CN116376918A - Scn5a突变基因、引物、试剂盒、检测方法及用途 - Google Patents

Scn5a突变基因、引物、试剂盒、检测方法及用途 Download PDF

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CN116376918A CN202310071169.5A CN202310071169A CN116376918A CN 116376918 A CN116376918 A CN 116376918A CN 202310071169 A CN202310071169 A CN 202310071169A CN 116376918 A CN116376918 A CN 116376918A
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Abstract

本发明公开了一种SCN5A突变基因，基因组位置chr3:38607917处碱基G突变为碱基A、或在基因组位置为chr3:38620923处碱基G突变为碱基T，参考基因序列GRCh37。在基因组chr3:38607917位点处碱基G突变为碱基A的杂合错义突变和/或chr3:38620923位点的碱基G突变为碱基T的杂合错义突变均可以将病窦综合征患者和正常人群区分开，还可以作为临床辅助诊断病窦综合征的生物标志物。本发明提供的引物和试剂盒为人类攻克病窦综合征提供新的药物靶点，促进创新药物研发。

Description

SCN5A突变基因、引物、试剂盒、检测方法及用途
技术领域
本发明涉及人类遗传学和心血管技术领域，特别是涉及一种SCN5A突变基因、引物、试剂盒、检测方法及用途。
背景技术
病态窦房结综合症(简称病窦综合征，英文：sicksinussyndrome，英文简称SSS，)主要是由窦房结起搏功能障碍或窦房、房室系统穿到功能障碍引起心律失常的临床综合征，在临床上常导致黑朦、乏力、晕厥及猝死。病窦综合征属于心血管疾病和重大慢性非传染型疾病，具有发病率高、致残率高和死亡率高等特点。病窦综合征常见于有潜在心脏疾病的老年人群，但也见于胎儿、婴儿和儿童，近年来病窦综合征发病率逐渐增加且呈年轻化趋势。
目前，已报道有10多个致病基因与病窦综合征有关，随着越来越多影响病窦综合征的基因(涉及基因有SCN5A、ANK2、HCN4、MYH6等)，以及突变位点的发现，基因检测已经成为确诊病窦综合征的重要手段。SCN5A基因编码心脏钠通道蛋白Nav1.5，是遗传性病窦综合征首个致病基因。SCN5A基因有6048kb，含有28个外显子，每个外显子大小约在53个(第24个外显子)至3257个(第28个外显子)碱基之间。既往研究中已经确定相关的20多个基因突变位置，包括T220I、P1298L、delF1617、R1623X和R1632H等。但是由于基因突变具有随机性和不定性，以及病窦综合征的罕见性，目前发现的突变基因还十分有限，发现任何一个病窦综合征的相关基因都是对本领域的重要技术贡献。
发明内容
本发明的目的是提供一种SCN5A突变基因、引物、试剂盒、检测方法及用途，在基因组chr3:38607917位点处碱基G突变为碱基A的杂合错义突变和/或chr3:38620923位点的碱基G突变为碱基T的杂合错义突变均可以将病窦综合征患者和正常人群区分开，还可以作为临床辅助诊断病窦综合征的生物标志物。本发明提供的引物和试剂盒为人类攻克病窦综合征提供新的药物靶点，促进创新药物研发。
为此，本发明的技术方案是，一种SCN5A突变基因，SCN5A突变基因与人类基因组参考基因序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：在基因组位置chr3:38607917处碱基G突变为碱基A、在基因组位置为chr3:38620923处碱基G突变为碱基T。
一种检测SCN5A突变基因的引物，该引物为具有如下序列的至少一组引物：
正向引物序列为：ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC和反向引物序列为：GCAAGGGCTGCGGGCTTCTGAGGCC；
正向引物序列为：CAAGACCTGCTACCACATCG和反向引物序列为：AAAGGCAAGTCTCCCTCTGT；
正向引物序列为：CGCAAGACCTGCTACCAC和反向引物序列为：CACGCCCATGATGCTGAA；
正向引物序列为：CTACCTAGAGGAGCGGAAGAC和反向引物序列为：TGGTGTAGTTCAAAGGCAAGT。
一种检测SCN5A突变基因的引物在制备病窦综合征检测试剂中的应用。
