CN105400863A - 一种基于多重延伸连接的探针扩增方法、其用途和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于多重延伸连接的探针扩增方法、其用途和试剂盒。进一步地，本发明涉及本发明的基于多重延伸连接的探针扩增方法用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因SNP的用途以及用于本发明的方法的试剂盒。

Description

一种基于多重延伸连接的探针扩增方法、其用途和试剂盒

技术领域

本发明涉及基于多重延伸连接的探针扩增法的技术领域。更特别地，本发明涉及根据本发明的方法用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因SNP的用途；以及用于本发明方法的试剂盒。

背景技术

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PD)是胞浆中一种重要的酶，广泛存在于所有细胞内，对红细胞的完整性和正常功能尤其重要。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏(Glucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiency,G6PDd)是最常见的遗传性酶病。据估计，全世界至少有4亿人携带G6PD缺陷的基因，其中大约有3.5亿分布于疟疾流行国家，参见NkhomaET,PooleC,VannappagariV,HallSA,BeutlerE:Theglobalprevalenceofglucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiency:asystematicreviewandmeta-analysis.BloodCellsMolDis2009,42:267-278。尽管G6PD缺乏的患病率在不同的国家、不同地区、不同人群之间有很大差别，但其在疟疾流行国家的流行率高达8％，参见HowesRE,PielFB,PatilAP,NyangiriOA,GethingPW,DewiM,HoggMM,BattleKE,PadillaCD,BairdJK,HaySI:G6PDdeficiencyprevalenceandestimatesofaffectedpopulationsinmalariaendemiccountries:ageostatisticalmodel-basedmap.PLoSMed2012,9:e1001339。G6PD缺乏已成为世界范围内特别是疟疾流行地区重要的公共卫生问题。

G6PD缺乏是由于编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的G6PD基因的突变引起酶的活性下降，表现出G6PD缺乏的表型。G6PD基因位于X染色体长臂2区8带(Xq28)，全长约18kb，包含13个外显子，12个内含子，参见MartiniG,TonioloD,VulliamyT,LuzzattoL,DonoR,VigliettoG,PaonessaG,D'UrsoM,PersicoMG:StructuralanalysisoftheX-linkedgeneencodinghumanglucose6-phosphatedehydrogenase.EMBOJ1986,5:1849-1855，编码含515个氨基酸的蛋白亚基，有活性的G6PD酶由两个或四个亚基组成，参见AuSW,NaylorCE,GoverS,Vandeputte-RuttenL,ScopesDA,MasonPJ,LuzzattoL,LamVM,AdamsMJ:Solutionofthestructureoftetramerichumanglucose6-phosphatedehydrogenasebymolecularreplacement.ActaCrystallogrDBiolCrystallogr1999,55:826-834。

G6PD缺乏的遗传表现为典型的X染色体连锁模式。由于男性只有一个G6PD等位基因，为半合子(hemizygote)，因此，可能表现为正常或缺乏；而女性有两个G6PD等位基因，由于其中一条X染色体随机失活(莱昂假说)，两个G6PD等位基因中有一个失活，为遗传嵌合体(mosaic)，参见BeutlerE,YehM,FairbanksVF:ThenormalhumanfemaleasamosaicofX-chromosomeactivity:studiesusingthegeneforC-6-PD-deficiencyasamarker.ProcNatlAcadSciUSA1962,48:9-16；DavidsonRG,NitowskyHM,ChildsB:DemonstrationofTwoPopulationsofCellsintheHumanFemaleHeterozygousforGlucose-6-PhosphateDehydrogenaseVariants.ProcNatlAcadSciUSA1963,50:481-485。因此，女性患者可能表现为正常、缺乏(纯合子)或介于正常和缺乏的中间体(杂合子)。女性杂合子的临床表现复杂多样，有些无症状或临床症状轻，有些会发生严重的急性溶血性贫血。在某些人群中G6PD缺乏的等位基因突变频率很高，纯合子并不罕见。

G6PD基因是人类基因组中具有高度多态性的基因之一。据最新报道，目前已发现的G6PD基因突变类型有186种，编码的酶表现出不同的残余活性(residualenzymeactivity)。这些突变中，绝大多数(85.4％,159/186)为单点错义突变(missense)，少数(8.0％,15/186)为多点突变(两个或两个以上取代)，缺失突变(deletion)占的比例很小(5.3％)，仅有2个突变(1％)发生在内含子区，参见MinucciA,MoradkhaniK,HwangMJ,ZuppiC,GiardinaB,CapoluongoE:Glucose-6-phosphatedehydrogenase(G6PD)mutationsdatabase:reviewofthe"old"andupdateofthenewmutations.BloodCellsMolDis2012,48:154-165。

G6PD缺乏可能是酶分子数量减少的定量改变，也可能是酶结构不同引起定性改变，或两者都有。研究发现，所有已知的基因突变均发生在编码区，尚未发现有突变影响基因表达调控区，这表明G6PD缺乏是由于酶稳定性下降引起的，而不是基因表达缺乏引起的。G6PD基因的突变在人群中非常常见，但不同人群中各种突变型出现的频率却有很大的不同，有一些位点已经达到多态性的频率(polymorphicfrequencies)。G6PDA–型是非洲和欧洲南部最常见的突变型，并且在北美、南美、意大利以及西印度群岛等地的发生频率也很高。其次，最常见的是G6PD地中海型(Mediterranean)和G6PDUnion型，被报道发生于萨丁尼亚岛，加那利群岛，参见CabreraVM,GonzalezP,SaloWL:HumanenzymepolymorphismintheCanaryIslands.VII.G6PDSeattleinCanariansandNorthAfricanBerbers.HumHered1996,46:197-200和中国，参见PerngLI,ChiouSS,LiuTC,ChangJG:ANovelC-SubstitutiontoT-SubstitutionatNucleotide1360ofCdnaWhichAbolishesaNaturalHha-ISiteAccountsforaNewG6pdDeficiencyGeneinChinese.HumanMolecularGenetics1992,1:205-205等地。

