CN112029852B - ONFH易感相关TNF-α、GREM1、TGF-β、CR2基因SNP检测物质 - Google Patents

ONFH易感相关TNF-α、GREM1、TGF-β、CR2基因SNP检测物质 Download PDF

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Abstract

本发明涉及ONFH易感相关TNF‑α、GREM1、TGF‑β、CR2基因SNP检测物质。本发明涉及TNF‑α基因单核苷酸多态位点rs1800629(A/G)和GREM1基因单核苷酸多态位点rs11632715(G/A)基因分型，等位基因频率和遗传学模型，TNF‑α基因单核苷酸多态位点rs1800629(A/G)和rs1800630(C/A)、TGF‑β基因单核苷酸多态位点rs8105161(C/T)及CR2基因单核苷酸多态位点rs3813946(T/C)组合之间的交互作用与ONFH发病风险的关联，为建立ONFH的分子水平防治对策提出关键分子靶点，用于ONFH的易感人群筛查及早期干预，促进分子病因学的研究成果与ONFH的临床防治及早对接。

Description

ONFH易感相关TNF-α、GREM1、TGF-β、CR2基因SNP检测物质
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及TNF-α基因单核苷酸多态位点rs1800629(A/G)和rs1800630(C/A)，GREM1基因单核苷酸多态位点rs11632715(G/A)，TGF-β基因单核苷酸多态位点rs8105161(C/T)及CR2基因单核苷酸多态位点rs3813946(T/C)标志物或标志物的组合在制备诊断或辅助诊断、制备评价或辅助评价待测人患ONFH风险性产品中的应用，用于ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
背景技术
股骨头坏死(osteonecrosisofthefemoralhead，ONFH)是由遗传因素与环境因素共同作用引起的复杂性疾病。在近10多年来，ONFH的发病率呈现逐年增加的趋势。据估计在美国年均20000～30000位患者被新诊断为ONFH，在中国每年新增ONFH病例为150000～200000，而且目前中国成年人ONFH患者812万人，主要发病群体为40岁至50岁之间的青壮年，致残率高，导致严重社会与家庭经济负担，是目前人类健康面临主要挑战之一。及早发现ONFH遗传学分子诊断标志物进而实施早期分子预警，使其防治时段前移，是降低ONFH发病率的关键。
近年来ONFH分子发病机理的重要研究进展是陆续提出了多系列基因多态性与ONFH的发病风险相关，它们或者与另外一些基因形成连锁不平衡共同影响ONFH的发病，或者影响其它易感基因的表达功能，在ONFH的发生发展中起协同作用，这些遗传分子病因学研究结果清晰地提示，ONFH属于多个微效基因联合参与并由环境因素诱导的复杂病。例如以下研究：
一、关于TNF-α基因的研究
TNF-α基因染色体位置6p21.33，含有4个外显子，编码蛋白是一种多功能促炎细胞因子，属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族。TNF-α主要由巨噬细胞分泌，能与受体TNFRSF1A/TNFR1和TNFRSF1B/TNFBR结合并发挥作用。这种细胞因子参与调节广泛的生物学过程，包括细胞增殖、分化、凋亡、脂质代谢和凝血。TNF-α与多种疾病有关，包括自身免疫性疾病、胰岛素抵抗和癌症。对小鼠的敲除研究也表明了这种细胞因子的神经保护功能。TNFα作为一种参与全身炎症的细胞因子涉及了ONFH的发病过程。但TNFα在ONFH中的确切作用尚不清楚。
一项TNFα对大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)的研究显示，TNFα可促进细胞增殖和血管生成，从而抑制成骨。DNA甲基化和组蛋白修饰在调节TNFα对成骨分化的影响中起着重要作用。在TNFα处理的rMSCs中，大鼠Runx2启动子的CpG甲基化率增加，坏死组织中TNFα含量明显低于正常组织，TNFα处理的rMSCs中多个Wnt信号通路被TNFα抑制，提示了TNFα对成骨关键信号通路的抑制作用。
遗传流行病学研究已经评估了不同人群中抗炎和促炎症因子基因多态性与ONFH发病风险的关系，但由于不同人群的遗传异质性，结果不均衡。一项来自中国人群的研究关于IL-10、IL-12rs3212227和TNF-α多态性对ONFH的影响，显示TNF-αrs1800629和IL-10rs1800872的基因型和等位基因频率在ONFH患者与正常对照组之间无显著性差异。
二、关于TGF-β1基因的研究
TGF-β1基因染色体位置19q13.2，含有7个外显子，编码TGF-β超家族的分泌配体。该家族配体结合各种转化生长因子β受体，导致SMAD家族转录因子的募集和激活，这些转录因子调节基因表达。TGF-β1基因编码的前蛋白经蛋白质水解处理以产生潜伏期相关肽(LAP)和成熟肽，由成熟肽同二聚体、LAP同二聚体和潜在TGFβ1结合蛋白组成的潜伏形式，或仅包含成熟肽同二聚体的活性形式。成熟肽也可以与其他TGFβ家族成员形成异二聚体。这种编码蛋白调节细胞增殖、分化和生长，并能调节包括干扰素γ和肿瘤坏死因子α在内的其他生长因子的表达和激活。
TGF-β1在骨组织中含量丰富，是骨形成和骨吸收的重要调节因子。TGF-β1基因多态性被认为与骨密度和骨质疏松性脊柱骨折的易感性有关。采用RFLP和直接测序法对237例中国绝经后妇女TGF-β1基因C(-1348)-T、T29-C和T(861-20)-C三个SNPs进行了分析，同步测量腰椎和髋部的骨密度、骨转换的生化标志物以及血清TGF-β1水平。只有TGF-β1基因T29-C多态性与骨密度和骨折风险相关。TC基因型患者脆性骨折发生率显著生高。TC基因型女性血清碱性磷酸酶、骨钙素水平及尿N-端肽排泄量均显著高于TT或CC基因型，TC基因型女性股骨转子骨密度和髋关节总骨密度较低。
