CN116334240A - Snp标记在近交系大鼠品系鉴定中的应用及引物序列 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种SNP标记在近交系大鼠品系鉴定中的应用及引物序列。本发明提供的SNP标记包括4个SNP位点，能够对选自BN、F344、WKY、Lewis、DA、PVG、SHR和TSC的8个近交系大鼠品系中的部分或全部进行鉴定，提高了近交系大鼠品系鉴定的范围和效率，并节约了鉴定成本。

Description

SNP标记在近交系大鼠品系鉴定中的应用及引物序列
技术领域
本发明属于大鼠品系鉴定的技术领域，具体涉及一种SNP标记在近交系大鼠品系鉴定中的应用及引物序列。
背景技术
实验动物是指经人工饲育且对其携带的微生物实行控制、遗传背景明确或者来源清楚、用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的动物。从遗传学的角度，实验动物分为近交系、封闭群和杂交群等，不同品系的实验动物具有其特有的遗传背景。实验动物的遗传背景信息决定了实验动物的反应特性，同时实验动物遗传结构的稳定性对实验结果的准确性和可靠性有着关键性的影响，因此在生物医学研究中使用具有明确遗传背景的实验动物是非常重要的。实验大鼠和实验小鼠是生物医学研究中应用最广泛的实验动物，其中实验大鼠具有体型较大、易于研究，以及在某些生理特性方面更接近人类等优点，是生物医学研究中不可替代的动物模型，广泛应用于临床前药物安全性评价和疾病机制研究中。在常见的、使用较多的多个近交系大鼠品系中，各大鼠品系之间的遗传差异较大，但是，在表观遗传学性状上差异却并不大，几乎无法单纯从外观上来鉴定近交系大鼠品系。随着生命医学的发展，科研人员和商业对实验动物质量的要求越来越高。因此，对近交系大鼠品系的鉴定成了亟待解决的问题。
现有的近交系大鼠品系的鉴定方法有生化标记、皮肤移植、毛色基因、免疫标记等，但这些方法均存在一定的局限性，不能满足科研工作的需要。为了完善实验大鼠的遗传检测方法，目前多用SNP标记技术对实验大鼠品系进行鉴定。例如专利文献CN109022592A(以下称文献1)公开一种用于四种常用品系大鼠鉴定的SNP标记及其应用，其采用13个SNP位点能够同时鉴定出Wistar、GK、BN和SD这4个品系实验大鼠。专利文献CN110452969A(以下称文献2)公开一种基于KASP的大鼠遗传质量监控SNP标记分型方法及试剂盒，其采用48个SNP位点能够同时鉴定出Lewis、F344、BN和Wistar这4个品系实验大鼠。专利文献CN113136436A(以下称文献3)公开一种大鼠遗传背景相关SNP及其用途，其采用21个SNP位点能够同时鉴定出DA、PVG、Lewis、BN和F344这5个品系近交系大鼠。徐园等人(基于高通量靶向测序的大鼠遗传质量检测方案建立，生物化工，2020,6(04)，以下称文献4)建立一种基于高通量靶向测序的大鼠遗传质量检测方法，其利用90个SNP位点能够同时对5个大鼠品系：SHR、WKY、GK、F344和SD进行遗传质量检测。王淑菁等人(单核苷酸多态性分析在近交系大鼠遗传检测中的应用，中国实验动物学报，2011,19(06)，以下称文献5)建立一种利用9个SNP位点对7个大鼠品系：BN、F344、WKY、LEW、SHR、MIJ和HFJ的近交系大鼠品系进行鉴定的方法。然而，以上文献1-5公开的方法虽然可利用SNP位点对多个近交系大鼠品系进行鉴定的目的，但是它们至少需要采用9个SNP位点，甚至需要采用更多的SNP位点，才能同时对至多7个大鼠品系进行鉴定，甚至只能鉴定4个大鼠品系，因此存在所需SNP位点数以及扩增这些SNP位点的引物序列较多，而能够同时鉴定的大鼠品系较少，进而会增加近交系大鼠品系的鉴定成本以及会降低近交系大鼠品系的鉴定效率的缺陷。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种SNP标记在近交系大鼠品系鉴定中的应用，其利用4个SNP位点的组合对8个近交系大鼠品系中的部分或全部进行鉴定，所述组合为分别命名为SNP1、SNP2、SNP3和SNP4的位点组合，或为分别命名为SNP5、SNP6、SNP7和SNP8的位点组合，所述近交系大鼠品系为BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY和TSC；其中：
所述SNP1的Ensembl rs编号为rs8173311，其等位基因为C或T；
所述SNP2的Ensembl rs编号为rs106506161，其等位基因为T或C；
所述SNP3的Ensembl rs编号为rs65729677，其等位基因为A或G；
所述SNP4的Ensembl rs编号为rs65970293，其等位基因为T或C；
所述SNP5的Ensembl rs编号为rs64750237，其等位基因为T或C；
所述SNP6的Ensembl rs编号为rs106888236-R，其等位基因为G或T；
所述SNP7的Ensembl rs编号为rs106672258，其等位基因为T或C；
所述SNP8的Ensembl rs编号为rs105466309-R，其等位基因为C或T。
本发明另一方面提供了上述的SNP标记在制备用于鉴定近交系大鼠品系的试剂盒或液相芯片中的应用，其中所述试剂盒或液相芯片用于检测所述近交系大鼠品系的4个SNP位点的等位基因；其中所述4个SNP位点分别为SNP1、SNP2、SNP3、SNP4，或为SNP5、SNP6、SNP7、SNP8，所述近交系大鼠品系选自BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY和TSC。
本发明另一方面还提供一种用于扩增上述的SNP标记的引物组合，其用于鉴定近交系大鼠品系，包括用于扩增SNP1位点的第一引物、用于扩增SNP2位点的第二引物、用于扩增SNP3位点的第三引物、用于扩增SNP4位点的第四引物，或所述引物组合包括用于扩增SNP5位点的第五引物、用于扩增SNP6位点的第六引物、用于扩增SNP7位点的第七引物、用于扩增SNP8位点的第八引物，且所述近交系大鼠品系选自BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY和TSC；
可选地，
所述第一引物包括SNP1-F和SNP1-R，其中所述SNP1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SNP1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述第二引物包括SNP2-F和SNP2-R，其中所述SNP2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述SNP2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述第三引物包括SNP3-F和SNP3-R，其中所述SNP3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述SNP3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述第四引物包括SNP4-F和SNP4-R，其中所述SNP4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述SNP4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述第五引物包括SNP5-F和SNP5-R，其中所述SNP5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述SNP5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
所述第六引物包括SNP6-F和SNP6-R，其中所述SNP6-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述SNP6-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
所述第七引物包括SNP7-F和SNP7-R，其中所述SNP7-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述SNP7-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
所述第八引物包括SNP8-F和SNP8-R，其中所述SNP8-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述SNP8-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
