CN115820830A - 与非创伤性股骨头坏死风险性有关il23r基因的单核苷酸多态性的检测物质及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与非创伤性股骨头坏死风险性有关IL23R基因的单核苷酸多态性的检测物质及其应用，具体涉及的单核苷酸多态性位点为rs4655686、rs6683039、rs11465754、rs1884444、rs1569922、rs6693831。本发明首次阐述了上述6SNPs与非创伤性股骨头坏死发病风险的关联，对非创伤性股骨头坏死分子预警及分子水平防治具有重大价值。

Description

与非创伤性股骨头坏死风险性有关IL23R基因的单核苷酸多 态性的检测物质及其应用
本申请是中国专利“与非创伤性股骨头坏死风险性有关IL23R基因的单核苷酸多 态性的检测物质及其应用”的分案申请，原专利的申请号为2020109056370，申请日为2020- 09-01，申请人为吉林大学，申请公布号为CN111961719A。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关IL23R基因的单核苷酸多态性的物质，进一步将其用于非创伤性股骨头坏死的分子预警、药物治疗靶标和临床分子诊断与分型。
背景技术
股骨头坏死(osteonecrosisofthefemoralhead，ONFH)是由遗传因素与环境因素共同作用引起的复杂性疾病。在近10多年来，ONFH的发病率呈现逐年增加的趋势。据估计在美国年均20000～30000位患者被新诊断为ONFH，在中国每年新增ONFH病例为150000～200000，而且目前中国成年人ONFH患者812万人，主要发病群体为40岁至50岁之间的青壮年，致残率高，导致严重社会与家庭经济负担，是目前人类健康面临主要挑战之一。及早发现ONFH遗传学分子诊断标志物进而实施早期分子预警，使其防治时段前移，是降低ONFH发病率的关键。
近年来ONFH分子发病机理的重要研究进展是陆续提出了多系列基因多态性与ONFH的发病风险相关，它们或者与另外一些基因形成连锁不平衡共同影响ONFH的发病，或者影响其它易感基因的表达功能，在ONFH的发生发展中起协同作用。这些遗传分子病因学研究结果清晰地提示，ONFH属于多个微效基因联合参与并由环境因素诱导的复杂病。然而，目前国内外关于ONFH的基因多态性研究领域存在的主要瓶颈问题，零散研究基因位点的资料多，系统研究多基因位点的资料少，不利于多种微效基因联合致病的分子病因学与分子发病机理的阐述。这些瓶颈问题是阐述ONFH分子发病机理的严重束缚，也是ONFH分子病因学的最新成果与临床防治实施对接的关键障碍。本发明从解决这一根本问题入手，发现了IL23R基因6SNPs组合在非创伤性股骨头坏死分子预警、分子诊断及治疗药物靶标的重要应用价值。
IL23R基因染色体位置1p31.3，含有13个外显子。该基因编码的蛋白质IL23A/IL23受体的一个亚单位。这种蛋白与受体分子IL12RB1/IL12Rbeta1配对，两者都是IL23A信号转导所必需的。该蛋白与Janus激酶2(JAK2)组成性地结合，并以配体依赖的方式与转录激活剂STAT3结合。
IL23A是一种异二聚体蛋白，由两个亚基组成：IL-23R和IL-12Rb1。IL-23R在活化的T细胞、树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞上表达，尤其与IL-23结合，IL-23主要由树突状细胞和来自外周组织的活化巨噬细胞产生。IL23R是一种促炎细胞因子，它通过核因子NFκB配体受体激活剂抑制破骨细胞的生成，并影响T细胞。在韩国人群中发现IL23R基因多态性与ONFH患者该基因表达相关，其中，IL23R基因多态性与特发性ONFH风险尤其相关，而与酒精及激素性ONFH没有显著相关性。对中国人群的研究证实IL23R基因的rs6693831多态性与中国男性饮酒导致的ONFH风险降低有关。酒精中毒会影响脂肪代谢和骨细胞压力，是导致骨坏死的重要危险因素。
ONFH与多种因素有关，如激素滥用、酒精中毒、感染、骨髓浸润性疾病、凝血缺陷和一些自身免疫性疾病等。尤其是一些自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)、风湿性多肌痛(PMR)、类风湿性关节炎(RA)和炎症性肠病(IBD)，都与骨坏死的发生有关。
IL23是一种促炎细胞因子，由IL12的p19亚基和p40亚基组成。IL23R与IL12R配对，两者都是IL23信号通路所必需的。IL23调节免疫反应的活性，并通过IL23R的参与促进炎症反应。这些细胞因子主要在免疫系统细胞中表达，如T细胞、巨噬细胞和树突状细胞。IL23缺陷小鼠对胶原诱导的关节炎具有抵抗力，IL23还通过T细胞活化抑制RANK从而抑制破骨细胞生成。近年来许多研究表明IL23R与炎症性疾病有关。IL23R基因的一些变异相关于银屑病的皮肤疾病的风险。此外，在先前发表的全基因组关联研究中，IL23R基因多态性与IBD和克罗恩病(CD)易感性相关。
发明内容
本发明确定了IL23R基因单核苷酸多态性位点或具有交互作用的位点组合与ONFH的易感性相关，并比较了ONFH患者和对照组的基因型和等位基因频率，联合应用分子技术的创新集成在国内外率先阐述IL23R基因6SNPs基因分型、等位基因频率、基因之间的组合与ONFH发病风险的关联，为建立ONFH的分子水平防治对策提出关键分子靶点，本发明用于ONFH的易感人群筛查及早期干预，促进分子病因学的研究成果与ONFH的临床防治及早对接。
本发明的一个目的是检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关IL23R基因的单核苷酸多态性的物质，其特征在于：
所述物质在诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；
或所述物质在评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；