尽管G6PD缺乏广泛分布于世界各地，但在疟疾流行区，G6PD缺乏的发病率更高。从历史上来看，大量的流行病学研究发现G6PD缺乏的地理分布与疟疾的分布很类似，据此有学者提出G6PD缺乏患病率升高是疟疾自然选择的假说，参见RuwendeC,HillA:Glucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiencyandmalaria.JMolMed(Berl)1998,76:581-588；LouicharoenC,PatinE,PaulR,NuchprayoonI,WitoonpanichB,PeerapittayamongkolC,CasademontI,SuraT,LairdNM,SinghasivanonP,etal:PositivelySelectedG6PD-MahidolMutationReducesPlasmodiumvivaxDensityinSoutheastAsians.Science2009,326:1546-1549；MotulskyAG:Metabolicpolymorphismsandtheroleofinfectiousdiseasesinhumanevolution.HumBiol1960,32:28-62。最新的疟疾地图计划(MalariaAtlasProject,MAP)公布了2010年全球间日疟的分布地图，使用空间统计模型详细描述了全球各地间日疟的地方流行特点。报道发现，G6PD缺乏与间日疟流行在地理分布上存在共定位的现象，在间日疟流行的国家和地区G6PD缺乏患病率很高。据该统计模型估计，疟疾流行国家的G6PD缺乏的等位基因频率(allelefrequency)高达8％，也就是大约2.2亿男性和1.33亿女性携带突变基因型。这项研究也支持了疟疾是G6PD缺乏优势选择背后的驱动力量这一理论。在疟疾流行区开展G6PD缺乏的研究有着重要的公共卫生意义。

在我国，绝大多数疟疾是间日疟，主要集中在中部和南部地区。其中，云南省和海南省的发病率最高，参见WardropNA,BarnettAG,AtkinsonJA,ClementsAC:PlasmodiumvivaxmalariaincidenceovertimeanditsassociationwithtemperatureandrainfallinfourcountiesofYunnanProvince,China.MalarJ2013,12:452。

云南省是我国疟疾流行最严重的地区之一，从1999年至2004年以来，疟疾报告病例数量排第一位，疟疾发病率排第二位。云南省在2001-2005年五年间疟疾平均发病率为3.05/万，其中大部分为间日疟(73.41％)。云南省内部的疟疾分布是不均匀的，其中与中缅边境交界的地区是疟疾发病高风险区之一。缅甸拉咱市是中缅边境的一个小城市，位于缅甸克钦邦第二特区，与我国云南省盈江县仅有一河之隔，两地交通便利。双方务工人口的涌入与回归，使当地成为输入性疟疾的主要疫源地。因此，对这些交界地区进行密切监测和主动侦查疟疾发病情况是疟疾防治工作的重点。自2007年起，我国卫生部与英国无国界卫生组织联合开展“中缅边境疟疾联防联控项目”，在中缅边境各诊疗点和流动医疗组开展疟疾现场流行病学调查和重点联防联控。

最新的G6PD突变基因型的数据库共包括186种基因变异体(genevariants)，参见MinucciA,MoradkhaniK,HwangMJ,ZuppiC,GiardinaB,CapoluongoE:Glucose-6-phosphatedehydrogenase(G6PD)mutationsdatabase:reviewofthe"old"andupdateofthenewmutations.BloodCellsMolDis2012,48:154-165。G6PD突变基因型的频率在不同国家，不同人群，以及同一民族不同地区存在很大差异。WeiyingJiang等人对我国来自11个民族的一千余人进行了G6PD基因型分析，检测到14个突变位点，这些位点在不同的少数民族间突变频率有很大的差异，研究同时发现我国的人群G6PD突变基因型不同于非洲、欧洲及印度人群，参见JiangW,YuG,LiuP,GengQ,ChenL,LinQ,RenX,YeW,HeY,GuoY,etal:Structureandfunctionofglucose-6-phosphatedehydrogenase-deficientvariantsinChinesepopulation.HumGenet2006,119:463-478。我们总结了大量文献报道，汇总了我国最常见的23种G6PD突变基因型(见表1)，其中有些位点在我国人群中已经达到多态性的频率(polymorphic)。

我们采用的G6PD的cDNA在GenBank中序列标识符为X03674(version:X03674.1GI:31542)，gDNA为X55448(version:X55448.1GI:450527)。起始密码子ATG中的A编号为+1。由于数据库的更新，为了标准化和统一这些序列，建立统一的起始密码用于基因比对，需要从GenBankcDNA的序列中减去470个核苷酸，基因组DNA序列中减去3350个核苷酸。在本发明的实施方式部分检测了以下23个G6PD基因突变位点。

表1我国最常见的23个G6PD基因突变位点.

