CN105671198A - 检测肝糖原累积症iii型agl基因突变的试剂盒及其应用 - Google Patents

检测肝糖原累积症iii型agl基因突变的试剂盒及其应用 Download PDF

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CN105671198A CN201610252379.4A CN201610252379A CN105671198A CN 105671198 A CN105671198 A CN 105671198A CN 201610252379 A CN201610252379 A CN 201610252379A CN 105671198 A CN105671198 A CN 105671198A
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Abstract

本发明涉及一种检测肝糖原累积症III型AGL基因突变的试剂盒及其应用，所述试剂盒主要包括用于检测AGL基因的10个外显子Exon6、Exon13、Exon14、Exon15、Exon26、Exon27、Exon31、Exon32、Exon33和Exon34的特异性扩增引物和PCR反应试剂。本发明试剂盒用于检测AGL基因与肝糖原累积症III型疾病相关的10个外显子突变位点，特异性好，灵敏度高，可显著提高不典型GSD？III型病例的诊断率，也是通过产前诊断从而有效降低该病发病率的重要手段。

Description

检测肝糖原累积症III型AGL基因突变的试剂盒及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种检测肝糖原累积症III型AGL基因突变的试剂盒及其应用。
(二)背景技术
糖原累积症III型(GlycogenStorageDiseaseTypeIII,GSDIII)又称Cori病，是由糖原脱支酶(glycogendebranchingenzyme,AGL)缺陷引起的一种常染色体隐性遗传性、糖原代谢异常性疾病。AGL有两个独立的催化位点，即ɑ-1,6-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.33)和ɑ-1,4-糖基转移酶(EC3.4.1.25)，完整的AGL活性需要葡萄糖苷酶和葡萄糖转移酶共同发挥作用。根据酶缺陷和累及的组织器官不同，GSDIII型可分为四个亚型，分别为GSDIIIa、GSDIIIb、GSDIIIc和GSDIIId型，其中以肝脏和肌肉中AGL活性均缺乏的GSDIIIa为最多见，约占总GSDIII型的85％，其它三种相对较为罕见。
GSDIII型患者临床表现主要为伴有酮症的饥饿性低血糖、生长迟缓和肝脾增大，高脂血症也是常见的表现；青春期后，大部分的GSDIII型患者的肝部症状会消失，但是有些患者也会出现进行性肝纤维化和肝硬化，甚至发展成肝功能衰竭或肝细胞癌；部分患者在成年后会并发累及肌肉组织，表现为肌无力、肌痉挛、肌萎缩、心肌病等，在行走过速或爬坡时尤为明显。所有的GSDIII型亚型均由AGL基因突变引起，该基因1992年被定位于人类1号染色体断臂的2区1带(1p21)区域，全长85kb，由35个外显子组成，其中外显子6、13、14和15被认定为具有ɑ-1,4-糖基转移酶催化功能区域，外显子26和27为ɑ-1,6-葡萄糖苷酶功能区，而糖原结合区域存在于外显子31-34上。迄今为止，国内外已发现与GSDIII疾病相关的的AGL基因突变类型超过30余种，在美国人中，p.Arg864X突变最常见，占10.3％；在意大利人中，常见突变为c2681+1G>A，占20.5％；国内最常见突变主要有c1735+1G>T和p.Tyr1428X(占25％)。
基因测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。目前常用的Sanger测序法是FrederickSanger于1975年发明的，测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应(PCR)。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸又少了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。作为一种新型基因检测技术，基因测序能够从血液或唾液中分析测定目的基因序列，助力相关遗传病诊断，可以对那些即使没有临床症状的患者，也可以得到尽早的诊断和治疗，为临床诊治提供科学依据。与患者拥有相同基因型的家族成员，尽管没有临床症状也应该尽早治疗，而临床症状或生化检查都模棱两可的家族成员，有可能是杂合子携帯者需加以关注，具有高度特异且精确，低成本，操作简便，快速，高通量等优点，是国际上公认的检测基因突变的“金标准”。