一种检测SCN5A突变基因的试剂盒，该试剂盒包括检测SCN5A突变基因的引物。
一种检测SCN5A突变基因的方法，应用检测SCN5A突变基因的试剂盒，该方法用于非诊断目的，包括以下步骤：
步骤S100、DNA基因样本组准备；
步骤S200、多重PCR扩增；
步骤S300、消化部分引物序列；
步骤S400、扩增子接头连接与文库纯化。
进一步地，步骤S200多重PCR扩增的步骤包括：
S210、冰上配制第一反应液，第一反应液包括Nuclease-free H2O、DNA模板、4xMuti-PCR Mix，使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心将第一反应液收集至管底；
S220、将配置好的第一反应液加入到PCR反应管中，分别加入正向引物和反向引物，吹打混匀，短暂离心；
S230、将PCR管置于PCR仪上进行多重PCR反应，PCR结束后，短暂离心。
进一步地，步骤S300消化部分引物序列的步骤包括：
S310、将Digest Mix2轻弹混匀，短暂离心，置于冰上，在冰上配置如下第二反应液，第二反应液包括步骤S200混合的反应产物、Digest Mix2，吹打混匀；
S320、将PCR管置于PCR仪上，热盖温度为105℃，PCR程序为50℃10min，55℃10min，60℃20min，10℃保持。
进一步地，步骤S400扩增子接头连接与文库纯化的步骤包括：
S410、冰上配制第三反应液，第三反应液包括：步骤S300反应产物、LigationEnhancer、Ligation Enzyme Mix2、Ampseq Adapters；
S420、将PCR管置于PCR仪上，热盖温度为105℃，PCR程序：22℃30min，72℃10min，10℃保持；
S430、文库纯化。
进一步地，在步骤S400扩增子接头连接与文库纯化的步骤之后，还包括：步骤S500、文库扩增与纯化。
本发明的有益效果是，本发明提供的在基因组chr3:38607917位点处碱基G突变为碱基A的杂合错义突变和/或chr3:38620923位点的碱基G突变为碱基T的杂合错义突变均可以将病窦综合征患者和正常人群区分开，还可以作为临床辅助诊断病窦综合征的生物标志物。本发明中所述的非诊断疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多态性、用于家族演化研究或者追踪基因突变、为受试者提供优生优育指导和遗传咨询等。本发明提供的引物和试剂盒为人类攻克病窦综合征提供新的药物靶点，促进创新药物研发。
附图说明
图1是病窦综合征患者家系图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所适用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1
先证者验证实验：
样本来源：山东大学齐鲁医院，在先证者(男，29岁)及家属自愿签署知情同意书的前提下，将病窦综合征家系成员分次召集至当地医院，进行全面体检并抽取外周静脉血5-10mL置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，缓慢摇匀，保证全血与抗凝剂的充分混合，用于制备基因组DNA。本研究已得到本单位伦理委员会批准。经过全面体检发现，上述病窦综合征家系中除先证者之外，其母亲也患有病窦综合征，病窦综合征患者家系如图1所示。
对先证者及其家属进行基因检测，具体步骤如下：
(1)对先证者和验证样本分别应用试剂盒法提取血液基因组DNA。
(2)DNA样品检测及文库构建
应用琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解和污染程度后，取0.5μg以上DNA样品用于建库。将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打断成长度为350bp左右的片段，经末端修复和加A尾后，再在片段两端分别连接接头，制备DNA文库。
(3)基因组二代测序
库检合格后，运用Illumina平台进行高通量测序。测序所得原始图像数据文件经碱基识别分析后转化为原始测序序列-SequencedReads(raw reads)。
(4)测序数据过滤
测序得到的原始测序序列，里面含有带接头的、低质量的reads。为了保证信息分析质量，需要对rawreads进行精细过滤，得到clean reads，后续分析都基于clean reads进行。数据处理的步骤如下：1)去除带接头(adapter)的reads对；2)当单端测序read中N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10％时，需要去除此对reads；3)当单端测序read中含有的低质量(低于5)碱基数超过该条read长度比例的50％时，需要去除此对reads。
