CN112795653A - Kras基因突变检测的引物探针组、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了KRAS基因突变检测的引物探针组、试剂盒及其应用。该引物探针组包括：检测KRAS基因突变的引物对；检测突变型KRAS基因的突变型探针，包括G12D探针、G12V探针、G12S探针、G12C探针、G12A探针、G12R探针和G13D探针；以及检测野生型KRAS基因的野生型探针。申请人通过研究发现，上述引物对扩增的特异性和效率都比较高，并且有较高的灵敏度。因此针对7个突变位点设计相应的检测探针，将所有突变位点的检测置于同一体系中，配合使用特异性引物和特异性探针，根据检测结果对有无突变做出判断，实现对KRAS基因突变的高灵敏度检测，同时有效兼顾了检测成本问题。

Description

KRAS基因突变检测的引物探针组、试剂盒及其应用
技术领域
本申请涉及分子诊断技术领域，尤其是涉及KRAS基因突变检测的引物探针组、试剂盒及其应用。
背景技术
RAS基因编码的RAS蛋白分子量为21kD，主要位于细胞膜内侧，是具有GTPase活性的信号转导蛋白。RAS蛋白作为不可或缺的分子开关，在信号转导通路中发挥至关重要的作用。一般情况下RAS蛋白与GDP结合处于非激活状态，当胞外信号传递至胞内(如EGF配体和受体结合)时，RAS则以与GTP结合的形式存在，激活丝苏氨酸激酶级联放大效应，从而进一步激活下游的信号转导通路。然而，KRAS基因发生突变后，表达的RAS蛋白为GAP非敏感型，抑制RAS与GAP反应，引起RAS的持续活化，不断地与GTP结合使下游的RAF-MEK-ERK通路持续激活，导致细胞持续生长并阻止细胞凋亡。
RAS基因家族中与人类肿瘤相关的有三种，HRAS、KRAS和NRAS。其中，KRAS基因对于人类肿瘤的影响最大。KRAS基因定位于人12号染色体短臂(12p12.1)，长约35kb，其mRNA由6个外显子组成。研究表明，KRAS基因突变见于90％的胰腺癌、35％～40％的结直肠癌及20％的非小细胞肺癌患者。KRAS基因突变多为点突变，主要集中在2号外显子第12、13、59、61密码子和4号外显子的第117、146密码子。其中第12密码子G12D、G12V、G12C、G12S、G12A、G12R和13密码子G13D这7种热点突变占KRAS基因突变的90％以上。
表皮生长因子受体(EGFR)是目前肿瘤靶向治疗的主要作用靶点。EGFR的靶向药物包括EGFR单克隆抗体药西妥昔单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗，以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼。然而，肿瘤组织发生KRAS基因突变的肿瘤患者对此类靶向药物完全耐药。美国国立综合癌症网络(NCCN)明确指出：所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态，并且不建议KRAS基因突变的非小细胞肺癌患者使用特罗凯进行分子靶向治疗。可见，KRAS基因突变的检测对于提高癌症治疗的针对性具有重要意义。
目前，基因突变检测的金标准是Sanger测序法，该技术的优点是实验方法简单，结果直观可靠，成本较低。经过几十年的临床应用，已经得到广大医务人员的认可，但其检测灵敏度较低，且检测周期较长。此外，还有几种可用方法：如高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)，该方法是通过饱和染料结合于PCR扩增产物监控其形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，其灵敏度在5％左右；扩增阻滞突变系统(amplificationrefractory mutation system，ARMS)，此方法根据引物3′端末位碱基必须与其模板DNA链互补才能进行有效的扩增的原理，设计针对基因突变位点的引物序列，从而检测突变基因，其灵敏度在1％左右；以及数字PCR方法，虽然数字PCR的灵敏度能达到0.01％，但是数字PCR系统成本高昂，通量有限，操作繁琐，并且目前qPCR的灵敏度也能够很好的满足需求，故现阶段数字PCR平台并未普及。这些方法都有各自的不足，使得目前在临床上对于KRAS基因突变的检测应用仍不理想，无法同时兼顾检测成本和灵敏度问题。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种成本低、灵敏度高的KRAS基因突变检测的引物探针组、试剂盒及其应用。
本申请的第一方面，提供KRAS基因突变检测的引物探针组，该引物探针组包括：
检测KRAS基因突变的引物对：
上游引物：5'-CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC-3'(SEQ ID No.1)，
下游引物：5'-TCTATTGTTGGATCATATTCGTCCAC-3'(SEQ ID No.2)；
检测突变型KRAS基因的突变型探针，包括：
检测KRAS基因第12密码子G12D突变的G12D探针：5'-TACGCCATCAGCTC-3'(SEQ IDNo.5)，
检测KRAS基因第12密码子G12V突变的G12V探针：5'-TACGCCAACAGCTC-3'(SEQ IDNo.6)，