在AGL基因克隆之前，GSDIII的诊断主要靠临床表现和生化检查，在临床上主要问题表现为诊断率低和诊断手段有限。进一步确诊则依靠在肝脏和/肌肉中检测到异常的糖原和AGL活性降低或缺乏。但是实际操作比较困难，大多数患者或者家长不接受肝脏和肌肉活检，对携带者更是无法进行检查，产前诊断如果对胎儿肝脏进行活检会给胎儿带来危险。AGL基因突变检测使得以DNA为基础的基因诊断成为可能，该方法不仅显著提高了不典型GSDIII型病例的诊断率，也是通过产前诊断从而有效降低该病发病率的重要手段。同时对患者的同胞进行基因检测将有可能将诊断提前至无症状的临床前期，因而对于GSDIII型的基因测序检测，具有更准确、更经济、更简便，利于开展，避免了以往该病的诊断有赖于肝穿刺和肌肉活检的诊断方法，更易于被患者接受。因此以DNA为基础的非侵入性基因测序诊断为传统的诊断提供了一种可替代的方法。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种检测肝糖原累积症III型AGL基因突变的试剂盒及其应用，该试剂盒用于检测AGL基因突变位点，特异性好，灵敏度高。
本发明采用的技术方案是：
一种检测肝糖原累积症III型AGL基因突变的试剂盒，主要包括用于检测AGL基因的10个外显子Exon6、Exon13、Exon14、Exon15、Exon26、Exon27、Exon31、Exon32、Exon33和Exon34的特异性扩增引物和PCR反应试剂，所述特异性引物序列如下：
外显子Exon6扩增引物：
上游引物：5’-GAACCCAAGTGTTTGACCTCTTTTC-3’
下游引物：5’-CTTTCTCTTATTTGTGTGTATATGT-3’；
外显子Exon13扩增引物：
上游引物：5’-TAAAAACCAGTGTTTCCTTG-3’
下游引物：5’-AATGCTTGTGTCCAACTAGC-3’；
外显子Exon14扩增引物：
上游引物：5’-TGTCAAATCATGCCTCCTT-3’
下游引物：5’-GTTCATCCTACTGGTCTTTCAA-3’；
外显子Exon15扩增引物：
上游引物：5’-TGAGCCATTTCTCCAGTTAAG-3’
下游引物：5’-TATGGGTATGATTGTGACCAAG-3’；
外显子Exon26扩增引物：
上游引物：5’-AGGATTTGCAGGTGCCT-3’
下游引物：5’-AATACAGCTCCCAAATGTTAAG-3’；
外显子Exon27扩增引物：
上游引物：5’-AAAGAAATAGGGCAAGAGAGA-3’
下游引物：5’-GGTGCCAAATCAATACTGAC-3’；
外显子Exon31扩增引物：
上游引物：5’-ACACATCTCAATTCAGACTGG-3’
下游引物：5’-TGGGAATAAGGAACTAAGCA-3’；
外显子Exon32扩增引物：
上游引物：5’-GGCTTTCCTAACTTCTACGG-3’
下游引物：5’-GGTGTACACAATCTCTCCCA-3’；
外显子Exon33扩增引物：
上游引物：5’-AGATGGATGATGTACTAATGCC-3’
下游引物：5’-ATAGTCTTTGCAGTAGTCTCCG-3’；
外显子Exon34扩增引物：
上游引物：5’-CTGTGGAATTTATGACAATGC-3’
下游引物：5’-AGGGCATACAGAAATCAATTC-3’。
所述PCR反应试剂为本领域常规试剂，主要包括：dNTP、10*PCR缓冲液、双蒸水、Tag酶等。
所述试剂盒还可包括AGL基因10个外显子序列标准品，所述标准品序列如下：
外显子Exon6：
5’-GCTACAACATGATTCATTTTACCCCATTGCAGACTCTTGGACTATCTAGGTCATGCTACTCCCTTGCCAATCAGTTAGAATTAAATCCTGACTTTTCAAGACCTAATAGAAAGTATACCTGGAATGATGTTGGACAGCTAGTGGAAAAATTAAAAAAGGAATGGAATGTTATTTGTATTACTGATGTTGTCTACAATCATACTG-3’；
外显子Exon13：
