CN116926185A - 常染色体显性多囊肾病致病基因突变检测 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基因检测技术领域,具体涉及一种ADPKD相关致病基因突变的检测方法和内含子上致病基因突变的筛选方法等。
Description
技术领域
本申请涉及分子检测技术领域,具体涉及一种ADPKD相关致病基因突变的检测方法及和内含子上致病基因突变的筛选方法等。
背景技术
常染色体显性多囊肾病(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease,ADPKD)是一种常见的单基因遗传性肾病,患病率约为1/400-1/1000,典型的表型特征是在成年后出现双侧大量肾脏囊肿,随年龄增长囊肿不断扩大,压迫正常肾脏组织,损害肾脏结构和功能,并伴有肝、胰、脾、心脏等多器官受累,最终导致至少50%的患者进展至终末期肾病(ESKD),给个人、家庭和社会带来很大负担。
大多数ADPKD是由PKD1和PKD2基因突变引起的,在所有病人中分别占到大约85%和15%。PKD1基因位于16p13.3,由46个外显子组成。PKD2基因位于4q22.1,由15个外显子组成。它们分别编码多囊蛋白1(PC1)和多囊蛋白2(PC2),PC2是PC1的伴侣分子,对PC1的折叠、在细胞器间的转运和蛋白成熟具有极其重要的作用。PKD1和PKD2形成异源四聚体复合物,并可能在初级纤毛上行使重要生理学功能。PKD1基因的杂合变异往往导致1型多囊肾病,主要表现为肾囊肿、肝囊肿和颅内动脉瘤。PKD2基因的杂合变异则导致2型多囊肾病,主要表现在为双侧肾逐渐形成囊肿并扩大,通常在成年后导致终末期肾病。
ADPKD的传统临床诊断是基于患者的年龄和超声检查的肾囊肿数目。超声检查的价格低廉,风险低,但存在一定的局限性:仅适用于有ADPKD家族史的患者。另有10-25%的ADPKD患者由于新发突变、嵌合突变或亲代数据缺失等并无阳性家族史;此外,仅使用超声检查并不能将40岁以下的高危患者排除在遗传条件之外;并且,一些具有可见肾囊肿的非典型患者并不符合ADPKD诊断的临床标准,容易产生漏诊。
基于致病基因突变的检测方法可以帮助患者及其家属获得更全面和准确的诊断。目前的检测手段多样,但存在各种缺陷:1.PKD1的基因组区域复杂,1-33号外显子区域有6个假基因(PKD1P1-P6),虽然假基因与PKD1相比存在较大的缺失,但仍然与PKD1序列具有97.7%的同源性,另外突变种类多,涉及整个基因,且无突变热点,GC含量高等,均给基因检测带来了困难;另外通过一代测序检测各个外显子部分,耗时长、成本高,且不易区分真假基因。2.巢式扩增获取目的基因的方式,操作过于繁琐。3.PCR体系中需要加入其他优化扩增的辅助试剂,配制繁琐。4.不同长片段扩增的PCR程序不统一,需要2个以上扩增仪或耗时长。5.只进行PKD1或/和PKD2测序,未纳入其他致病比例较小的基因,容易造成漏检。6.用三代测序检测PKD1价格较为昂贵。7.将引物设计在外显子内部,给数据分析造成一定难度,并容易造成分析时的误判。
有鉴于此,提出本申请。
发明概述
为解决上述技术问题,本申请提出了一种ADPKD相关致病基因突变的检测方法及其试剂盒。
具体的,本申请所采用的技术方案如下:
本申请首先提供一种用于ADPKD相关致病基因突变检测的LR-PCR扩增引物组合,所述捕获体系包括针对PKD1、PKD2、GANAB和DNAJB11基因全长的LR-PCR引物。
进一步的,所述LR-PCR引物按照如下方法进行设计:
1)引物GC含量在40%-65%之间,且上下游引物GC含量差异不超15%;
2)引物Tm值在65-85℃之间,上下游引物的Tm差值不超过5℃;
3)引物不形成引物发卡结构和稳定二聚体;
4)引物长度在22~30bp;
5)引物设计在外显子区域外。
更进一步的,所述LR-PCR引物序列如SEQ ID NO.1-42所示。
本申请还提供上述LR-PCR扩增引物组合在制备ADPKD相关致病基因突变检测试剂或中的应用。
本申请还提供上述LR-PCR扩增引物组合在ADPKD相关致病基因的低频突变、稀有突变或嵌合体突变筛选中的应用;优选的,所述筛选针对内含子序列上的突变进行筛选。
本申请还提供一种测序文库的构建方法,包括如下步骤:
