CN110982890B

CN110982890B - 一种用于预测儿童川崎病治疗反应性的试剂及其应用

Info

Publication number: CN110982890B
Application number: CN201911325996.2A
Authority: CN
Inventors: 李晓惠; 姜茜; 孟莉; 姚玮; 杨帅; 张明明; 林瑶; 刘杨; 李爱杰; 石琳
Original assignee: AFFILIATED CHILDREN'S HOSPITAL OF CAPITAL INSTITUTE OF PEDIATRICS
Current assignee: AFFILIATED CHILDREN'S HOSPITAL OF CAPITAL INSTITUTE OF PEDIATRICS
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN110982890A

Abstract

本发明提供一种用于预测儿童川崎病治疗反应性的试剂及其应用，主要用于检测静脉注射人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)无反应型川崎病易感基因的试剂及其包含该试剂的试剂盒。通过检测患者的3个基因的5个SNP位点(SMAD5基因的rs10056474或rs746994、PLA2G7基因的rs76863441，和/或IL‑1B基因的rs16944或rs1143627位点)，可以评估川崎病患儿对IVIG治疗的反应性。该试剂盒具有操作简便、成本低廉等特点。本发明的使用可以为尽早筛选IVIG无反应高危患儿，指导临床采取合理的干预、治疗措施提供依据，符合精准医疗的发展趋势。

Description

一种用于预测儿童川崎病治疗反应性的试剂及其应用

发明领域

本发明属于基因工程及分子遗传学领域，具体的说，涉及一种用于预测川崎病治疗反应性的试剂及其应用，尤其是用于检测静脉注射人免疫球蛋白(intravenousimmunoglobulin，IVIG)无反应型川崎病易感基因的试剂及其应用。

技术背景

川崎病(Kawasaki disease,KD)又名皮肤黏膜淋巴结综合征(mucocutaneouslymph node syndrome，MCLS)，是一种主要发生于5岁以下儿童，以全身血管炎症为主要病变的急性发热出疹性疾病。川崎病目前是儿童获得性心脏病最常见病因。川崎病的主要并发症为冠状动脉损伤，包括冠状动脉扩张，冠状动脉瘤，冠状动脉血栓形成、狭窄、闭塞甚至猝死。严重影响患儿及患儿家庭的生活质量。静脉注射人免疫球蛋白(intravenousimmunoglobulin，IVIG)联合口服大剂量阿司匹林是目前国际公认的KD急性期的标准治疗方案，据统计经本方案治疗后KD合并冠状动脉并发症的概率可由原来的15-25％下降至5％。但该方案治疗中有6.8-38.3％的患儿会发生IVIG无反应，并且IVIG无反应型KD患儿冠脉损害的发生率远高于IVIG敏感型KD患儿，且近年研究表明,IVIG无反应型川崎病发生率有上升趋势。因此，IVIG无反应型川崎病日益受到重视，对于如何在初始治疗之前预测出IVIG反应性已经成为重要的临床及科研问题。现有的国内外几种评分系统均通过临床表现及实验室指标预测IVIG无反应性。这些评分系统对于数据来源人群有较好的敏感性和特异性，但是当其应用至数据来源人群以外时预测效力明显降低。研究表明在常规IVIG治疗 KD时会下调许多免疫细胞基因的表达。因此我们有理由认为发生IVIG无反应的机制可能与免疫遗传有关。积极寻找并确定KD患儿发生IVIG无反应的易感基因，结合我院现有依靠实验室指标建立的预测模型，构建基因联合临床实验指标的新的预测模型，尽早识别高危患儿并及时干预，对于改善KD患儿的预后至关重要。