TGF-β1基因多态性也在骨折、骨质疏松症(OP)和骨关节炎(OA)等骨疾病的发病机制中起重要作用。一项荟萃分析研究了TGF-β1基因rs1982073C>T单核苷酸多态性与骨折、OP和OA风险之间的关系，结果显示骨折、OP或OA患者rs1982073C>T的频率高于健康对照组。分层分析进一步显示rs1982073C>T多态性与亚洲人骨折、OP和OA的风险呈正相关。rs1982073C>T在等位基因模型下可能增加骨折、OP和OA的风险，但在显性模型下仅与OP显著相关，而在等位基因模型中rs1982073C>T多态性的受试者更容易发生三种骨病。
三、关于GREM1基因的研究
GREM1基因染色质位置15q13.3，含有3个外显子，编码BMP拮抗剂家族的一个成员。与BMP一样，BMP拮抗剂含有胱氨酸结，通常形成同源二聚体和异二聚体。该基因所属的BMP拮抗剂CAN亚家族的特征是具有一个八元环的C端胱氨酸结。该基因编码的分泌型糖基化蛋白的拮抗作用可能是由于它直接与BMP蛋白结合。作为BMP的拮抗剂，该基因可能在调节器官发生、体型形成和组织分化中发挥作用。
研究显示BMP拮抗剂GREM1上游的一种罕见的种系复制导致孟德尔显性遗传性结直肠癌(CRC)。潜在的发病机制是肠上皮细胞强烈的GREM1异位过度表达。而且确认了一个常见的GREM1多态性，rs16969681，也与CRC易感性相关。在普通人群中有20％的差异风险。推测潜在原因是GREM1表达的中度差异。rs16969681位于活性染色质区域，具有等位基因和组织特异性增强活性。CRC高危等位基因与更强的基因表达相关，较高的Grem1mRNA水平增加了Apc(Min)小鼠的肠道肿瘤负荷。肠道特异性转录因子CDX2和Wnt效应因子TCF7L2结合在rs16969681附近，与风险等位基因的亲和力显著增高，CDX2在CDX2/GREM1阴性细胞中过度表达导致GREM1的再表达。rs16969681通过影响结直肠癌中Wnt驱动的GREM1表达来影响结直肠癌的风险。
四、关于CR2基因的研究
OA的发生可能与关节软骨细胞肥大分化的激活有关。与其他透明软骨亚型(如生长板软骨)相比，健康的关节软骨对肥大分化具有高度的抵抗力。
一项研究人类关节软骨和生长板软骨发生肥大分化倾向差异的分子机制显示，对来自同一青少年供者的健康人生长板和关节软骨进行全基因组基因表达芯片分析，结果显示与生长板软骨相比，关节软骨中Wnt信号转导减少，这至少部分是由于BMP和Wnt拮抗剂Gremlin1、Frizzled-relatedprotein(FRP)和Dkk-1在关节软骨中mRNA和蛋白质水平上的表达增加相关。在长骨外植体培养和软骨分化的人骨髓间充质干细胞，补充这些蛋白质可减少终末肥大分化，而不影响软骨发生。而且，位于GREM1基因控制区的单核苷酸多态性rs12593365与2个基于人群队列中放射治疗髋部OA的风险降低20％显著相关。因此，gremlin1、FRP和Dkk-1是关节软骨肥大分化的天然制动器，而关节软骨的肥大分化可能有助于OA的发生。
CR2基因染色体位置1q32.2，含有21个外显子。该基因编码一种膜蛋白，作为EB病毒与B淋巴细胞和T淋巴细胞结合的受体。CR2是补体激活的调节因子家族，该基因的遗传变异与系统性红斑狼疮9型(SLEB9)的易感性有关。在中国人群中对468例SONFH患者和1224例健康对照组研究了位于CR2基因内的10个标签(SNPs)基因分型。通过10个SNP遗传关联分析及生物信息学分析，结果显示一个内含子SNP，rs311306，与SONFH的风险显著相关。等位基因分析表明，该SNP的C等位基因显著增加了SONFH的发病。此外，3SNP单倍型与SONFH显著相关(rs311306-rs17044576-rs3767933，p＝7.49×10-8)。此外，生物信息学分析表明，rs311306的功能影响有限，但SLC44A2基因编码的蛋白质和CD19、CD81和C3基因编码的蛋白质之间构建了一个复杂的相互作用网络。
已经发现一些自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)和炎症性肠病(IBD)都与ONFH的发生有关。CR2是一种结合补体激活过程中产生的C3降解产物的膜糖蛋白。CR2在正常免疫中有许多重要功能，被认为在自身免疫性疾病的发生发展中起着重要作用。研究CR2基因多态性与SLE患者ONFH的风险相关的研究结果表明，CR2基因5'-UTR(未翻译区)的3个SNP，即rs3813946，内含子1的rs311306，外显子10的rs17615与隐性模式下ONFH的风险增加有关。单倍型也与SLE患者ONFH的风险增加相关。这些发现为CR2参与了韩国SLE患者的ONFH易感性提供了证据。
然而，目前国内外关于ONFH的基因多态性研究领域存在的主要瓶颈问题，零散研究基因位点的资料多，系统研究多基因位点的资料少，不利于多种微效基因联合致病的分子病因学与分子发病机理的阐述。这些瓶颈问题是阐述ONFH分子发病机理的严重束缚，也是ONFH分子病因学的最新成果与临床防治实施对接的关键障碍。
发明内容
本发明联合应用分子技术的创新集成在国内外率先阐述涉及TNF-α基因单核苷酸多态位点rs1800629(A/G)和GREM1基因单核苷酸多态位点rs11632715(G/A)基因分型和等位基因频率和遗传学模型，TNF-α基因单核苷酸多态位点rs1800629(A/G)和rs1800630(C/A)、TGF-β基因单核苷酸多态位点rs8105161(C/T)及CR2基因单核苷酸多态位点rs3813946(T/C)组合之间的交互作用与ONFH发病风险的关联，为建立ONFH的分子水平防治对策提出关键分子靶点，用于ONFH的易感人群筛查及早期干预，促进分子病因学的研究成果与ONFH的临床防治及早对接。
