CN111471768B - 用于检测jak2 v617f及calr第九外显子基因突变的pcr引物组及试剂盒 - Google Patents

用于检测jak2 v617f及calr第九外显子基因突变的pcr引物组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒，将多重PCR和基于毛细管电泳技术的遗传分析系统相结合，在一个PCR反应系统中同时完成JAK2V617F与CALR第九外显子基因突变检测；采用毛细管电泳片段分析法分析PCR产物片段由于具有高分辨率，因此即使出现非特异扩增也能识别，而传统手段只能在特定片段大小位点出现荧光信号才可判读为阳性；具有高灵敏度，可识别最低0.1ng/uL DNA中的突变，以及最少0.1％的突变；通量高，使用该方法可同时分析96个标本的基因突变情况，可应用于大规模疾病筛查。

Description

用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物 组及试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒。
背景技术
BCR-ABL阴性的骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)真性红细胞增多症(polycythemia vera，PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)和原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis，PMF)等疾病。此类疾病主要是因为人体正常基因发生突变而造成骨髓细胞一系或多系增生活跃。因此发现及检测基因突变成为MPN的主要诊断方法。近年来的研究表明在MPN患者中主要存在JAK2(Janus kinase 2)、CALR(calreticulin)、MPL(myeloproliferative leukemia virus gene)等基因的突变，JAK2、CALR以及MPL基因突变已成为诊断MPN的主要标准。其中JAK2 V617F突变在PV中阳性率可高达95％，在ET与PMF中的突变率达50％以上，同时20％-30％的ET和PMF患者中存在CALR基因第九外显子的缺失(CALRL367 fs*46，52bp缺失)或者插入(CALRL385 fs*47，5bp插入)突变，因此对JAK2 V617F以及CALR第九外显子基因突变检测对诊断MPN具有非常重要的意义。
检测JAK2 V617F以及CALR基因突变的方法主要有荧光定量PCR法、高分辨熔解曲线法、直接测序法等。以上方法在检测MPN基因突变的应用已经在文献中相继报道，检测技术相对成熟且已经有商品化试剂盒供临床诊断使用。由于JAK2 V617F是点突变，可以使用突变扩增系统PCR(amplification refractory mutation system,ARMS-PCR)通过PCR和琼脂糖凝胶电泳或者实时荧光PCR即可检测出DNA中已知突变，但是CALR第九外显子的突变多属于小片段的缺失和插入突变，普通的琼脂糖凝胶电泳由于对扩增产物的分辨力有限，无法精确分辨出CALR基因突变，需要对PCR产物进一步的进行基因测序准确分析。使用普通的凝胶电泳分析，无法在同一个PCR反应管中同时检测JAK2 V617F、CALR基因突变。实时荧光PCR检测多基因突变时，每个突变位点都要设计特异性荧光探针，且同一标本需要进行多管PCR反应，时间与经济成本相对较高。
基于多重PCR技术和基于毛细管电泳技术的遗传分析系统片段分析功能进行多基因检测已经广发应用于微生物病原检测、基因表达分析等分子检测领域。但是使用基于毛细管电泳技术的遗传分析系统片段分析功能同时检测JAK2V617F及CALR第九外显子的缺失或者插入突变的相关报道国内外还未见。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒，将多重PCR和基于毛细管电泳技术的遗传分析系统相结合，在一个PCR反应系统中同时完成JAK2V617F与CALR第九外显子基因突变检测，以期可以开发出一种快速、便捷诊断MPN疾病基因突变的检测试剂盒。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
本发明所述的用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组，其特征在于：包括用于JAK2 V617F基因突变的ARMS引物和用于CALR第九外显子基因突变的PCR引物；其中，所述用于JAK2 V617F基因突变的ARMS引物包括SEQIDNO：1所示的JAK2野生型正向引物、SEQIDNO：2所示的JAK2突变型反向引物、SEQIDNO：3所示的JAK2内参正向引物和SEQIDNO：4所示的JAK2内参反向引物，所述用于CALR第九外显子基因突变的PCR引物包括SEQIDNO：5所示的CALR正向引物和SEQIDNO：6所示的CALR反向引物。