所述与非创伤性股骨头坏死有关的具有交互作用的位点组合为以下(1)至(6)中的任意一个或多个：
(1)rs6683039位点与rs11465754位点的组合；
(2)rs6683039位点与rs1884444位点的组合；
(3)rs6683039位点与rs1569922位点的组合；
(4)rs11465754位点与rs1569922位点的组合
(5)rs1884444位点与rs6693831位点的组合；
(6)rs4655686位点与rs6693831位点的组合。
进一步的，所述物质为制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品，或所述物质为制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品，所述产品中包括记载有如下A至I中至少一种条件的可读性载体：
A.同时携带所述rs6683039位点最小纯合基因型CC型与rs11465754最小纯合基因型GG型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
B.同时携带所述rs6683039最小纯合基因型CC型与rs1884444最小纯合基因型GG型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
C.同时携带所述rs6683039最小纯合基因型CC型与rs1569922最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
D.同时携带所述rs11465754位点最小纯合基因型GG型与rs1569922最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
E.同时携带所述rs1884444最小纯合基因型GG型与rs6693831最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
F.同时携带所述rs4655686最小纯合基因型AA型与rs6693831最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低。
进一步的，所述物质为用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种SNP分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。
进一步的，用于检测rs4655686位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对甲或成套单链DNA分子甲；所述引物对甲由如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子组成和如SEQID NO.2所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子甲由如SEQ ID NO.1所示的单链DNA、如SEQ ID NO.2所示的单链DNA和如SEQ ID NO.3所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs6683039位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对乙或成套单链DNA分子乙；所述引物对乙由如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子组成和如SEQID NO.5所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子乙由如SEQ ID NO.4所示的单链DNA、如SEQ ID NO.5所示的单链DNA和如SEQ ID NO.6所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs11465754位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丙或成套单链DNA分子丙；所述引物对丙由如SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子组成和如SEQ IDNO.8所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丙由如SEQ ID NO.7所示的单链DNA、如SEQ ID NO.8所示的单链DNA和如SEQ ID NO.9所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs1884444位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丁或成套单链DNA分子丁；所述引物对丁由如SEQ ID NO.10所示的单链DNA分子组成和如SEQ IDNO.11所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丁由如SEQ ID NO.10所示的单链DNA、如SEQ ID NO.11所示的单链DNA和如SEQ ID NO.12所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs1569922位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对戊或成套单链DNA分子戊；所述引物对戊由如SEQ ID NO.13所示的单链DNA分子组成和如SEQ IDNO.14所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丁由如SEQ ID NO.13所示的单链DNA、如SEQ ID NO.14所示的单链DNA和如SEQ ID NO.15所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs6693831位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对己或成套单链DNA分子己；所述引物对己由如SEQ ID NO.13所示的单链DNA分子组成和如SEQ IDNO.16所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子己由如SEQ ID NO.17所示的单链DNA、如SEQ ID NO.14所示的单链DNA和如SEQ ID NO.18所示的单链DNA组成。