目前为止，KD发生IVIG无反应的机制仍不清楚。但许多研究发现，不同国家及地区发生IVIG无反应的几率不尽相同，故认为无论是KD的发病还是KD的IVIG无反应在很大程度上可能与遗传和种族有关。国际上部分研究报道了KD患儿IVIG治疗无反应的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)位点，例如CCR5(C-C chemokine receptortype 5，C-C趋化因子受体型5)基因rs333、CASPASE-3(Cysteinyl Aspartate SpecificProteinase-3，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3)基因rs113420705、FCGR(Fc γreceptor，Fcγ受)2B基因rs3219018、FCGR2B基因rs780467580、FCGR2A基因 rs1801274、FCGR3A基因rs396991、FCGR3A基因rs403016、FCGR3A基因rs447536等等。但是，这些研究多是在不同人群中关于某一基因或是某一基因通路的研究，尚未在同一人群中，尤其是黄色人种中进行过多重基因的分析比较验证。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明通过查阅文献，选取目前文献报道可能与IVIG无反应相关的18个单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)位点：CCR5(C-C chemokine receptor type 5，C-C趋化因子受体型5)基因rs333、CASPASE-3(CysteinylAspartate Specific Proteinase-3，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3)基因rs113420705、FCGR(Fcγreceptor，Fcγ受)2B基因rs3219018、FCGR2B基因rs780467580、FCGR2A 基因rs1801274、FCGR3A基因rs396991、FCGR3A基因rs403016、FCGR3A基因rs447536、 IL-1B(interleuki-1beta，白细胞介素-1β)基因rs16944、IL-1B基因rs1143627、 ITPKC(inositol 1,4,5-triphosphate 3-kinase C，1,4,5三磷酸肌醇3激酶C)基因rs28493229、PLA2G7(phospholipase A2，PLA2)基因rs76863441、SMAD(drosophilamothers against decapentaplegic protein)3基因rs7163381、SMAD5基因rs10056474、SMAD5 基因rs746994、TGFB(transforming growth factor beta，转化生长因子β)2基因rs3892225、TGFBR(transforming growth factor beta receptor，转化生长因子β受体) 2基因rs3773649、TNF-α(Tumor Necrosis factor-α，肿瘤坏死因子-α)基因rs1800629，首次在黄色人种中国地区同一人群中(77名IVIG无反应型KD患儿及154名IVIG敏感型 KD患儿)，尤其是北方地区的人群中，通过一代测序检测、验证,经统计分析研究发现有3 个基因的5个SNP位点(SMAD5基因的rs10056474及rs746994、PLA2G7基因的rs76863441，以及IL-1B基因的rs16944及rs1143627的位点)与KD患儿IVIG治疗反应性有关。以此为基础，本发明将提供一种用于预测IVIG无反应型KD上述易感基因的检测试剂及其应用。因此，本发明提供：

一种检测试剂，所述检测试剂用于检测SMAD5基因的rs10056474或rs746994、PLA2G7 基因的rs76863441，和/或IL-1B基因的rs16944或rs1143627多态性位点的基因分型，所述基因的多态性位点是(1)rs10056474(C-G)，(2)rs76863441(G-T)，(3)rs746994(G-A)，和/或(4)rs16944(C-T)或rs1143627(T-C)。

优选的，所述检测试剂用于检测SMAD5基因的rs10056474多态性位点的基因分型。

优选的，所述检测试剂用于检测PLA2G7基因的rs76863441多态性位点的基因分型。

优选的，所述检测试剂用于检测SMAD5基因的rs746994多态性位点的基因分型。

优选的，所述检测试剂用于检测IL-1B基因的rs16944或rs1143627多态性位点的基因分型。

优选的，所述检测试剂用于检测上述基因的多态性位点的基因分型的任一组合。

更优选的，所述检测试剂用于检测IL-1B基因的rs16944、rs1143627、SMAD5基因的rs10056474、rs746994，和PLA2G7基因的rs76863441多态性位点的基因分型。

其中，rs10056474GG基因型、rs746994GG基因型、rs76863441GT基因型、rs16944CT/TT基因型、rs1143627CT/CC基因型显著增加IVIG抵抗危险。