本发明提供了一种检测TNF-α和\或GREM1和\或TGF-β和\或CR2基因与非创伤性股骨头坏死风险性有关的位点或具有交互作用两个位点组合的多态性或等位基因或基因型的物质；所述物质在诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；或所述物质在评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；所述与非创伤性股骨头坏死风险性有关的位点或具有交互作用两个位点为以下(1)至(4)中的任意一个或多个：
(1)GREM1基因rs11632715(G/A)位点；
(2)TNF-α基因rs1800629(G/A)位点；
(3)TNF-α基因rs1800629(G/A)位点与TGF-β基因rs8105161(T/C)位点的组合；
(4)CR2基因rs3813946(T/C)位点与TNF-α基因rs1800630(C/A)位点的组合；
进一步的，所述制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品或制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品中包括记载有如下A至F中至少一种条件的可读性载体：
A.所述rs11632715(G/A)位点为最小纯合基因型GG型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
B.所述rs11632715(G/A)位点最小等位基因G频率低于对照组的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
C.所述rs11632715(G/A)位点显性模型(GG+AGvsAA)相关于降低创伤性股骨头坏死风险性；
D.所述rs1800629(A/G)位点最小等位基因A频率低于对照组的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
E.同时携带所述rs3813946(C/T)位点最小纯合基因型CC型与所述rs1800630(A/C)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低。
F.同时携带所述rs1800629(A/G)最小纯合基因型AA型与所述rs8105161(C/T)最小纯合基因型CC型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加。
进一步的，所述物质为用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于SNP分型方法的试剂。更进一步的，所述SNP分型方法为基于杂交的方法或基于引物延伸的方法或基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。
进一步的，用于检测rs1800629位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对甲或成套单链DNA分子甲；所述引物对甲由SEQIDNO.1所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.2所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子甲由SEQIDNO.1所示的单链DNA、SEQIDNO.2所示的单链DNA和SEQIDNO.3所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs1800630位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对乙或成套单链DNA分子乙；所述引物对乙由SEQIDNO.4所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.5所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子乙由SEQIDNO.4所示的单链DNA、SEQIDNO.5所示的单链DNA和SEQIDNO.6所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs11632715位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丙或成套单链DNA分子丙；所述引物对丙由SEQIDNO.7所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.8所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丙由SEQIDNO.7所示的单链DNA、SEQIDNO.8所示的单链DNA和SEQIDNO.9所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs8105161位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丁或成套单链DNA分子丁；所述引物对丁由SEQIDNO.10所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.11所