23个突变位点，包括24个基因型，其中835位点可能从A突变为T或G；/表示该突变位点有多个名字。

现有的G6PD基因突变检测技术及局限

目前鉴定G6PD缺乏基因突变的分子学方法主要依赖不同的技术区分等位基因。常见的G6PD基因突变检测技术有基于PCR的单链构象多态性分析(PCRbasedsingle-strandedconformationpolymorphismanalysis,PCR-SSCP)，参见AinoonO,YuYH,AmirMuhrizAL,BooNY,CheongSK,HamidahNH:Glucose-6-phosphatedehydrogenase(G6PD)variantsinMalaysianMalays.HumMutat2003,21:101。基于PCR的反向斑点杂交(PCRbasedreversedotblot,PCR-RDB)，参见LuX,HuaL,ZhangT,LiS,FanX,PengQ,LiW,YeJ,LongJ,HeX:AreversedotblotassayfortheexpandedscreeningofelevenChineseG6PDmutations.ClinChimActa2013,418:45-49。变性高压液相色谱(denaturinghigh-performanceliquidchromatography,DHPLC)，参见WuG,LiangWH,ZhuJ,OuyangH,PearsonP,CaiR,LiaoC,MoQH,ZhuDL,XuXM:Rapid,simultaneousgenotypingof10SoutheastAsianglucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiency-causingmutationsandasilentpolymorphismbymultiplexprimerextension/denaturingHPLCassay.ClinChem2005,51:1288-1291。限制性片段长度多态性聚合酶链反应(restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis,PCR-RFLP)，参见TangTK,HuangCS,HuangMJ,TamKB,YehCH,TangCJ:Diversepointmutationsresultinglucose-6-phosphatedehydrogenase(G6PD)polymorphisminTaiwan.Blood1992,79:2135-2140，高分辨率溶解曲线(high-resolutionmelting,HRM)，参见WuG,LiangWH,ZhuJ,OuyangH,PearsonP,CaiR,LiaoC,MoQH,ZhuDL,XuXM:Rapid,simultaneousgenotypingof10SoutheastAsianglucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiency-causingmutationsandasilentpolymorphismbymultiplexprimerextension/denaturingHPLCassay.ClinChem2005,51:1288-1291；PanM,LinM,YangL,WuJ,ZhanX,ZhaoY,WenY,LiuG,YangL,CaiY:Glucose-6-phosphatedehydrogenase(G6PD)genemutationsdetectionbyimprovedhigh-resolutionDNAmeltingassay.MolBiolRep2013,40:3073-3082。基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱法(matrixassistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOFMS)，参见ZhaoF,OuX-L,XuC-C,CaiG-Q,WuX-Y,HuangY-M,ZhuW-F,JiangQ-C:RapiddetectionofsixcommonChineseG6PDmutationsbyMALDI-TOFMS.BloodCells,Molecules,andDiseases2004,32:315-318以及直接测序等等。尽管每种技术都有其独特的优点，然而，这些技术对于人群大规模筛查G6PD基因多重突变位点也存在一些局限。

PCR-SSCP

PCR-SSCP是最常用的一种简单快速的点突变筛查方法，其基本原理是PCR扩增目的片段后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)区分有突变的单链DNA。仅有单个碱基的突变就可以影响DNA的立体构象，而不同的立体构象会影响DNA电泳迁移率，产生不同的电泳带，进而区分突变与正常。但是，SSCP筛查仅能够检测到突变是否存在，还需要随后的DNA测序才能知道具体的突变位点；而且该方法最大的局限是很难标准化，不同的杂交条件，洗脱条件(凝胶类型、电泳缓冲液、温度)对单链DNA影响都很大，这就造成方法的稳定性较差，有可能出现检测结果的假阴性或假阳性，不易临床推广应用。

PCR-RDB

PCR-RDB是将等位基因特异的寡核苷酸探针(allele-specificoligonucleotide,ASO)固定在尼龙膜上，通过ASO中部的等位基因特异的碱基与靶序列DNA严格杂交配对来检测突变位点。RDB用于基因分型具有无放射性，对设备和技术要求低，便于推广的特点，然而由于其检测结果需要人工判读和报告，这就限制了其在临床大规模人群筛查中的应用。

MALDI-TOFMS

MALDI-TOFMS是一种高准确度，高分辨率的基因分型或单核苷酸多态性位点(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)检测的技术。其基本原理是多重PCR扩增目的片段后，以PCR产物作为模板，用位点特异的引物进行单碱基延伸(singlebaseextension,SBE)，延伸后的产物具有不同的质量(mass)，通过质谱进行检测和区分多重等位基因突变(或SNP位点)。由于质谱信号准确度高，信噪比(signal-to-noiseratio,SNR)高的特点使得到的结果假阳性率很低，而且操作方法标准化，检测结果直接由机器判读给出，方便临床检测使用，优于之前的检测技术。同时，该方法的引物无需荧光等化学修饰，可以检测多重突变位点(或SNP位点)。

基于此技术的商品化iPLEXGoldAssay(Sequenom,CA)联合了应用自动点样仪和384个样品的芯片，实现了中等通量的基因分型。然而，尽管该技术PCR后的质谱检测准确度高，速度快，但PCR之前样品的提取和处理成为该方法应用于大规模人群筛查的一个“瓶颈”。同时，该方法在检测多个突变时依赖多重PCR扩增靶位点，多重PCR存在引物设计复杂、扩增效率低、不同模板间扩增效率不同等问题，而且随着检测突变位点重数的增加，设计难度也加大，这对于同时检测G6PD多个突变位点提出了较大的挑战。

其他技术

其他技术，如PCR限制性酶切的方法虽然特异性高，但容易出现酶切不完全的现象；HRM方法灵敏度高，但是每次只能检测一个突变位点，对于检测多重等位基因突变位点工作量大；DNA测序是检测突变的“金标准”，但由于其检测时间较长，成本较高，不适用于临床大规模人群的筛查。

本研究成功建立了可靠、灵敏、高通量的多个基因突变位点(或SNP位点)检测的新技术，并且利用该技术开发了G6PD基因常见的23个突变位点分型的检测方案；同时，我们将此方案成功应用于疟疾流行区伯氨喹啉用药的间日疟血样和干血片样本的G6PD基因分型。该检测方案补充完善了G6PD缺乏的分子信息，可以应用于我国疟疾流行区G6PD缺乏基因分型的大规模人群筛查，为这些地区伯氨喹啉用药风险评估和等位基因突变频率的流行病学统计研究提供了有力的技术支撑。同时，MELPA技术有望拓展应用于其他多重基因分型(或多个SNP位点分型)的高通量的临床检测和人群筛查。

发明内容

本发明人开发了一种新的检测方法——基于多重延伸连接的探针扩增法MELPA(MultiplexExtensionandLigation-basedProbeAmplification)。该方法无需核酸提取，直接裂解样本，杂交捕获靶DNA，利用通用引物等效扩增多重靶分析物后，通过MALDI-TOF质谱进行检测分析。我们对比了MELPA和商品化的基于多重PCR的iPLEX方法以及金标准测序技术在检测G6PD基因23个基因分型位点的结果，评价该新方法的准确度、批次间重复性以及不同类型的检测样本(全血和干血片)的适用性。最后，我们将该方法应用于疟疾流行区300余例样品的G6PD基因分型筛查。