其中，优选方案如下：
所述的用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的引物组，其特征在于：所述JAK2野生型正向引物、JAK2内参正向引物和CALR正向引物的5'标记的荧光基团为CY5。
本发明还提供了一种用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR试剂盒，其特征在于：含有2×rTaq的PCR反应液10uL、上文所述的JAK2野生型正向引物、JAK2突变型反向引物、JAK2内参正向引物、JAK2内参反向引物、CALR正向引物和CALR反向引物各0.5uL、待测DNA模板1uL、ddH2O 6uL，其中各引物的浓度均为10uM。
其中，优选方案如下：
所述待测DNA模板的浓度为10～200ng/uL。
该PCR试剂盒的PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，共40个循环；72℃充分延伸5min。
该PCR试剂盒的PCR扩增产物的分析方法采用毛细管电泳法，具体按照以下步骤进行：
1)在96孔加样板的每孔中加入30uL上样缓冲液(美国BECKMAN公司，货号：608012)、分子内标1uL(美国BECKMAN公司，货号：608098)、1uLPCR扩增产物，并加盖石蜡油；
2)在分离液缓冲板中加入分离液并关注聚丙烯酰胺凝胶；
3)将96孔加样板和分离液缓冲板放入遗传分析系统(美国BECKMAN GenomeLabGeXP遗传分析系统)，选择毛细管电泳程序进行检测，具体程序如下：90℃变性时间120s,注射电压2.0KV时间30s，分离电压6.0KV时间45min；根据电泳条带大小分析结果。
本发明的优点在于：(1)使用多重PCR在一个PCR反应管中可同时检测两个基因三个位点的突变情况；(2)采用毛细管电泳片段分析法分析PCR产物片段由于具有高分辨率，因此即使出现非特异扩增也能识别，而传统手段只能在特定片段大小位点出现荧光信号才可判读为阳性；(3)具有高灵敏度，可识别最低0.1ng/uL DNA中的突变，以及最少0.1％的突变；(4)通量高，使用该方法可同时分析96个标本的基因突变情况，可应用于大规模疾病筛查。
附图说明
图1是理想状态下PCR产物片段设计图；
图2是全血DNA模板的PCR扩增产物毛细管电泳分析图-无突变产物；
图3是全血DNA模板的PCR扩增产物毛细管电泳分析图-JAK2 V617F突变；
图4是全血DNA模板的PCR扩增产物毛细管电泳分析图-CALR基因第九外显子52bp缺失突变；
图5是全血DNA模板的PCR扩增产物毛细管电泳分析图-CLAR第九外显子5bp插入突变；
图6是1ng/μL浓度的JAK2 V617F阳性突变DNA模板PCR扩增产物毛细管电泳分析图；
图7是0.1ng/μL浓度的JAK2 V617F阳性突变DNA模板PCR扩增产物毛细管电泳分析图；
图8是0.01ng/μL浓度的JAK2 V617F阳性突变DNA模板PCR扩增产物毛细管电泳分析图；
图9是10ng/μL浓度的JAK2 V617F与CLAR双阳性模板PCR扩增产物毛细管电泳分析图；
图10是1ng/μL浓度的JAK2 V617F与CLAR双阳性模板PCR扩增产物毛细管电泳分析图；
图11是0.1ng/μL浓度的JAK2 V617F与CLAR双阳性模板PCR扩增产物毛细管电泳分析图；
图12是含有10％JAK2 V617F阳性突变DNA模板的混合模板PCR扩增产物毛细管电泳分析图；
图13是含有1％JAK2 V617F阳性突变DNA模板的混合模板PCR扩增产物毛细管电泳分析图；
图14是含有0.1％JAK2 V617F阳性突变DNA模板的混合模板PCR扩增产物毛细管电泳分析图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1：
一种用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组，包括用于JAK2 V617F基因突变的ARMS引物和用于CALR第九外显子基因突变的PCR引物；其中，所述用于JAK2 V617F基因突变的ARMS引物包括SEQIDNO：1所示的JAK2野生型正向引物、SEQIDNO：2所示的JAK2突变型反向引物、SEQIDNO：3所示的JAK2内参正向引物和SEQIDNO：4所示的JAK2内参反向引物，所述用于CALR第九外显子基因突变的PCR引物包括SEQIDNO：5所示的CALR正向引物和SEQIDNO：6所示的CALR反向引物。
具体如下：
JAK2野生型正向引物：CATGGTTTTAAATTATGGAGTATATG
JAK2突变型反向引物：GGTCTTACTCTCGTCTCCACAAAA
JAK2内参正向引物：TCCTCAGAACGTTGATGGCAG
JAK2内参反向引物：TTGCTTTCCTTTTTCACAAGAT
CALR正向引物：AGGCAGCAGAGAAACAAATGAAG
CALR反向引物：CAGCCTGGAAAAAAATGAAAGTT