进一步的，所述rs4655686位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第67172321位核苷酸；所述位点的核苷酸为T或A。所述rs6683039位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第67165650位核苷酸；所述rs6683039位点的核苷酸为C或T。所述rs11465754位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第33259408位核苷酸；所述rs11465754位点的核苷酸为A或G。所述rs1884444位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第67168129位核苷酸；所述rs1884444位点的核苷酸为G或T。所述rs1569922位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第67199280位核苷酸；所述rs1569922位点的核苷酸为T或C。所述rs6693831位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第1:67255184位核苷酸；所述rs6693831位点的核苷酸为T或C。
本发明还提供一种试剂盒，包括所述用于检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关的(1)至(6)至少一个位点组合的单核苷酸多态性的物质。
本发明还提供一种靶向治疗药物，所述药物为以所述与非创伤性股骨头坏死有关的(1)至(6)位点组合中的任意一个或多个为靶标基因的药物。
本发明公开了IL23R基因单核苷酸多态位点rs4655686、rs6683039、rs11465754、rs1884444、rs1569922、rs6693831标志物组合在检测非创伤性股骨头坏死发病风险中的应用，进一步用于ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
本发明所提供物质为用于检测rs4655686、rs6683039、rs11465754、rs1884444、rs1569922、rs6693831位点及其组合在ONFH发病风险及分子预警、临床分子诊断与分型的产品，或作为ONFH药物治疗靶标的应用及其产品。
本发明的发明人通过中国汉族人群ONFH临床病例对照体系研究，发现IL23R基因rs4655686单核苷酸多态位点最小纯合基因型AA型及最小等位基因A频率显著相关于降低患ONFH风险；遗传学隐性模型也显著相关于降低患ONFH风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。还发现rs6683039与rs11465754交互作用显著相关于降低ONFH发病风险；发现rs6683039与rs1884444交互作用显著相关于降低ONFH发病风险；发现rs6683039与rs1884444交互作用显著相关于降低ONFH发病风险；发现rs11455754与rs1569922交互作用显著相关于降低ONFH发病风险；发现rs18844444与rs6693831交互作用显著相关于降低ONFH发病风险；发现rs4655686与rs6693831交互作用显著相关于降低ONFH发病风险。
本发明首次阐述了IL23R基因上述7SNPs与ONFH发病风险的关联，对ONFH分子预警及分子水平防治具有重大价值。
附图说明
图1为MassarraySNP分型实验流程图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
下述实施例中所用的实验材料及试剂如无特殊说明均可通过商业途径购买。
实施例1、IL23R基因在非创伤性股骨头坏死分子预警、分子诊断及治疗药物靶标的应用。
一、ONFH病例对照研究体系建立
建立在知情同意基础上，ONFH病例对照研究体系共600例，其中健康对照组300例，ONFH患者组300例。
ONFH病例来自于2012年6月至2018年10月期间分别就诊于吉林大学第二、第三临床医学院骨科的住院临床患者，其中男性204例，女性96例，年龄54.49±11.8岁。排除明显髋关节的外伤史和髋关节先天性疾病、髋关节感染性疾病及髋关节肿瘤，按Ficat诊断与分期标准进行ONFH的临床诊断与分期。
健康对照组来自2013年11月至2014年3月期间在吉林大学第二临床医学院体检中心的健康体检者，其中男性131名，女性169名，年龄56.5±8.61岁。其空腹血糖、血清甘油三脂及总胆固醇均居于正常人群参考值水平，腹腔脏器超声检查及胸部X线摄片无异常，并排除心脑血管疾病等重大疾病史。以上病例-对照研究体系均为中国汉族人，个体之间无血缘关系。
二、外周血白细胞基因组DNA提取
空腹状态下采集肘静脉血液2ml,按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书的规程操作，主要步骤依次为：抗凝血2ml，2000rpm离心10min，取血浆-80℃保存；剩余细胞加入红细胞裂解液A型1ml并轻柔颠倒混匀；10000g室温离心2min，弃上清；将沉淀重悬于500μl的红细胞裂解液A型中，轻柔吹打混匀后，10000g室温离心min，去上清；加入0.6mL溶液A，轻柔吹打混匀,室温作用5min；加入0.2mL氯仿和0.3mL溶液B，立即颠倒混匀；室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5mL塑料离心管；加入0.7ml异丙醇，颠倒混匀5-8次，出现絮状DNA沉淀；加入1mL75％乙醇，13000g离心min，弃上清后空气中挥发乙醇，加入0.2mlTris-EDTA反应溶解DNA；取1μl提取DNA，应用Nanodrop2000检测DNA含量及纯度；将DNA分装，-80℃保存。