(5)测序深度、覆盖度统计
有效测序数据通过BWA软件比对到参考基因组(GRCh37/hg19)，得到BAM格式的最初的比对结果。然后用SAMtools软件对比对结果进行排序；再用Picard标记重复reads。最后利用重复标记后的比对结果进行覆盖度、深度等的统计。通常人类样本的测序reads能达到95％以上的比对率；当一个位点的碱基覆盖深度(read depth)达到10X以上时，该位点处检测出的SNP比较可信。
(6)变异检测结果分析
通过SAMtool软件识别单核苷酸突变(SNV)及体细胞插入或缺失突变(InDel)，CREST检测基因组中结构变异(SV)，包括大片段缺失、插入、重复，拷贝数变异，倒位和易位等；Control-Freec软件检测拷贝数变异(CNV)。
(7)疑似致病突变筛选
变异检测结束后对所得SNV、InDel、SV和CNV数据进行二次筛选，具体筛选过程如下：1)过滤千人基因组数据库，保留1000G中频率低于0.01的变异位点。旨在去除个体间的多样性位点，得到真正可能致病的罕见突变；2)保留外显子区或剪接位点区变异；3)去除不导致氨基酸编码改变的同义突变，得到对基因表达产物有影响的突变；4)依据SIFT，Polyphen，MutationTaster，CADD这4个软件的打分进行变异位点筛选，要求这4个软件中，有分值的软件中至少有一半支持该位点可能有害，该位点才被保留。最后依据遗传模式筛选相应的位点，查找、定位患者共有而健康对照者没有的基因突变位点，应用Phenolyzer软件对疑似致病基因与病窦综合征的关联性进行预测，结果SCN5A基因可能是遗传性病窦综合征的潜在致病基因。
通过上述方法，本发明人在上述病窦综合征家系进行分析过程中发现家系中的病窦综合征患者(先证者及其母亲)SCN5A基因均具有以下两个杂合错义突变：
Figure BDA0004064824870000061
c.G3661A表示：在SCN5A基因的CDS区，第3661位的碱基G突变为碱基A，p.D1221N表示，SCN5A突变基因编码蛋白的第1221位的氨基酸由天冬氨酸(Asp)变为天冬酰胺(Asn)。
c.G3289T表示：在SCN5A基因的CDS区，第3289位的碱基G突变为碱基T，p.V1097L表示，SCN5A突变基因编码蛋白的第1097位的氨基酸由缬氨酸(Val)变为亮氨酸(Leu)。
chr3:38607901-chr:38607950上，野生型SCN5A基因的序列号为SEQIDNO:1，具体序列为：
AGATGCTACTCCTTCAGCTCGGTCGTGGTCCGTAACCACTTCATGAAGAA，其中，G为突变前碱基。
SCN5A突变基因的序列号为SEQIDNO:2，具体序列为：
AGATGCTACTCCTTCAACTCGGTCGTGGTCCGTAACCACTTCATGAAGAA，其中，A为突变后碱基。
chr3:38620901-chr:38620950上，野生型SCN5A基因的序列号为SEQIDNO:3，具体序列为：
AGTCTCCTCCGTCAGCGACTGTGGACCGAGGTCCAGGACCTTAGGCCTCC，其中，G为突变前碱基。
SCN5A突变基因的序列号为SEQIDNO:4，具体序列为：
AGTCTCCTCCGTCAGCGACTGTTGACCGAGGTCCAGGACCTTAGGCCTCC，其中，T为突变后碱基。
查询人群频率数据库发现上述两个变异为罕见变异(千人基因组：无，ESP6500：无，ExAC：无)。在发现上述两个变异之前，现有数据库中均未有报道病窦综合征相关家系中携带该变异，数据库包括但不限于中国各地区人群。试用多个生物信息预测软件(SIFT，Polyphen，MutationTaster，CADD等)均提示有害。文献检索未发现这两个变异与病窦综合征疾病相关的报道。
另外，为了验证上述两个变异与病窦综合征的关系，发明人采用与人类基因相似度达87％的斑马鱼作为实验动物，通过CRISPRi技术对SCN5A基因突变的危害性进行了载体验证。通过CRISPRi技术干扰了斑马鱼体内SCN5A基因的正常表达，随后通过显微注射将至少包含上述任一突变的表达载体质粒导入斑马鱼体内。当斑马鱼发育至第5天时，我们发现SCN5A基因上述任一突变后，斑马鱼心脏的脉搏输出量减少10％～30％、心搏量均减少20％～40％，出现病窦综合征的症状。上述实验结果进一步说明上述任一突变可影响心脏功能，从而进一步证实上述任一突变均会导致病窦综合征。