1)利用上述任一所述引物组合中的各对引物分别对同一样本进行LR-PCR扩增;
2)扩增产物分别进行磁珠纯化;
3)Qubit定量并计算纯化产物浓度,按照等摩尔浓度混合。
优选的,所述Qubit定量是利用以下公式计算产物浓度:
产物浓度(nM)≈产物质量(ng/μl)×106/[660×产物长度(bp)]。
4)定量产物稀释后进行文库构建;
优选的,所述文库构建步骤包括:DNA片段化、PCR富集和扩增产物长度分选。
进一步的,所述LR-PCR扩增体系如下:
更进一步的,所述LR-PCR扩增程序如下;
本申请还提供一种用于ADPKD相关致病基因突变检测的LR-PCR扩增试剂盒,所述试剂盒包含上述任一所述的LR-PCR扩增引物组合;优选的,所述试剂盒还包括 GXL Buffer、dNTP混合物和PrimeSTAR GXL DNA Polymerase等。
本申请还提供一种ADPKD相关致病基因突变检测的方法,所述检测包括利用上述任一所述引物组合对ADPKD患者外周血DNA进行LR-PCR扩增的步骤;优选的,所述方法还包括文库构建、测序和生信分析的步骤。
本申请还提供一种ADPKD相关致病基因的低频突变、稀有突变或嵌合体突变筛选方法,其特征在于,通过上述任一所述引物组合对ADPKD患者外周血DNA进行LR-PCR扩增建库,并据此测序分析获得相应低频突变、稀有突变或嵌合体突变;优选的,所述筛选针对内含子序列。
相比于现有技术,本申请至少具有如下技术优势:
本申请通过LR-PCR捕获引物的设计、优化和筛选,同时对扩增程序也进行优化设计。在此基础上,可一次性通过PCR分段扩增出常染色体显性多囊肾病(ADPKD)4个致病基因—PKD1、PKD2、GANAB和DNAJB11的基因全长序列,再经文库构建,执行二代高通量测序检测基因变异,生信分析其变异位点,发掘已知和未知致病变异。有助于优生优育。
该申请具有以下优点:
(1)检测基因包括目前已知确定的所有ADPKD致病基因,不含其他相关疾病的致病基因,针对性强,总扩增量仅160,846bp,可有效减少测序和分析时间,降低测序成本,并在获得相同数据量的前提下增加测序深度,有利于低频突变、稀有突变和嵌合体突变的检出。
(2)检测引物的扩增区域涵盖4个基因的全长序列,相较于其他panel只检测外显子及其侧翼几十个碱基的测序范围,本申请更有助于发现内含子上变异可能导致的多囊肾病症。
(3)本申请通过利用LR-PCR,在相同PCR程序和体系下即可实现待检测基因的全长扩增,且可通过琼脂糖凝胶电泳的方法可视化检测每对引物的扩增效果,增加质控点,避免后续实验结果不如预期而无法回溯原因,有利于监测实验过程。
(4)本申请中所有基因的扩增片段均可以定量,并投入等量的扩增产物进入文库构建步骤,所以每个片段的测序深度差异较小,不会因为个别片段需要提高测序深度而增加整体测序数据的产量,有助于降低测序成本。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本申请的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1、全部初次设计引物经标准流程-PCR体系1和标准流程-PCR程序1的LR-PCR产物电泳图;
图2、扩增PKD1第1、4、5、7片段和PKD2第1、10片段的初次设计引物经标准流程-PCR体系1和标准流程-PCR程序2的LR-PCR产物电泳图;
图3、扩增PKD1第1、4、5、7片段的优化设计引物经标准流程-PCR体系1和标准流程-PCR程序1的LR-PCR产物电泳图;
图4、扩增PKD1第1、4片段的优化设计引物经标准流程-PCR体系1和标准流程-PCR程序2的LR-PCR产物电泳图;
图5、扩增PKD1第3-4、4-5片段的引物经标准流程-PCR体系1和标准流程-PCR程序2-2的LR-PCR产物电泳图;
图6、扩增除PKD1第4-5片段外的其他片段在标准流程-PCR体系1和标准流程-PCR程序2-2下的LR-PCR产物电泳图;
图7、本申请统计扩增区域内基因覆盖度和扩增片段测序深度结果;
图8、Sanger一代验证结果图。
发明详述