本发明再一方面还提供一种用于鉴定近交系大鼠品系的试剂盒或液相芯片，命名为第一试剂盒或第一液相芯片，其包括：A1.上述的引物组合，其包括用于扩增SNP1位点的第一引物、用于扩增SNP2位点的第二引物、用于扩增SNP3位点的第三引物、用于扩增SNP4位点的第四引物；
可选地，所述第一试剂盒或第一液相芯片还包括：
B1.分别针对SNP1、SNP2、SNP3、SNP4位点的野生型和突变型特异性ASPE引物，其中每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成；可选地，所述特异性引物序列包括：针对SNP1位点的SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、针对SNP2位点的SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、针对SNP3位点的SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、针对SNP4位点的SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32；进一步可选地，所述tag序列为选自SEQ ID NO:33-40中的序列；和
C1.分别包被有特异性anti-tag序列的磁球，所述anti-tag序列相应地与B1中所述tag序列互补配对；可选地，所述anti-tag序列为选自SEQ ID NO:63-64、SEQ ID NO:67-68、SEQ ID NO:71-74中的序列。
在一些实施方式中，所述第一试剂盒或第一液相芯片包括以下1)-4)：
1)针对SNP1位点的由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:33组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:34组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64；
2)针对SNP2位点的由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:35组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:36组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68；
3)针对SNP3位点的由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:37组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:38组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72；
4)针对SNP4位点的由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:40组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74。
本发明再一方面还提供一种用于鉴定近交系大鼠品系的试剂盒或液相芯片，命名为第二试剂盒或第二液相芯片，其包括：A2.上述的引物组合，其包括用于扩增SNP5位点的第五引物、用于扩增SNP6位点的第六引物、用于扩增SNP7位点的第七引物、用于扩增SNP8位点的第八引物；
可选地，所述第二试剂盒或第二液相芯片还包括：
B2.分别针对SNP5、SNP6、SNP7、SNP8位点的野生型和突变型特异性ASPE引物，其中每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成；可选地，所述特异性引物序列包括：针对SNP5位点的SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42、针对SNP6位点的SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44、针对SNP7位点的SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46、针对SNP8位点的SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48；进一步可选地，所述tag序列为选自SEQ ID NO:33-34、SEQ ID NO:37-40、SEQ ID NO:49-50中的序列；和
C2.分别包被有特异性anti-tag序列的磁球，所述anti-tag序列相应地与B2中所述tag序列互补配对；可选地，所述anti-tag序列为选自SEQ ID NO:63-66、SEQ ID NO:71-74中的序列。
在一些实施方式中，所述第二试剂盒或第二液相芯片包括以下5)-8)：
5)针对SNP5位点的由SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:33组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:34组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64；
6)针对SNP6位点的由SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:49组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66；
7)针对SNP7位点的由SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:37组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:38组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72；
8)针对SNP8位点的由SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:39组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:40组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74。
本发明又一方面还提供一种近交系大鼠品系SNP位点的检测方法，其使用上述的试剂盒或液相芯片，所述近交系大鼠品系选自BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY和TSC。
在一些实施方式中，所述检测方法包括以下步骤：
(1)PCR扩增待测近交系大鼠品系的DNA样品，获得PCR扩增产物；
(2)将获得的PCR扩增产物进行纯化处理，获得纯化产物；
(3)用所述特异性ASPE引物对获得的纯化产物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，获得带有多个生物素标记的反应后产物；
(4)将对应所述特异性ASPE引物的包被有特异性anti-tag序列的磁球与所述带有多个生物素标记的反应后产物进行杂交反应，获得杂交产物；
(5)将所述杂交产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，得到反应产物；
(6)检测所述反应产物，获得所述近交系大鼠品系的SNP位点的等位基因信息；
可选地，在步骤(1)中，以上述提及的第一引物、第二引物、第三引物和第四引物为一组对所述近交系大鼠品系的DNA样品进行四重PCR扩增，或以上述提及的第五引物、第六引物、第七引物和第八引物为一组对所述近交系大鼠品系的DNA样品进行四重PCR扩增。
本发明又一方面还提供一种鉴定近交系大鼠品系的方法，所述近交系大鼠品系选自BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY和TSC，所述方法在上述的检测方法的基础上还包括以下步骤：
(7)利用获得的所述近交系大鼠品系的SNP位点的等位基因信息鉴定近交系大鼠品系；鉴定过程包括：
根据SNP1位点的分型结果将以上8个近交系大鼠品系分成两组，其中Lewis、BN、PVG和TSC为A组，DA、SHR、F344和WKY为B组；在A组中，根据SNP2位点的分型结果将TSC与其他3个近交系大鼠品系区分开来，随后根据SNP3位点的分型结果将PVG与剩下的2个近交系大鼠品系区分开来，最后根据SNP4位点的分型结果将Lewis和BN区分开来；在B组中，根据SNP2位点的分型结果将SHR与其他3个近交系大鼠品系区分开来，随后根据SNP3位点的分型结果将WKY与剩下的2个近交系大鼠品系区分开来，最后根据SNP4位点的分型结果将DA和F344区分开来；或