对于G6PD基因突变的人群筛查，常用的检测样本为全血或干血片(driedbloodspot，DBS)。常规的方法需要逐个提取样本的基因组DNA，对于仅有少量血样的DBS样品而言，提取DNA的数量和质量都有风险，而且在核酸提取过程中也易出现样品间的交叉污染。我们开发了一种新的检测技术——基于多重延伸连接的探针扩增法(MultiplexExtensionandLigation-basedProbeAmplification,MELPA)，这项技术无需提取血样或DBS中的基因组DNA，通过探针将靶基因捕获，直接进行基因分型，避免了上述核酸提取的问题，解决了临床上大规模人群筛查中的限速问题。

MELPA技术利用多重探针特异杂交到靶位点处，捕获靶DNA，进行探针的延伸连接反应，延伸连接后的产物带有通用序列，通过通用引物进行PCR扩增，放大信号。反应能够在一个孔内同时检测多重基因突变(或SNP位点)，避免了常规的多重PCR(MultiplexPCR)对不同位点扩增效率不同的问题。我们将此新技术应用于G6PD基因多重突变的检测中，成功分型了G6PD基因的中国人最常见的23个热点突变。对比MELPA技术的检测结果与DNA测序金标准和常规的基于质谱的iPLEX技术，MELPA与测序结果的一致率为100％，且检测复孔间重复性较好。随后，我们将该检测方案成功应用于300余例中缅边境伯氨喹啉用药的间日疟血样和云南省疟疾流行区干血片样本的G6PD基因分型，得到了良好的检测结果。

本研究成功建立了可靠、灵敏、高通量的多个基因突变位点(或SNP位点)检测的新技术，并且利用该技术开发了G6PD基因常见的23个突变位点分型的检测方案；同时，我们将此方案成功应用于疟疾流行区伯氨喹啉用药的间日疟血样和干血片样本的G6PD基因分型。该检测方案补充完善了G6PD缺乏的分子信息，可以应用于我国疟疾流行区G6PD缺乏基因分型的大规模人群筛查，为这些地区伯氨喹啉用药风险评估和等位基因突变频率的流行病学统计研究提供了有力的技术支撑。同时，MELPA技术有望拓展应用于其他多重基因分型(或多个SNP位点分型)的高通量的临床检测和人群筛查。

本研究建立的MELPA检测技术得到的G6PD基因分型结果与DNA测序结果一致率为100％。该方法检测准确度高于iPLEX方法，且可以直接检测全血/干血片样品，无需核酸提取，通量显著高于现有技术。我们进行回顾性研究，用MELPA检测了中缅边境106例伯氨喹啉用药的疟疾血样，检测到来自9例病人的10个突变位点，人群G6PD突变发生率为8.5％，其中1例临床出现溶血的样本被检测到其基因型为G6PDMahidol半合型突变；另外，我们对云南省疟疾流行地区184例干血片样本进行了基因筛查，共检测到2例样本发生突变，人群G6PD突变发生率为1.1％。

本研究在MALDI-TOF基因分型技术的分析前样品处理方面进行了核心技术创新，首次实现了适合大规模筛查使用的可靠、准确、灵敏的高通量基因分型检测方法--MELPA。经过对疾控现场获得的实际样品进行实验室高通量检测，结果证明MELPA应可以作为一种普遍的高通量方法用于大规模同时筛查人群中的多重点突变/SNP多态性位点。我们将该方法应用于疟疾流行区高风险人群血样的G6PD缺乏症突变位点的高通量直接检测，为人群水平上的溶血风险分层以及伯氨喹啉临床用药实践和政策制定提供了可靠、有力的技术支撑。

具体地，本发明提供了一种基于多重延伸连接的探针扩增法，所述方法包括以下步骤:

a)提供含有待检测核酸的样本；

b)使用含有蛋白酶K的裂解液裂解含有待测核酸的样本；

c)在足以使互补碱基杂交的条件下，将步骤b)获得的裂解样本与捕获探针以及连接探针孵育，所述捕获探针结合至捕获载体表面；

d)在足以使延伸反应和连接反应发生的条件下，使与待检测核酸互补杂交的连接探针延伸并连接；

e)使用PCR扩增延伸连接的连接探针之间的序列。

特别地，根据本发明的方法，其中步骤c)中使用至少一对捕获探针和至少一对连接探针，所述一对连接探针之一的5’端被磷酸化修饰、3’端具有与通用引物的反向引物互补的序列；所述一对连接探针的另一个的5’端具有与通用引物的正向引物相同的序列。

特别地，根据本发明的方法，其中捕获探针的一端带有一段序列，其与以共价键结合在捕获载体表面的寡核苷酸序列互补，并通过碱基配对与该寡核苷酸序列结合，另一端通过互补碱基与待检测核酸杂交。

优选地，根据本发明的方法，其中所述的含有待测核酸的样本是全血或干血片。

进一步优选地，根据本发明的方法，其中捕获载体表面与待测核酸互补的捕获探针共价键结合。

优选地，根据本发明的方法，其中所述捕获载体是固相支持物，优选是96孔平板。

根据本发明所述的方法，进一步包括步骤：

f)通过树脂纯化步骤e)中扩增后的产物；

g)通过质谱、测序、或凝胶电泳的方法检测待检测核酸的序列、碱基突变以及DNA拷贝数。

另一方面，本发明提供了根据本发明的方法用于高通量检测基因组中的SNP、基因插入、基因缺失的用途。

另一方面，本发明提供了根据本发明的方法用于高通量检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因SNP的用途。

另一方面，本发明提供了用于本发明方法的试剂盒，所述试剂盒包含至少一对捕获探针和至少一对连接探针，以及捕获载体。

再一方面，本发明提供了一种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因SNP的试剂盒，所述试剂盒包含选自序列为SEQIDNO:1-51所示的寡核苷酸以及捕获载体。