检测KRAS基因第12密码子G12S突变的G12S探针：5'-TACGCCACTAGCTC-3'(SEQ IDNo.7)，
检测KRAS基因第12密码子G12C突变的G12C探针：5'-TACGCCACAAGCTC-3'(SEQ IDNo.8)，
检测KRAS基因第12密码子G12A突变的G12A探针：5'-TACGCCAGCAGCTC-3'(SEQ IDNo.9)，
检测KRAS基因第12密码子G12R突变的G12R探针：5'-TACGCCACGAGCTC-3'(SEQ IDNo.10)，
检测KRAS基因第13密码子G13D突变的G13D探针：5'-TACGTCACCAGCTC-3'(SEQ IDNo.11)；
检测野生型KRAS基因的野生型探针，包括：5'-TACGCCACCAGCTC-3'(SEQ IDNo.12)。
根据本申请实施例的引物探针组，至少具有如下有益效果：
引物会影响扩增片段的长度，而不同扩增长度又对检测灵敏度有一定影响，同时不同引物的扩增效率也不相同。申请人通过研究发现，上述引物对扩增的特异性和效率都比较高，并且有较高的灵敏度。同时，由于KRAS基因的第12第13密码子一般至多只会发生一个位点突变，因此针对7个突变位点设计相应的检测探针，通过与野生型探针进行比对，将所有突变位点的检测置于同一体系中，配合使用特异性引物和特异性探针，根据检测结果对有无突变做出判断，实现对KRAS基因突变的高灵敏度检测。另外，在检测时可以采用常规的qPCR方法，有效兼顾了检测成本问题。
在本申请的一些实施方式中，野生型探针和/或突变型探针进行了锁核酸修饰。锁核酸(LNA)是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2'-O，4'-C-亚甲基-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2'-O位和4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥硫亚甲基桥或胺亚甲基桥并连接成环形，形成的环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故在PCR反应中LNA对模板DNA有很好的识别能力和强大的亲和力，从而有效提高探针的特异性和灵敏度。
在本申请的一些实施方式中，G12D探针的第5、7、8个碱基进行了锁核酸修饰，G12V探针的第4、7、8个碱基进行了锁核酸修饰，G12S探针的第7、8个碱基进行了锁核酸修饰，G12C探针的第4、7、9个碱基进行了锁核酸修饰，G12A探针的第5、8个碱基进行了锁核酸修饰，G12R探针的第5、7个碱基进行了锁核酸修饰，G13D探针的第5、7个碱基进行了锁核酸修饰，野生型探针的第6、7个碱基进行了锁核酸修饰。
在本申请的一些实施方式中，还包括内参引物和内参探针。通过内参引物和内参探针的设置，校正检测过程中可能存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
在本申请的一些实施方式中，内参引物包括检测ACTB基因的引物对：
上游引物：5'-CTTTCTGCATGTCCCCCGT-3'(SEQ ID No.3)，
下游引物：5'-AGTCCATCACGATGCCAGTG-3'(SEQ ID No.4)。
ACTB基因是一个管家基因，在多数组织和细胞内表达水平相对恒定，因此将其作为KRAS突变检测的对照以保证检测结果的准确性。
在本申请的一些实施方式中，内参探针为检测ACTB基因的探针：5'-ATGTACGTTGCTATCCA-3'(SEQ ID No.13)。
在本申请的一些实施方式中，探针的5'端标记有报告基团，探针的3'端标记有淬灭基团。
在本申请的一些实施方式中，报告基团选自FAM、ROX、VIC、HEX、TET、JOE、NED、Cy5、Cy3。
在本申请的一些实施方式中，淬灭基团选自BQH1、BHQ2、BHQ3、TAMARA、NFQ-MGB。
在本申请的一些实施方式中，淬灭基团为NFQ-MGB。探针的3'端的NFQ基团为非荧光淬灭基团，其本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，提高信噪比从而提高检测的灵敏度。同时其上连接的MGB修饰基团能够嵌入DNA双螺旋结构中的小沟形成非共价结合，将其与探针结合可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，方便了探针的设计，提高了探针设计的成功率，同时还提高其分辨能力。
通过采用上述技术方案，本申请采用的报告基团均为常用的荧光基团，而且突变型基因探针标记的荧光基团与野生型基因探针标记的荧光基团不同，在同一体系中进行荧光定量PCR时，可以进行有效区分，便于实验结果的观察和统计。
在本申请的一些实施方式中，野生型探针和突变型探针的报告基团不同。由于KRAS基因的第12、第13密码子一般至多只会发生一个位点突变，因此，使野生型探针和突变型探针分别修饰不同发光波段的报告基团即可实现对第12和第13密码子是否发生突变的检测。
本申请的第二方面，提供试剂盒，该试剂盒包括上述的引物探针组。
在本申请的一些实施方式中，引物探针组为引物探针混合液。
在本申请的一些实施方式中，引物探针混合液中引物对的浓度为10～50μmol/L，突变型探针和野生型探针的浓度为1～20μmol/L。