根据SNP5位点的分型结果将以上8个近交系大鼠品系分成两组，其中Lewis、BN、TSC、PVG和DA为C组，F344、SHR和WKY为D组；在C组中，根据SNP6位点的分型结果将5个近交系大鼠品系分成两组，其中Lewis和BN为E组，TSC、PVG和DA为F组，在E组中，根据SNP8位点的分型结果将Lewis和BN区分开来，在F组中，根据SNP7位点的分型结果将DA与剩下的2个近交系大鼠品系区分开来，再根据SNP8位点的分型结果将TSC和PVG区分开来；在D组中，根据SNP6位点的分型结果将SHR与另外2个近交系大鼠品系区分开来，再根据SNP7或SNP8位点的分型结果将F344和WKY区分开来，进而实现这8个近交系大鼠品系的鉴定。
基于以上技术方案提供的用于鉴定近交系大鼠品系的SNP标记包括4个SNP位点，利用这4个SNP位点的组合可以同时对8个近交系大鼠品系(包括BN、F344、WKY、Lewis、DA、PVG、SHR和TSC)中的多个或全部进行鉴定，因此相对于上述文献1-5公开的使用更多(例如9个以上)的SNP标记仅能对至多7个或更少的近交系大鼠品系进行鉴定的方法，本发明使用的SNP标记更为精简，用于扩增这些SNP位点的引物序列更少，且鉴定的近交系大鼠品系更丰富，可以有效节约成本并提高鉴定效率。另一方面，在本发明提供的用于扩增4个SNP位点的4对引物中，可以对近交系大鼠品系的DNA样品进行四重PCR扩增，因此针对每个样本只需要一次PCR扩增反应即可，因此可以有效简化操作，节约时间，从而进一步提高近交系大鼠品系的鉴定效率。
附图说明
图1为使用针对SNP1-SNP12位点的PCR引物分别对8个近交系大鼠品系的基因组DNA进行PCR扩增的产物的凝胶电泳图像；其中A幅表示使用针对SNP1-SNP4位点的PCR引物的凝胶电泳图像，B幅表示使用针对SNP5-SNP8位点的PCR引物的凝胶电泳图像，C幅表示使用针对SNP9-SNP12位点的PCR引物的凝胶电泳图像，各图中1-8分别表示：Lewis、BN、TSC、PVG、DA、F344、SHR、WKY的DNA样本。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。文中“第一”、“第二”、……、和“第八”等适用于区分类似的对象，不作为特定顺序或先后次序的限定，也不作为对象个数的限定。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:ALaboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例1：用于鉴定近交系大鼠品系的SNP标记的确定及扩增SNP位点的引物设计
1.1、用于鉴定近交系大鼠品系的SNP标记的筛选
上述文献4已经公开多个可用于实验大鼠遗传质量检测的SNP位点，本发明人从中筛选出多组SNP标记，如以下表1、表2和表3所示，示出了其中的三组SNP标记(分别命名为第一组SNP标记、第二组SNP标记和第三组SNP标记)，以从中确定可用于对8个近交系大鼠品系(包括BN/SsNSlcNifdc(简称BN)、F344/NSlcNifdc(简称F344)、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY、TSC)进行鉴定的SNP标记。
表1：第一组SNP标记的SNP位点及其位置和等位基因信息
位点编号 Ensembl rs编号 染色体定位 等位基因
SNP1 rs8173311 Chromosome 19:28152386 C/T
SNP2 rs106506161 Chromosome 10:48666517 T/C
SNP3 rs65729677 Chromosome 5:165382887 A/G
SNP4 rs65970293 Chromosome 1:57557141 T/C
表2：第二组SNP标记的SNP位点及其位置和等位基因信息
位点编号 Ensembl rs编号 染色体定位 等位基因
SNP5 rs64750237 Chromosome4:57406208 T/C
SNP6 rs106888236-R Chromosome16:25469544 G/T
SNP7 rs106672258 Chromosome12:27308022 T/C
SNP8 rs105466309-R Chromosome5:85772036 C/T
注：rs106888236-R表示rs106888236的互补链；rs105466309-R表示rs105466309的互补链；
表3：第三组SNP标记的SNP位点及其位置和等位基因信息
位点编号 Ensembl rs编号 染色体定位 等位基因
SNP9 rs13453252 Chromosome 20:30513112 G/C
SNP10 rs64102787 Chromosome 6:25783066 C/A
SNP11 rs106647405 Chromosome 4:90154766 C/T
SNP12 rs65545562 Chromosome X:92061566 T/G
1.2、针对SNP位点的PCR引物的设计
根据上述步骤1.1中筛选的三组SNP标记(表1-3所示)的SNP位点信息，分别在Ensembl数据库中查找下载各SNP位点上下游500bp序列，用primer 6.0软件设计能扩增含SNP位点的PCR引物，并使其扩增产物的片段大小尽量相差50bp左右或以上，以便电泳结果区分各个位点条带，具体引物序列见下表4-6所示，引物是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的。
表4：针对SNP1-4位点的PCR引物
Figure BDA0004105900440000081
表5：针对SNP5-8位点的PCR引物
Figure BDA0004105900440000082
表6：针对SNP9-12位点的PCR引物
Figure BDA0004105900440000083
发明人分别利用上述表1-3所示的SNP标记按照以下实施例2中的方法对8个近交系大鼠品系(包括BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY、TSC)进行鉴定，结果表明只有表1和表2所示的两组SNP标记能够将以上8个近交系大鼠品系全部鉴定出来(请参照以下实施例2的鉴定结果)，因此本发明确定使用表1和表2所示的两组SNP标记对以上8个近交系大鼠品系进行鉴定。
实施例2：8个近交系大鼠品系的鉴定
该实施例利用上述实施例1设计的表1-3所示的SNP标记的PCR引物(表4-6所示)分别对8个近交系大鼠品系(包括BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY、TSC)进行鉴定，鉴定方法具体包括以下操作。
2.1、近交系大鼠品系的DNA样品的提取
该步骤中使用市售血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa)对大鼠的基因组DNA进行提取，参照试剂盒说明书具体包括以下步骤：
(1)剪取鼠尾1-2cm，放入1.5mL的EP管中。加入180μL的Buffer GL、20μL的Proteinase K和10μL的RNase A(10mg/mL)，于56℃水浴温浴至组织完全裂解(2-3小时，难裂解的材料可以适当延长裂解时间甚至过夜裂解)。注：温浴时可时常将样品取出进行振荡或吸打以加速裂解。
(2)向裂解液中加入200μL Buffer GB和200μL 100％乙醇，充分吸打混匀。
(3)将Spin Column安置于Collection Tube上，将步骤(2)所得溶液移至SpinColumn中，12,000rpm离心2min，弃滤液。
(4)将500μL的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。
(5)将700μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。注：请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100％乙醇。请沿Spin Column管壁四周加入Buffer WB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。
(6)重复操作步骤(5)。
(7)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2min。