5’-GTTCAGAAGTTTACCTAAGGAGAGAACTTATTTGCTGGGGAGACAGTGTTAAATTACGCTATGGGAATAAACCAGAGGACTGTCCTTATCTCTGGGCACACATGAAAAAATACACTGAAATAACTGCAACTTATTTCCAGGGAGTACGTCTTGATAACTGCCACTCAACACCTCTTCACGTAGCTGAG-3’；
外显子Exon14：
5’-TACATGTTGGATGCTGCTAGGAATTTGCAACCCAATTTATATGTAGTAGCTGAACTGTTCACAGGAAGTGAAGATCTGGACAATGTCTTTGTTACTAGACTGGGCATTAGTTCCTTAATAAGAG-3’；
外显子Exon15：
5’-AGGCAATGAGTGCATATAATAGTCATGAAGAGGGCAGATTAGTTTACCGATATGGAGGAGAACCTGTTGGATCCTTTGTTCAGCCCTGTTTGAGGCCTTTAATGCCAGCTATTGCACATGCCCTGTTTATGGATATTACGCATGATAATGAGTGTCCTATTGTG-3’；
外显子Exon26：
5’-GCTTACCTCATTTTTCTTCTGGTATTTTCCGCTGCTGGGGAAGGGATACTTTTATTGCACTTAGAGGTATACTGCTGATTACTGGACGCTATGTAGAAGCCAG-3’。
外显子Exon27：
5’-GAATATTATTTTAGCATTTGCGGGTACCCTGAGGCATGGTCTCATTCCTAATCTACTGGGTGAAGGAATTTATGCCAGATACAATTGTCGGGATGCTGTGTGGTGGTGGCTGCAGTGTATCCAGGATTACTGTAAAATGGTTCCAAATGGTCTAGACATTCTCAAGTGCCCAGTTTCCAGAATGTATCCTACAGATGATTCTGCTCCTTTGCCTGCTGGCACACTG-3’；
外显子Exon31：
5’-GAAAGGCTATAAAGGTCTCATATGATGAGTGGAACAGAAAAATACAAGACAACTTTGAAAAGCTATTTCATGTTTCCGAAGACCCTTCAGATTTAAATGAAAAGCATCCAAATCTGGTTCACAAACGTGGCATATACAAAGATAGTTATGGAGCTTCAAGTCCTTGGTGTGACTATCAGCTCAGGCCTAATTTTACCATAGCAATGGTTGTG-3’；
外显子Exon32：
5’-GCCCCTGAGCTCTTTACTACAGAAAAAGCATGGAAAGCTTTGGAGATTGCAGAAAAAAAATTGCTTGGTCCCCTTGGCATGAAAACTTTAGATCCAGA-3’；
外显子Exon33：
5’-TGATATGGTTTACTGTGGAATTTATGACAATGCATTAGACAATGACAACTACAATCTTGCTAAAGGTTTCAATTATCACCAAGGACCT-3’；
外显子Exon34：
5’-GAGTGGCTGTGGCCTATTGGGTATTTTCTTCGTGCAAAATTATATTTTTCCAGATTGATGGGCCCGGAGACTACTGCAAAGACTATAGTTTTGGTTAAAAATGTTCTTTCCCGACATTATGTTCATCTTGAGAG-3’。
PCR及测序所需野生型标准品的制备以Genebank中发布AGL的基因序列为标准，以健康体检人的外周血基因组为模板，用上述10对引物扩增出10个特异性的PCR片段，合成与表1引物一致的野生型质粒，并与AGL的标准基因序列比对，确认质粒的正确性，作为检测分析中的标准品。
本发明还涉及所述试剂盒在检测肝糖原累积症III型AGL基因突变中的应用。
具体的，所述应用方法如下：
(1)采集待测血液样本，提取DNA；
(2)以样品DNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增；
(3)步骤(2)得到的PCR反应产物进行进一步的测序，依据单基因遗传病基因突变数据库或者对照标准品序列进行分析，确定是否肝糖原累积症III型致病突变位点。
所述PCR反应体系每25μL组成如下：
5×PrimeSTARBuffer5μL
dNTPMixture(200uM)2μL
正向引物(10μmol/L)lμL
反向引物(10μmol/L)lμL
模板lμL
PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μl；
ddH2O补足至25μL。
所述PCR反应条件如下：95℃3min；98℃10s、56℃15s，72℃30s，30个循环；最后72℃8min。