在本申请的一些实施方式中，引物探针混合液中引物对的浓度为20μmol/L，突变型探针和野生型探针的浓度为10μmol/L，另外，内参引物和内参探针的浓度可以比照上述引物对和探针的浓度分别设置为20μmol/L和10μmol/L。
在本申请的一些实施方式中，还包括Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液。其中，Mg2 +是DNA聚合酶的辅因子，对扩增效率、扩增特异性等具有影响。Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液的浓度可以根据本领域的常规方法进行调整。
在本申请的一些实施方式中，还包括DNA提取试剂。
在本申请的一些实施方式中，DNA提取试剂为QIAamp DNA Blood Mini Kit。
在本申请的一些实施方式中，上述试剂盒基于实时荧光PCR的方法进行检测。
在本申请的一些实施方式中，实时荧光PCR检测的方法为：
从待测样品中提取DNA作为模板，优选的，模板浓度10ng/μl～50ng/μl；
利用上述引物探针组或试剂盒，以提取的模板配制PCR扩增反应体系；
对上述PCR扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增，优选的，PCR扩增反应的程序为：37℃，5min，1个循环；95℃，10min，1个循环；95℃，30s变性，64℃，40s退火，72℃，20s延伸，共进行5个循环；95℃，30s变性，60℃，40s退火，72℃，20s延伸，共进行40个循环；98℃，10min，1个循环；其中，在延伸阶段采集荧光信号；
根据PCR扩增反应的结果，判断待测样品中是否存在KRAS基因突变。
本申请的第三方面，提供上述的引物探针组或试剂盒在制备癌症的预后试剂中的应用。
在本申请的一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌中的至少一种。研究表明，KRAS基因突变可作为非小细胞肺癌无进展生存期重要的不良预后因子，而且其突变与胰腺癌患者的无进展生存期等存在一定联系。另一方面，KRAS基因突变与免疫治疗结直肠癌、非小细胞肺癌的疗效关系密切，携带KRAS基因突变的结直肠癌患者对帕尼单抗或西妥昔单抗的反应不良，而KRAS基因突变还与EGFR-TKI治疗非小细胞肺癌的疗效有关。因此，通过对患者KRAS基因突变位点的检测能够在一定程度上实现对上述癌症预后判断的辅助作用。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1
本实施例提供一种引物探针组，该引物探针组包括用于检测人KRAS基因突变的引物对，其设计方法如下：
从NCBI上搜索到人KRAS基因cds序列，利用primer软件设计能扩增出包含第12、第13密码子片段的上下游引物。根据引物设计原理，设计了多对引物。合成包括如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示引物的多对引物，并采用PCR技术对6对引物进行测试，发现引物会影响扩增片段的长度，不同扩增长度对该实验方案的灵敏度会有影响。并且，不同引物扩增的效率不同。结果表明，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物的扩增特异性、效率均较高，且采用该引物检测的灵敏度更高。该引物对的核苷酸序列如下所示：
正向引物：5'-CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC-3'(SEQIDNo.1)；
反向引物：5'-TCTATTGTTGGATCATATTCGTCCAC-3'(SEQIDNo.2)。
该引物探针组中还包括作为内参引物的检测ACTB基因的引物对，其设计方法与检测KRAS基因突变的引物对的设计方法相同，其扩增特异性、效率以及灵敏度均较高。最终得到的内参引物的核苷酸序列如下所示：
正向引物：5'-CTTTCTGCATGTCCCCCGT-3'(SEQIDNo.3)；
反向引物：5'-AGTCCATCACGATGCCAGTG-3'(SEQIDNo.4)。
该引物探针组中还针对KRAS基因以及内参ACTB基因cds序列的突变位点设计了野生型基因探针和突变型基因探针，探针的序列信息如表1所示
表1探针序列表
Figure BDA0002939381370000061
Figure BDA0002939381370000071
其中，FAM、VIC、ROX表示其5'端的报告基团，MGB-NFQ表示其3'端的淬灭基团；“+”号表示符号后一位碱基进行了锁核酸修饰，即G12V探针的第4、7、8个碱基进行了锁核酸修饰，G12S探针的第7、8个碱基进行了锁核酸修饰，G12C探针的第4、7、9个碱基进行了锁核酸修饰，G12A探针的第5、8个碱基进行了锁核酸修饰，G12R探针的第5、7个碱基进行了锁核酸修饰，G13D探针的第5、7个碱基进行了锁核酸修饰，野生型探针的第6、7个碱基进行了锁核酸修饰。
利用本申请实施例所提供的引物探针组中的特异性探针与特异性引物配合使用，能够实现KRAS基因突变的高灵敏度检测。
实施例2
