CN108060235B - 皮肤性状相关基因的多重pcr检测方法 - Google Patents

皮肤性状相关基因的多重pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法，包括如下步骤：(1)设计引物组合；(2)第一次PCR扩增后磁珠纯化产物；(3)将步骤(2)纯化后的产物进行第二次PCR扩增，并对扩增产物进行磁珠纯化；(4)将步骤(3)纯化后的产物进行二代测序。本发明的方法解决了多重PCR技术检测这些与皮肤特性相关位点的扩增效果问题，可以显著降低检测成本和增加检测效果。

Description

皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测，尤其涉及一种皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高，对护肤品的需要日益增加。除了生活环境、护理程度等外在因素影响，基因对人的皮肤特性有着重要的影响，甚至直接决定了皮肤的特性。基因的一些重要位点存在着单碱基突变(SNP)。某个位点的碱基突变后会形成不同的基因型，不同的基因型往往会决定不同的皮肤特性。通过检测自身的具体基因型，可以更有效的根据自身特点选择护肤品，从而可以更有针对性的进行护肤。
对于基因单碱基突变的检测目前有多种技术，常见的技术如下：
1.一代测序法：
基于一代测序原理来检测样本的基因型。优点是在常规方法中准确度最高。缺点是成本高，检测通量很低。适合少量样本或少量位点的检测。
2.Taqman之类的终点荧光法
主要是利用两种不同颜色的荧光标记相应两种基因型的探针，通过读取PCR反应后两种颜色荧光的比值确定样本的基因型。
此类技术的优点是操作简单，检测时间短，检测通量高，结果较为准确，检测位点数目少时成本低。缺点是检测位点数目多时成本高，样本量少时检测效果差。
3.基于芯片的检测
主要是利用DNA互补配对原理，和芯片上已知基因型的序列杂交，根据芯片上各已知基因型的荧光信号有无和强弱来判断样本基因型。
此类技术的优点是检测通量高，适合数目非常多的位点(几十万-上百万的位点)的检测。缺点是操作复杂，检测周期长，检测位点数目少时成本高，准确性相对较低。
4.基于酶切的RFLP技术
主要是利用突变前后的两种基因型，其中一种可以被特定的限制性内切酶识别并切断，而另外一种不能被限制性内切酶识别并切断。通过凝胶电泳或者毛细管电泳对酶切后的片段是否存在相应基因型的片段，从而判断样本基因型。
该技术的优点是操作简单，成本低，无需特殊或者价格高昂的专用仪器设备。缺点是检测通量低，对位点要求高(不能形成酶切位点的突变无法检测)，因为酶切不完全会存在假阳性。
5.质谱法
利用PCR扩增出的不同基因型产物的碱基分子量和电荷数不同，从而导致不同的基因型产物具有不同的核质比，通过质谱仪区分两种核质比的产物来确定样本的基因型。
该技术的优点是灵敏度高，通量大，样品数量大时成本低。缺点是目的位点附近的位点如果也有突变，那么就会是检测结果不准确，对样品质量要求高，如果有检测失败的样品，重新检测比较麻烦。
6.基于多重PCR的二代测序法
通过多重PCR法将目的位点和附近的序列进行扩增，然后纯化后利用二代测序技术对突变位点测序，从而确定样本的基因型。
该技术的优点是准确性仅次于一代测序，通量大，检测位点数中等(几十-几百个)的时候成本低。缺点是位点数目少时成本高，引物设计难度高。
7.基于MLPA技术的二代测序法
利用MLPA技术将目的位点和附近的序列进行扩增，然后将产物纯化并利用二代测序技术对突变位点测序，从而确定样本的基因型。优点是通量大，准确性高，检测位点数中等时(几十-几百位点)成本低。缺点是位点数目少时成本高，对位点附近的序列依赖性高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法。
本发明的目的是通过以下方案实现：
一种皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)设计引物组合；
(2)第一次PCR扩增后磁珠纯化产物；
(3)将步骤(2)纯化后的产物进行第二次PCR扩增，并对扩增产物进行磁珠纯化；
(4)将步骤(3)纯化后的产物进行二代测序。
优选地，所述步骤(2)中第一次PCR扩增引物组合如表1：
表1第一次PCR扩增的引物组合
Figure BDA0001518431380000031
Figure BDA0001518431380000041
Figure BDA0001518431380000051
Figure BDA0001518431380000061
Figure BDA0001518431380000071
Figure BDA0001518431380000081
Figure BDA0001518431380000091
优选地，所述步骤(2)扩增体系为PlatinumTM Multiplex PCR Master Mix：15uL；待检测DNA样品：3uL；引物：6uL；H2O：6uL；将扩增体系中各组分的混合均匀，放到PCR仪上；
所述各引物浓度均为1uM；所述PlatinumTM Multiplex PCR Master Mix为thermofisher，货号为4464268。
优选地，所述步骤(2)中PCR条件如下：