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丁由SEQIDNO.10所示的单链DNA、SEQIDNO.11所示的单链DNA和SEQIDNO.12所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs3813946位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对戊或成套单链DNA分子戊；所述引物对戊由SEQIDNO.13所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.14所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丁由SEQIDNO.13所示的单链DNA、SEQIDNO.14所示的单链DNA和SEQIDNO.15所示的单链DNA组成。
进一步的，所述预测或辅助预测非创伤性股骨头坏死风险性的产品或所述评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品为试剂盒，所述试剂盒包括所述用于检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关的(1)至(4)位点或具有交互作用的两个位点的组合的单核苷酸多态性的物质。
本发明还提供一种靶向治疗药物，所述药物为以所述与非创伤性股骨头坏死有关的(1)至(4)位点或具有交互作用的位点组合中的任意一个或多个为靶标基因的药物。
进一步的，所述rs1800629位点为人类基因组6号染色体自5'末端起第31575254位核苷酸；所述rs1800629位点的核苷酸为A或G。
进一步的，所述rs1800630位点为人类基因组6号染色体自5'末端起第31574699位核苷酸；所述rs1800630位点的核苷酸为A或C。
进一步的，所述rs11632715位点为人类基因组15号染色体自5'末端起第32712046位核苷酸；所述rs11632715位点的核苷酸为G或A。
进一步的，所述rs8105161位点为人类基因组9号染色体自5'末端起第41333726位核苷酸；所述rs8105161位点的核苷酸为C或T。
进一步的，所述rs3813946(T/C)位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第207454348位核苷酸；所述rs3813946位点的核苷酸为T或C。
本发明中所述待测人的最适人群为中国汉族人群。
本发明的发明人通过中国汉族人群ONFH临床病例对照体系研究，发现TNF-α基因单核苷酸多态位点rs1800629(A/G)最小等位基因A频率显著相关于降低ONFH发病风险；GREM1基因单核苷酸多态位点rs11632715(G/A)单核苷酸多态位点最小纯合基因型GG型及最小等位基因G频率也显著相关于降低ONFH风险；遗传学显性模型也显著相关于降低ONFH风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
本发明还发现CR2基因rs3813946(T/C)与TNF-α基因rs1800630(C/A)之间的交互作用显著相关于降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
本发明还发现TNF-α基因rs1800629(G/A)与TGF-β基因rs8105161(T/C)之间的交互作用显相关于增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
本发明首次阐述了TNF-α、GREM1、TGF-β及CR2基因多态性及组合与ONFH发病风险的关联，可用于ONFH分子预警、分子诊断及治疗药物靶标，对ONFH分子水平防治具有重大价值。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
下述实施例中所用的实验材料及试剂如无特殊说明均可通过商业途径购买。
实施例1、TNF-α、GREM1、TGF-β及CR2基因多态性组合在检测非创伤性股骨头坏死的分子预警、分子诊断及治疗药物靶标中的应用；
一、建立ONFH病例对照研究体系
建立在知情同意基础上，ONFH病例对照研究体系共600例，其中健康对照组300例，ONFH患者组300例。ONFH病例来自于2012年6月至2018年10月期间分别就诊于吉林大学第二、第三临床医学院骨科的住院临床患者，其中男性204例，女性96例，年龄54.49±11.8岁。排除明显髋关节的外伤史和髋关节先天性疾病、髋关节感染性疾病及髋关节肿瘤,按Ficat诊断与分期标准进行ONFH的临床诊断与分期。健康对照组来自2013年11月至2014年3月期间在吉林大学第二临床医学院体检中心的健康体检者，其中男性131名，女性169名，年龄56.5±8.61岁。其空腹血糖、血清甘油三脂及总胆固醇均居于正常人群参考值水平，腹腔脏器超声检查及胸部X线摄片无异常，并排除心脑血管疾病等重大疾病史。以上病例-对照研究体系均为中国汉族人，个体之间无血缘关系。
二、提取外周血白细胞基因组DNA
空腹状态下采集肘静脉血液2ml，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书的规程操作，主要步骤依次为：抗凝血2ml，2000rpm离心10min，取血浆-80℃保存；剩余细胞加入红细胞裂解液A型1ml并轻柔颠倒混匀；10000g室温离心2min，弃上清；将沉淀重悬于500μl的红细胞裂解液A型中，轻柔吹打混匀后，10000g室温离心min，去上清；加入0.6mL溶液A，轻柔吹打混匀,室温作用5min；加入0.2mL氯仿和0.3mL溶液B，立即颠倒混匀；室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5mL塑料离心管；加入0.7ml异丙醇，颠倒混匀5-8次，出现絮状DNA沉淀；加入1mL75％乙醇，13000g离心min，弃上清后空气中挥发乙醇，加入0.2mlTris-EDTA反应溶解DNA；取1μl提取DNA，应用Nanodrop2000检测DNA含量及纯度；将DNA分装，-80℃保存。