本实施例提供一种试剂盒，该试剂盒包括实施例1中的引物探针组和PCR MIX。PCRMIX包括Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液等成分组成的反应体系和DNA提取试剂，该DNA提取试剂为QIA amp DNA Blood Mini Kit。本实施例中利用上述试剂盒中的引物、探针等组分配制成得到PCR反应体系的具体成分参见表2。
表2.反应体系
Figure BDA0002939381370000072
Figure BDA0002939381370000081
实验过程中，将表1的PCR反应液与2μl DNA模板混合，得到20μl PCR扩增反应体系。
实施例3
采用上述的试剂盒对配制的突变频率为0.5％的G12D、G12V、G12S、G12C、G12A、G12R、G13D阳性对照品进行检测，具体的检测方法如下：
(1)以制备的突变频率为0.5％的G12D、G12V、G12S、G12C、G12A、G12R、G13D阳性参考品为DNA模板；
(2)按照实施例2配置7个实时荧光PCR反应体系，每个反应体系18μl，取2μl的DNA模板加入PCR反应体系并置于96孔板或8联管中，封好膜或盖好管盖，轻轻涡旋混合均匀并瞬时离心；
(3)将离好心的96孔板或8联管放入实时荧光PCR仪中，设置反应程序进行PCR扩增，并在延伸阶段采集荧光信号。PCR扩增反应程序为：37℃，5min，1个循环；95℃，10min，1个循环；95℃，30s变性，64℃，40s退火，72℃，20s延伸，共进行5个循环；95℃，30s变性，60℃，40s退火，72℃，20s延伸，共进行40个循环；98℃，10min，1个循环。
实验结果表明，本申请实施例所提供的实时荧光PCR反应体系在同一反应体系能够对7个突变位点的突变型和野生型基因进行扩增。不同的阳性对照品均能够形成典型的对数扩增“S”型曲线，而与之对应的阴性对照组(无模板)无扩增曲线，并且Ct值符合要求。上述结果表明，本申请实施例所提供的引物探针组或试剂盒的检测灵敏度可达0.5％，灵敏度高，特异性好，检测成本低。
综合上述结果可以看到，本申请实施例所提供的引物探针组以及相应的试剂盒能够通过实时荧光PCR的方法同时检测样本中KRAS基因第12、第13密码子有无突变，灵敏度高，特异性好，可用于指导临床用药。并且操作步骤简单，检测周期短，检测效率较高；而且，无需利用成本高昂的数字PCR系统即可实现较高的灵敏度，在提高检测准确性的同时降低了检测成本。
实施例4
本实施例采用实施例2中的PCR反应液或试剂盒检测人全血KRAS基因第12、第13密码子，具体的检测方法为：
(1)基因组DNA提取：使用QIA amp DNA Blood Mini Kit，参照试剂盒说明书提取正常外周血基因组DNA。获得的基因组DNA使用NanoDrop100检测DNA纯度，凝胶电泳检测DNA的完整性，qubit4.0荧光计定量，DNA浓度范围在10ng/μl～50ng/μl；
(2)按照实施例2配置实时荧光PCR反应体系，每个反应体系18μl，取2μl步骤(1)得到的DNA模板加入PCR反应体系并置于96孔板或8联管中，封好膜或盖好管盖，轻轻涡旋混合均匀并瞬时离心；
(3)将离好心的96孔板或8联管放入实时荧光PCR仪中，设置反应程序进行PCR扩增，并在延伸阶段采集荧光信号。PCR扩增反应程序为：37℃，5min，1个循环；95℃，10min，1个循环；95℃，30s变性，64℃，40s退火，72℃，20s延伸，共进行5个循环；95℃，30s变性，60℃，40s退火，72℃，20s延伸，共进行40个循环；98℃，10min，1个循环。
根据扩增结果对样本中KRAS基因是否存在突变进行判断。
实施例5
本实施例提供一种胰腺癌/结直肠癌/非小细胞肺癌的预后判断试剂，该试剂中包括实施例1的引物探针组。本领域诸多研究表明，KRAS基因突变与非小细胞肺癌、胰腺癌的无进展生存期等存在一定联系，并且与免疫治疗结直肠癌、非小细胞肺癌的疗效关系密切。因此，通过对患者KRAS基因突变位点的检测能够在一定程度上实现对上述癌症预后判断的辅助作用。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市核子基因科技有限公司
<120> KRAS基因突变检测的引物探针组、试剂盒及其应用
<130> 1
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctgctgaaa atgactgaat ataaac 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctattgttg gatcatattc gtccac 26
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctttctgcat gtcccccgt 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agtccatcac gatgccagtg 20
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tacgccatca gctc 14
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tacgccaaca gctc 14