对于扩增出来的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，纯化后分别对扩增引物测序，结果采用DNAStar软件子程序SeqMan分析，整理数据并在国际通用标准人基因突变数据库中(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)进行比对分析或者与对照标准序列进行比对，进一步分析已明确的致病突变位点，可作为临床诊断的依据。
本发明的有益效果主要体现在：本发明试剂盒用于检测AGL基因与肝糖原累积症III型疾病相关的10个外显子突变位点，特异性好，灵敏度高，可显著提高不典型GSDIII型病例的诊断率，也是通过产前诊断从而有效降低该病发病率的重要手段。同时对患者的同胞进行基因检测将有可能将诊断提前至无症状的临床前期，具有更准确、更经济、更简便，利于开展，避免了以往该病的诊断有赖于肝穿刺和肌肉活检的诊断方法，更易于被患者接受。
(四)附图说明
图1为患者A的检测结果；其AGL基因外显子27附近处出现剪切点突变(IVS27-2A→C)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
⑴样品准备。临床医生怀疑该患者A为遗传代谢性肝病糖原累积症III型，但是不能确诊，决定实施基因检测。
⑵样品处理。抽取受检者A静脉血2ml左右，置于肝素抗凝管内，低温避光保存运输至检验室；全血DNA提取向样品中抽取300μL血液加入900μL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1分钟，吸去上清，留下白细胞。
⑶基因组DNA提取。向上述装有白细胞的1.5ml离心管加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，混匀后快速离心后加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短快速离心以去除管盖内壁的水珠；加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，快速离心以去除管盖内壁的水珠；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000g离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入600μl缓冲液PW，12000g离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；再重复上一步骤操作；将吸附柱CB3放回收集管中，12000g离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱液TE，室温放置3min，12000g离心2min，将溶液收集到离心管中。
⑷PCR扩增。
表1：可扩增出AGL中5个特异性外显子及其附近区域的引物
表2：AGL中10个与GSDIII疾病相关的10特异性外显子标准品序列
利用表1中AGL10个外显子部位特异性PCR扩增引物，以样品DNA作为模板，进行PCR扩增。
PCR反应体系组成如下(共25μL)：
野生型标准品和待测样品的模板均稀释成同一浓度5ng/μL。
PCR反应条件如下：
95℃3min；
98℃10s、56℃15s，72℃45s，30个循环；
最后72℃10min；
同时利用表2中标准品设置阴阳性对照。
10对引物分别扩增出431bp，361bp，452bp，451bp，324bp，483bp，427bp，451bp，411bp，和412bp的片段。
⑸上机测序。利用测序仪进行目的片段测序。
⑹利用DNAMAN8软件对的测序结果进行序列分析，在单基因遗传病基因突变数据库进行确定诊断，分析出外显子27处出现的剪切点突变(IVS27-2A→C)，从而可确诊患者A属于遗传代谢性肝病糖原累积症III型(参见图1)。

Claims (5)

1.一种检测肝糖原累积症III型AGL基因突变的试剂盒，主要包括用于检测AGL基因的外显子Exon6、Exon13、Exon14、Exon15、Exon26、Exon27、Exon31、Exon32、Exon33和Exon34的特异性扩增引物和PCR反应试剂，所述特异性引物序列如下：
外显子Exon6扩增引物：
上游引物：5’-GAACCCAAGTGTTTGACCTCTTTTC-3’
下游引物：5’-CTTTCTCTTATTTGTGTGTATATGT-3’；
外显子Exon13扩增引物：
上游引物：5’-TAAAAACCAGTGTTTCCTTG-3’