虽然本申请可以以许多不同的形式来实施,但在此公开的是验证本申请原理的其具体的举例说明性实施方式。应该强调的是,本申请不限于所举例说明的具体实施方式。此外,本文使用的任何章节标题仅用于组织目的,并不被解释为限制所描述的主题。以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本申请而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义,本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解,但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。
术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的,且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方式。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方式,这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方式组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”,“所述”,包括该名词的复数形式。
此外,说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类,是用于区分相似的元素,不是描述顺序或时间次序必须的。应理解,如此应用的术语在适当的环境下可互换,并且本申请描述的实施方式能以不同于本申请描述或举例说明的其它顺序实施。
术语“和/或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。因此,如在本文中的短语例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B;A或B;A(单独);和B(单独)。同样地,如在短语例如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一个:A、B和C;A、B或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A(单独);B(单独);和C(单独)。
术语“例如”和“即”仅作为实例使用,而无意于限制,并且不应当诠释为仅涉及在说明书中明确列举的那些项目。
术语“或更多”、“至少”、“超过”等,例如“至少一种”应当理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过所述值。还包括其间任何更大的数字或分数。
相反地,术语“不超过”包括小于所述值的每个值。例如,“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其间任何更小的数字或分数。
术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二个”等应当理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括其间任何更大的数字或分数。
术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10%,优选±5%。
如文本所述,除非另有说明,否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括所叙述范围内的任何整数的值,并且在适当时包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。
本申请通过附图和如下实施例进一步描述,所述的附图和实施例只是为了例证本申请的特定实施方案,不应理解为以任何方式限制本申请范围之意。
实施例1、基因选择
常见的导致ADPKD疾病的基因是PKD1和PKD2,根据《中国常染色体显性多囊肾病临床实践指南(第二版)》的描述,分别占到发病人群的85%和15%,但仍有8-10%的ADPKD患者未发现PKD1和PKD2上的变异。