(8)将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50-200μL的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5min。注将灭菌水或Elution Buffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。
(9)12,000rpm离心2min洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到SpinColumn膜的中央或再加入50-200μL的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5min后，12,000rpm离心2min洗脱DNA。
(10)基因组DNA定量。提取得到的基因组DNA可通过电泳或吸光度测定以定量。
(11)待提取的DNA溶液在4℃冰箱稳定1-2天后，使用1.6％琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
按照上述步骤(1)-(11)分别提取获得8个近交系大鼠品系的基因组DNA样品。
2.2、近交系大鼠品系的基因组DNA的PCR扩增
该步骤中分别使用上述实施例1中表4-6的PCR引物对上述步骤2.1提取获得的8个近交系大鼠品系的基因组DNA样品分别进行四重PCR扩增，得到每个近交系大鼠品系的PCR扩增产物，其中多重PCR反应体系和程序分别如下表7和表8所示。在使用表4-6所示的多重PCR引物分别对近交系大鼠品系的基因组DNA进行PCR扩增时，以分别针对SNP1-4位点、SNP5-8位点和SNP9-12位点的PCR引物为一组进行四重PCR扩增。
表7：多重PCR反应体系
Figure BDA0004105900440000101
表8：多重PCR反应程序
Figure BDA0004105900440000102
2.3、多重PCR产物的电泳检测
配制2.0％的琼脂糖凝胶：在40mL的1×TAE溶液中加入0.8g琼脂糖，加入Ex Red染液4uL(注意：染液与琼脂糖凝胶的比例为1：10000)，混匀后放入微波炉，加热数次后至溶液透明无气泡，随后将溶解好的溶液倒入胶板，插上梳子，室温放置20-30min。
取4μL多重PCR扩增产物加入1μL6×DNA loading buffer混匀加入电泳槽进行电泳检测，使用50bp的DNA marker作为条带的位置参照。在120V电泳40min，之后使用紫外凝胶成像系统扫描拍照。如图1所示，示出了凝胶电泳胶图，其中A幅表示使用表4所示的PCR引物分别对8个近交系大鼠品系的基因组DNA进行PCR扩增的结果，B幅表示使用表5所示的PCR引物分别对8个近交系大鼠品系的基因组DNA进行PCR扩增的结果，C幅表示使用表6所示的PCR引物分别对8个近交系大鼠品系的基因组DNA进行PCR扩增的结果。
2.4、多重PCR产物的纯化
多重PCR反应结束后会有扩增剩余的dNTP、引物、单链产物等，会影响后续的ASPE延伸反应，使用Exonuclease I可除去扩增剩余的引物和单链产物，Alkaline Phosphatase(Shrimp)酶除去PCR产物中剩余的引物、单链DNA以及剩余的dNTPs，尤其是dCTP。该步骤使用Exonuclease I、Alkaline Phosphatase(Shrimp)试剂(均购自Takara公司)。在每10μL多重PCR产物中加入1μL的Exo-SAP混合液(10uLExonuclease I、62.5uLAlkalinePhosphatase(Shrimp)、27.5uLddH2O配制成Exo-SAP混合液)，随后在37℃反应30min，在80℃15min使酶灭活，获得纯化的多重PCR产物。
2.5、位点特异性引物延伸反应(ASPE)
该步骤利用设计的位点特异性引物对上述步骤2.4纯化的多重PCR产物进行引物延伸反应，在反应过程中的Biotin-14-dCTP(购自Invitrogen)，从而使反应后的产物带上多个生物素标记。
2.5.1、位点特异性引物(ASPE引物)的设计
每条ASPE引物(退火温度应位于51-56℃之间)包括两个部分，5’端为针对相应磁球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异性引物序列。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。该步骤设计的分别针对SNP1-4位点的ASPE引物如下表9所示，设计的分别针对SNP5-8位点的ASPE引物如下表10所示，设计的分别针对SNP9-12位点的ASPE引物如下表11所示。
表9：分别针对SNP1-4位点的ASPE引物序列信息
Figure BDA0004105900440000111
表10：分别针对SNP5-8位点的ASPE引物序列信息
Figure BDA0004105900440000112
表11：分别针对SNP9-12位点的ASPE引物序列信息
Figure BDA0004105900440000121
2.5.2、ASPE反应体系和反应程序
ASPE反应体系选择Luminex公司操作指南上推荐的20μL体系，具体如下表12所示。
表12：ASPE反应体系
Figure BDA0004105900440000122
/>
将PCR扩增仪按照下表13的反应程序进行设置后，将配好的ASPE反应体系放进去进行ASPE反应，得到ASPE延伸的反应产物。
表13：ASPE反应程序
Figure BDA0004105900440000123
2.6、杂交反应
2.6.1、磁球的选择
该步骤根据上述表9-11设计的ASPE引物，选择相应的磁球(磁球浓度均为2.5×106个/mL，购自Luminex公司)。每种磁球分别带有不同颜色编码，同时每种磁球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag序列)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合。相应的磁球的颜色编码以及携带的anti-tag序列如下表14所示。
表14：磁球的颜色编码以及携带的anti-tag序列
Figure BDA0004105900440000131
2.6.2、ASPE延伸的PCR产物与包被有anti-tag序列的磁球的杂交反应
Luminex用户指南上推荐的杂交方法分为两种，清洗磁球的方法和不清洗磁球的方法，本实施例采取不清洗磁球的方法：
(1)在使用前将磁球使用涡旋振荡器振荡30-60s，防止无法吸到沉淀到瓶底的磁球，每种编码的磁球吸取10μL，配制成为磁球原液，随后将原液稀释成为工作液，工作液浓度大约为100个/μL，吸取22.5μL的磁球工作液至PCR八连排的反应管中；
(2)向反应管中加入2.5μL待测的ASPE延伸的反应产物，使得总反应体积为25μL；
(3)阴性对照加入2.5μLddH2O，阳性对照加入2.5μL合成的质粒的ASPE延伸的反应产物；
(4)做好标记后将PCR八连排管放在涡旋振荡仪上混匀后放入微型离心机中离心10s左右，随后放入PCR扩增仪，反应条件为：96℃变性90s，之后在37℃反应30min；
(5)取100μL含有8μg/mL链霉亲和素藻红蛋白和0.01％BSA的1×杂交缓冲液添加到PCR八连排反应管中，使用移液器缓慢吹打，切记不可使用涡旋振荡仪振荡混匀，将沉淀的磁球进行重悬；
(6)再次将PCR八连排反应管放入PCR扩增仪中进行链霉亲和素藻红蛋白杂交。将温度调节至37℃，在此温度下反应20min，反应结束后即可使用Luminex200仪器进行检测，系统输出数值为中位数荧光值(median fluorescence intensity，MFI)；
(7)使用Luminex仪器检测样品前要先打开机器预热30min，随后进行仪器的验证，验证结束后方可进行样品检测；
(8)样品检测结束之后需要对检测探针进行清洗，在校正板的相应位置加入去离子水和10％的含氯消毒液来进行探针清洗，清洗结束之后则可关闭软件，注意要定期清理废液桶中的废液。
2.7、数据分析
经上述步骤2.6.2的杂交反应后，使用Luminex200阅读系统分别激发红色激光和绿色激光对磁球体系进行检测，输出数值为中位数荧光值(median fluorescenceintensity，MFI)，以此来计算等位基因MFI比率，等位基因MFI比率＝MFI目标碱基/(MIF野生型+MFI突变型)。分型原则遵守的是：等位基因MFI比率>0.75或者<0.25为纯合野生型或者纯合突变型，0.25<等位基因MFI比率<0.75则为杂合突变型，采用Excel 2019软件进行统计学分析。
