弯曲杆菌属与其他肠道细菌鉴别开来。

本发明通过使用大连宝生物有限公司精心研制的premix Ex Taq^TM混合液，有效抑制了非特异性的PCR扩增，提高了PCR的扩增效率。同时，本发明通过对引物和探针浓度、退火温度等影响扩增和检测特异性的因素进行优化，解决了非特异性探针结合的问题，从而可以准确无误的鉴别不同的耐药突变基因型。另外，本发明可以在同一反应条件下，同时检测位置相邻的两个突变点。本发明从抽提细菌DNA到报告整个过程只需2小时左右，比测序等其他检测突变的方法操作简便、准确快速。

国外已经建立的荧光定量PCR方法，是通过比较熔解曲线和Tm值差异来检测和鉴别突变类型。本发明是使用特异性探针检测耐药突变，其检测的特异性更强，灵敏度更高，荧光信号的判读更直观和准确。

附图说明

图1是本发明所设计的引物特异性考查结果。该图是运用所设计的引物分别扩增几种肠道细菌的PCR扩增后的琼脂糖电泳图，标记中的1号为空肠弯曲杆菌标准株ATCC33291(购自美国标准物保藏中心)，2号为大肠杆菌ATCC25922(购自美国标准物保藏中心)，3号为粪肠球菌ATCC29212(购自美国标准物保藏中心)，4号为沙门氏菌C77431(购自中国兽医微生物菌种保藏中心)，图中：M为DL2000的DNA marker。图中只有1号菌扩增出147bp的片断，表明所设计的引物特异性较好，可以很好的鉴别空肠弯曲杆菌与其他肠道优势菌群。

图2是三种标准对照质粒的测序图谱。

其中图2A为质粒WT插入序列的测序图谱。质粒WT为野生型对照质粒。

图2B为质粒A2074C插入序列的测序图谱。质粒A2074C为发生了A2074C突变的诱变质粒。

图2C为质粒A2075G插入序列的测序图谱。质粒A2075G为发生了A2075G突变的诱变质粒。

对比以上三种对照质粒的插入序列的测序结果可以确定三种质粒的基因类型。这三种已知基因类型的质粒可以作为标准对照质粒用于考查本发明中所建方法的特异性。

图3是TaqMan荧光定量PCR检测标准对照质粒的特异性考查结果

其中，图3A显示反应条件优化以后，三条探针特异性检测三种对照质粒的总体结果。其中横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值。图中显示的三个荧光信号分别在图B、C和D中逐一说明。

图3B-图3D分别是三条探针检测三种对照质粒的结果。

图3B为野生型探针(探针WT)的特异性检测结果。图中只有野生型对照质粒(质粒WT)具有荧光信号，其他突变型对照质粒则没有荧光信号，表明野生型探针的检测特异性较好。

图3C为突变型探针1(探针A2074C)的特异性检测结果。图中只有突变型对照质粒A2074C具有荧光信号，而野生型对照质粒和另外一个突变型对照质粒则没有荧光信号，表明突变型探针1的检测特异性较好，可以鉴别A2074C的特征性突变。

图3D为突变型探针2(探针A2075G)的特异性检测结果。图中只有突变型对照质粒A2075G具有荧光信号，而野生型对照质粒和另外一个突变型对照质粒则没有荧光信号，表明突变型探针2的检测特异性较好，可以鉴别A2075G的特征性突变。

图4是TaqMan荧光定量PCR检测空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药突变位点的结果

其中，图4A为三条探针分别检测空肠弯曲杆菌ATCC33291的结果，图中只有野生型探针的荧光信号而没有其他两条探针的荧光信号，表明所检测的细菌样本为空肠弯曲杆菌大环内酯类敏感菌株，没有发生相关的耐药突变。此结果与测序结果相同。

图4B为三条探针分别检测空肠弯曲杆菌耐药株95064(法国弯曲杆菌和幽门螺旋杆菌研究中心惠赠)的结果，图中只有突变型探针1(探针A2074C)的荧光信号而没有其他两条探针的荧光信号，表明所检测的细菌样本为空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药突变株，细菌发生了A2074C的突变。此结果与测序结果和文献报道结果一致(耐药株95064的文献见：Vacher，S.，A.Menard，E.Bernard，and F.Megraud.2003.PCR-restriction fragment length polymorphismanalysis for detection of point mutations associated with macrolide resistance in Campylobacter spp.Antimicrob Agents Chemother 47：1125-8.)。