更优选的，所述检测试剂是针对包含上述5个SNP位点相应的目标序列的特异性扩增引物。

更优选的，所述引物如SEQ ID NO：1-10所示。

本发明还提供一种上述检测试剂在制备检测静脉注射人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)无反应型川崎病易感基因的试剂盒中的用途。

本发明还提供一种上述检测试剂联合其他试剂在制备评估静脉注射人免疫球蛋白 (intravenous immunoglobulin，IVIG)无反应型川崎病的试剂盒中的用途，所述其他试剂为检测川崎病(KD)临床生化指标的试剂。

优选的，所述KD临床生化指标包括但不仅限于C反应蛋白，中性粒细胞百分比，血清钠(Na)，血清白蛋白，血清总胆红素等等。

其中，rs10056474GG基因型、rs746994GG基因型、rs76863441GT基因型、rs16944CT/TT基因型、rs1143627CT/CC基因型显著增加IVIG抵抗危险，即增加IVIG无反应型风险。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述检测试剂，用于检测静脉注射人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)无反应型川崎病易感基因。

优选的，所述试剂盒还包括检测川崎病(KD)临床生化指标的试剂。

优选的，所述试剂盒还包括检测试剂所需的PCR反应液。

本发明还提供一种检测静脉注射人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG) 无反应型川崎病易感基因的方法(Sanger测序法)，所述方法包括用上述检测试剂对样本进行检测。

优选的，所述样本来源于血液。

优选的，所述样本来源于黄色人种。

优选的，所述方法包括下列步骤：

(1)DNA提取；

(2)PCR反应和电泳；

(3)PCR产物纯化；

(4)PCR产物测序反应；

(5)PCR产物测序结果分析。

本发明的优点在于：本发明首次通过检索综合既往报道与IVIG无反应型相关位点，并在黄色人种中，尤其是中国北方地区人群中进行过多重基因的分析比较验证；进而提供用于检测IVIG无反应型KD易感基因的试剂盒，具有一定创新性。且试剂盒具有操作简便、成本低廉等特点。本发明的使用可以为尽早筛选IVIG无反应高危患儿，预测儿童川崎病治疗反应性，指导临床采取合理的干预、治疗措施提供依据，符合精准医疗的发展趋势。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：SMAD5-rs10056474(C>G)基因型检测结果，其中，箭头表示SMAD5基因的rs10056474位点基因型为GG。

图2：PLA2G7-rs76863441(G/T)基因型检测结果，其中，箭头表示PLA2G7基因的rs76863441位点基因型为GG。

图3：SMAD5-rs746994(G/A)基因型检测结果，其中，箭头表示SMAD5基因的rs746994 位点基因型为GG。

图4：IL-1B-rs16944(C/T)基因型检测结果，其中，箭头表示IL-1B基因的rs16944位点患者的基因型为杂合型CT型。

图5：IL-1B-rs1143627(T/C)基因型检测结果，其中，箭头表示IL-1B基因的rs1143627 位点基因型为TT型。

图6：患者地区来源分布图

图7：预测IVIG反应的列线图对各变量赋分

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，主要设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

表1：主要设备和材料

表2：主要试剂

实施例1：检测川崎病IVIG无反应型的易感基因

我们入选了首都儿科研究所附属儿童医院心内科从2015年12月-2019年8月住院的 231例KD患儿(77名IVIG无反应型KD患儿，154名IVIG敏感型KD患儿)，选取KD诊断标准包括：发热5天以上，伴下列5项临床表现中4项者，排除其他疾病后，即诊断为川崎病：(1)四肢变化：急性期手足硬性水肿，恢复期指(趾)端膜状脱皮；(2)多型性红斑；(3)眼结膜非化脓性充血；(4)口腔黏膜充血，杨梅舌；(5)颈部淋巴结肿大；注：如5项临床标准不足4项，但超声心动图有冠状动脉损害，可诊断为不完全川崎病。 IVIG无反应型的诊断标准包括：在IVIG应用后36小时体温仍大于38℃，或IVIG治疗后 2-7天再次出现发热，并符合至少一项KD临床表现，同时排除因再次合并感染或出现其他并发症而引起的发热。