三、目标基因及其SNPs的优化筛选
应用Hapmap数据库以及相关文献查询TNF-α、TGF-β、GREM1、CR2基因SNPs，通过多种生物信息库比对各SNPs位点在不同国家、民族、地区人群的分布，尤其在亚洲人群的分布数据，基因多态性的分布符合Hardway平衡，分别在基因编码区、启动子区及内含子及选择5SNPs作为研究的靶位点，所选择的目标基因5SNPs位点见表1。
表1
所述5SNPs序列信息见表2。
表2
四、MassarraySNP分型
(一)引物设计及合成、稀释
1、基因序列的获取：①在Myagena网站中注册成用户；②在NCBI网页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)中输入该SNP位点的名称,按照dbSNPbatchreportor格式显示；③将SNP位点所在序列发送到Myagena网站注册的邮箱中；④在Myagena网站的TOOLS工具栏中选择Genotyping；⑤点击RSformat，在Browse按钮中选择NCBI网站发送到邮箱的文件；⑥网站对序列的格式化完成后在Sentto栏中，选择ProxSNP；⑦开始ProxSNP，点击BeginStart；⑧上述步骤完成后，在Sentto栏中选择PreXTEND；⑨开始ProxSNP，点击BeginStart；⑩在产生的结果中，选择OUTPUT，并把文件内容复制在新的文本文件.txt中。PCR引物序列表信息见表3。
2、采用AssayDesigner3.1软件进行引物设计PCR反应和单碱基扩展引物，并交由生物公司合成：①在软件SNPGroup栏中选择Browse按钮，找到上述产生的txt文件；②在AassyDesign栏中选择SBEMassExtend，并在SBEstopmix栏中选择iPlex，在MμltiplexLevel中按照实际情况选择不同的反应重数；③SNPcapture，Extendprimerdesign，MASSMμltiplexing均选择默认参数；④参数设定后，点击Run；⑤在txt文件目录相应位置找到产生的引物序列文件，5SNPs的PCR引物及测序引物序列见表3。
表3
3、引物稀释：①PCRmastermix引物配置，稀释单管PCRmaster至浓度100μM，加入去离子水混合所有单管PCRmaster使最终反应PCRmastermix浓度为0.5μM；②EXTENDMix引物配置：稀释单管延伸引物至终浓度500μM，加入引物混合后使得各引物浓度为8μM、10μM、15μM。按照DNA合成产品使用说明计算该条引物分子量、质量数和摩尔数，进而根据所需的浓度计算需加入去离子水的量。②将混合好的单管延伸引物根据分子量大小，分别取(小于6300Da)1倍，(6300Da至7200Da)1.2倍，(大于7200Da)1.5倍体积量进行混合待用。
(二)AgenaMassArray系统基因分型步骤
分型原理：通过PCR反应扩增出含有待检SNP位点的目的片段，然后用SAP酶去除PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物，所述TNF-α、GREM1、TGF-β及CR2基因5SNPs引物及测序引物序列表见表3，再加入单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨SNP位点，且与目的片段上的碱基完全互补，采用四种ddNTP替代dNTP，这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。
1、PCR扩增反应
①取1.5mlEP管中配置PCRmastermix，并振荡低速离心，反应组分如下：
ThefinalMgCl2concentrationis3.5mM，1.875mMfromthePCRbufferand1.625mMfromtheMgCl2
②选用8道移液器，在384孔板的每个加样孔中加入4μlPCRmastermix，最后加入1μl模板DNA(20ng/μl)混匀，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。1000rpm离心1minute；③设置如下PCR扩增反应程序：94℃5min；94℃20sec，56℃30sec，72℃1min，45cycles；72℃3min；4℃∞。将PCR反应板放置于PCR仪上，启动程序。
2、产物碱性磷酸酶处理
①在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs；
②在新1.5mlEP管中配制碱性磷酸酶处理反应液，SAPMix反应组分如下：
③将SAPmix加入384孔PCR反应板，对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应总体积为7μl，其中PCR产物5μl，SAPmix2μl；④移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序；⑤设置SAP反应程序：37℃20min；85℃5min；4℃∞。并将384孔反应板放置于PCR仪上，启动程序。
3、单碱基延伸反应
①在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl；
②在新1.5mlEP管中配制单碱基延伸反应液，EXTENDMix反应组分如下：