图4C为三条探针分别检测细菌样本3和样本4的结果，图中没有任何探针的荧光信号，表明所检测的为非弯曲杆菌属的阴性样本。此结果与细菌样本鉴定结果一致，样本3为大肠杆菌DH5α，样本4为大肠杆菌ATCC25922，其中大肠杆菌DH5α是对照质粒的转化载体。此结果表明我们所建立的检测方法可以有效鉴别空肠弯曲杆菌和肠道优势菌大肠杆菌，可以有效扣除大肠杆菌的基因背景，进一步证实三条探针的检测特异性。

具体实施方式

实施例1、弯曲杆菌大环内酯类药物耐药性相关靶基因序列的选择、引物和探针设计与合成

利用NCBI中的BLAST工具，比较空肠弯曲杆菌属23S rDNA基因序列与其他肠道细菌序列差异。利用Beacon Designer2.1(分子信标设计软件2.1)设计一对引物，以特异性扩增空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药性相关靶基因。其扩增靶基因长度为147bp，其基因序列与其他肠道细菌同源性不高，可以保证PCR反应特异性扩增空肠弯曲杆菌属大环内酯类耐药相关基因。其中引物的特异性通过普通PCR扩增来考查。从图1的结果看出，所设计的引物只能特异性扩增空肠弯曲杆菌菌株，而对于其他肠道优势菌群(大肠杆菌、肠球菌和沙门氏菌)呈阴性结果，该发明所设计的引物的特异性良好。

在该发明所设计的上下游引物之间，我们设计了特异性探针分别与突变和野生位点结合。同时，我们运用Beacon Designer 2.1设计三条TaqMan探针，其中一条为野生型探针，另外两条为突变型探针。其中突变型探针分别检测靶基因序列中2074位和2075位的点突变。探针长度为15～30个碱基，5’端以FAM或HEX标记，3’端以TAMRA标记。所有引物和探针由上海基康生物技术有限公司合成。

引物1：5’CGA GAT GGG AGC TGT CTC AAA G 3’

引物2：5’CCC ACC TAT CCT GCA CAT TCT T 3’。

探针WT：FAM-TCCACGGGGTCTTTCCGTCTTG-TAMRA

探针A2074C：HEX-TCCACGGGGTCTTGCCGTCTT-TAMRA

探针A2075G：HEX-TCCACGGGGTCTCTCCGTCTTG-TAMRA

实施例2、三种对照质粒的构建

1.野生型对照质粒(质粒WT)的构建

参考Amera Gibreel(Gibreel，A.，and D.E.Taylor.2006.Macrolide resistance inCampylobacter jejuni and Campylobacter coli.J.Antimicrob.Chemother.58：243-255.)一文，PCR扩增空肠弯曲杆菌标准菌株ATCC 33291(购自美国标准物保藏中心)23S rDNAV区的一段308bp的核酸序列。所扩增的PCR产物胶回收以后，使用大连宝生物有限公司生产的TA克隆试剂盒，按照该试剂盒说明书所介绍的方法，将PCR产物连接到pMD18-T载体(该载体为该试剂盒自带)中，转化至大肠杆菌DH5α中，从而构建野生型重组质粒。重组质粒PCR产物测序，确定其插入序列为野生型序列，不含有2074和2075位点突变。

2.突变型对照质粒的构建

首先，通过上海基康生物技术有限公司设计并合成定点诱变引物(序列如下所列出的A2074C诱变引物和A2075G诱变引物)，同时，购买上海赛百盛基因技术有限公司的定点诱变试剂盒，按照该试剂盒的说明书所介绍的的定点诱变的方法将野生型质粒(命名为质粒WT)诱变成为含有2074和2075位点突变的重组质粒(质粒A2074C和质粒A2075G)。对重组质粒PCR产物测序，确定突变质粒A2074C含有A2074C的位点突变，突变质粒A2075G含有A2075G的位点突变。

