CN104561287A - 检测calr基因第9外显子突变的试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使用Sanger测序技术检测CALR基因第9外显子突变的试剂和方法。本发明所述试剂和方法的检测特异性高，可具体分析出CALR第9外显子插入和缺失的突变类型，不存在假阳性问题，同时也避免稀有突变的漏检，可用于临床筛查原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化患者的基因。

Description

检测CALR基因第9外显子突变的试剂和方法
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种采用Sanger测序技术及测序图谱分析识别鉴定CALR基因第9外显子突变状况的方法及引物。Sanger测序技术目前仍是金标准，适于临床样本的筛查。
技术背景
骨髓增殖性肿瘤(MPN)是一种慢性髓系肿瘤，其特征为过量产生成熟的血细胞，并可能往急性髓系白血病(AML)进展。除了Ph+的慢性髓系白血病(CML)外，其他最为常见的三种MPN为真性红细胞增多症(PV)，原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)。
许多Ph-的MPN患者都携带有JAK2V617F突变，特别是PV患者，约占90％。而ET和PMF患者JAK2V617F突变率均为50-60％。JAK2V617F突变检测已经成为国内外临床辅助诊断MPN的一线检测项目。然而仍有近一半JAK2未突变的ET和PMF患者，无法通过基因检测结果来鉴别诊断继发性的和原发性的血小板增高和骨髓纤维化。近期，CALR基因突变在JAK2突变阴性的ET和PMF患者中频繁地被检出，其第9外显子突变是第二个突变率较高的可用于临床筛查ET和PMF患者的基因，其在ET和PMF患者中的突变率分别为～25％和～35％，其突变区域集中于c.1092-1155区域。
CALR基因是一个高度保守的编码多功能内质网蛋白的基因。其编码的钙网蛋白，在内质网中，在保持钙离子的动态平衡和蛋白折叠的功能中起着不可或缺的作用；在内质网外，钙网蛋白可出现在细胞质、细胞表面，参与调控整合素介导的细胞粘附作用、基因的核内转运、细胞碎片的清除及免疫细胞的凋亡等。
目前用于CALR基因第9外显子的突变检测或筛查的方法主要有：sanger测序和二代测序技术(Next-generation sequencing)。二代测序技术虽然灵敏度高，通量大；但是试剂成本也很高，适用于科研服务，不适用于临床的日常筛查。而sanger测序法目前是临床应用于检测基因突变极其普遍的一种手段，测序检测结果堪称金标准。二代测序检测到的突变仍需要通过Sanger测序再次验证。
而其他常用于基因突变检测的方法学如：HRM、ARMS等，由于CALR第9外显子的突变类型为插入和缺失，上述两种方法一是无法区分突变类型，二是ARMS法主要针对点突变，对缺失和插入突变检测不太适用。故Sanger测序法是目前检测CALR第9外显子突变最合适的方法学。其特异性高，可分析具体的突变类型，不存在假阳性问题。
发明内容
鉴于目前筛查检测CALR基因第9外显子的方法学的可选择性较小，而综合考虑成本、特异性及临床普及问题，本发明考虑使用Touchdown PCR结合Sanger测序的方法来对检测区域进行引物的设计及检测。
本发明提供了一种检测CALR基因第9外显子突变的试剂，所述试剂包含扩增引物CALR-F和CALR-R，其核苷酸序列如下：
CALR-F：5’-CTGGTCCTGGTCCTGATGTC-3’；
CALR-R：5’-ACCAAAATCCACCCCAAAT-3’。
进一步地，所述试剂还包括测序引物CALR-F，所述测序引物的核苷酸序列如下：
CALR-F：5’-CTGGTCCTGGTCCTGATGTC-3’。
目前文献报道的突变区域为c.1092-1155(如图1下划线所示)，为避免稀有突变的漏检，本发明将检测区域设置为整个第9外显子参与编码的区域(如图1细线方框所示)。同时为保证扩增及测序效果好，本发明所述引物能将扩增及测序片段控制在500bp以内，这样通过一管PCR反应和单侧测序结果即可判读测序结果，减少检测耗时，节约成本。此外，为保证PCR扩增的效率，引物设计时，还需要遵守一些引物设计的原则：如避开连续4个G和4个C，避开GC含量过高的区域等。综合上述因素，最终筛选出设计的引物如上所述。
本发明还提供了使用上述引物进行待检区段扩增及Sanger测序的结果判读规则，其特征在于包括以下步骤：
⑴提取人全血样本中的DNA。
⑵用CALR-F和CALR-R这对引物进行PCR扩增，使用Touchdown PCR法，得到特异性扩增产物。PCR扩增条件为：95℃预变性10min；98℃变性10s，62℃退火30s(每循环下降1℃)，68℃延伸30s，10个循环；98℃变性10s，54℃退火30s，68℃延伸30s，20个循环；68℃2min。
⑶用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增条带。并将PCR产物进行纯化及测序。
⑷标准比对序列的制作：参考序列号为NG_029662和NM_004343的两条序列，根据CDS(Coding sequence，编码序列)区域，获取CALR第9外显子参与编码蛋白的区域序列(如图1细线方框所示序列)，作为标准比对序列。目前文献报道的突变区域为c.1092-1155(如图1下划线所示)，但本发明考虑到其他稀有突变发生的可能性，故将检测区域扩大至整个第9外显子的编码区域，以免造成稀有突变的漏检，即利用本引物可以检测出整个第9外显子的编码区域。
⑸测序结果的分析：通过Mutation Surveyor V4.0.5软件，将比对序列和测序结果进行比对，判读测序结果。