三、目标基因及其SNPs的优化筛选
应用Hapmap数据库以及相关文献查询IL23R基因的SNPs,通过多种生物信息库比对各SNPs位点在不同国家、民族、地区人群的分布，尤其在亚洲人群的分布数据，基因多态性的分布符合Hardway平衡，分别在基因编码区、启动子区及内含子及选择6SNPs作为研究的靶位点，所选择的目标基因SNPs位点见表1。
表1
Figure BDA0003741968680000071
所述的CREBPA、PPARg、CREBBP基因11SNPs序列信息见表2。
表2
Figure BDA0003741968680000072
四、MassarraySNP分型实验流程，具体见图1。
(一)引物设计及合成、稀释1.基因序列的获取：①在Myagena网站中注册成用户；②在NCBI网页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)中输入该SNP位点的名称,按照dbSNPbatchreportor格式显示；③将SNP位点所在序列发送到Myagena网站注册的邮箱中；④在Myagena网站的TOOLS工具栏中选择Genotyping；⑤点击RSformat，在Browse按钮中选择NCBI网站发送到邮箱的文件；⑥网站对序列的格式化完成后在Sentto栏中，选择ProxSNP；⑦开始ProxSNP，点击BeginStart；⑧上述步骤完成后，在Sentto栏中选择PreXTEND；⑨开始ProxSNP，点击BeginStart；⑩在产生的结果中，选择OUTPUT，并把文件内容复制在新的文本文件.txt中。2.采用AssayDesigner3.1软件进行引物设计PCR反应和单碱基扩展引物，并交由生物公司合成：①在软件SNPGroup栏中选择Browse按钮，找到上述产生的txt文件；②在AassyDesign栏中选择SBEMassExtend，并在SBEstopmix栏中选择iPlex，在MμltiplexLevel中按照实际情况选择不同的反应重数；③SNPcapture，Extendprimerdesign，MASSMμltiplexing均选择默认参数；④参数设定后，点击Run；⑤在txt文件目录相应位置找到产生的引物序列文件，设计的引物序列见表3。
表3
Figure BDA0003741968680000081
3.引物稀释：①PCRmastermix引物配置，稀释单管PCRmaster至浓度100μM，加入去离子水混合所有单管PCRmaster使最终反应PCRmastermix浓度为0.5μM；②EXTENDMix引物配置：稀释单管延伸引物至终浓度500μM，加入引物混合后使得各引物浓度为8μM、10μM、15μM。按照DNA合成产品使用说明计算该条引物分子量、质量数和摩尔数，进而根据所需的浓度计算需加入去离子水的量。②将混合好的单管延伸引物根据分子量大小，分别取(小于6300Da)1倍，(6300Da至7200Da)1.2倍，(大于7200Da)1.5倍体积量进行混合待用。(二)AgenaMassArray系统基因分型步骤；分型原理：通过PCR反应扩增出含有待检SNP位点的目的片段，然后用SAP酶去除PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物,再加入单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨SNP位点，且与目的片段上的碱基完全互补，采用四种ddNTP替代dNTP，这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异,确定该点处碱基。测序引物序列表相关信息间表3。1.PCR扩增反应：①取1.5mlEP管中配置PCRmastermix，并振荡低速离心，反应组分见下表4；②选用8道移液器，在384孔板的每个加样孔中加入4μlPCRmastermix，最后加入1μl模板DNA(20ng/μl)混匀，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。1000rpm离心1minute；③设置如下PCR扩增反应程序：94℃5min；94℃20sec，56℃30sec，72℃1min，45cycles；72℃3min；4℃∞。将PCR反应板放置于PCR仪上，启动程序。
表4
Figure BDA0003741968680000091
2.产物碱性磷酸酶处理：
①在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs；②在新1.5mlEP管中配制碱性磷酸酶处理反应液，SAPMix反应组分见下表5；③将SAPmix加入384孔PCR反应板，对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应总体积为7μl，其中PCR产物5μl，SAPmix2μl；④移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序；⑤设置SAP反应程序：37℃20min；85℃5min；4℃∞。并将384孔反应板放置于PCR仪上，启动程序。
表5
SAPmixofReagent Concentration Volume(1rxn)
Water(HPLCgrade) NA 1.53μl
SAPBuffer 10x 0.17μl
SAPEnzyme 1U/μl 0.30μl
Totalvolume - 2.00μl