其中A2074C诱变引物为：

2074-FP：CGCGGCAAGACGGCAAGACCCCGTGGAC；

2074-RP：GTCCACGGGGTCTTGCCGTCTTGCCGCG

A2075G 诱变引物为：

2075-FP：CGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGGACC

2075-RP：GGTCCACGGGGTCTCTCCGTCTTGCCGCG。

三种质粒插入序列的测序结果如下：

质粒WT插入序列：GGCAAACGATC-TTGTCGGTTAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAAAGA

质粒A2074C插入序列：GCAGATCGATCATTGTCGGTTAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAAAGA

质粒A2075G插入序列：GCATATCGATC-TTGTCGGTTAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAAAGA

质粒WT插入序列：GGGATCCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACC

质粒A2074C插入序列：GGGATCCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGCAAGACCCCGTGGACC

质粒A2075G插入序列：GGGATCCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGGACC

质粒WT插入序列：TTTACTACAGCTTGACACTGCTACTTGGATAAGAATGTGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAGTATA

质粒A2074C插入序列：TTTACTACAGCTTGACACTGCTACTTGGATAAGAATGTGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAGTATA

质粒A2075G插入序列：TTTACTACAGCTTGACACTGCTACTTGGATAAGAATGTGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAGTATA

质粒WT插入序列：TGACGCCAGTTGTATATGAGCCATTGTTGAGATACCACTCTTTCTTATTTGGGTAGCAACCCAGCTTGAA

质粒A2074C插入序列：TGACGCCAGTTGTATATGAGCCATTGTTGAGATACCACTCTTTCTTATTTGGGTAGCTAACCAGCTTGAA

质粒A2075G插入序列：TGACGCCAGTTGTATATGAGCCATTGTTGAGATACCACTCTTTCTTATTTGGGTAGCTAACCAGCTTGAA

实施例3、TaqMan荧光定量PCR反应体系和反应条件优化

TaqMan荧光定量PCR反应退火温度的选择：为了降低非特异性扩增，同时保证较高的扩增效率，我们结合引物和探针的Tm值，设定了58℃，62℃和64℃三个退火温度。

TaqMan荧光定量PCR反应中引物和探针比例的优化：为避免探针与模板非特异性结合，参考其他相关TaqMan荧光定量PCR反应中引物和探针的浓度设定，利用方阵设计原理，我们选定了三个比例10∶3，5∶3和5∶1进行比较，以确定最佳引物和探针比例(见表1-4)。

TaqMan荧光定量PCR反应体系为25μl，其中包括以下组成(见表1)。定量PCR扩增采用Bio-Rad(伯乐)公司IQ^TM5PCR扩增仪，程序为95℃3分钟1循环；95℃10秒、58/62/64℃20秒，共计50个循环。反应过程中收集荧光信号。

表1 Taqman荧光定量PCR反应体系

实施例4、TaqMan荧光定量PCR反应检测特异性考查

将通过人工构建的三个对照质粒作为特异性考查检测对象，进行TaqMan荧光定量PCR反应。反应体系和反应条件组合如下表2：

表2 TaqMan荧光定量PCR反应体系和反应条件组合

对于以上六种组合的特异性检测结果列表如表3(表中的检测值用C_T值表示)，C_T值大于40的判定为阴性结果，用NA表示。

根据表3中的检测结果，我们可以确定最佳TaqMan荧光定量PCR反应为组合5的反应体系和反应条件(退火温度为62℃，引物和探针浓度比例为5∶1)。然而在此最佳组合下，探针A2074C和探针A2075G的特异性还有待提高。故我们考虑加入二甲亚砜(DMSO)以提高引物和探针的特异性，并通过调节阈值来达到最佳的检测效果。最终确定的对于不同的探针的反应条件和检测结果见表4。从图3(A-D图)可以看出，几条探针的特异性良好，野生型探针(探针WT)可以将野生型对照质粒与其他两种突变型质粒鉴别开来，突变型探针1(探针A2074C)可以针对性检测出A2074C的突变，突变型探针2(探针A2075G)可以特异性检测出A2075G的突变。