下游引物：5’-AATGCTTGTGTCCAACTAGC-3’；
外显子Exon14扩增引物：
上游引物：5’-TGTCAAATCATGCCTCCTT-3’
下游引物：5’-GTTCATCCTACTGGTCTTTCAA-3’；
外显子Exon15扩增引物：
上游引物：5’-TGAGCCATTTCTCCAGTTAAG-3’
下游引物：5’-TATGGGTATGATTGTGACCAAG-3’；
外显子Exon26扩增引物：
上游引物：5’-AGGATTTGCAGGTGCCT-3’
下游引物：5’-AATACAGCTCCCAAATGTTAAG-3’；
外显子Exon27扩增引物：
上游引物：5’-AAAGAAATAGGGCAAGAGAGA-3’
下游引物：5’-GGTGCCAAATCAATACTGAC-3’；
外显子Exon31扩增引物：
上游引物：5’-ACACATCTCAATTCAGACTGG-3’
下游引物：5’-TGGGAATAAGGAACTAAGCA-3’；
外显子Exon32扩增引物：
上游引物：5’-GGCTTTCCTAACTTCTACGG-3’
下游引物：5’-GGTGTACACAATCTCTCCCA-3’；
外显子Exon33扩增引物：
上游引物：5’-AGATGGATGATGTACTAATGCC-3’
下游引物：5’-ATAGTCTTTGCAGTAGTCTCCG-3’；
外显子Exon34扩增引物：
上游引物：5’-CTGTGGAATTTATGACAATGC-3’
下游引物：5’-AGGGCATACAGAAATCAATTC-3’。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括AGL基因外显子序列标准品，所述标准品序列如下：
外显子Exon6：
5’-GCTACAACATGATTCATTTTACCCCATTGCAGACTCTTGGACTATCTAGGTCATGCTACTCCCTTGCCAATCAGTTAGAATTAAATCCTGACTTTTCAAGACCTAATAGAAAGTATACCTGGAATGATGTTGGACAGCTAGTGGAAAAATTAAAAAAGGAATGGAATGTTATTTGTATTACTGATGTTGTCTACAATCATACTG-3’；
外显子Exon13：
5’-GTTCAGAAGTTTACCTAAGGAGAGAACTTATTTGCTGGGGAGACAGTGTTAAATTACGCTATGGGAATAAACCAGAGGACTGTCCTTATCTCTGGGCACACATGAAAAAATACACTGAAATAACTGCAACTTATTTCCAGGGAGTACGTCTTGATAACTGCCACTCAACACCTCTTCACGTAGCTGAG-3’；
外显子Exon14：
5’-TACATGTTGGATGCTGCTAGGAATTTGCAACCCAATTTATATGTAGTAGCTGAACTGTTCACAGGAAGTGAAGATCTGGACAATGTCTTTGTTACTAGACTGGGCATTAGTTCCTTAATAAGAG-3’；
外显子Exon15：
5’-AGGCAATGAGTGCATATAATAGTCATGAAGAGGGCAGATTAGTTTACCGATATGGAGGAGAACCTGTTGGATCCTTTGTTCAGCCCTGTTTGAGGCCTTTAATGCCAGCTATTGCACATGCCCTGTTTATGGATATTACGCATGATAATGAGTGTCCTATTGTG-3’；
外显子Exon26：
5’-GCTTACCTCATTTTTCTTCTGGTATTTTCCGCTGCTGGGGAAGGGATACTTTTATTGCACTTAGAGGTATACTGCTGATTACTGGACGCTATGTAGAAGCCAG-3’。
外显子Exon27：
5’-GAATATTATTTTAGCATTTGCGGGTACCCTGAGGCATGGTCTCATTCCTAATCTACTGGGTGAAGGAATTTATGCCAGATACAATTGTCGGGATGCTGTGTGGTGGTGGCTGCAGTGTATCCAGGATTACTGTAAAATGGTTCCAAATGGTCTAGACATTCTCAAGTGCCCAGTTTCCAGAATGTATCCTACAGATGATTCTGCTCCTTTGCCTGCTGGCACACTG-3’；外显子Exon31：