附图说明

图1：MELPA技术的原理示意图。，T4DNA连接酶；，突变位点。

具体实施方式

在以下实施方式中，本发明人公开了使用本研究建立的MELPA检测技术检测的G6PD基因的23中点突变(参见上表1)，并于iPLEX方法以及直接测序方法进行了比较。

1、MELPA技术的原理以及用于检测23种G6PD基因型

MELPA技术的原理

MELPA技术的原理是在检测基因靶位点(或SNP位点)附近设计一套捕获探针(captureprobe,CP)和连接探针(ligationprobe,LP)，裂解血样或DBS样本后，直接将基因组DNA捕获在固相板孔内，然后进行多重探针的延伸和连接反应，产生的分析物上带有通用引物标签(tag)，然后通过通用引物(universalprimer,UP)进行等效PCR扩增得到目的片段，之后进行单碱基延伸(singlebaseextension，SBE)反应，得到的产物通过质谱检测分析(原理示意图见图1)。

间日疟血样和正常人血样

本研究对2007年～2008年间缅甸拉咱市收集的112例伯氨喹啉用药的间日疟血样进行回顾性研究，检测血样的G6PD基因分型。

血样纳入标准：a)间日疟患者虫体密度≥250/μl血；b)年龄为4～60岁；c)非孕妇和非恶性疟患者；d)无其他严重并发症；e)所有患者间日疟发病期间随机分组，采用我国治疗方案氯伯8d疗法或WHO推荐方案氯伯14d疗法。我国氯伯8d疗法为，氯喹：(成人)口服总剂量1200mg，第1d600mg，第2d、3d各300mg，顿服；伯氨喹啉：口服总剂量180mg，22.5mg/d，与氯喹同服用。WHO推荐方案氯伯14d疗法为成人氯喹总剂量1500mg(25mg/kg体重X3d，顿服)，伯氨喹啉剂量210mg(0.25mg/kg体重X14d)，与氯喹同服用。其中编号为V07和VA的患者间日疟发病期间采用我国氯伯8d疗法；编号为VB的患者采用WHO推荐氯伯14d疗法。所有样本均按照WHO28d体内疗法评价法进行追踪随访。

间日疟血样来自云南省寄生虫病防治所疟疾防制科，正常对照血样来自2名无疟疾感染的健康人，所有被采样者均志愿参加并签署知情同意书。

疟疾流行区人群的干血片样本

192例DBS样本采集自云南省临沧市耿马县孟定镇邱山村，采集时间为2013年7月。所有血样均经云南省寄生虫病防治所疟疾防制科进行疟疾快速诊断检测(RapidDiagnosticTest,RDT)均未查到疟疾感染。所有被采样者均志愿参加并签署知情同意书。所有血样均按照WHO标准操作规范，将75μl抗凝静脉全血点在Whatman903滤纸规定的圈内，过夜干燥(或至少干燥4小时)，每个纸片分别包于密闭塑料袋中，加入适量硅胶干燥剂，储存于-80℃待用。

MELPA技术用于检测G6PD基因的23个突变位点

探针设计

表2：MELPA用于G6PD基因23个突变位点检测的所有探针、通用引物序列以及PCR后扩增产物的长度

其中捕获探针(CP探针)在3‘端连接一段序列和以共价键结合在捕获载体表面的寡核苷酸序列互补。

采用本领域已知的方法，对所有合成的连接探针LP2进行磷酸化修饰。将所有的LP1，LP2，CP1，CP2探针核酸干粉用DIH2O稀释备用。

样品制备

该方法检测的样品包括全血样品和干血片(DBS)样品。干血片(DBS)样品是临床检测以及流行病学人群研究中最常见的样本。与全血相比，DBS样品用血量少，样本采集、运输和储存成本更低，也更容易。

我们用MELPA检测序列已知的同一样本的全血样本和DBS样本。配置如下裂解液裂解血液样品或干血片样品：3X裂解液50μl；20mg/ml蛋白酶K，7.5μl；DIH2O，56.5μl；LP探针混合物(0.1uM/各种)，1.5μl；CP探针混合物(0.1uM/各种)，1.5μl；逆转录(10uM)，3μl。

过夜孵育捕获

将上述裂解后产物加至已共价包被了捕获用寡核苷酸序列的捕获载体(Diacurate公司，产品号Cat#12000)。每孔100μl，置于PCR仪上98℃5min充分热变性DNA，55℃过夜孵育(>16小时)。

延伸连接反应

在如下混合液中，在冰上配置延伸连接反应：DIH2O，43μl/孔；10XNEB缓冲液，2μl/孔；10mMdNTP，0.5μl/孔；100XBSA，0.5μl/孔；T4DNA连接酶，0.5μl/孔；T4DNA聚合酶，0.5μl/孔。

PCR

在95℃，2min；而后45个循环的95℃，30s、56℃，30s、72℃，60s；以及72℃，5min进行PCR。PCR引物序列为SEQIDNo52，53。

用虾碱性磷酸酶(ShrimpAlkalinePhosphatase，SAP)去除未反应的dNTP。

UEP单碱基延伸

设计适用于MELPA的UEP见表3，由于一些G6PD突变位点距离较近，将UEP分成两孔1和2两个反应孔。延伸反应在如下条件下进行：94℃，30s；40个循环的94℃，5s、52℃，5s、80℃，5s；72℃，3min；4℃，维持。UEP质量以及引物延伸后的质量等详细信息见表4。