95℃2分钟；
96℃30秒，58℃4分钟，17个循环；
4℃直到取出产物。
优选地，所述步骤(2)中的磁珠纯化是指在PCR产物中加入15uL磁珠混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，将上清移到新的离心管中，并加入15uL磁珠混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，弃去上清，加入100uL浓度为75％的乙醇溶液到离心管中，在磁力架上错位移动离心管清洗磁珠，然后弃去乙醇溶液，待磁珠快干燥时，从磁力架上取下离心管，加入10uL超纯水混匀磁珠以便洗脱DNA，混匀后静置2分钟，置于磁力架上2分钟，吸取9uL上清溶液备用。
优选地，所述步骤(3)中PCR扩增的引物如表2所示：
表2第二次扩增的引物序列
Figure BDA0001518431380000101
优选地，所述步骤(3)中第二次PCR扩增体系为
Figure BDA0001518431380000102
热启动超保真2X MasterMix：10uL；纯化后的PCR产物：9uL；扩增引物的浓度均为4uM：每种引物各0.5uL；将扩增体系中各组分的混合均匀，放到PCR仪上。
优选地，所述步骤(3)中PCR条件如下：
98℃30秒；
98℃10秒，63℃30秒，72℃1分钟，9个循环；
72℃5分钟；
4℃直到取出产物。
优选地，所述步骤(3)中纯化是指在第二次PCR产物中加入16uL磁珠混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，弃去上清，加入100uL浓度为75％的乙醇溶液到离心管中，在磁力架上错位移动离心管清洗磁珠，然后弃去乙醇溶液，待磁珠快干燥时，从磁力架上取下离心管，加入20uL超纯水混匀磁珠以便洗脱DNA，混匀后静置2分钟，置于磁力架上2分钟，吸取19uL上清溶液到新的离心管中备用。
优选地，所述步骤(4)的二代测序是指基于illumina平台的二代测序方法。
本发明的方法的优点：本检测设计的位点有近百个，而且会涉及到大量样本的检测，所以需要选择一个对于检测近百个位点成本低的技术，而且该技术必须具备高通量的特点。多重PCR的方案，其中难点和重点是在引物的设计，一个根据目前研究报道的文献查询到的与皮肤特性相关的重要位点有上百个，综合考虑检测通量，检测成本和其他因素考虑，基于多重PCR方式的二代测序方法是最适合的。
从检测位点数和检测通量来考虑：除了芯片，多重PCR和MLPA技术外，其他技术在可接受的成本内，基本是针对几个或者几十个位点检测的，对于上百个位点的基因型检测并不是很合适。而且其他技术有很多在可接受成本内无法做高通量检测。再从检测成本考虑：芯片技术优势在于检测几万甚至上百万的位点成本优势明显，而对于上百个位点来说，和多重PCR，MLPA技术相比检测成本较高。最后从技术难易程考虑：MLPA技术对于位点附近序列的依赖性比多重PCR高，灵活性没有多重PCR高。所以只要解决了多重PCR的引物设计难题，综合考虑来看是最适合用来做上百个位点的皮肤特性相关位点的检测。好的引物组合，可以明显增加，建库成功率、降低测序成本和提高测序效果。本申请通过多次实验，设计出来一组扩增效果良好的引物组合。解决了多重PCR技术检测这些与皮肤特性相关位点的扩增效果问题，可以显著降低检测成本和增加检测效果。二代测序技术有基于几种不同原理的平台，各有其独特的优点和缺点。主流的有Illumina公司基于可逆合成终止原理的一系列测序仪，Thermofisher公司基于pH检测原理的Ion Torrent测序仪和基于酶连技术的SOLID测序仪，华大基因基于酶连技术的测序仪。选择illumina平台主要是基于两个原因：第一其市场上占有率较高，第二综合考虑其测序精度和测序长度，优于其他几种测序仪。二代测序和一代测序相比，最主要的特点是高通量和低成本。可以对大量样本同时进行高深度的测序，完成一代测序很难完成或者需要很高成本才能完成的测序。此处利用二代测序技术可以对大量待检测样本PCR扩增出的包含我们待检测位点的产物进行高深度的测序，得到这些样本PCR扩增出的产物的DNA序列，从而获得待检测位点的基因型信息，根据这些信息进行进一步的分析。二代测序的高通量特点可以满足大量人群检测的需要，而低成本的特点可以满足大多数人的经济承受能力。所以二代测序是一个比较理想的检测方法。
具体实施方式
下面对本发明进行详细的解释。
多重PCR引物设计
通过各种因素比较，在可接受的成本范围内，多重PCR作为近百个位点的皮肤特性相关基因的检测较为合适。而多重PCR的引物设计是其中的关键和难点，直接关系到检测的成本和效果。经过多次试验设计出一组效果较好的引物，引物序列见表1。表1中引物组合的选取原理是根据以往实验的经验设计，然后再根据实验结果对效果差的引物进行重新设计，经过多次改进后的引物组合，其益处是能够在规定的平均测序深度情况下，每个SNP都能达到规定的测序深度。如果是普通的引物组合，在规定的平均测序深度情况下，有些SNP位点无法被检测到或者测序深度很低，达不到数据分析对深度的要求。
通过不断的根据检测结果设计优化引物，经过多次实际检测，现在已经设计出一套比较理想的用于检测这些位点的多重PCR引物的组合，可以达到良好的检出效果。
本申请的方法包括如下6个具体步骤：