③将EXTENDMix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系EXTENDMix2μl；SAP+PCRreaction7μl，TotalVolume9μ；④移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序：94℃30sec；[94℃5sec，(52℃5sec，80℃5sec)5cycles]40cycles；4℃∞。
4、树脂纯化
①在384/6MGDimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干；②在384样本板的每个孔中加16μl水；③将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中；④将384样本板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟。
5、芯片点样：启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384-wellSpectroCHIPbioarray上。
6、质谱检测及数据输出：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析，检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果保存入相应存储媒介并递交生物信息室分析。
(三)统计分析；
基因型频率和等位基因频率计算，检验Hardy-Weinberg平衡和MAF，通过PLNK卡方检验比较病例组和对照组之间基因型和等位基因分布情况。
单个SNP关联分析，通过PLNK卡方检验，分析ONFH组和疾病组在每个位点上基因型和等位基因的差异，寻找与疾病相关的位点。
4个SNPs之间的两两交互作用与ONFH发病风险的相关性，通过PLINK软件基因交互作用(上位效应，epistasis)分析完成。
五、实验结果分析
(一)TNF-α、TGF-β、GREM1、CR2基因5SNPs基因分型与ONFH风险的相关性。
测序结果见表4，PLINK卡方分析发现ONFH组GREM1基因rs11632715(G/A)位点最小纯合基因型GG(Minor genotype)频率显著低于对照组，P＝0.01575，也就是说，GREM1基因rs11632715(G/A)位点最小纯合基因型GG型携带者显著降低ONFH发病风险。
表4
*PLINK卡方统计分析
(二)TNF-α、TGF-β、GREM1、CR2基因5SNPs等位基因频率与ONFH发病风险的相关性，测序结果见表5，测序结果发现ONFH组TNF-α基因rs1800629(A/G)位点最小等位基因A(MinorAllele)频率显著低于对照组，P＝0.029；OR(95％CI)：0.566(0.377-0.949)，也就是说，TNF-α基因rs1800629(A/G)位点等位基因A频率显著降低ONFH发病风险,可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
测序结果还发现GREM1基因rs11632715(G/A)位点最小等位基因G(Minor Allele)频率显著低于对照组，P＝0.004；OR(95％CI)：0.874(0.514-0.883)，也就是说，GREM1基因rs11632715(G/A)位点G等位基因频率显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
所述rs11632715位点为人类基因组15号染色体自5'末端起第32712046位核苷酸，所述rs11632715位点的核苷酸为G或A。
表5
*PLINK卡方统计
(三)TNF-α、TGF-β、GREM1、CR2基因5SNPs不同遗传模型与ONFH发病风险的相关性,不同遗传学模型分析结果见表6，发现ONFH组GREM1基因rs11632715(G/A)位点显性模型(GG+AGvsAA)显著低于对照组，P＝0.008，也就是说，GREM1基因rs11632715(G/A)位点最小纯合基因型GG频率显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物
表6
*PLINK卡方统计
(四))TNF-α、TGF-β、CR2基因4SNPs交互作用与ONFH发病风险相关性
应用PLINK软件基因交互作用(上位效应，epistasis)分析方法对rs3813946(T/C)、rs1800630(C/A)、rs1800629(G/A)、rs8105161(T/C)位点的两两交互作用分析。
所述rs3813946位点为人类基因组1号染色体自5'末端起第207454348位核苷酸；所述位点的核苷酸为T或C；所述rs1800630位点为人类基因组6号染色体自5'末端起第31574699位核苷酸；所述位点的核苷酸为C或A；所述rs1800629位点为人类基因组6号染色体自5'末端起第31575254位核苷酸；所述位点的核苷酸为A或G；所述rs8105161位点为人类基因组9号染色体自5'末端起第41333726位核苷酸；所述位点的核苷酸为C或T。
PLINK软件分析基因之交互作用的结果见表7。
表7
*PLINK卡方检验；#PLINK基因交互作用(上位效应,epistasis)分析。
CR2基因rs3813946(C/T)位点与TNF-α基因rs1800630A/C)位点之间的交互作用显著降低ONFH发病风险，OR：0.4673，P＝0.032，见表7中的序号1，也就是说，同时携带CR2基因rs3813946(C/T)位点最小纯合基因型CC型与TNF-α基因rs1800630(A/C)位点最小纯合基因型AA型的个体显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