为了便于检测上述任一突变基因，本发明提供了一种检测SCN5A突变基因的引物，SCN5A突变基因与人类基因组参考基因序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：在基因组位置chr3:38607917处碱基G突变为碱基A、在基因组位置为chr3:38620923处碱基G突变为碱基T，该引物为具有如下序列的至少一组引物：
对chr3:38607917位置A碱基进行特异性识别的引物：正向引物SEQIDNO:5和反向引物SEQIDNO:6。
对chr3:38620923位置T碱基进行特异性识别的引物：正向引物SEQIDNO:7和反向引物SEQIDNO:8，或者正向引物SEQIDNO:9和反向引物SEQIDNO:10，或者正向引物SEQIDNO:11和反向引物SEQIDNO:12。
序列 方向 引物 引物长度
NO:5 F(5’-3’) GGCCTCAGAAGCCCGCAGCCCTTGC 25
NO:6 R(5’-3’) GCAAGGGCTGCGGGCTTCTGAGGCC 25
NO:7 F(5’-3’) CAAGACCTGCTACCACATCG 20
NO:8 R(5’-3’) AAAGGCAAGTCTCCCTCTGT 20
NO:9 F(5’-3’) CGCAAGACCTGCTACCAC 18
NO:10 R(5’-3’) CACGCCCATGATGCTGAA 18
NO:11 F(5’-3’) CTACCTAGAGGAGCGGAAGAC 21
NO:12 R(5’-3’) TGGTGTAGTTCAAAGGCAAGT 21
实施例2
本发明还提供一种检测SCN5A突变基因的试剂盒，包括以下试剂：
Figure BDA0004064824870000081
在具体实施过程中，试剂盒中还包括实施例1中的所有引物，每种引物的规格为10uM/24人份。
本发明实施例提供的试剂盒的保存条件：-30℃～-15℃保存，运输条件：≤0℃
使用本发明实施例提供的试剂盒时，需要配合使用的试剂有：
建库试剂：VAHTSTM AmpSeq Cancer HotSpot Panel(Vazyme#NA102)或其它等效产品；
VAHTSTM AmpSeq Adapters for Illumina/Ion Torrent(Vazyme#NA111/NA121)；
纯化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads(Vazyme#N411)；
文库评价：Equalbit dsDNA HS Assay Kit(Vazyme#EQ121)；
VAHTSTM Library Quantification Kit for Illumina(Vazyme#NQ101-106)；
Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品及配套试剂；
其他材料：新鲜配制的80％乙醇、灭菌超纯水；RNase-free PCR管、低吸附EP管；PCR仪、磁力架等。
实施例3
本发明实施例还提供了上述试剂盒的使用方法：
步骤S100、DNA基因样本组准备。
制作DNA基因样本组，并进行DNA Qubit检测，根据样本浓度选择合适的进样量，起始DNA模板量在1-100ng。
另外，将试剂盒中的4x Multi-PCR Mix、DigestMix2、Ligation Enhancer、Ligation Enzyme Mix2等试剂取出，以及配合使用的试剂中的Ampseq Adapters等试剂，置于冰上解冻，充分融化后上下颠倒混匀并短暂离心，冰上放置；DNA Clean Beads震荡混匀并平衡至室温。配置80％的乙醇，每个样本约用400uL 80％的乙醇冲洗。
步骤S200、多重PCR扩增：
S210.冰上配制第一反应液：
组分 体积
Nuclease-free H2O To 20uL
DNA模板 1-2uL
4x Multi-PCR Mix 10uL
使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心将第一反应液收集至管底。
S220.将配置好的20uL的第一反应液加入到PCR反应管中，分别对应加入1uL的正向引物和反向引物，吹打混匀，短暂离心。
S230.将PCR管置于PCR仪上进行多重PCR反应，反应程序如下：
热盖设置为105℃，99℃2min；(99℃15sec，60℃4min)24个循环，72℃10min，4℃保持。
PCR结束后，短暂离心，终体积为20uL。