⑹结果判读规则：由于不同的标准比对序列，其在Mutation Surveyor V4.0.5软件中所显示的位置是不同的，故根据本发明制作的标准比对序列，其测序结果判断规则如下：
①在标准比对序列范围内，与比对序列完全一致，则为未突变。
②在标准比对序列78位对应于测序序列位置，开始出现套峰，且套峰的前6位序列为“ACAAGG”，则为c.1092_1143del 52bp突变。
③在标准比对序列134位对应于测序序列位置，开始出现套峰，且套峰的前5位序列为“TTGTC”，则为c.1154_1155insTTGTC突变。
④在标准比对序列82位对应于测序序列位置，开始出现套峰，且套峰的前9位序列为“GGAGGAGGC”，则为c.1103_1136del 34bp突变。
附图说明
图1是本发明检测区域、常见突变区域、引物设计区域示意图。
图2是使用本发明引物测序方法对第一个待检血液样本进行筛查的Sanger测序图，检测结果CALR第9外显子未突变。
图3是使用本发明引物测序方法对第二个待检血液样本进行筛查的Sanger测序图，检测结果CALR第9外显子c.1092_1143del 52bp突变。
图4是使用本发明引物测序方法对第三个待检血液样本进行筛查的Sanger测序图，检测结果显示CALR第9外显子c.1154_1155insTTGTC突变。
图5是使用本发明引物测序方法对第四个待检血液样本进行筛查的Sanger测序图，检测结果显示CALR第9外显子c.1103_1136del 34bp突变。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1：
本发明用于检测样品中CALR基因第9外显子突变的扩增引物如下表所示：
实施例2：
血液DNA的提取：使用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)。取300μl待检全血样本加入1.5ml离心管中，加入900ul红细胞裂解液颠倒混匀，10000rpm离心1min，弃上清；加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀；加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。再加200μl无水乙醇，混匀，将溶液加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，弃废液；向CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液；向CB3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液；重复一次。再将CB3放回收集管中，12000rpm空离心2min；并将CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，所得即为样本DNA。
10×红细胞裂解液配方为：NH4Cl 82g，NaHCO38.4g，EDTA-Na23.72g，加ddH2O定容至1000ml。
实施例3：
PCR扩增：按如下试剂及试剂量配置PCR扩增体系，其中引物CALR-F(10μM)和CALR-R(10μM)各0.3ul；2×KOD Buffer 10ul，KOD酶(1U/ul)0.3ul，d NTP(2mM)2ul(东洋纺(上海)生物科技有限公司)；加去离子水6.1ul；最后加DNA模版1ul。其扩增程序如下：95℃10min；98℃10s，62℃30s(每循环下降1℃)，68℃30s，10个循环；98℃10s，54℃30s，68℃30s，20个循环；68℃2min。
实施例4：
PCR产物鉴定：取2ul PCR产物用于2％的琼脂糖凝胶电泳分析。
实施例5：
测序检测及结果比对：使用CALR-F引物作为测序引物，进行Sanger测序检测。将测序结果与标准比对序列在Mutation Surveyor V4.0.5软件中进行比对分析。若检测结果为单一峰图，且与标准比对序列一致，则待检样本未突变；若检测结果出现套峰，与标准比对序列不一致，则待检样本发生突变。
实施例6：
第一个待检全血样本检测：对第一个待检全血样本按实施例2-5所述进行DNA提取、PCR扩增PCR产物鉴定、测序检测及结果比对，得到的测序图谱如图2。待检样本测序峰图与标准比对序列一致，显示结果未突变。
实施例7：
第二个待检全血样本检测：对第二个待检全血样本按实施例2-5所述进行DNA提取、PCR扩增PCR产物鉴定、测序检测及结果比对，得到的测序图谱如图3。待检样本测序峰图符合结果判读规则第二条，故为c.1092_1143del 52bp突变。
实施例7：
第三个待检全血样本检测：对第三个待检全血样本按实施例2-5所述进行DNA提取、PCR扩增PCR产物鉴定、测序检测及结果比对，得到的测序图谱如图4。待检样本测序峰图符合结果判读规则第三条，故为c.1154_1155insTTGTC突变。
实施例8：
第四个待检全血样本检测：对第四个待检全血样本按实施例2-5所述进行DNA提取、PCR扩增PCR产物鉴定、测序检测及结果比对，得到的测序图谱如图5。待检样本测序峰图符合结果判读规则第四条，故为c.1103_1136del 34bp突变。
实施例9：
通过实施例2-5所示方法对临床85例MPN患者样本进行测序检测，所得结果如下：
由实验结果可知，本发明所述试剂和方法的检测特异性高，可具体分析出CALR第9外显子插入和缺失的突变类型，不存在假阳性问题，同时也避免稀有突变的漏检，可用于临床筛查原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化患者的基因。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  南京艾迪康医学检验所有限公司
 