GANAB基因位于11q12.3,由25个外显子组成,编码葡萄糖苷酶II的催化亚基。葡萄糖苷酶II是一种内质网酶,催化水解肽结合寡糖的葡萄糖残基;同时也引发糖蛋白折叠的质量控制评估。在人肾细胞中完全敲除GANAB可导致成熟的N端PC1的缺失,但不影响全长的PC1和PC2,说明GANAB在PKD1和PKD2蛋白的成熟中起主要作用。GANAB基因的杂合变异会导致3型多囊肾病,以肾囊肿为特征,因该基因在人的肝脏中也有表达,故患者常伴有肝囊肿,可能致使器官功能障碍。
DNAJB11基因位于3q27.3,由10个外显子组成,编码内质网可溶性糖蛋白,作为GRP78的辅因子,帮助GRP78在蛋白质折叠、组装、运输和降解中发挥重要作用。其基因突变可能会导致PC1和PC2蛋白产生折叠和转运问题,从而影响其功能。DNAJB11基因杂合变异会导致6型多囊肾病,其特征是在第六个10年后发展为多个小肾囊肿,并进展为肾功能不全或终末期肾病。
GANAB和DNAJB11基因会影响PKD1和PKD2所编码蛋白的折叠、转运和成熟,从而造成其生物功能的变化。GANAB和DNAJB11基因导致ADPKD的发病占比虽然很低,仅为约0.3%和1%,但在PKD1和PKD2未检出致病突变的情况下,加入对其的测序可以扩大检测范围,不易造成漏检。
至于其他相关基因,本申请考虑到其他基因检测疾病的范围还可能涉及到其他类型的肝肾囊肿疾病,如常染色体隐性多囊肾(PKHD1和DZIP1L)、Alport综合征(COL4A3和COL4A5)、多囊性肝病(LRP5)和VHL综合征(VHL)等,本申请为避免误检,为实现更准确和全面的针对ADPKD相关致病突变检测和未知致病突变发现,因此设计上述四种基因组合进行检测。
实施例2、LR-PCR引物设计、优化和筛选
为检测整个检测实验操作流程,本申请基于靶向扩增思路进行文库构建,该方法针对性强,可去除基因组冗余数据的干扰,不仅能够降低测序成本,增加测序深度,减少测序和数据分析时间,还有助于低频突变、稀有突变和嵌合体突变的发现等。为实现上述目的,本实施例采用了LR-PCR技术来靶向扩增目标基因。
本领域都清楚,LR-PCR是长片段PCR,是一种利用特殊高保真DNA聚合酶在体外扩增长度超过5kb产物的PCR技术,其对于引物和扩增体系的要求严格,理由是:长片段的PCR扩增通常会遇到高GC的模板,其PCR体系需要有获得此种扩增产物的能力,对引物要求高;此外,较普通PCR引物,LR-PCR的引物要更长,以提高退火温度,从而增加扩增的特异性;并且,由于引物长度的增加,形成二聚体、发卡结构和3’端互补的概率也会随之增加,引物设计难度较普通引物更大;最后,PCR体系缓冲液中需含高浓度Mg2+(2mM-5mM),以提高扩增速率。因此能够筛选设计出有效的长片段扩增体系,是本申请能够高效和准确检出的关键。
具体的,本申请在LR-PCR引物设计时,根据检测需要,申请人首先遵守如下原则进行LR-PCR引物设计:
引物的GC含量尽量在40%-65%之间,且上下游引物的GC含量差尽量不超过15%;Tm值在65-85℃之间(Tm=[(A、T数)×2]+[(C、G数)×4]-5),上下游引物的Tm差值不超过5℃;避免形成引物发卡结构和稳定的二聚体;引物长度为控制在20~30bp;引物不设计在外显子区域内;需经序列比对,确保所设计的引物在基因组中不存在其他可与之互补的区域,以减少错配率;尤其对于PKD1基因的引物设计,与PDK1的假基因没有完全互补区域,以降低PDK1的假基因被扩增的概率。
初步设计引物序列如下:
LR-PCR的扩增体系,本实施例通过筛选确定采用TaKaRa的GXL DNAPolymerase,该酶具有保真性高、扩增片段长特点,对GC含量高的模板也无需更换Buffer及设定特别反应条件便可获得扩增产物。模板投入量,本实施例提取ADPKD患者外周血DNA作为PCR模板,投入量设计在200ng左右。PCR反应体系和反应流程,本申请分别设计为:标准流程-PCR体系1,和标准流程-PCR程序1,如下表:
基于上述引物和扩增体系进行扩增评价,PCR结果如图1所示:发现PKD1的第1、5、7片段扩增产物的杂带多,且无目的条带;PKD1的第4片段的扩增产物目的条带大小与预期不符;PKD2的第1片段的扩增产物极少;PKD2的第10片段杂带较多。
进一步,本实施例在上述引物和PCR体系不变前提下,使用标准流程-PCR程序2(如下)对上述未成功扩增条带进行优化。
扩增结果如图2所示,除PKD2的第1片段的扩增效果好外,其他片段的扩增均无改善。因PKD2第10片段的目的主带较为清晰,故后续不再对其进行扩增条件的优化。