患者地区来源如图6所示：共纳入231名KD患儿为研究对象，其中北方地区为207人，占90％，南方地区为24人，占10％。

检测静脉注射人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)无反应型川崎病易感基因的方法步骤包括：

(1)外周血DNA提取：所有患儿诊断KD明确开始治疗之前(约病程6-10日)清晨空腹采取KD患儿1-2ml外周血置于含EDTA抗凝管中。离心去掉血清获得血细胞，提取 200-300ug血细胞置于-80℃冰箱保存用于提取DNA。

(2)用Sanger测序法确定上述18个多态性位点的基因型，其中，rs403016与rs447536 设计的引物相同，具体方案为：

所需引物序列由北京诺禾心康基因科技有限公司合成，具体结构如表3所示：

注*：WW:ACAGTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGACA(SEQ ID No.35)；

W-:ACA。

PCR试剂体系如表4所示，其他主要仪器如表1所示：

表4 PCR体系(50μl体系)

具体操作步骤：

(1)DNA提取：采用试剂盒提取(参考试剂盒提供的protocol)。

(2)PCR反应和电泳：

①配置PCR体系(50μl体系)(如表4所示)

②设置PCR反应程序，具体程序如下：

1，94℃预变性,5min；

2c，94℃，30s；

3c，50-60℃，30s；

4c，72℃，90s；(2c-4c循环35次)

5，72℃，5min

③琼脂糖凝胶电泳：PCR产物用琼脂糖凝胶电泳法分离纯化，最后溶于ddH₂O，收集纯化后产物30μl左右。取3μl上样检测，以3K Marker为参照。

(琼脂糖配比：8G琼脂糖溶解在400ML的TAE溶液中，微波炉煮沸，冷却至适当温度加入EB，混匀后倒入制胶板中，冷却后使用。电泳条件：220V电压下，大约45分钟即可。)

(3)PCR产物回收：向PCR产物中加入5μl溴酚蓝溶液，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳。取30μl上样，每点8个孔后面点一个marker。电泳仪电压220V左右，大约45分钟左右。紫外分析仪下，对照片段产物长度信息，将目的条带切下，然后用胶回收试剂盒回收，(SANGON的柱式PCR产物纯化试剂盒，操作流程按说明书即可)得到30μl左右的纯化产物。取3μl上样检测，记录。

(4)PCR产物测序反应：纯化后检测成功的样本进行BDT反应。依次加入测序酶，buffer，引物和纯化后的产物。上PCR仪进行扩增。扩增后产物进行纯化。采用酒精纯化法，纯化后的产物加入HIDI混匀，上机(3730XL)测序。

(5)PCR产物测序结果分析：主要是判读测序峰图是否成功，是否有测序过程中人为及仪器干扰存在。测序成功的序列提交报告。

测序结果分析使用Seqman软件导入ab1和seq文件，进行比对，得到一代测序结果的峰图，根究目标区域序列，寻找变异位点。

结果解读：测序峰图由Chromas软件截图，其中：

图1-SMAD5-rs10056474(C>G)基因型检测结果，其中，箭头表示SMAD5基因的rs10056474位点基因型为GG。

图2-PLA2G7-rs76863441(G/T)基因型检测结果，其中，箭头表示PLA2G7基因的rs76863441位点基因型为GG。

图3-SMAD5-rs746994(G/A)基因型检测结果，其中，箭头表示SMAD5基因的rs746994 位点基因型为GG。

图4-IL-1B-rs16944(C/T)基因型检测结果，其中，箭头表示IL-1B基因的rs16944位点患者的基因型为杂合型CT型。

图5-IL-1B-rs1143627(T/C)基因型检测结果，其中，箭头表示IL-1B基因的rs1143627 位点基因型为TT型。

Sanger测序方法检测结果统计：

通过HAPLOVIEW 4.2软件对18个SNP位点进行SNP关联及连锁不平衡分析显示：rs3219018、rs780467580、rs333位点SNP突变极少或不存在(minMAF＜0.01)，故排除；同时排除不符合Hardy-Weinberg平衡rs403016和rs447536位点，在调整以上因素后，共计13个位点进入单因素统计分析，结果如表5。