3.单碱基延伸反应：①在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl；②在新1.5mlEP管中配制单碱基延伸反应液，EXTENDMix反应组分见下表6；③将EXTENDMix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系EXTENDMix2μl；SAP+PCRreaction7μl,TotalVolume9μ；④移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序:94℃30sec；[94℃5sec，(52℃5sec,80℃5sec)5cycles]40cycles；4℃∞。
表6
EXTENDMixofReagent Conc.in9μl Volume(1rxm)
Water(HPLCgrade) NA 0.619μl
iPLEXBufferPlus 0.222x 0.200μl
iPLEXTerminationmix 1x 0.200μl
PrimerMix(7μM:14μM) 0.625uM:1.25uM 0.940μl
iPLEXEnzyme 1x 0.041μl
4.树脂纯化：①在384/6MGDimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干；②在384样本板的每个孔中加16μl水；③将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中；④将384样本板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟。
5.芯片点样：启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384-wellSpectroCHIPbioarray上。
6.质谱检测及数据输出：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析，检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果保存入相应存储媒介并递交生物信息室分析。
(三)统计分析；
基因型频率和等位基因频率计算，检验Hardy-Weinberg平衡和MAF，通过Person卡方检验比较病例组和对照组之间基因型和等位基因分布情况。
单个SNP关联分析，通过PLINK卡方检验，分析ONFH组和疾病组在每个位点上基因型和等位基因的差异，寻找与疾病相关的位点。
多个SNPs之间的两两交互作用与ONFH发病风险的相关性，通过PLINK基因交互作用(上位效应，epistasis)分析完成。
五、实验结果分析
(一)ONFH组与对照组IL23R基因6SNPs基因分型与ONFH发病风险的相关性，具体6SNPs基因型在ONFH组与对照组的分布见表7。
测序结果PLINK卡方分析发现ONFH组IL23R基因rs4655686(A/T)位点最小纯合基因型AA(Minorgenotype)频率显著低于对照组，见表7，P＝5.249e-005，也就是说，IL23R基因rs4655686(A/T)位点AA型携带者显著降低ONFH发病风险。
表7
Figure BDA0003741968680000111
(二)ONFH组与对照组IL23R基因6SNPs等位基因频率与ONFH发病风险的相关性，SNP等位基因型在病例组与对照组样本中分布频数如表8所示。
测序结果发现ONFH组IL23Rrs4655686(A/T)位点最小等位基因A(Minor Allele)频率显著低于对照组，P＝0.007019；OR(95％CI)0.671(0.502-0.897)，也就是说，IL23Rrs4655686(A/T)位点A等位基因频率显著降低ONFH发病风险
表8
Figure BDA0003741968680000121
*PLINK卡方检验。
(三)IL23R基因6SNPs不同遗传模型与ONFH发病风险的相关性见表9；IL23R基因6SNPs位点不同遗传学模型分析结果进一步发现，ONFH组IL23Rrs4655686(A/T)位点隐性模型(AAvsAT+TT)显著低于对照组，P＝2.94E-056，也就是说，IL23Rrs4655686(A/T)位点最小纯合基因型AA频率显著降低ONFH发病风险。
表9
Figure BDA0003741968680000122
Figure BDA0003741968680000131
(四)IL23R基因6SNPs的基因-基因交互作用与ONFH发病风险相关性。
应用PLINK软件基因交互作用分析方法对rs4655686(A/T)、rs6683039(C/T)、rs11465754(A/G)、rs1884444(G/T)、rs1569922(T/C)、rs6693831(T/C)6SNPs的两两交互作用分析，结果见表10。
所述rs4655686位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第67172321位核苷酸；所述位点的核苷酸为T或A；所述rs6683039位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第67165650位核苷酸；所述rs6683039位点的核苷酸为C或T；所述rs1569922位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第33259408位核苷酸；所述rs11465754位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第67165748位核苷酸；所述rs11465754位点的核苷酸为A或G；所述rs1884444位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第67168129位核苷酸；所述rs1884444位点的核苷酸为G或T；所述rs1569922位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第67199280位核苷酸；所述rs1569922位点的核苷酸为T或C；所述rs6693831位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第67255184位核苷酸；所述rs6693831位点的核苷酸为C或T。