上述结果可知,仅调整扩增程序无法得到良好扩增效果,需进一步对引物进行序列调整。示例性的,通过进一步研究,本申请发现扩增较差的片段的引物对内两条引物在GC含量或Tm值上存在较大差异,所以重新设计引物,并尽量做到以下3点:1)进一步减少引物对内两条引物的GC含量的差异;2)降低每条引物的GC含量;3)降低每条引物的Tm值,新设计的引物对信息如下:
/>
基于新设计引物进一步评价,PCR反应体系采用标准流程-PCR体系1,PCR扩增程序采用标准流程-PCR程序1进行。扩增结果如图3所示:PKD1第5片段和第7片段经引物优化后,可获得比较清晰的目的条带,对应泳道E和J对应的引物对。
进一步,PCR反应体系采用标准流程-PCR体系1,PCR扩增程序采用标准流程-PCR程序2进行扩增。扩增结果如图4所示:PKD1第1片段经扩增条件优化后,可获得比较清晰的目的条带,即泳道A和B对应的引物对,因泳道B的扩增条带杂带较少,故选用此泳道对应的引物对。
因经过上述引物对和扩增条件的优化,PKD1的第4片段仍无法获得理想的目的条带,本申请尝试将其第3-4片段或第4-5片段进行扩增,重新设计引物对信息如下:
PCR反应体系采用标准流程-PCR体系1,PCR扩增程序采用标准流程-PCR程序2-2(如下)进行扩增。
扩增结果如图5所示:PKD1第4-5片段一起扩增的效果较好,其中泳道C,可获得比较清晰且杂带较少的目的条带,故选用此泳道对应的引物对。
此外,为精简PCR程序,本申请尝试将PCR程序2-2是否可适用于其他片段的扩增。结果显示(图6):基本可获得不错的PCR效果,PKD1的第1、4-5、7片段和PKD2的第1片段均需扩增100μl体系。
综上,确定本申请的最优LR-PCR引物组合:
/>
/>
确立的最优LR-PCR反应体系和反应程序为:
实施例2、ADPKD相关致病基因突变的检测
1、基于上述确立的LR-PCR扩增体系和反应程序对已知临床疾病的人外周血提取的DNA样本分别进行扩增,并据此进行致病基因突变检测。
2、LR-PCR产物的纯化和定量
按以下步骤进行PCR产物纯化。
1)取5μl LR-PCR产物,加入1μl 6×Loading Buffer进行0.7%琼脂糖凝胶电泳120V 45min,观察PCR是否成功获得所预计大小的片段。
2)将磁珠液提前30min从2-8℃取出,静置使其温度平衡至室温。使用前颠倒或旋涡振荡使磁珠液充分混匀。
3)用灭菌的ddH2O补充PCR产物至50μl,吸取25μl(0.5×)磁珠液加入PCR产物中,使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。
4)室温孵育10min,使DNA结合到磁珠上。
5)将样品置于磁力架上,待溶液澄清后(约5min),小心移除上清。
6)保持样品始终处于磁力架上,加入200μl新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec,小心移除上清。
7)重复步骤(6)一次,总计漂洗两次。
8)保持样品始终处于磁力架上,室温下开盖干燥磁珠约5-10min。
9)将样品从磁力架上取下,加入适量无核酸酶水,涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀,室温静置2min。在磁力架上静置5min待溶液澄清后,小心吸取上清至一个新的无核酸酶离心管中。可-20℃冰箱保存。
10)用Qubit精确定量纯化产物,然后按以下公式计算每个LR-PCR产物的摩尔质量。
产物浓度(nM)≈产物质量(ng/μl)×106/[660×产物长度(bp)]。
3、高通量测序文库构建
稀释各LR-PCR产物至相同的摩尔浓度,并等体积混合,用Qubit对混合物进行定量。稀释后取1ng作为文库构建的初始模板,采用诺唯赞DNA Library Prep KitV2 for Illumina和/>Index Kit V3 for Illumina进行文库构建。
DNA片段化:
1)在灭菌PCR管中配置如下反应体系,并使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
试剂 | 使用量 |
5×TTBL | 4μl |
1ng DNA | Xμl(视浓度而定) |