表3：MELPA中针对G6PD突变位点的UEP引物

表4：MELPA用于G6PD基因常见23个突变位点检测的质谱信

WELL	SNP_ID	AMP_LEN	UEP_DIR	UEP_MASS	EXT1_CALL	EXT1_MASS	EXT2_CALL	EXT2_MASS	EXT3_CALL	EXT3_MASS
											W1	1024	106	F	4534.9	C	4782.1	T	4862
W1	825	92	R	4745.1	G	4992.3	C	5032.3
											W1	592	97	F	5219.4	C	5466.6	T	5546.5
W1	703	107	F	5434.5	C	5681.7	T	5761.6
											W1	1387	94	R	5612.7	T	5883.9	C	5899.9
W1	159	90	F	5716.7	C	5963.9	G	6003.9
											W1	406	120	F	5837.8	C	6085	T	6164.9
W1	487	111	F	6038.9	A	6310.1	G	6326.1
											W1	95	85	R	6125	G	6372.2	A	6452.1
W1	871	111	F	6403.2	A	6674.4	G	6690.4
											W1	1360	107	F	6487.2	C	6734.4	T	6814.3
W1	1376	120	F	6632.3	G	6919.5	T	6959.4
											W1	517	120	F	7018.6	C	7265.8	T	7345.7
W2	519	117	R	4464.9	G	4712.1	C	4752.1
											W2	392	103	R	4600	G	4847.2	T	4871.2
W2	1004	119	R	4626	C	4913.2	A	4953.1
											W2	493	113	R	4897.2	G	5144.4	A	5224.3
W2	202	114	F	5083.3	A	5354.5	G	5370.5
											W2	442	90	R	5208.4	G	5455.6	A	5535.5
W2	1388	94	R	5323.5	G	5570.7	A	5650.6
											W2	274	102	R	5407.5	T	5678.7	C	5694.7
W2	835	113	R	5490.6	G	5737.8	T	5761.8	A	5817.7
											W2	1414	92	F	6006.9	C	6254.1	A	6278.1

AMP_LEN：扩增产物长度；UEP_DIR：UEP方向；EXT_CALL:UEP延伸的位点信息；EXT_MASS：UEP延伸后产物质量。

树脂纯化

树脂纯化是必须的步骤，树脂可以去除多余的盐离子，这些多余的盐离子可能引起数据获取中出现假的质谱峰，影响检测结果。

点样仪点样至芯片以及质谱检测与分析

按照Sequenom公司标准操作MassARRAYTyper4.0软件进行质谱检测，

得到每个等位基因位点的检测结果，并且质谱给出对结果可信度的描述分为A～D四个等级，见表5。本实验的结果判读中，当结果描述为A级和B级时，为实验结果可信，C级实验结果可信度较低，需要进一步观察峰图根据SNR值判读结果，未延伸的峰高度为0，延伸后主峰SNR>6.4可以认为质谱结果中度可信。

表5：实验结果

2、iPLEX方法用于检测23种G6PD基因型

登陆SEQUENOM公司在线设计网站(https://mysequenom.com)，选择基因分型在线设计工具(HumanGenoTypingTools)。将G6PD基因组序列检测靶位点输入后软件将自动设计出扩增引物和延伸引物(unextenededprimer，UEP)。由于G6PD基因很多突变位点距离较近，为了避免扩增引物和UEP有重叠序列导致形成异源二聚体，iPLEX软件设计时自动将G6PD的23个突变位点分成4个反应孔检测，扩增引物和UEP序列见表6。同时，为了打质谱时UEP与PCR扩增引物的质量可以区分开来，PCR所有上下游引物均加了5’ACGTTGGATG3’的10mer的尾巴。扩增产物长度、扩增方向、UEPmass以及引物延伸后的mass等详细信息见表7。设计好后，送去公司合成引物和UEP。

表6：iPLEXassay针对G6PD23个突变位点的扩增引物和UEP的序列

孔表示4个独立反应孔；正向PCR引物和反向PCR药物为PCR扩增上下游引物；UEP为单碱基延伸反应中使用的延伸引物，UEP5’端的小写字母是为了使打质谱时UEP的质量可以区分开，软件设计时所增加的碱基。

iPLEX方法如下进行：使用QIAGEN试剂盒提取全血基因组DNA；在95℃，2min；而后45个循环的95℃，30s、56℃，30s、72℃，60s；以及72℃，5min进行PCR反应；SAP处理可以去除未完全反应的dNTP；UEP单碱基延伸反应，如上所述进行；树脂纯化后，点样，进行质谱分析。详细信息见表7。

表7：iPLEXGoldassay用于G6PD基因常见23个突变位点检测的质谱信息

WELL	SNP_ID	AMP_LEN	UEP_DIR	UEP_MASS	EXT1_CALL	EXT1_MASS	EXT2_CALL	EXT2_MASS	EXT3_CALL	EXT3_MASS
											W1	1004	106	F	4534.9	C	4782.1	T	4862
W1	825	92	R	4745.1	G	4992.3	C	5032.3
											W1	592	97	F	5219.4	C	5466.6	T	5546.5
W1	703	107	F	5434.5	C	5681.7	T	5761.6
											W1	1387	94	R	5612.7	T	5883.9	C	5899.9
W1	159	90	F	5716.7	C	5963.9	G	6003.9
											W1	406	120	F	5837.8	C	6085	T	6164.9
W1	487	111	F	6038.9	A	6310.1	G	6326.1
											W1	95	85	R	6125	G	6372.2	A	6452.1
W1	871	111	F	6403.2	A	6674.4	G	6690.4
											W1	1360	107	F	6487.2	C	6734.4	T	6814.3
W2	519	117	R	4464.9	G	4712.1	C	4752.1
											W2	1024	119	R	4626	C	4913.2	A	4953.1
W2	202	114	F	5083.3	A	5354.5	G	5370.5
											W2	442	90	R	5208.4	G	5455.6	A	5535.5
W2	274	102	R	5407.5	T	5678.7	C	5694.7
											W2	835	113	R	5490.6	G	5737.8	T	5761.8	A	5817.7
W2	1414	92	F	6006.9	C	6254.1	A	6278.1
											W3	392	103	R	4600	G	4847.2	T	4871.2
W3	493	113	R	4922.2	G	5169.4	A	5249.3
											W3	1388	94	R	5323.5	G	5570.7	A	5650.6
W4	517	120	R	4513.9	T	4785.1	C	4801.1
											W4	1376	120	F	5405.5	G	5692.7	T	5732.6

AMP_LEN：扩增产物长度；UEP_DIR：UEP方向；EXT_CALL:UEP延伸的位点信息；EXT_MASS：UEP延伸后产物质量。

3、G6PD基因突变位点的DNA测序

在分析的23个G6PD突变位点附近设计引物，进行PCR扩增，送公司进行测序验证MELPA方法检测结果。引物的设计采用Primer3在线软件，引物序列、PCR产物长度以及PCR产物包含的突变位点见表8。

表8：Sanger测序引物、PCR产物长度以及扩增产物所覆盖的G6PD基因突变位点

按如下程序进行PCR扩增，94℃，30s；35个循环的56℃，30s；72℃，60s；最后，72℃5min。用正向引物或者反向引物进行Sanger测序，验证MELPA或iPLEX基因分型结果。

4、MELPA检测G6PD基因常见23个位点的可靠性

4.1MELPA检测结果与金标准测序结果对比

我们用MELPA方法检测了112例间日疟血样G6PD基因这23个位点的基因型，共找到10个发生突变的位点，来自于9例样品，其中有1例样本检测到两个突变位点，检测结果见表9。我们发现最常见的突变发生在487位点，而且所有杂合子突变的样本均来自女性。

表9：MELPA方法检测到的有突变位点的样本信息以及测序结果.