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tacgccacta gctc 14
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tacgccacaa gctc 14
<210> 9
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tacgccagca gctc 14
<210> 10
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tacgccacga gctc 14
<210> 11
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tacgtcacca gctc 14
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tacgccacca gctc 14
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
atgtacgttg ctatcca 17

Claims (10)

1.KRAS基因突变检测的引物探针组，其特征在于，包括：
检测KRAS基因突变的引物对：
上游引物：5'-CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC-3'，
下游引物：5'-TCTATTGTTGGATCATATTCGTCCAC-3'；
检测突变型KRAS基因的突变型探针，包括：
检测KRAS基因第12密码子G12D突变的G12D探针：5'-TACGCCATCAGCTC-3'，
检测KRAS基因第12密码子G12V突变的G12V探针：5'-TACGCCAACAGCTC-3'，
检测KRAS基因第12密码子G12S突变的G12S探针：5'-TACGCCACTAGCTC-3'，
检测KRAS基因第12密码子G12C突变的G12C探针：5'-TACGCCACAAGCTC-3'，
检测KRAS基因第12密码子G12A突变的G12A探针：5'-TACGCCAGCAGCTC-3'，
检测KRAS基因第12密码子G12R突变的G12R探针：5'-TACGCCACGAGCTC-3'，
检测KRAS基因第13密码子G13D突变的G13D探针：5'-TACGTCACCAGCTC-3'；
检测野生型KRAS基因的野生型探针，包括：5'-TACGCCACCAGCTC-3'。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述野生型探针和/或所述突变型探针进行了锁核酸修饰；
优选的，所述G12D探针的第5、7、8个碱基进行了锁核酸修饰，所述G12V探针的第4、7、8个碱基进行了锁核酸修饰，所述G12S探针的第7、8个碱基进行了锁核酸修饰，所述G12C探针的第4、7、9个碱基进行了锁核酸修饰，所述G12A探针的第5、8个碱基进行了锁核酸修饰，所述G12R探针的第5、7个碱基进行了锁核酸修饰，所述G13D探针的第5、7个碱基进行了锁核酸修饰，所述野生型探针的第6、7个碱基进行了锁核酸修饰。
3.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，还包括内参引物和内参探针；
优选的，所述内参引物包括检测ACTB基因的引物对：
上游引物：5'-CTTTCTGCATGTCCCCCGT-3'，
下游引物：5'-AGTCCATCACGATGCCAGTG-3'；
优选的，所述内参探针为检测所述ACTB基因的探针：5'-ATGTACGTTGCTATCCA-3'。
4.根据权利要求1至3任一项所述的引物探针组，其特征在于，所述探针的5'端标记有报告基团，所述探针的3'端标记有淬灭基团；
优选的，所述报告基团选自FAM、ROX、VIC、HEX、TET、JOE、NED、Cy5、Cy3；
优选的，所述淬灭基团选自BQH1、BHQ2、BHQ3、TAMARA、NFQ-MGB；
优选的，所述野生型探针和所述突变型探针的报告基团不同。
5.试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任一项所述的引物探针组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组为引物探针混合液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针混合液中所述引物对的浓度为10～50μmol/L，所述突变型探针和所述野生型探针的浓度为1～20μmol/L。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液。
9.根据权利要求5至8任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂。
10.权利要求1至4任一项所述的引物探针组，或权利要求5至9任一项所述的试剂盒在制备癌症的预后试剂中的应用；
优选的，所述癌症选自胰腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌中的至少一种。
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