PLINK软件分析基因之交互作用的结果发现：
IL23R基因rs6683039(C/T)位点与IL23R基因rs11465754(A/G)位点交互作用显著降低ONFH发病风险，OR：0.7132，P＝0.04978也就是说，同时携带IL23R基因rs6683039(C/T)位点最小纯合基因型CC型与rs11465754(A/G)位点最小纯合基因型GG型的个体显著降低ONFH发病风险，作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
IL23R基因rs6683039(C/T)位点与IL23R基因rs1884444(G/T)位点之间的交互作用降低ONFH发病风险，OR：0.6878，P＝0.03934，也就是说，同时携带IL23R基因rs6683039(C/T)位点最小纯合基因型CC型与IL23R基因rs1884444(G/T)位点最小纯合基因型GG型的个体显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
IL23R基因rs6683039(C/T)位点与IL23R基因rs1569922(T/C)位点之间的交互作用显著降低ONFH发病风险，OR：0.6871，P＝0.03841，也就是说，同时携带IL23R基因rs6683039(C/T)位点最小纯合基因型CC型与IL23R基因rs1569922(T/C)位点最小纯合基因型TT型的个体显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
IL23R基因rs11465754(A/G)位点与IL23R基因rs1569922(T/C)位点之间的交互作用显著降低ONFH发病风险,OR:0.6914，P＝0.03871，也就是说，同时携带IL23R基因rs11465754(A/G)位点最小纯合基因型GG型与IL23R基因rs1569922(T/C)位点最小纯合基因型TT型的个体显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
IL23R基因rs1884444(G/T)位点与IL23R基因rs6693831(T/C)位点之间的交互作用显著降低ONFH发病风险，OR:0.6615，P＝0.04742，也就是说，同时携带IL23R基因rs1884444(G/T)位点最小纯合基因型GG型与IL23R基因rs6693831(T/C)位点最小纯合基因型TT型的个体显著显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
IL23R基因rs4655686(A/T)位点与IL23R基因rs6693831(T/C)位点的交互作用显著相关于降低ONFH发病风险，也就是说，同时携带IL23R基因rs4655686(A/T)位点最小纯合基因型AA型与IL23R基因rs6693831(T/C)位点最小纯合基因型TT型的个体显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH发病风险的分子保护标志物。
本发明首次发现IL23R基因6SNPs的两两交互作用显著相关于ONFH发病风险，且这些风险相关性与单一SNP对ONFH发病风险所表现的作用部分或完全不同，基因交互作用的结果更清晰地发现了多个SNPs对降低ONFH风险的保护效应，进一步验证了ONFH是多个微效基因联合引起的复杂病，阐述这些分子遗传学位点的联合效应，对ONFH早期分子预警及分子防控对策建立具有重要价值。所述基因交互作用，又称上位效应(epistaticeffect)是指影响同一性状的两对非等位基因，其中一对基因(显性或隐性的)抑制(或掩盖)另一对显性基因的作用时所表现的作用。
表10.IL23R6SNPs之间两两交互作用与ONFH发病风险相关性
Figure BDA0003741968680000151
*PLINK卡方分析；#PLINK基因交互作用分析
本领域技术人员将能通过检测SNP位点的任何方法或技术在个体的核酸中进行在本文所公开的SNP标记上存在的核苷酸的分析。例如，一个人能用本发明的方法通过进行Tagman法、质谱法、DNA微阵列法、微测序、杂交、限制性酶切分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-HRM或联合应用上述方法检测SNP位点标记，当然，这一列表仅是示例性的，并且决不用于限制本发明。本领域技术人员可使用任何合适的方法来实现这种检测。
本领域技术人员可使用任何合适的方法来实现这种检测。
本发明的实施例中涉及到的主要实验仪器和设备如下表11。
表11
Figure BDA0003741968680000152
Figure BDA0003741968680000161
本发明的实施例中涉及到的主要试剂或软件如下表12。
Figure BDA0003741968680000162
Figure BDA0003741968680000171
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关IL23R基因的单核苷酸多态性的物质，其特征在于：
所述物质在诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；
或所述物质在评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；
所述与非创伤性股骨头坏死有关的位点组合为以下(1)至(6)中的任意一个或多个：
(1)rs6683039位点与rs11465754位点的组合；
(2)rs6683039位点与rs1884444位点的组合；
(3)rs6683039位点与rs1569922位点的组合；
(4)rs11465754位点与rs1569922位点的组合
(5)rs1884444位点与rs6693831位点的组合；
(6)rs4655686位点与rs6693831位点的组合。