为了进一步验证MELPA检测结果是否可信，我们对上述9个样本检测到的10个突变位点进行金标准测序验证。测序结果与MELPA检测结果结果一致，一致率为100％

4.2MELPA与iPLEX方法检测结果对比

我们从112例间日疟血样中随机抽取1例间日疟血样和1例正常对照血样分别用iPLEX方法和MELPA方法检测了G6PD基因23个突变位点，每个样品均做复孔。总结iPLEX结果见表10，同样的样本用MELPA方法结果见表11，基因分型的结果描述(Description)为质谱仪根据峰图自动给出的，表示所得到的基因分型结果的可信程度。举例说明四种级别的结果描述所相应的峰图，A级别和B级别的基因分型结果可信，C级别的结果需要进一步观察峰图确定分型结果是否可信，D级别结果不可信。我们可以发现iPLEX方法两个样本的大多数突变位点检测结果较好，其中间日疟血样有159、517和825三个突变的复孔间未重复出相同的检测结果，正常血样有517、392和825三个突变的复孔间检测结果重复性不好，复孔间一致率约为87％(20/23)；MELPA方法两个样品的23个位点检测结果均较好，结果描述均为A和B级结果可信，未检测到突变，所有位点均为野生型，复孔间重复性较好，一致率为100％。

此外，为了避免扩增引物和UEP探针之前的相互影响，iPLEX检测这23个突变位点时，需要4个独立的反应孔，而MELPA仅需2个反应孔可检测所有的23个突变位点，将试剂和耗材成本缩小了50％。

表10：iPLEX方法检测间日疟血样和正常对照血样

v表示间日疟，n表示正常对照，数字为样本编号。

表11、MELPA方法检测间日疟血样和正常对照血样

v表示间日疟，n表示正常对照，数字为样本编号。

我们将两个血样分别提取基因组DNA，PCR扩增四个不一致的位点159、517、392和825附近的片段，测序检测到的样品位点基因型。我们发现正常样本和间日疟血样的这四个位点均为单峰，即均为野生型纯合子。总结对比两种检测方法和测序金标准的结果，可知这两例样本四个位点用MELPA检测出的结果与金标准测序结果完全一致，且复孔间重复性较好；而iPLEX方法复孔间重复性较差，检测结果与金标准测序结果不完全一致(参见表12和13)。

表12：对比间日疟样品(v-6)iPLEX方法和MELPA方法结果与测序结果

表13：对比正常血样(n-2)的iPLEX方法和MELPA方法结果与测序结果

4.3MELPA的重复性

为了验证MELPA方法的重复性，我们在112例间日疟血样中随机抽取16例血样在不同的两个日期进行重复检测，详细的检测结果见附录5。16例样品均检测G6PD基因的23个突变位点，共检测368个位点(23*16)，其中有4例样品各有1个位点在两次的检测中，有一次未给出基因型分型的结果(NA.质谱信号较低，机器未读出检测结果)，占总检测位点的1.08％(4/368)；其余所有位点的结果在两个不同日期基因分型结果均一致，成功检测364个位点占98.9％(364/368)，即一致率为98.9％。MELPA方法针对同一样本在不同日期检测结果的重复性较好。

4.4MELPA对临床样本的适用性

经过SNP预实验，我们发现MELPA既可以直接检测全血，也可以直接检测干血片(DBS)样本，两种样本均无需提取基因组DNA，通过直接裂解捕获样本中的DNA进行检测。我们将G6PD突变分型的检测方案应用于这两种样本较大的样本量中，进一步评估该检测方案对两种临床样本的适用性。

4.4.1全血样本

对于基因突变分型或SNP检测，检出率(CallRate)是一个很重要的指标。质谱检测的结果中，检出率定义为质谱给出的分型结果占总的检测位点的百分比(CallRate＝Calls/TotalPossibleCalls)。我们用MELPA方法总共检测了112例间日疟全血样本。每个样本均分析了G6PD基4.4.1因的23个常见突变位点，共2576个位点(23*112)。其中质谱给出的分型结果(包括A～C级别的结果)的有2520个，即CallRate为97.83％(2520/2576)，未能得到分型结果(包括D～I级别的结果)的有56个，占2.17％(56/2576)。

MELPA检测血样G6PD基因分型的详细结果表明，A级别的结果有2380个占92.39％；B的有128个占4.97％，即A和B级别可信的结果共占所有质谱给出分型结果的97.36％(2508/2576)；C与D级别，尽管得到分型结果，但结果可信度不高，共有43个位点，占1.67％。我们可以发现MELPA方法用于检测全血样本，CallRate超过97％，可信分型结果(A和B级别)比例大于97％，该方法可以很好地适用于全血样本的直接检测。

此外，112例样本中有6例样本未能成功检测所有的23个位点，这些样本的23个位点中有5个以上的位点未得到分型结果(D～I级别的结果)，占样本比例的5.36％(6/112)，这可能是由于这些血样存储时间较久，个别样品DNA降解所致。

4.4.2干血片样本(DBS)

我们用MELPA方法总共检测了192例DBS样本，每个样本均检测了G6PD基因的23个常见突变位点，共4416个位点(23*192)。其中质谱给出的分型结果(包括A～C级别的结果)的有4295个，即CallRate为97.26％(4295/4416)，未能得到分型结果(包括D～I级别的结果)的有121个占2.74％(121/4416)。