TTE Mix V1 | 5μl |
ddH2O | up to 20μl |
2)将反应管置于PCR仪中,运行如下反应程序。
3)反应完成后立即向产物中加入5μl 5×TS,使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温放置5min。
PCR富集
1)将PCR管置于冰上,配置如下反应体系:
试剂 | 使用量 |
ddH2O | 4μl |
上一步产物 | 25μl |
5xTAB | 10μl |
N6XX | 5μl |
N8XX | 5μl |
TAE | 1μl |
2)使用移液器轻轻吹打充分混匀,将反应管置于PCR仪中,运行如下反应程序:
扩增产物长度分选
1)取一个DNA低吸附1.5ml EP管,吸取30μl混匀的磁珠至50μl PCR产物(体积不足50μl的须使用灭菌蒸馏水将体积补齐)中,涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀,室温孵育5min。
2)将反应管短暂离心并置于磁力架上,使磁珠与液体分离,待溶液澄清后(约5min)小心转移上清至新的灭菌PCR管中,丢弃磁珠。
3)涡旋振荡混匀磁珠并吸取7.5μl体积至上清中,涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀,室温孵育5min。
4)将反应管短暂离心并置于磁力架上,使磁珠与液体分离,待溶液澄清后(约5min)小心移除上清。
5)保持反应管始终处于磁力架上,加入200μl新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠。室温孵育30sec,小心移除上清。再重复一次。
6)保持反应管始终处于磁力架上,开盖空气干燥磁珠约5min,应避免磁珠裂开。
7)将反应管从磁力架上取出,加入22μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀,室温孵育5min。
8)将反应管短暂离心并置于磁力架上,使磁珠与液体分离,待溶液澄清后(约5min)小心吸取20μl上清至新的灭菌PCR管中,纯化产物进行质检或-20℃保存。
3、文库质检
使用Qubit进行文库定量,Qsep 100进行文库片段分析。利用以下公式计算其摩尔浓度。
文库浓度(nM)≈文库质量(ng/μl)×106/[660×文库平均长度(bp)]。
4、上机测序
按照不同Illumina测序仪型号上机要求进一步稀释变性并上机测序。
此方案中:
1)将每个文库稀释至0.8nM,各取20ul稀释后的文库进行混合。
2)取310μl混合文库,加入77μl新鲜配置的0.2N NaOH溶液,短暂涡旋,280×g离心1min,之后室温孵育8min。
3)加入78μl 400mM Tris-HCl(pH 8.0)进行中和,短暂涡旋,280×g离心1min。
4)将全部溶液转移至文库试管中,立即将试管加载至簇生成试剂盒,在Illumina平台采用PE150进行测序。
5、测序数据的生物信息学分析及检测结果解读
下机后的原始数据(raw data)结果经质量控制(包含去接头、去低质量序列等)得到clean data。以GRCh37作为参考基因组,将经过过滤的数据映射到参考序列,得到比对结果文件。根据比对结果文件进行SNP和InDel变异信息检测,统计扩增区域内碱基的测序深度,根据突变位点的测序深度筛选可靠性高的突变。最后,对变异信息进行注释。结果表明,本申请的统计扩增区域内基因覆盖度几乎可达到100%,且扩增片段的大多测序深度都大于400×(参见图7)。
进一步的,本申请具体检测结果如下表,可见本申请检测结果与一代测序结果相符(图8),且都能够有效的检出致病变异位点(下表)。
另外,除上述关于PKD1和PKD2基因的致病/可能致病/意义不明的变异位点外,本申请方法还能有效检测到GANAB和DNAJB11基因上的变异(均为良性变异),具体如下表。