使用表1所示的第一组SNP标记的Luminex检测结果和计算的等位基因MFI比率分别如下表15和表16所示，使用表2所示的第二组SNP标记的Luminex检测结果和计算的等位基因MFI比率分别如下表17和表18所示。使用表3所示的第三组SNP标记的Luminex检测结果和计算的等位基因MFI比率分别如下表19和表20所示。
表15：第一组SNP标记的Luminex检测结果
Figure BDA0004105900440000141
表16：根据第一组SNP标记的Luminex检测结果计算的等位基因MFI比率
Lewis 0.963029025 C 0.93466731 T 0.920697598 A 0.044715447 C
BN 0.951440768 C 0.940932461 T 0.9264 A 0.935545531 T
TSC 0.963388101 C 0.037673461 C 0.914943037 A 0.036711479 C
PVG 0.968964719 C 0.926226636 T 0.060058049 G 0.051119561 C
DA 0.090619469 T 0.932112492 T 0.870540722 A 0.908675799 T
F344 0.10341986 T 0.933372195 T 0.910523354 A 0.033348472 C
SHR 0.08534432 T 0.046879129 C 0.050799136 G 0.949073709 T
WKY 0.085220398 T 0.930535636 T 0.072390348 G 0.933770562 T
表17：第二组SNP标记的Luminex检测结果
Figure BDA0004105900440000151
表18：根据第二组SNP标记的Luminex检测结果计算的等位基因MFI比率
Lewis 0.925047239 T 0.930255403 G 0.927131589 T 0.051014425 T
BN 0.950470219 T 0.948484206 G 0.923911703 T 0.95627907 C
TSC 0.957576731 T 0.0390484 T 0.059095232 C 0.030813435 T
PVG 0.953744493 T 0.053433288 T 0.040763968 C 0.961662892 C
DA 0.954829172 T 0.044799719 T 0.945769487 T 0.97602208 C
F344 0.066875879 C 0.947075828 G 0.942233278 T 0.95717417 C
SHR 0.054855669 C 0.040091265 T 0.086214506 C 0.060847107 T
WKY 0.06661251 C 0.943705036 G 0.054180776 C 0.050996252 T
表19：第三组SNP标记的Luminex检测结果
Figure BDA0004105900440000152
表20：根据第三组SNP标记的Luminex检测结果计算的等位基因MFI比率
Lewis 0.964047846 G 0.908195812 C 0.929244014 C 0.879558948 T
BN 0.961769115 G 0.945225916 C 0.935450502 C 0.906564969 T
TSC 0.947396107 G 0.946189376 C 0.930878699 C 0.061576581 G
PVG 0.955301884 G 0.930268538 C 0.942684452 C 0.87491065 T
F344 0.962590299 G 0.934489843 C 0.94851184 C 0.910794183 T
SHR 0.960195268 G 0.05258467 A 0.070179759 T 0.049885728 G
DA 0.053041018 C 0.941086458 C 0.962971698 C 0.060447605 G
WKY 0.048606746 C 0.043122465 A 0.058162078 T 0.056956876 G
由上述表16所示的等位基因MFI比率计算分型结果可知，Lewis在SNP1-SNP4位点分型信息为C、T、A、C；BN在SNP1-SNP4位点分型信息为C、T、A、T；TSC在SNP1-SNP4位点分型信息为C、C、A、C；PVG在SNP1-SNP4位点分型信息为C、T、G、C；DA在SNP1-SNP4位点分型信息为T、T、A、T；F344在SNP1-SNP4位点分型信息为T、T、A、C；SHR在SNP1-SNP4位点分型信息为T、C、G、T；WKY在SNP1-SNP4位点分型信息为T、T、G、T。因此根据SNP1-SNP4位点分型组合信息可以将BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY、TSC共计8个大鼠品系进行鉴定。具体鉴定过程为：可以根据rs8173311位点的分型结果将8个近交系大鼠品系分成两组(Lewis、BN、PVG和TSC为A组，DA、SHR、F344和WKY为B组)，在A组中，可根据rs106506161位点的分型结果将TSC与其他3个品系区分开来，随后根据rs65729677位点的分型结果将PVG与剩下的2个品系区分开来，最后根据rs65970293位点的分型结果将Lewis和BN区分开来。在B组中，可根据rs106506161位点的分型结果将SHR与其他3个品系区分开来，随后根据rs65729677位点的分型结果将WKY与剩下的2个品系区分开来，最后根据rs65970293位点的分型结果将DA和F344区分开来。因此可见本发明提供的包括SNP1-SNP4这4个SNP位点的第一组SNP标记可以将8个近交系大鼠品系(包括BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY、TSC)区分开来，进而实现这8个近交系大鼠品系的鉴定。
由上述表18所示的等位基因MFI比率计算分型结果可知，Lewis在SNP5-SNP8位点分型信息为T、G、T、T；BN在SNP5-SNP8位点分型信息为T、G、T、C；TSC在SNP5-SNP8位点分型信息为T、T、C、T；PVG在SNP5-SNP8位点分型信息为T、T、C、C；DA在SNP5-SNP8位点分型信息为T、T、T、C；F344在SNP5-SNP8位点分型信息为C、G、T、C；SHR在SNP5-SNP8位点分型信息为C、T、C、T；WKY在SNP5-SNP8位点分型信息为C、G、C、T。因此根据SNP5-SNP8位点分型组合信息可以将BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY、TSC共计8个大鼠品系进行鉴定。具体鉴定过程为：可以根据rs64750237位点的分型结果将8个近交系大鼠品系分成两组(Lewis、BN、TSC、PVG和DA为C组，F344、SHR和WKY为D组)，在C组中，可根据rs106888236-R位点的分型结果将5个品系分成两组(Lewis和BN为E组，TSC、PVG和DA为F组)，在E组中，可根据rs105466309-R位点的分型结果将Lewis和BN区分开来，在F组中，可根据rs106672258位点的分型结果将DA与剩下的2个品系区分开来，再根据rs105466309-R位点的分型结果将TSC和PVG区分开来。在D组中，可根据rs106888236-R位点的分型结果将SHR与另外两个品系区分开来，再根据rs106672258或rs105466309-R位点的分型结果将F344和WKY区分开来。因此可见本发明提供的包括SNP5-SNP8这4个SNP位点的第二组SNP标记可以将8个近交系大鼠品系(包括BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY、TSC)区分开来，进而实现这8个近交系大鼠品系的鉴定。