1.按照经过多次实验和设计出的特定序列的引物组合合成引物(引物的序列见表1)，经过实验优化的特定引物组合可以保证扩增的时候能达到较好的扩增效果，增加扩增产物中目的产物和非目的产物的比例。
2.按照经过优化的实验条件和试剂进行第一次PCR扩增，以便将我们需要检测的位点扩增出来。经过优化后的PCR扩增体系和扩增程序如下：
按照下列比例配制PCR扩增体系：
PlatinumTM Multiplex PCR Master Mix(thermofisher，货号：4464268)：15uL；待检测DNA样品：3uL；引物(各引物浓度均为1uM)(此处是表1中全部的引物组合)：上述反应体系配制好后混合均匀，放到PCR仪上使用下列扩增程序进行第一次扩增：
95℃2分钟；
96℃30秒，58℃4分钟，17个循环；
4℃直到取出产物；
3.使用磁珠对第一次PCR的产物进行纯化回收，得到我们需要的目的产物，把非目的产物通过纯化去掉。纯化按照下列步骤进行：
在PCR产物中加入15uL磁珠(Vazyme，货号N411，下文相同)，混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，将上清移到新的离心管中，加入15uL磁珠混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，弃去上清，加入100uL浓度为75％的乙醇溶液到离心管中，在磁力架上错位移动离心管清洗磁珠，然后弃去乙醇溶液，待磁珠快干燥的时候，从磁力架上取下离心管，加入10uL超纯水混匀磁珠以便洗脱DNA，混匀后静置2分钟，置于磁力架上2分钟，吸取9uL上清溶液到4.步中的第二次PCR反应体系中。
4.通过PCR对3中纯化后的产物进行第二次PCR扩增，以便给目的产物加上测序接头，以便能够测序。第二次PCR扩增的反应体系和程序如下：
按照下列比例配制第二次PCR反应液：
Figure BDA0001518431380000131
热启动超保真2X Master Mix(NEB，货号：M0494L)：10uL；
纯化后的第一次PCR产物：9uL；
第二次扩增引物(各引物浓度均为4uM，序列见表2)：1uL；
将上述反应液配制好后，混合均匀，放到PCR仪上使用下列扩增程序进行第二次扩增：
98℃30秒；
98℃10秒，63℃30秒，72℃1分钟，9个循环；
72℃5分钟；
4℃直到取出产物。
5.使用磁珠对第二次PCR产物进行纯化回收，得到我们要的目的产物，把第二次扩增中产生的非目的产物通过纯化去除掉，以便增加测序时的有效数据量，降低测序成本。
第二次PCR产物的纯化按照下列步骤进行：
在PCR产物中加入16uL磁珠，混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，弃去上清，加入100uL浓度为75％的乙醇溶液到离心管中，在磁力架上错位移动离心管清洗磁珠，然后弃去(用移液器吸出乙醇溶液转移到废液瓶中，并将用过的移液器吸头弃于废物桶中)乙醇溶液，待磁珠快干燥的时候，从磁力架上取下离心管，加入20uL超纯水混匀磁珠以便洗脱DNA，混匀后静置2分钟，置于磁力架上2分钟，吸取19uL上清溶液到新的离心管中保存待用。
6.对5中纯化好的PCR产物进行二代测序，本申请中检测用的是基于illumina平台的二代测序方法。利用二代测序技术可以对大量待检测样本PCR扩增出的包含我们待检测位点的产物进行高深度的测序，得到这些样本PCR扩增出的产物的DNA序列，从而获得待检测位点的基因型信息，根据这些信息进行进一步的分析。
实施例1-3分别为3个不同的样品，且均按照上述6个具体步骤进行试验，各位点在3次检测结果中的测序深度见表3。从这3次实验结果中看出，使用本引物组合和实验条件。3个样本在平均测序深度2500x左右的情况下，所有待检测的位点的测序深度最低的为460x，测序深度已经能满足二代测序的生物信息分析对于待检测位点的基因型的鉴定要求(要求测序深度不低于30x)。
表3实施例1-3的检测结果中各样品各位点的测序深度
Figure BDA0001518431380000141
Figure BDA0001518431380000151
Figure BDA0001518431380000161
Figure BDA0001518431380000171
各位点在实施例1-3中的检测结果中的基因型见表4。从这3次实验结果中看出，使用本引物组合和实验条件，3个样本在平均测序深度2500x左右的情况下，可以很好的检测出各位点的基因型。
表4实施例1-3检测结果中各样品各位点的基因型
Figure BDA0001518431380000172
Figure BDA0001518431380000181
Figure BDA0001518431380000191
Figure BDA0001518431380000201