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前述对本申请的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本申请限定为所公开的精确形式,并且很显然,根据上述教导,可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本申请的特定原理及其实际应用,从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本申请的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本申请的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种用于ADPKD相关致病基因突变检测的LR-PCR扩增引物组合,其特征在于,所述捕获体系包括针对PKD1、PKD2、GANAB和DNAJB11基因全长的LR-PCR引物。
2.根据权利要求1所述的LR-PCR扩增引物组合,其特征在于,所述LR-PCR引物具有如下特征:
1)引物GC含量在40%-65%之间,且上下游引物GC含量差异不超15%;
2)引物Tm值在65-85℃之间,上下游引物Tm差值不超过5℃;
3)引物不形成发卡结构和稳定二聚体;
4)引物长度在22-30bp;
5)引物设计在外显子区域外。
3.根据权利要求1-2任一所述的LR-PCR扩增引物组合,其特征在于,所述LR-PCR引物序列如SEQ ID NO.1-42所示。
4.权利要求1-3任一所述的LR-PCR扩增引物组合在制备ADPKD相关致病基因突变检测试剂或中的应用。
5.权利要求1-3任一所述的LR-PCR扩增引物组合在ADPKD相关致病基因的低频突变、稀有突变或嵌合体突变筛选中的应用;优选的,所述筛选针对内含子序列。
6.一种测序文库的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)利用权利要求1-3任一所述引物组合中的各对引物分别对同一样本进行LR-PCR扩增;
2)扩增产物分别进行磁珠纯化;
3)Qubit定量并计算纯化产物浓度,产物按等摩尔浓度混合;
优选的,所述Qubit定量是利用以下公式计算产物浓度:
产物浓度(nM)≈产物质量(ng/μl)×106/[660×产物长度(bp)];
4)定量产物稀释后进行文库构建;
优选的,所述文库构建步骤包括:DNA片段化、PCR富集和扩增产物长度分选。
7.根据权利要求6所述的构建方法,其特征在于,所述LR-PCR扩增体系如下:
所述LR-PCR扩增程序如下;
8.一种用于ADPKD相关致病基因突变检测的LR-PCR扩增试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含权利要求1-3任一所述的LR-PCR扩增引物组合;优选的,所述试剂盒还包括GXL Buffer、dNTP混合物和PrimeSTAR GXL DNA Polymerase。
9.一种ADPKD相关致病基因突变检测的方法,其特征在于,所述检测包括利用权利要求1-3任一所述引物组合对ADPKD患者外周血DNA进行LR-PCR扩增的步骤;
优选的,所述方法还包括文库构建、测序和生信分析步骤。
10.一种ADPKD相关致病基因的低频突变、稀有突变或嵌合体突变筛选方法,其特征在于,通过权利要求1-3任一所述引物组合对ADPKD患者外周血DNA进行LR-PCR扩增建库,并据此测序分析获得相应低频突变、稀有突变或嵌合体突变;优选的,所述筛选针对内含子序列。
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2023
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CN117143997A (zh) * | 2023-10-31 | 2023-12-01 | 北京中仪康卫医疗器械有限公司 | 一种用于pkd1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法 |
CN117143997B (zh) * | 2023-10-31 | 2024-02-23 | 北京中仪康卫医疗器械有限公司 | 一种用于pkd1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法 |
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