由上述表20所示的等位基因MFI比率计算分型结果可知，PVG在SNP9-SNP12位点分型信息为G、C、C、T；Lewis在SNP9-SNP12位点分型信息为G、C、C、T；F344在SNP9-SNP12位点分型信息为G、C、C、T；BN在SNP9-SNP12位点分型信息为G、C、C、T；TSC在SNP9-SNP12位点分型信息为G、C、C、G；SHR在SNP9-SNP12位点分型信息为G、A、T、G；DA在SNP9-SNP12位点分型信息为C、C、C、G；WKY在SNP9-SNP12位点分型信息为C、A、T、G。由于PVG、Lewis、BN、F344在SNP9-SNP12分型结果一致，故使用该组位点不能将这4个大鼠品系区分开，因此该组位点信息组合不能对BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY、TSC这8个大鼠品系同时进行鉴定，只能对TSC、SHR、DA、WKY这4个大鼠品系进行鉴别。具体鉴定过程为：可以根据rs13453252位点的分型结果8个近交系大鼠品系分成两组(PVG、Lewis、BN、SHR、TSC和F344为G组，DA和WKY为H组)，在G组中，根据rs64102787位点的分型结果可以将SHR与其他5个品系区分开来，再根据rs106647405位点的分型结果可以将TSC与其他4个品系区分开来，但是不能进一步区分剩余的4个品系(PVG、Lewis、BN和F344)。在H组中，根据rs64102787或rs106647405位点的分型结果可以将DA和WKY区分开来。因此可见包括SNP9-SNP12这4个SNP位点的第三组SNP标记不能将8个近交系大鼠品系区分开来，最多仅能鉴定其中的4个近交系大鼠品系(包括SHR、TSC、DA和WKY)。
实施例3：用于鉴定近交系大鼠品系的试剂盒或液相芯片
该实施例提供了两种用于鉴定8个近交系大鼠品系的试剂盒或液相芯片，分别命名为第一试剂盒或第一液相芯片和第二试剂盒或第二液相芯片，其中所述8个近交系大鼠品系包括BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY、TSC。
提供的第一试剂盒或第一液相芯片包括以下组分：
A1.实施例1中表4所示的用于分别扩增SNP1-SNP4位点的PCR引物(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:8，可简写为SEQ ID NO:1-8，全文同)；
B1.分别针对SNP1、SNP2、SNP3、SNP4位点的野生型和突变型特异性ASPE引物中的一条或多条，其中每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成；可选地，所述特异性引物序列包括：实施例2中表9所示的针对SNP1位点的SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、针对SNP2位点的SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、针对SNP3位点的SEQID NO:29和SEQ ID NO:30、针对SNP4位点的SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32中的一种或多种；进一步可选地，所述tag序列为选自实施例2中表9中的SEQ ID NO:33-40中的序列；和
C1.分别包被有特异性anti-tag序列的磁球，所述anti-tag序列能相应地与B1中所述tag序列互补配对；可选地，所述anti-tag序列为选自表14中的SEQ ID NO:63-64、SEQID NO:67-68、SEQ ID NO:71-74中的序列，且针对相同的SNP位点的所述磁球具有不同的颜色编号。
具体地，该实施例提供的第一试剂盒或液相芯片包括以下1)-4)：
1)针对SNP1位点的由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:33组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:34组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64；
2)针对SNP2位点的由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:35组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:36组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68；
3)针对SNP3位点的由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:37组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:38组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72；
4)针对SNP4位点的由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:40组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74。
提供的第二试剂盒或第二液相芯片包括以下组分：
A2.实施例1中表5所示的用于分别扩增SNP5-SNP8位点的PCR引物(SEQ ID NO:9-16)；
B2.分别针对SNP5、SNP6、SNP7、SNP8位点的野生型和突变型特异性ASPE引物，其中每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成；可选地，所述特异性引物序列包括：实施例2中表10所示的针对SNP5位点的SEQ ID NO:41和SEQ IDNO:42、针对SNP6位点的SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44、针对SNP7位点的SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46、针对SNP8位点的SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48；进一步可选地，所述tag序列为选自实施例2中表10中的SEQ ID NO:33-34、SEQ ID NO:37-40、SEQ ID NO:49-50中的序列；和
C2.分别包被有特异性anti-tag序列的磁球，所述anti-tag序列能相应地与B2中所述tag序列互补配对；可选地，所述anti-tag序列为选自表14中的SEQ ID NO:63-66、SEQID NO:71-74中的序列，且针对相同的SNP位点的所述磁球具有不同的颜色编号。
具体地，该实施例提供的第二试剂盒或液相芯片包括以下5)-8)：
5)针对SNP5位点的由SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:33组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:34组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64；
6)针对SNP6位点的由SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:49组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66；
7)针对SNP7位点的由SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:37组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:38组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72；
8)针对SNP8位点的由SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:39组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:40组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74。
在以上试剂盒或液相芯片产品中，可以将针对各SNP位点的PCR扩增引物混合包装或单独包装，当单独包装时，使用时再进行混合；可以将针对各SNP位点的特异性ASPE引物单独包装，以及可以将包被有特异性anti-tag序列的磁球单独包装。
另外，在本发明提供的(第一和第二)试剂盒或液相芯片中还包括使用该试剂盒或液相芯片检测近交系大鼠品系的SNP位点的方法或鉴定近交系大鼠品系的方法，其中：
检测近交系大鼠品系的SNP位点的方法包括以下步骤：
(1)使用试剂盒或液相芯片中提供的PCR引物分别扩增(可以采用多重PCR扩增的方式，例如由第一引物至第四引物组合的四重PCR扩增，或由第五引物至第八引物组合的四重PCR扩增)获自待测近交系大鼠品系的DNA样品，获得PCR扩增产物；
(2)将获得的PCR扩增产物进行纯化处理，获得纯化产物；