表5 IVIG抵抗组和IVIG敏感组13个SNP基因型分布比较

注：P*及Adjusted OR*:经过年龄以及性别校正后结果

基因型的单因素分析显示：

(1)以P＜0.05作为统计学差异界限，在IVIG抵抗组与敏感组存在差异位点如下：

rs10056474GG基因型的KD儿童IVIG抵抗风险是rs10056474(CC+CG)基因型的2.459 倍，即rs10056474GG基因型显著增加IVIG抵抗危险(OR＝2.459>1)。

(2)以P＜0.1作为统计学差异界限，在IVIG抵抗组与敏感组存在差异位点如下：

①rs10056474GG基因型的KD儿童IVIG抵抗风险是rs10056474(CC/CG)基因型的2.459倍，即rs10056474GG基因型显著增加IVIG抵抗危险(OR＝2.459>1)。

②rs76863441GT基因型的KD儿童IVIG抵抗风险是rs76863441GG基因型的 2.062倍，即rs76863441GT基因型显著增加IVIG抵抗危险(OR＝2.062>1)。

③rs16944(CT/TT)基因型的KD儿童IVIG抵抗风险是rs16944 CC基因型的1.957倍，即rs16944(CT/TT)基因型显著增加IVIG抵抗危险(OR＝1.957>1)。

④rs1143627(CT/CC)基因型的KD儿童IVIG抵抗风险是rs1143627TT基因型的1.957倍，即rs1143627(CT/CC)基因型显著增加IVIG抵抗危险(OR＝1.957>1)。

⑤rs396991TT基因型的KD儿童IVIG抵抗风险是rs396991(GG/GT)基因型的 1.667倍，即rs396991TT基因型显著增加IVIG抵抗危险(OR＝1.667>1)。

因SNP位点间存在一定关联关系，故需进一步进行多因素分析。将单因素分析中P＜0.1 的位点纳入下一步多因素分析。因SMAD5基因rs10056474和rs746994存在不完全连锁关系(D’1.0，r² 0.222)，故将rs746944作为rs10056474交互变量亦纳入多因素分析；IL-1B基因的rs16944和rs1143627存在完全连锁关系(D’1.0，r² 0.974)，仅选取rs16944或rs1143627任一位点纳入；在调整以上因素后，共计5个位点进入下一步统计分析阶段。IVIG抵抗组和敏感组5个SNP基因型频率多因素分析结果如表6。

表6 IVIG无反应型KD的多因素分析

多因素统计分析结果显示rs16944或rs1143627、rs10056474、rs746994、rs76863441 与KD患儿IVIG反应性有关，且显示具备rs10056474GG、rs746994GG、rs76863441GT、 rs16944(CT/TT)或rs1143627(CT/CC)的KD患儿会增加IVIG无反应的风险(OR＞1)。可作为判断IVIG无反应型的指标。

实施例2：KD患儿发生IVIG抵抗的预测评分模型建立-列线图制作及验证我院既往以实验室生化指标为基础建立的旧预测模型如表7。

表7以生化指标为基础的预测模型

基因联合实验室指标新的预测模型构建：

将本次研究中4个与KD患儿IVIG反应型相关的SNP及我院既往实验室生化指标为基础的预测模型指标为变量，在231名KD患儿中排除化验指标不完善的6名患儿后，最终以225名KD患儿(75例IVIG无反应型KD患儿及150例IVIG敏感型KD患儿)纳入下一步构建新的预测模型。通过R软件制作的预测IVIG反应的列线图对各变量赋分如图7(为方便临床应用，各变量分数取值精确为整数值或0.5)，建立的新预测模型赋分值如表8。