<120>  检测CALR基因第9外显子突变的试剂和方法
 
<130> 
 
<160>  3    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
ctggtcctgg tcctgatgtc                                                 20
 
 
<210>  2
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
accaaaatcc accccaaat                                                  19
 
 
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
ctggtcctgg tcctgatgtc                                                 20
 
 

Claims (6)

1.一种检测CALR基因第9外显子突变的试剂，其特征在于，所述试剂包含扩增引物CALR-F和CALR-R，其核苷酸序列如下：
CALR-F：5’-CTGGTCCTGGTCCTGATGTC-3’；
CALR-R：5’-ACCAAAATCCACCCCAAAT-3’。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括测序引物CALR-F，所述测序引物的核苷酸序列如下：
CALR-F：5’-CTGGTCCTGGTCCTGATGTC-3’。
3.一种判断CALR基因第9外显子突变的方法，其特征在于包括以下步骤：
 提取人全血样本中的DNA；
 用CALR-F和CALR-R这对引物进行PCR扩增；所述引物的核苷酸序列如下：
CALR-F：5’-CTGGTCCTGGTCCTGATGTC-3’；
CALR-R：5’-ACCAAAATCCACCCCAAAT-3’；
 PCR产物鉴定：用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增条带，并将PCR产物进行纯化及测序；
 标准比对序列的制作：参考序列号为NG_029662和NM_004343的两条序列，根据CDS区域，获取CALR第9外显子参与编码蛋白的区域序列；
 测序结果的分析：将比对序列和测序结果进行比对，判读测序结果；
 结果判读，确定突变类型。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增方条件为：95℃预变性10min；98℃变性10s，62℃退火30s，每循环下降1℃，68℃延伸30s，10个循环；98℃变性10s，54℃退火30s，68℃延伸30s，20个循环；68℃ 2min。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述的CALR第9外显子为整个第9外显子的编码区域。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的结果判读，确定突变类型的方法为：
在标准比对序列范围内，与比对序列完全一致，则为未突变；
在标准比对序列78位对应于测序序列位置，开始出现套峰，且套峰的前6位序列为“ACAAGG”，则为c.1092_1143del 52bp突变；
在标准比对序列134位对应于测序序列位置，开始出现套峰，且套峰的前5位序列为“TTGTC”，则为c.1154_1155insTTGTC突变；
在标准比对序列82位对应于测序序列位置，开始出现套峰，且套峰的前9位序列为“GGAGGAGGC”，则为c.1103_1136del 34bp突变。
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