其中，所述JAK2野生型正向引物、JAK2内参正向引物和CALR正向引物的5'标记的荧光基团为CY5。
实施例2：
一种用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR试剂盒，含有2×rTaq的PCR反应液10uL、实施例1所述的JAK2野生型正向引物、JAK2突变型反向引物、JAK2内参正向引物、JAK2内参反向引物、CALR正向引物和CALR反向引物各0.5uL、全血DNA模板1uL、ddH2O 6uL，其中各引物的浓度均为10uM。
如无特殊说明所有化学试剂均购自Sigma-Aldrich(St Louis，USA)，分子生物学试剂均购置Takara公司(大连、中国)
全血DNA模板的提取及浓度检测：天根生物全血基因组提取试剂盒(天根生物、北京、中国，Cat No.DP318)提取患者DNA，并使用Nanodrop分光光度计(ThermoFisher、USA)测定核酸浓度与质量，确保核酸OD260/280比值在1.7-2.0之间，核酸浓度要求在10-200ng/μL之间。
然后PCR反应管放入ABI 2720热循环仪中进行扩增反应，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，共40个循环；72℃充分延伸5min。
由于多重PCR的产物较多，使用普通琼脂糖凝胶电泳无法精确分离产物片段，因此本实验使用美国BECKMAN GenomeLab GeXP遗传分析系统的毛细管电泳技术可精确分离PCR产物(精度达5bp)。具体按照以下步骤进行：
1)在96孔加样板的每孔中加入30uL上样缓冲液(美国BECKMAN公司，货号：608012)、分子内标1uL(美国BECKMAN公司，货号：608098)、1uLPCR扩增产物，并加盖石蜡油；
2)在分离液缓冲板中加入分离液并关注聚丙烯酰胺凝胶；
3)将96孔加样板和分离液缓冲板放入遗传分析系统(美国BECKMAN GenomeLabGeXP遗传分析系统)，选择毛细管电泳程序进行检测，具体程序如下：90℃变性时间120s,注射电压2.0KV时间30s，分离电压6.0KV时间45min；根据电泳条带大小分析结果。
根据实验设计，在理想状态下次多重PCR会产生6条大小不一的PCR产物片段，不同的基因型PCR产物片段具体设计如图1示，分别为野生型基因位点PCR产物片段的JAK2V617F野生型PCR产物-233bp、CALR基因野生型PCR产物-313bp、JAK2内参片段-460bp；以及表示突变基因位点的PCR产物，分别为JAK2 V617F突变-283bp、CALR第九外显子52bp缺失突变-261bp、CLAR第九外显子5bp插入突变-318bp。
分析结果：如图2～图5所示，图2无突变电泳图，存在3条PCR产物片段分别为233bpJAK2 V617F野生型PCR产物、313bp CALR基因野生型PCR产物、460bp JAK2内参基因PCR产物；图3为JAK2 V617F突变型电泳图，相比于图2多出283bp的突变PCR产物片段；图4为CALR第九外显子52bp缺失突变电泳图，相比于图2多出261bp的突变PCR产物片段；图5为CLAR第九外显子5bp插入突变电泳图，相比于图2多出318bp的突变PCR产物片段。综上，多重PCR与毛细管电泳技术结合可在一个PCR反应中同时检测JAK2 V617F与CALR基因突变，电泳结果显示获得片段清晰，且片段大小符合预期(由于仪器分辨率可能存在1-2bp左右的误差)，实验结果可靠。
JAK2 V617F检出限：JAK2 V617F阳性突变DNA模板浓度分别使用双蒸水稀释至1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL，在PCR反应液中加入1μL稀释后的模板，扩增完毕后，上机检测，验证本方法的最低检测DNA浓度。如图6～图8所示，检测结果显示将JAK2 V617F阳性突变DNA模板按稀释致0.01ng/μL，PCR产物的荧光信号会随着模板浓度的降低而减弱，但是PCR产物条带依然清晰，突变PCR产物荧光信号减弱不明显。
JAK2 V617F与CLAR双阳性突变检出限：DNA模板(JAK2 V617F与CLAR基因突变在同一标本中未检测到同时存在，此模板是将两种单独突变模板混合制双阳突变模板为)浓度分别使用双蒸水稀释至10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL，在PCR反应液中加入1μL稀释后的模板，扩增完毕后，上机检测，验证本方法的最低检测DNA浓度。如图9～图11所示，JAK2 V617F与CLAR双阳性模板稀释至0.1ng/μL时，使用毛细管电泳依然可以检出，荧光信号虽减弱但是条带清晰，不影响结果判读。
JAK2 V617F灵敏度检测：将相同DNA浓度JAK2 V617F阳性突变模板与正常人DNA模板混和，制成10％、1％、0.1％的混合模板，在PCR反应液中加入1μL混合模板扩增完毕后，上机检测，验证本方法阳性检测最低百分数。如图12～图14所示，将JAK2 V617F阳性突变模板与阴性DNA模板进行混合，在含有10％、1％的阳性突变模板时，突变条带清晰可见，PCR产物荧光信号明显高于背景信号，在0.1％的含有阳性突变模板的的PCR产物条带中，荧光信号高于背景信号，可以进行结果判读。