TNF-α基因rs1800629(A/G)位点与TGF-β基因rs8105161(C/T)位点之间的交互作用显著增高ONFH发病风险，OR：2.827，P＝0.022，见表7中的序号2，也就是说，同时携带TNF-α基因rs1800629(A/G)位点最小纯合基因型AA型与TGF-β基因rs8105161(C/T)位点最小纯合基因型CC型的个体显著增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、分子诊断及治疗药物的靶标。
本发明首次发现TNF-α、TGF-β、CR2基因4SNPs的两两交互作用显著相关于ONFH发病风险，且这些风险相关性与单一SNP对ONFH发病风险所表现的作用部分或完全不同，基因交互作用的结果更清晰地发现了多个SNPs对ONFH风险的协同效应，进一步验证了ONFH是多个微效基因联合引起的复杂病，阐述这些分子遗传学位点的联合效应，对ONFH早期分子预警及分子防控对策建立具有重要价值。基因交互作用，又称上位效应(epistaticeffect)是指影响同一性状的两对非等位基因，其中一对基因(显性或隐性的)抑制(或掩盖)另一对显性基因的作用时所表现的作用。
本领域技术人员将能通过检测SNP位点的任何方法或技术在个体的核酸中进行在本文所公开的SNP标记上存在的核苷酸的分析。例如，一个人能用本发明的方法通过进行Tagman法、质谱法、DNA微阵列法、微测序、杂交、限制性酶切分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-HRM或联合应用上述方法检测SNP位点标记，当然，这一列表仅是示例性的，并且决不用于限制本发明。本领域技术人员可使用任何合适的方法来实现这种检测。
所述风险性降低指的是患非创伤性股骨头坏死的风险性小于其他等位基因或其他基因型或其他遗传学模型的待测人。所述风险性增加指的是患非创伤性股骨头坏死的风险性大于其他等位基因或其他基因型或其他遗传学模型的待测人。
本领域技术人员可使用任何合适的方法来实现这种检测。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> ONFH易感相关TNF-α、GREM1、TGF-β、CR2基因SNP检测物质
<130> 2020
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgttggatg ggtccccaaa agaaatggag 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgttggatg gccactgact gatttgtgtg 30
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctaggctgaa ccccgtcc 18
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgttggatg gagatgtgac cacagcaatg 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acgttggatg ctctacatgg ccctgtcttc 30
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccgccctgt cttcgttaag 20
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgttggatg gacacaagag tgaaaacgtg 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acgttggatg ggcttattta gtcccttccc 30
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gattgatgtc tctgctattt ac 22
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgttggatg ttcactcagg gacccttaac 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acgttggatg tgaggaggtg atgttcagtc 30
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cccttaactc ctaaagcagt g 21
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acgttggatg tatttaaggg cccgcctctc 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acgttggatg atgcgttccg agacccgcga 30
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tggcgcacag ctgcttgctg ctccagcc 28

Claims (6)

1.用于检测（1）中位点，和（2）中位点，和（3）中位点组合，和（4）中位点组合的单核苷酸多态性的物质在制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死的产品中的应用，或在制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；