通过实施例1-3的测序深度和对基因型的检测结果来看，这组引物组合和实验条件能很好的扩增出我们需要检测的位点，并且能够检测出各位点的基因型，可以实现根据基因型来分析每个检测个体的皮肤特性，可以根据检测结果来有针对性的对皮肤进行护理。二代测序技术有基于几种不同原理的平台，各有其独特的优点和缺点。二代测序和一代测序相比，最主要的特点是高通量和低成本。可以对大量样本同时进行高深度的测序，完成一代测序很难完成或者需要很高成本才能完成的测序。此处利用二代测序技术可以对大量待检测样本PCR扩增出的包含我们待检测位点的产物进行高深度的测序，得到这些样本PCR扩增出的产物的DNA序列，从而获得待检测位点的基因型信息，根据这些信息进行进一步的分析。二代测序的高通量特点可以满足大量人群检测的需要，而低成本的特点可以满足大多数人的经济承受能力。所以二代测序是一个比较理想的检测方法。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
<110> 美因健康科技（北京）有限公司
<120> 皮肤性状相关基因的多重PCR检测方法
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gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagggagctgagttgcatcttcagcc

Claims (10)

1.一种用于皮肤性状相关基因的多重PCR检测的引物组合，其特征在于，所述引物组合由表1中所列的全部引物组成：
表1引物组合
Figure FDA0002956106200000011
Figure FDA0002956106200000021
Figure FDA0002956106200000031
Figure FDA0002956106200000041
Figure FDA0002956106200000051
Figure FDA0002956106200000061
2.权利要求1所述的引物组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于皮肤性状相关基因的多重PCR检测，包括如下步骤：
(1)设计引物组合；
(2)第一次PCR扩增后磁珠纯化产物；
(3)将步骤(2)纯化后的产物进行第二次PCR扩增，并对扩增产物进行磁珠纯化；
(4)将步骤(3)纯化后的产物进行二代测序。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述步骤(2)扩增体系为PlatinumTMMultiplex PCR Master Mix：15uL；待检测DNA样品：3uL；引物：6uL；H2O：6uL；将扩增体系中各组分的混合均匀，放到PCR仪上；
所述各引物浓度均为1uM。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述步骤(2)中PCR条件如下：
95℃ 2分钟；
96℃ 30秒，58℃ 4分钟，17个循环；
4℃直到取出产物。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述步骤(2)中的磁珠纯化是指在PCR产物中加入15uL磁珠混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，将上清移到新的离心管中，并加入15uL磁珠混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，弃去上清，加入100uL浓度为75％的乙醇溶液到离心管中，在磁力架上错位移动离心管清洗磁珠，然后弃去乙醇溶液，待磁珠快干燥时，从磁力架上取下离心管，加入10uL超纯水混匀磁珠以便洗脱DNA，混匀后静置2分钟，置于磁力架上2分钟，吸取9uL上清溶液备用。
6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增的引物如表2所示：
表2第二次扩增的引物序列
Figure FDA0002956106200000062
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述步骤(3)中第二次PCR扩增体系为
Figure FDA0002956106200000063
热启动超保真2XMaster Mix：10uL；纯化后的PCR产物：9uL；扩增引物的浓度均为4uM：每种引物各0.5uL；将扩增体系中各组分混合均匀，放到PCR仪上。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述步骤(3)中PCR条件如下：
98℃ 30秒；
98℃ 10秒，63℃ 30秒，72℃ 1分钟，9个循环；
72℃ 5分钟；
4℃直到取出产物。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述步骤(3)中纯化是指在第二次PCR产物中加入16uL磁珠混合均匀，静置2分钟后置于磁力架上2分钟，弃去上清，加入100uL浓度为75％的乙醇溶液到离心管中，在磁力架上错位移动离心管清洗磁珠，然后弃去乙醇溶液，待磁珠快干燥时，从磁力架上取下离心管，加入20uL超纯水混匀磁珠以便洗脱DNA，混匀后静置2分钟，置于磁力架上2分钟，吸取19uL上清溶液到新的离心管中备用。
10.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述步骤(4)的二代测序是指基于illumina平台的二代测序方法。
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