5’-GAAAGGCTATAAAGGTCTCATATGATGAGTGGAACAGAAAAATACAAGACAACTTTGAAAAGCTATTTCATGTTTCCGAAGACCCTTCAGATTTAAATGAAAAGCATCCAAATCTGGTTCACAAACGTGGCATATACAAAGATAGTTATGGAGCTTCAAGTCCTTGGTGTGACTATCAGCTCAGGCCTAATTTTACCATAGCAATGGTTGTG-3’；
外显子Exon32：
5’-GCCCCTGAGCTCTTTACTACAGAAAAAGCATGGAAAGCTTTGGAGATTGCAGAAAAAAAATTGCTTGGTCCCCTTGGCATGAAAACTTTAGATCCAGA-3’；
外显子Exon33：
5’-TGATATGGTTTACTGTGGAATTTATGACAATGCATTAGACAATGACAACTACAATCTTGCTAAAGGTTTCAATTATCACCAAGGACCT-3’；
外显子Exon34：
5’-GAGTGGCTGTGGCCTATTGGGTATTTTCTTCGTGCAAAATTATATTTTTCCAGATTGATGGGCCCGGAGACTACTGCAAAGACTATAGTTTTGGTTAAAAATGTTCTTTCCCGACATTATGTTCATCTTGAGAG-3’。
3.权利要求1所述试剂盒在检测肝糖原累积症III型AGL基因突变中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用方法如下：
(1)采集待测血液样本，提取DNA；
(2)以样品DNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增；
(3)步骤(2)得到的PCR反应产物进行进一步的测序，依据单基因遗传病基因突变数据库或者对照标准品序列进行分析，确定是否肝糖原累积症III型致病突变位点。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述PCR反应条件如下：95℃3min；98℃10s、56℃15s，72℃30s，30个循环；最后72℃8min。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110564838A (zh) * 2019-08-13 2019-12-13 上海千贝医疗科技有限公司 用于新生儿糖原累积病基因分型的多重pcr引物系统及其用途
CN111004845A (zh) * 2019-12-11 2020-04-14 昆明理工大学 用于检测agl基因突变的引物组合及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104862313A (zh) * 2015-05-13 2015-08-26 福州市传染病医院 检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变的试剂盒及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104862313A (zh) * 2015-05-13 2015-08-26 福州市传染病医院 检测肝糖原累积症Ⅰa型GP6C基因突变的试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTIAAN P SENTNER等: "mutation analysis in glycogen storage disease type iii patients in the Netherlands: novel genotype-phenotype relationships and five novel mutations in the AGL gene", 《JIMD REPORTS》 *
HORINISHI A等: "AB035443", 《GENBANK》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110564838A (zh) * 2019-08-13 2019-12-13 上海千贝医疗科技有限公司 用于新生儿糖原累积病基因分型的多重pcr引物系统及其用途
CN110564838B (zh) * 2019-08-13 2023-11-21 上海稼多医疗器械有限公司 用于新生儿糖原累积病基因分型的多重pcr引物系统及其用途
CN111004845A (zh) * 2019-12-11 2020-04-14 昆明理工大学 用于检测agl基因突变的引物组合及其应用

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