表3 Taqman荧光定量PCR反应组合的特异性检测结果

表4 TaqMan荧光定量PCR反应最佳反应条件的确定及特异性检测结果

实施例5、TaqMan荧光定量PCR检测空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药突变位点

1.细菌DNA的提取

复苏细菌：其菌株包括空肠弯曲杆菌大环内酯类敏感株ATCC33291，空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药株95064(该菌株由法国弯曲杆菌和幽门螺旋杆菌研究中心惠赠，文献见Vacher，S.，A.Menard，E.Bernard，and F.Megraud.2003.PCR-restriction fragment length polymorphismanalysis for detection of point mutations associated with macrolide resistance in Campylobacter spp.Antimicrob Agents Chemother 47：1125-8.)，大肠杆菌DH5α(对照质粒的转化载体菌)和大肠杆菌ATCC25922。

取1ml细菌菌悬液，6000rpm离心10分钟，去上清，沉淀加入50-100ul灭菌双蒸水，重悬细菌，混悬液在沸水中煮沸10分钟，立即冰浴5-15分钟，12000rpm离心2分钟，上清转移到新的离心管中，作为模板DNA备用。

2.荧光定量PCR反应

采用优化的反应体系和最佳的反应条件，进行荧光定量PCR反应，检测所提取的细菌DAN样本。

3.荧光定量PCR结果分析

图4(A-C图)显示，对于空肠弯曲杆菌ATCC33291菌株的检测，图中只有一个野生型探针(探针WT)的荧光信号，而没有任何相应突变型探针的信号；对于空肠弯曲杆菌耐药菌株95064的检测，图中只有一个突变型探针(探针A2074C)的荧光信号，而没有野生型和另外一个突变型探针(探针A2075G)的荧光信号。而对于另外两株大肠杆菌则没有任何荧光信号。表明探针的特异性良好，此方法可以很好的鉴别出空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药的基因类型(野生型、A2074C突变型和A2075G突变型)

Claims

1、一种快速检测空肠弯曲杆菌大环内酯类药物耐药突变点的荧光定量PCR方法，其特征在于利用特异性TaqMan探针，同时检测空肠弯曲杆菌23S rDNA中的2074位和2075位的基因突变，它包括下述步骤：

a、根据空肠弯曲杆菌大环内酯耐药突变位点的靶基因序列设计、合成引物和荧光探针；

b、将引物、荧光探针与反应试剂配比、组合，构成实时荧光定量PCR反应体系；

c、优化实时荧光定量PCR的反应条件，其中退火温度为58℃至64℃；

d、进行实时荧光定量PCR反应，鉴别人工构建的野生型和突变型对照质粒；

e、进行实时荧光定量PCR反应，鉴别空肠弯曲杆菌耐药相关基因的突变情况。

其中：步骤a中所述的空肠弯曲杆菌大环内酯耐药性突变位点的靶基因序列位于一对引物之间，序列长度为147bp，该基因的核苷酸序列如下：

CGAGATGGGAGCTGTCTCAAAGAGGGATCCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTC

CTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAGCTTGACACTGCT

ACTTGGATAAGAATGTGCAGGATAGGTGGG；

步骤a中所述的引物对的核苷酸序列如下：

引物1：5’CGA GAT GGG AGC TGT CTC AAA G 3’，

引物2：5’CCC ACC TAT CCT GCA CAT TCT T 3’；

步骤a中所述的荧光探针为TaqMan探针，其探针5’端为FAM或HEX荧光基团标记，3’端标记荧光淬灭集团TAMRA，所述的荧光探针的序列为：

探针WT：(FAM)-TCCACGGGGTCTTTCCGTCTTG-(TAMRA)，

探针A2074C：(HEX)-TCCACGGGGTCTTGCCGTCTT-(TAMRA)，

探针A2075G：(HEX)-TCCACGGGGTCTCTCCGTCTTG-(TAMRA)。

2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述的荧光定量PCR反应体系采用大连宝生物有限公司的Premix Ex Taq^TM试剂，该反应体系中所述的引物与探针的体积比为10∶1～10∶6；还包括在整个反应体系中添加1～2％体积的二甲亚砜。

3、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中所述的荧光定量PCR反应条件为：94℃/95℃10秒～5分钟1循环；94℃/95℃5～10秒、58～64℃20秒，共计30～50个循环。