步骤S300、消化部分引物序列
具体包括以下步骤：
S310.将Digest Mix2轻弹混匀，短暂离心，置于冰上，在冰上配置如下第二反应液，吹打混匀。
组分 体积
步骤S200混合的反应产物 20uL
Digest Mix2 2.5uL
S320.反应程序：热盖设置为105℃。程序为50℃10min，55℃10min，60℃20min，10℃保持。
步骤S400、扩增子接头连接与文库纯化
具体包括以下步骤：
S410.冰上配制第三反应液：
Figure BDA0004064824870000101
S420.将PCR管置于PCR仪上，热盖温度105℃，PCR程序：22℃30min，72℃10min，10℃保持。
S430.文库纯化
(1)使用前将DNA Clean Beads震荡混匀并平衡至室温。配置80％的乙醇，每个样本约用400uL80％的乙醇冲洗。
(2)用ddH2O(约30uL)补齐体积至60uL，分别加入60uL(1x)DNA Clean Beads，吹打混匀，室温孵育8min，使文库结合到磁珠上。
(3)将反应管短暂离心并置于磁力架上，室温静置(约5min)，待溶液澄清后，弃掉上清。
(4)保持PCR管在磁力架上，加入200uL80％的乙醇，孵育30sec后移除上清。
(5)重复上述步骤(4)，共漂洗两次，用移液器吸走所有残留乙醇。
(6)开盖室温下干燥约5min，磁珠晾干后，将PCR管从磁力架上取下，加入22uL的Elution Buffer(或ddH2O)覆盖磁珠，用移液枪吹打混匀。
(7)室温孵育2min，短暂离心后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，吸取20uL上清液至新的EP管中，-20℃保存。
(8)质控
Qubit检测文库浓度。若浓度≥50ng/uL，则无需进行步骤S500；若浓度<50ng/uL，需进行步骤S500文库扩增与纯化的操作。
步骤S500、文库扩增与纯化
具体包括以下步骤：
S510.HiFi Amplification Mix、PCR Primer Mix(for Ion Torrent)等试剂取出，置于冰上解冻，充分融化后上下颠倒混匀并短暂离心，冰上放置。
S520.冰上配置如下体系：
组分 体积
HiFi Amplification Mix 25uL
PCR Primer Mix(for Ion Torrent) 5uL
纯化后的PCR产物 20uL
S530.将PCR管置于PCR仪上，热盖温度105℃，PCR程序：
95℃3min，(98℃20sec，60℃15sec，72℃30sec)5个cycles，72℃10min，4℃保持。
S540.文库纯化
S540具体包括以下步骤：
(1)提前将DNA Clean Beads震荡混匀并平衡至室温，配置80％的乙醇，每个样本约用400uL80％的乙醇重新。
(2)将样品全部转移至1.5mLEP管中，用ddH2O补齐体积至100uL，涡旋DNA CleanBeads磁珠使其充分混匀，分别加入120uL(1.2x)DNA Clean Beads，吹打混匀，室温孵育8min，使文库结合到磁珠上。
(3)将反应管短暂离心并置于磁力架上，室温静置(约5min)，待溶液澄清后，弃掉上清。
(4)保持PCR管在磁力架上，加入200uL80％的乙醇，孵育30sec后移除上清。
(5)重复步骤(4)，共漂洗两次，用移液器吸走所有残留乙醇。
(6)开盖室温干燥约5min，磁珠晾干后，将EP管从磁力架上取下，加入22uL的Elution Buffer(或ddH2O)覆盖磁珠，用移液枪吹打混匀。
(7)室温孵育2min，短暂离心后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，吸取20uL上清液至新的EP管中，-20℃保存。
(8)质控
使用Qubit检测每个样本的浓度，全血样本浓度一般在50ng/uL以上。根据100ng的总量进行样本混合，测定混合后样本浓度，上机测序。
为了验证本试剂盒的应用效能，发明人选取了10名病窦综合征患者的血液样本进行检测，同时发明人还选取了500名表型健康的对照成员的血液样本进行检测，检测数据如下：
10名病窦综合征患者中，5名患者均在chr3:38607917位点和chr3:38620923位点分别成功检测到了c.G3661A突变和c.G3289T突变，3名患者仅在chr3:38607917位点成功检测到了c.G3661A突变，2名患者仅在chr3:38620923位点成功检测到c.G3289T突变。
500名表型健康的对照成员均未检测到上述两个变异。