（1）GREM1基因rs11632715（G/A）位点；
（2）TNF-α基因rs1800629（G/A）位点；
（3）TNF-α基因rs1800629（G/A）位点与TGF-β基因rs8105161（T/C）位点的组合；
（4）CR2基因rs3813946（T/C）位点与TNF-α基因rs1800630（C/A）位点的组合。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断或辅助诊断待测人患非创伤性股骨头坏死风险性的产品，或评价或辅助评价待测人患非创伤性股骨头坏死风险性的产品中包括记载有如下A至F中条件的可读性载体：
所述rs11632715（G/A）位点为最小纯合基因型GG型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
所述rs11632715（G/A）位点最小等位基因G频率低于对照组的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
所述rs11632715（G/A）位点显性模型（GG+AGvsAA）相关于降低创伤性股骨头坏死风险性；
所述rs1800629（A/G）位点最小等位基因A频率低于对照组的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
同时携带所述rs3813946（C/T）位点最小纯合基因型CC型与所述rs1800630（A/C）位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
同时携带所述rs1800629（A/G）最小纯合基因型AA型与所述rs8105161（T/C）最小纯合基因型CC型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述物质为用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于SNP分型方法的试剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述SNP分型方法为基于杂交的方法或基于引物延伸的方法或基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于：
用于检测rs1800629位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对甲或成套单链DNA分子甲；所述引物对甲由SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子甲由SEQ ID NO.1所示的单链DNA、SEQ ID NO.2所示的单链DNA和SEQ ID NO.3所示的单链DNA组成；
用于检测rs1800630位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对乙或成套单链DNA分子乙；所述引物对乙由SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子乙由SEQ ID NO.4所示的单链DNA、SEQ ID NO.5所示的单链DNA和SEQ ID NO.6所示的单链DNA组成；
用于检测rs11632715位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丙或成套单链DNA分子丙；所述引物对丙由SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丙由SEQ ID NO.7所示的单链DNA、SEQ ID NO.8所示的单链DNA和SEQ ID NO.9所示的单链DNA组成；
用于检测rs8105161位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丁或成套单链DNA分子丁；所述引物对丁由SEQ ID NO.10所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.11所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丁由SEQ ID NO.10所示的单链DNA、SEQ ID NO.11所示的单链DNA和SEQ ID NO.12所示的单链DNA组成；
用于检测rs3813946位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对戊或成套单链DNA分子戊；所述引物对戊由SEQ ID NO.13所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.14所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丁由SEQ ID NO.13所示的单链DNA、SEQ ID NO.14所示的单链DNA和SEQ ID NO.15所示的单链DNA组成。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品或所述评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品为试剂盒，所述试剂盒包括所述用于检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关的（1）至（4）位点组合的单核苷酸多态性的物质。
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