表8基因+生化指标的预测模型

2种预测模型在同一人群中预测效能的比较：

在上述225名KD患儿(同一目标人群)中，比较新旧预测模型的预测效能，结果发现新预测模型明显提高了预测效能。(P＝0.0206)，如表9。

表9新、旧预测模型预测效能的比较

综上所述，SMAD5基因的rs10056474或rs746994、PLA2G7基因的rs76863441，和/或IL-1B基因的rs16944或rs1143627多态性位点与IVIG无反应型KD相关；将上述位点联合相关实验室指标构建的新预测模型，可预测KD患儿对IVIG治疗反应性，且预测效能优于应用实验值指标为基础建立的旧预测模型，有利于指导临床医生选择个体化的初始治疗方案。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 首都儿科研究所附属儿童医院

<120> 一种用于预测儿童川崎病治疗反应性的试剂及其应用

<130> 1

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatgtgggac aaagtggaag ac 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctagggtaa cagcacctgg tc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagacagaga gactccctta gc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttgctactc cttgcccttc 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caaggctgtc acacttaaag ag 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcagctcag cttataccat tc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttctgagatc attgtgttcc ag 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctagaaaga aaccctcctg cc 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaatgtcctg cccactggag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtgaggaga ggcagaagtc 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cttcatcatc ctcctgacaa tc 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgaagataag cctcacagcc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaagcctta acccgctgcc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cccttctagg tacccgttgg 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcagtgagtc tgggattatg ac 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggtgtagccc atgttcaaat tc 22

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaccatttcc ctctttctcc c 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agaatgacag gattcccatc ac 22

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctggagttcc aggagggaga aac 23

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcactaggga agacagacat taggg 25

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gacttttggg gacctcctgg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccaggctgag caataccagt 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctcatcatta cccctgagac cc 22

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcagagggag gaggtcagtg 20

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttgaagagag agcttgctct tg 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gtagtggcag gaatgaaatc ag 22

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

agttaatgga ggaagctggg tc 22

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gcgactttga taggtaaatg tc 22

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aggtgccctc tgctatgtct tc 22

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

acatagtgga caggagacag cg 22

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

acacagcttt tccctccaac c 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ctcatctgga ggaagcggta g 21

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gatatggact tctagctgca cc 22

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

caagatgctc taagactgag cc 22

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 人(homo)

<400> 35

acagtcagta tcaattctgg aagaatttcc agaca 35

Claims

1.一种检测试剂在制备检测静脉注射人免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）无反应型川崎病易感基因的试剂盒中的用途，其特征在于，所述检测试剂用于检测（1）rs10056474(C-G），（2）rs76863441（G-T），（3）rs746994(G-A)，和（4）rs16944(C-T)或rs1143627(T-C)多态性位点的基因分型，所述检测试剂是针对上述5个SNP位点相应的目标序列的特异性扩增引物。

2.一种检测试剂联合其他试剂在制备评估静脉注射人免疫球蛋白（intravenousimmunoglobulin，IVIG）无反应型川崎病的试剂盒中的用途，其特征在于，所述其他试剂为检测川崎病临床生化指标的试剂，所述检测试剂用于检测（1）rs10056474(C-G），（2）rs76863441（G-T），（3）rs746994(G-A)，和（4）rs16944(C-T)或rs1143627(T-C)多态性位点的基因分型，所述检测试剂是针对上述5个SNP位点相应的目标序列的特异性扩增引物。

3.如权利要求1-2任一所述的用途，其特征在于，所述SNP位点的rs10056474 GG基因型、rs746994 GG基因型、rs76863441 GT基因型、rs16944 CT/TT基因型、rs1143627 CT/CC基因型显著增加IVIG无反应型风险。

4.如权利要求1-2任一所述的用途，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO：1-10所示。