2.如权利要求1所述的应用，所述应用为用于检测(1)至(6)中的任意一个或多个的位点或位点组合的单核苷酸多态性的物质在制备诊断或辅助诊断待测人患非创伤性股骨头坏死风险性的产品，或在制备评价或辅助评价待测人患非创伤性股骨头坏死风险性的产品；其他特征在于：
所述产品中包括记载有如下A至F中至少一种条件的可读性载体：
A.同时携带所述rs6683039位点最小纯合基因型CC型与rs11465754最小纯合基因型GG型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
B.同时携带所述rs6683039最小纯合基因型CC型与rs1884444最小纯合基因型GG型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
C.同时携带所述rs6683039最小纯合基因型CC型与rs1569922最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
D.同时携带所述rs11465754位点最小纯合基因型GG型与rs1569922最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
E.同时携带所述rs1884444最小纯合基因型GG型与rs6693831最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
F.同时携带所述rs4655686最小纯合基因型AA型与rs6693831最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低。
3.如权利要求1所述的应用，所述应用为用于检测(1)至(7)中的任意一个或多个的位点或位点组合的单核苷酸多态性的物质在制备诊断或辅助诊断待测人患非创伤性股骨头坏死风险性的产品，或在制备评价或辅助评价待测人患非创伤性股骨头坏死风险性的产品；其他特征在于：
用于检测rs4655686位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对甲或成套单链DNA分子甲；所述引物对甲由如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子组成和如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子甲由如SEQ ID NO.1所示的单链DNA、如SEQ IDNO.2所示的单链DNA和如SEQ ID NO.3所示的单链DNA组成:
用于检测rs6683039位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对乙或成套单链DNA分子乙；所述引物对乙由如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子组成和如SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子乙由如SEQ ID NO.4所示的单链DNA、如SEQ IDNO.5所示的单链DNA和如SEQ ID NO.6所示的单链DNA组成:
用于检测rs11465754位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丙或成套单链DNA分子丙；所述引物对丙由如SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子组成和如SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丙由如SEQ ID NO.7所示的单链DNA、如SEQ ID NO.8所示的单链DNA和如SEQ ID NO.9所示的单链DNA组成；
用于检测rs1884444位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丁或成套单链DNA分子丁；所述引物对丁由如SEQ ID NO.10所示的单链DNA分子组成和如SEQ ID NO.11所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丁由如SEQ ID NO.10所示的单链DNA、如SEQ IDNO.11所示的单链DNA和如SEQ ID NO.12所示的单链DNA组成；
用于检测rs1569922位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对戊或成套单链DNA分子戊；所述引物对戊由如SEQ ID NO.13所示的单链DNA分子组成和如SEQ ID NO.14所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丁由如SEQ ID NO.13所示的单链DNA、如SEQ IDNO.14所示的单链DNA和如SEQ ID NO.15所示的单链DNA组成；
用于检测rs6693831位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对己或成套单链DNA分子己；所述引物对己由如SEQ ID NO.16所示的单链DNA分子组成和如SEQ ID NO.17所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子己由如SEQ ID NO.16所示的单链DNA、如SEQ IDNO.17所示的单链DNA和如SEQ ID NO.18所示的单链DNA组成。
4.一种试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述用于检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关的(1)至(6)至少一个位点或位点组合的单核苷酸多态性的物质。
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