MELPA检测DBS样本的G6PD基因分型详细结果表明，A级别的结果占91.03％；B级别占5.87％，即A和B级别可信的结果共占所有质谱给出分型结果的96.90％(4279/4416)；C与D级别，尽管得到分型结果，但结果可信度不高，共占0.79％。我们可以发现MELPA方法用于检测DBS样本，CallRate超过97％，可信分型结果(A和B级别)比例约占97％，该方法对于DBS样本的基因分型适用性良好。

此外，所有的N级别(没有特异单碱基延伸后产物)和I级别(未得到质谱峰)的结果集中于8个样品；这些样品的23个位点有10个以上的位点未得到成功的检测结果，占样本比例的4.12％(8/192)。

4.5MELPA技术在疟疾流行区G6PD基因突变筛查中的应用

4.5.1中缅边境间日疟血样G6PD基因23个突变位点的筛查与分布

我们用MELPA方法成功检测了中缅边境106例伯氨喹啉用药的间日疟血样G6PD基因的23个常见突变位点，其中男性78例，女性28例，平均年龄20.1岁，检测样本的民族分布见表14，主要以景颇族为主，占66.98％(71/106)，其次为缅族占28.3％(30/106)，傈傈族、汉族和傣族共占4.72％。

106例血样中共检测到9例样本发生突变，人群突变发生频率约为8.5％(9/106)；各民族检出突变类型、突变例数以及突变例数占该民族总检测人数的百分比见表。其中，景颇族检出突变频率为8.5％(6/71)，缅族为6.7％(2/30)，傣族为100％(1/1)，傈傈族和汉族未检测到突变，见表14。

共检测到10个突变位点，其中有1例患者发生两个位点的杂合突变，相应的样本信息见表15，其中所有的杂合突变均为女性，纯合突变均为男性(半合子)。突变位点的频数以及频率分布见表16，其中最常见的突变位点为玛希隆(c.487G->A)，突变发生频率为6.6％(7/106)；开平(c.1388G->A)，万象(c.871G->A)和庆安(c.392G->T)各检测到1例，突变频率为0.94％(1/106)。

表14：106例间日疟血样的民族分布、检出突变类型以及突变例数(百分比)

‐‐表示未检测到突变

表15：10个G6PD突变位点的样本信息

/表示该突变位点有多个名字。

表16：中缅边境106例间日疟血样的G6PD变体分布

/表示该突变位点有多个名字.

106例间日疟血样中，有75例采用我国氯伯8d疗法，有31例采用WHO推荐的氯伯8d疗法。所有样本中仅有1例(ID:vA-8)发生急性溶血反应，该样本为男性，19岁景颇族，采用我国氯伯8d疗法后3天出现血红蛋白尿。检测该样本G6PD23个突变位点中只有玛希隆(c.487G->A)位点发生突变，为玛希隆半合子，其余22个突变位点均未突变，所有检测结果均为A级别和B级别的可信结果。

4.5.2云南省疟疾流行区G6PD基因23个突变位点的筛查与分布

在检测了106例中缅边境伯氨喹啉用药的间日疟血样后，我们又用MELPA方法成功检测了云南省疟疾流行区的184例DBS样本的G6PD基因23个常见突变位点，其中男性97例，女性87例，平均年龄22.6岁，检测样本的民族分布见:，主要以拉祜族为主，占58.7％，其次为佤族占25.54％，其余少数民族共占15.76％。

184例DBS样本中共检测到2例样本发生突变，人群突变发生频率约为1.1％(2/184)；各民族检出突变类型、突变例数以及突变例数占该民族总检测人数的百分比见表17，其中2例样本均为拉祜族，拉祜族检出突变频率为1.8％(2/108)，其余少数民族未检出突变；检测到2个突变类型相应的样本信息见表18，其中玛希隆(c.487G->A)杂合突变为女性，巴利亚多利德(c.406C->T)纯合突变为男性(半合子)。

表17：184例DBS样本的民族分布、检出突变类型以及突变例数(百分比)

‐‐表示未检测到突变

表18：2个G6PD突变位点的样本信息

Claims (10)

1.一种基于多重延伸连接的探针扩增方法，所述方法包括以下步骤:

a)提供含有待检测核酸的样本；

b)使用含有蛋白酶K的裂解液裂解含有待测核酸的样本；

c)在足以使互补碱基杂交的条件下，将步骤b)获得的裂解样本与捕获探针以及连接探针孵育，所述捕获探针结合至捕获载体表面；

d)在足以使延伸反应和连接反应发生的条件下，使与待检测核酸互补杂交的连接探针延伸并连接；

e)使用PCR扩增延伸连接的连接探针之间的序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)中使用至少一对捕获探针和至少一对连接探针，所述一对连接探针之一的5’端被磷酸化修饰、3’端具有与通用引物的反向引物互补的序列；所述一对连接探针的另一个的5’端具有与通用引物的正向引物相同的序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中捕获探针的一端带有一段序列，其与以共价键结合在捕获载体表面的寡核苷酸序列互补，并通过碱基配对与该寡核苷酸序列结合，另一端通过互补碱基与待检测核酸杂交。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述捕获载体是固相支持物，优选是96孔平板。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述的含有待测核酸的样本是全血或干血片。

6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，进一步包括步骤：

f)通过树脂纯化步骤e)中扩增后的产物；

g)通过质谱、测序、或凝胶电泳的方法检测待检测核酸的序列、碱基突变以及DNA拷贝数。

7.根据权利要求1-7任一项的方法，用于高通量检测基因组中的SNP、基因插入、基因缺失的用途。

8.根据权利要求1-7任一项的方法，用于高通量检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因SNP的用途。

9.一种用于本发明的权利要求1-8任一项所述的方法试剂盒，所述试剂盒包含至少一对捕获探针和至少一对连接探针，以及捕获载体。

10.一种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因SNP的试剂盒，所述试剂盒包含选自序列为SEQIDNO:1-51所示的寡核苷酸以及捕获载体。