(3)用试剂盒或液相芯片中提供的特异性ASPE引物对获得的纯化产物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，获得带有多个生物素标记的反应后产物；
(4)将对应所述特异性ASPE引物的包被有特异性anti-tag序列的磁球与所述带有多个生物素标记的反应后产物进行杂交反应，获得杂交产物；
(5)将所述杂交产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，得到反应产物；
(6)检测(例如通过荧光检测仪)所述反应产物，获得所述近交系大鼠品系的SNP位点的等位基因信息。
鉴定(或鉴别区分)近交系大鼠品系的方法在上述提供的检测近交系大鼠品系的SNP位点的方法的基础上还包括以下步骤：
(7)利用获得的所述近交系大鼠品系的SNP位点的等位基因信息鉴定近交系大鼠品系；鉴定过程包括：
根据SNP1位点的分型结果将以上8个近交系大鼠品系分成两组，其中Lewis、BN、PVG和TSC为A组，DA、SHR、F344和WKY为B组；在A组中，根据SNP2位点的分型结果将TSC与其他3个近交系大鼠品系区分开来，随后根据SNP3位点的分型结果将PVG与剩下的2个近交系大鼠品系区分开来，最后根据SNP4位点的分型结果将Lewis和BN区分开来；在B组中，根据SNP2位点的分型结果将SHR与其他3个近交系大鼠品系区分开来，随后根据SNP3位点的分型结果将WKY与剩下的2个近交系大鼠品系区分开来，最后根据SNP4位点的分型结果将DA和F344区分开来；或
根据SNP5位点的分型结果将以上8个近交系大鼠品系分成两组，其中Lewis、BN、TSC、PVG和DA为C组，F344、SHR和WKY为D组；在C组中，根据SNP6位点的分型结果将5个近交系大鼠品系分成两组，其中Lewis和BN为E组，TSC、PVG和DA为F组，在E组中，根据SNP8位点的分型结果将Lewis和BN区分开来，在F组中，根据SNP7位点的分型结果将DA与剩下的2个近交系大鼠品系区分开来，再根据SNP8位点的分型结果将TSC和PVG区分开来；在D组中，根据SNP6位点的分型结果将SHR与另外2个近交系大鼠品系区分开来，再根据SNP7或SNP8位点的分型结果将F344和WKY区分开来；
进而实现利用4个SNP位点鉴别区分8个近交系大鼠品系的目的。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应属于本发明的内容。

Claims (10)

1.一种SNP标记在近交系大鼠品系鉴定中的应用，其特征在于，利用4个SNP位点的组合对8个近交系大鼠品系中的部分或全部进行鉴定，所述组合为分别命名为SNP1、SNP2、SNP3和SNP4的位点组合，或为分别命名为SNP5、SNP6、SNP7和SNP8的位点组合，所述近交系大鼠品系为BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY和TSC；其中：
所述SNP1的Ensembl rs编号为rs8173311，其等位基因为C或T；
所述SNP2的Ensembl rs编号为rs106506161，其等位基因为T或C；
所述SNP3的Ensembl rs编号为rs65729677，其等位基因为A或G；
所述SNP4的Ensembl rs编号为rs65970293，其等位基因为T或C；
所述SNP5的Ensembl rs编号为rs64750237，其等位基因为T或C；
所述SNP6的Ensembl rs编号为rs106888236-R，其等位基因为G或T；
所述SNP7的Ensembl rs编号为rs106672258，其等位基因为T或C；
所述SNP8的Ensembl rs编号为rs105466309-R，其等位基因为C或T。
2.权利要求1所述的SNP标记在制备用于鉴定近交系大鼠品系的试剂盒或液相芯片中的应用，其特征在于，所述试剂盒或液相芯片用于检测所述近交系大鼠品系的4个SNP位点的等位基因；其中所述4个SNP位点分别为SNP1、SNP2、SNP3、SNP4，或为SNP5、SNP6、SNP7、SNP8，所述近交系大鼠品系选自BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY和TSC。
3.一种用于扩增权利要求1所述的SNP标记的引物组合，其特征在于，所述引物组合用于鉴定近交系大鼠品系，包括用于扩增SNP1位点的第一引物、用于扩增SNP2位点的第二引物、用于扩增SNP3位点的第三引物、用于扩增SNP4位点的第四引物，或所述引物组合包括用于扩增SNP5位点的第五引物、用于扩增SNP6位点的第六引物、用于扩增SNP7位点的第七引物、用于扩增SNP8位点的第八引物，且所述近交系大鼠品系选自BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY和TSC；
可选地，
所述第一引物包括SNP1-F和SNP1-R，其中所述SNP1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SNP1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述第二引物包括SNP2-F和SNP2-R，其中所述SNP2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述SNP2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述第三引物包括SNP3-F和SNP3-R，其中所述SNP3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述SNP3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述第四引物包括SNP4-F和SNP4-R，其中所述SNP4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述SNP4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述第五引物包括SNP5-F和SNP5-R，其中所述SNP5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述SNP5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
所述第六引物包括SNP6-F和SNP6-R，其中所述SNP6-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述SNP6-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
所述第七引物包括SNP7-F和SNP7-R，其中所述SNP7-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述SNP7-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
所述第八引物包括SNP8-F和SNP8-R，其中所述SNP8-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述SNP8-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
4.一种用于鉴定近交系大鼠品系的试剂盒或液相芯片，命名为第一试剂盒或第一液相芯片，其特征在于，所述第一试剂盒或第一液相芯片包括：A1.权利要求3所述的引物组合，其包括用于扩增SNP1位点的第一引物、用于扩增SNP2位点的第二引物、用于扩增SNP3位点的第三引物、用于扩增SNP4位点的第四引物；
可选地，所述第一试剂盒或第一液相芯片还包括：
B1.分别针对SNP1、SNP2、SNP3、SNP4位点的野生型和突变型特异性ASPE引物，其中每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成；可选地，所述特异性引物序列包括：针对SNP1位点的SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、针对SNP2位点的SEQID NO:27和SEQ ID NO:28、针对SNP3位点的SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、针对SNP4位点的SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32；进一步可选地，所述tag序列为选自SEQID NO:33-40中的序列；和