抗干扰能力分析：检测标本主要为全血，待测样本多为红细胞增多患者，部分患者血液中胆红素含量高，因此抗干扰能力分析选择观察胆红素对实验结果的影响。胆红素含量较高患者PCR检测结果与正常胆红素含量患者PCR结果相比较未出现扩增收到抑制以及PCR产物荧光异常情况。
准确性对比：使用商品化骨髓增殖基因突变试剂盒(源奇生物，上海，中国，Cat.No.CA200059)检测样本，对比结果准确性。同时使用商品化试剂盒检测结果23例，符合度100％，准确可靠。具体结果如下表：
以上是本发明的详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法以及核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 内蒙古医科大学附属医院（内蒙古自治区心血管研究所）
<120> 用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒
<141> 2020-04-08
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
catggtttta aattatggag tatatg 26
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggtcttactc tcgtctccac aaaa 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tcctcagaac gttgatggca g 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ttgctttcct ttttcacaag at 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aggcagcaga gaaacaaatg aag 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cagcctggaa aaaaatgaaa gtt 23

Claims (5)

1.用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组，其特征在于：包括用于JAK2V617F基因突变的ARMS引物和用于CALR第九外显子基因突变的PCR引物；其中，所述用于JAK2V617F基因突变的ARMS引物包括SEQ ID NO：1所示的JAK2野生型正向引物、SEQ IDNO：2所示的JAK2突变型反向引物、SEQ ID NO：3所示的JAK2内参正向引物和SEQ ID NO：4所示的JAK2内参反向引物，所述用于CALR第九外显子基因突变的PCR引物包括SEQ ID NO：5所示的CALR正向引物和SEQ ID NO：6所示的CALR反向引物；所述JAK2野生型正向引物、JAK2内参正向引物和CALR正向引物的5'标记的荧光基团为CY5。
2.用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR试剂盒，其特征在于：含有2×rTaq的PCR反应液10uL、权利要求1所述的JAK2野生型正向引物、JAK2突变型反向引物、JAK2内参正向引物、JAK2内参反向引物、CALR正向引物和CALR反向引物各0.5uL、待测DNA模板1uL、ddH2O 6uL，其中各引物的浓度均为10uM。
3.根据权利要求2所述的用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR试剂盒，其特征在于：所述待测DNA模板的浓度为10～200ng/uL。
4.根据权利要求2所述的用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR试剂盒，其特征在于：该PCR试剂盒的PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，共40个循环；72℃充分延伸5min。
5.根据权利要求2所述的用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR试剂盒，其特征在于该PCR试剂盒的PCR扩增产物的分析方法采用毛细管电泳法，具体按照以下步骤进行：
1)在96孔加样板的每孔中加入30uL上样缓冲液、分子内标1uL、1uLPCR扩增产物，并加盖石蜡油；
2)在分离液缓冲板中加入分离液并关注聚丙烯酰胺凝胶；
3)将96孔加样板和分离液缓冲板放入遗传分析系统，选择毛细管电泳程序进行检测，根据电泳条带大小分析结果。
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