本发明提供的在基因组chr3:38607917位点处碱基G突变为碱基A的杂合错义突变和/或chr3:38620923位点的碱基G突变为碱基T的杂合错义突变均可以将病窦综合征患者和正常人群区分开，还可以作为临床辅助诊断病窦综合征的生物标志物。本发明中所述的非诊断疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多态性、用于家族演化研究或者追踪基因突变、为受试者提供优生优育指导和遗传咨询等，这样的应用是本领域技术人员可以理解的。本发明提供的引物和试剂盒为人类攻克病窦综合征提供新的药物靶点，促进创新药物研发。
惟以上所述，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，故其等同组件的置换，或依本发明专利保护范围所作的等同变化与修改，皆应仍属本发明权利要求书涵盖之范畴。

Claims (9)

1.一种SCN5A突变基因，其特征在于，所述SCN5A突变基因与人类基因组参考基因序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：在基因组位置chr3:38607917处碱基G突变为碱基A、在基因组位置为chr3:38620923处碱基G突变为碱基T。
2.一种检测如权利要求1所述SCN5A突变基因的引物，其特征在于，所述引物为具有如下序列的至少一组引物：
正向引物序列为：ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC和反向引物序列为：GCAAGGGCTGCGGGCTTCTGAGGCC；
正向引物序列为：CAAGACCTGCTACCACATCG和反向引物序列为：AAAGGCAAGTCTCCCTCTGT；
正向引物序列为：CGCAAGACCTGCTACCAC和反向引物序列为：CACGCCCATGATGCTGAA；
正向引物序列为：CTACCTAGAGGAGCGGAAGAC和反向引物序列为：TGGTGTAGTTCAAAGGCAAGT。
3.一种如权利要求2所述的检测SCN5A突变基因的引物在制备病窦综合征检测试剂中的应用。
4.一种检测SCN5A突变基因的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2所述的引物。
5.一种检测SCN5A突变基因的方法，应用如权利要求4所述的试剂盒，所述方法用于非诊断目的，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤S100、DNA基因样本组准备；
步骤S200、多重PCR扩增；
步骤S300、消化部分引物序列；
步骤S400、扩增子接头连接与文库纯化。
6.如权利要求5所述的一种检测SCN5A突变基因的方法，其特征在于，所述步骤S200多重PCR扩增的步骤包括：
S210、冰上配制第一反应液，第一反应液包括Nuclease-free H2O、DNA模板、4x Muti-PCR Mix，使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心将第一反应液收集至管底；
S220、将配置好的第一反应液加入到PCR反应管中，分别加入正向引物和反向引物，吹打混匀，短暂离心；
S230、将PCR管置于PCR仪上进行多重PCR反应，PCR结束后，短暂离心。
7.如权利要求5所述的一种检测SCN5A突变基因的方法，其特征在于，所述步骤S300消化部分引物序列的步骤包括：
S310、将DigestMix 2轻弹混匀，短暂离心，置于冰上，在冰上配置如下第二反应液，第二反应液包括步骤S200混合的反应产物、DigestMix2，吹打混匀；
S320、将PCR管置于PCR仪上，热盖温度为105℃，PCR程序为50℃10min，55℃10min，60℃20min，10℃保持。
8.如权利要求5所述的一种检测SCN5A突变基因的方法，其特征在于，所述步骤S400扩增子接头连接与文库纯化的步骤包括：
S410、冰上配制第三反应液，第三反应液包括：步骤S300反应产物、LigationEnhancer、Ligation Enzyme Mix2、AmpseqAdapters；
S420、将PCR管置于PCR仪上，热盖温度为105℃，PCR程序：22℃30min，72℃10min，10℃保持；
S430、文库纯化。
9.如权利要求5所述的一种检测SCN5A突变基因的方法，其特征在于，在所述步骤S400扩增子接头连接与文库纯化的步骤之后，还包括：步骤S500、文库扩增与纯化。
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