C1.分别包被有特异性anti-tag序列的磁球，所述anti-tag序列相应地与B1中所述tag序列互补配对；可选地，所述anti-tag序列为选自SEQ ID NO:63-64、SEQ ID NO:67-68、SEQID NO:71-74中的序列。
5.根据权利要求4所述的试剂盒或液相芯片，其特征在于，所述第一试剂盒或第一液相芯片包括以下1)-4)：
1)针对SNP1位点的由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:33组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:34组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64；
2)针对SNP2位点的由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:35组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:36组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68；
3)针对SNP3位点的由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:37组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:38组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72；
4)针对SNP4位点的由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:40组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74。
6.一种用于鉴定近交系大鼠品系的试剂盒或液相芯片，命名为第二试剂盒或第二液相芯片，其特征在于，所述第二试剂盒或第二液相芯片包括：A2.权利要求3所述的引物组合，其包括用于扩增SNP5位点的第五引物、用于扩增SNP6位点的第六引物、用于扩增SNP7位点的第七引物、用于扩增SNP8位点的第八引物；
可选地，所述第二试剂盒或第二液相芯片还包括：
B2.分别针对SNP5、SNP6、SNP7、SNP8位点的野生型和突变型特异性ASPE引物，其中每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成；可选地，所述特异性引物序列包括：针对SNP5位点的SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42、针对SNP6位点的SEQID NO:43和SEQ ID NO:44、针对SNP7位点的SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46、针对SNP8位点的SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48；进一步可选地，所述tag序列为选自SEQID NO:33-34、SEQID NO:37-40、SEQ ID NO:49-50中的序列；和
C2.分别包被有特异性anti-tag序列的磁球，所述anti-tag序列相应地与B2中所述tag序列互补配对；可选地，所述anti-tag序列为选自SEQ ID NO:63-66、SEQ ID NO:71-74中的序列。
7.根据权利要求6所述的试剂盒或液相芯片，其特征在于，所述第二试剂盒或第二液相芯片包括以下5)-8)：
5)针对SNP5位点的由SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:33组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:34组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64；
6)针对SNP6位点的由SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:49组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66；
7)针对SNP7位点的由SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:37组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:38组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72；
8)针对SNP8位点的由SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:39组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:40组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74。
8.一种近交系大鼠品系SNP位点的检测方法，其特征在于，使用权利要求4-7中任一项所述的试剂盒或液相芯片检测近交系大鼠品系的DNA，所述近交系大鼠品系选自BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY和TSC。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，使用权利要求5或7所述的试剂盒或液相芯片，所述检测方法包括以下步骤：
(1)PCR扩增近交系大鼠品系的DNA样品，获得PCR扩增产物；
(2)将获得的PCR扩增产物进行纯化处理，获得纯化产物；
(3)用所述特异性ASPE引物对获得的纯化产物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，获得带有多个生物素标记的反应后产物；
(4)将对应所述特异性ASPE引物的包被有特异性anti-tag序列的磁球与所述带有多个生物素标记的反应后产物进行杂交反应，获得杂交产物；
(5)将所述杂交产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，得到反应产物；
(6)检测所述反应产物，获得所述近交系大鼠品系的SNP位点的等位基因信息；
可选地，在步骤(1)中，以权利要求3中提及的第一引物、第二引物、第三引物和第四引物为一组对所述近交系大鼠品系的DNA样品进行四重PCR扩增，或以权利要求3中提及的第五引物、第六引物、第七引物和第八引物为一组对所述近交系大鼠品系的DNA样品进行四重PCR扩增。
10.一种鉴定近交系大鼠品系的方法，所述近交系大鼠品系选自BN、F344、PVG、Lewis、DA、SHR、WKY和TSC，其特征在于，所述方法在权利要求9所述的检测方法的基础上还包括以下步骤：
(7)利用获得的所述近交系大鼠品系的SNP位点的等位基因信息鉴定近交系大鼠品系；鉴定过程包括：
根据SNP1位点的分型结果将以上8个近交系大鼠品系分成两组，其中Lewis、BN、PVG和TSC为A组，DA、SHR、F344和WKY为B组；在A组中，根据SNP2位点的分型结果将TSC与其他3个近交系大鼠品系区分开来，随后根据SNP3位点的分型结果将PVG与剩下的2个近交系大鼠品系区分开来，最后根据SNP4位点的分型结果将Lewis和BN区分开来；在B组中，根据SNP2位点的分型结果将SHR与其他3个近交系大鼠品系区分开来，随后根据SNP3位点的分型结果将WKY与剩下的2个近交系大鼠品系区分开来，最后根据SNP4位点的分型结果将DA和F344区分开来；或
根据SNP5位点的分型结果将以上8个近交系大鼠品系分成两组，其中Lewis、BN、TSC、PVG和DA为C组，F344、SHR和WKY为D组；在C组中，根据SNP6位点的分型结果将5个近交系大鼠品系分成两组，其中Lewis和BN为E组，TSC、PVG和DA为F组，在E组中，根据SNP8位点的分型结果将Lewis和BN区分开来，在F组中，根据SNP7位点的分型结果将DA与剩下的2个近交系大鼠品系区分开来，再根据SNP8位点的分型结果将TSC和PVG区分开来；在D组中，根据SNP6位点的分型结果将SHR与另外2个近交系大鼠品系区分开来，再根据SNP7或SNP8位点的分型结果将F344和WKY区分开来，进而实现这8个近交系大鼠品系的鉴定。
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