CN112410413A - Onfh易感相关vdr、mmp2、mmp3、mmp9基因snp的检测物质及应用 - Google Patents

Onfh易感相关vdr、mmp2、mmp3、mmp9基因snp的检测物质及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了MMP3、MMP9、MMP2、VDR基因11SNPs标志物或标志物的组合用于ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。11SNPs的两两交互作用显著相关于ONFH发病风险，且这些风险相关性与单一SNP对ONFH发病风险所表现的作用部分或完全不同，基因交互作用的结果更清晰地发现了多个SNPs对ONFH风险的协同效应，进一步验证了ONFH是多个微效基因联合引起的复杂病，阐述这些分子遗传学位点的联合效应，对ONFH早期分子预警及分子防控对策建立具有重要价值。

Description

ONFH易感相关VDR、MMP2、MMP3、MMP9基因SNP的检测物质及 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及MMP3基因单核苷酸多态位点 rs650108、rs679620、rs522616，MMP9基因单核苷酸多态位点rs17576、 rs3918249、rs3918241、rs2274755，MMP2基因单核苷酸多态位点rs243847、 rs243832、rs14070及VDR基因单核苷酸多态位点rs731236标志物或标志物的组合在制备诊断或辅助诊断、制备评价或辅助评价待测人患ONFH风险性产品中的应用，进一步用于ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
背景技术
股骨头坏死(osteonecrosisofthefemoralhead，ONFH)是由遗传因素与环境因素共同作用引起的复杂性疾病。在近10多年来，ONFH的发病率呈现逐年增加的趋势。据估计在美国年均20000～30000位患者被新诊断为ONFH，在中国每年新增ONFH病例为150000～200000，而且目前中国成年人ONFH患者812 万人，主要发病群体为40岁至50岁之间的青壮年，致残率高，导致严重社会与家庭经济负担，是目前人类健康面临主要挑战之一。及早发现ONFH遗传学分子诊断标志物进而实施早期分子预警，使其防治时段前移，是降低ONFH发病率的关键。
基质金属蛋白酶(MMP)家族的蛋白质参与正常生理过程中细胞外基质的分解，如胚胎发育、生殖和组织重塑，以及疾病过程，如关节炎和肿瘤转移。大多数MMP是作为不活跃的前体蛋白分泌的，当被细胞外蛋白酶裂解时，这些前体蛋白被激活。
基质金属蛋白酶/金属蛋白酶组织抑制剂(MMPs/TIMPs)系统在ONFH的发生发展中起着重要作用。近年来，越来越多的学者发现激素性ONFH的发病与MMPs/TIMPs系统等易感因素有关，例如以下：
一、关于MMP3基因；
MMP3基因染色质位置11q22.2，含有10个外显子。该基因编码一种酶，可降解纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原III、IV、IX和X以及软骨蛋白多糖。这种酶被认为与伤口修复、动脉粥样硬化的进展和肿瘤的发生有关。该基因是定位于染色体11q22.2的MMP基因簇的一部分。一项探讨MMP3多态性与ONFH在中国人群中的相关性研究以585例ONFH患者和507例健康对照者为研究对象，从MMPs/TIMPs系统中筛选出两个基因的8SNPs。通过卡方检验、遗传模型分析、单倍型分析和分层分析风险系数(OR)和95％置信区间(CI)。发现rs650108 及rs522616的次要等位基因是一个风险等位基因。在遗传模型分析中还观察到两个易感性SNPs，即rs650108显性模型和加性模型相关于降低ONFH风险， rs522616隐性模型和加性模型相关于增加ONFH风险。结果证实了MMP3基因变异对中国北方人群ONFH易感性的影响。
另一项研究探讨了299例ONFH组和396例对照组的MMP3和MMP8单核苷酸多态性与酒精性ONFH的关系。在等位基因模型中，MMP3基因rs650108位点的次要等位基因与酒精诱导的ONFH风险降低相关。在调整了年龄的遗传模型中，rs650108在显性模型和对数加性模型与酒精诱导的ONFH风险降低相关； MMP8基因rs2012390位点显性模型和对数加性模型也与ONFH风险降低相关。单倍型分析显示CGATATGT与降低酒精诱导的ONFH风险相关。因此，中国男性MMP3基因rs650108位点和MMP8基因rs2012390位点相关于降低酒精诱导的 ONFH风险，而MMP8基因rs11225394位点相关于增加酒精诱导的ONFH风险。
二、关于MMP9基因；
腰椎间盘突出症(LDH)是骨科常见病、多发病，具有很强的遗传决定因素。椎间盘细胞外基质的破坏在LDH的发生发展中起着关键作用，提示异常的基质金属蛋白酶可能促进了椎间盘基质的降解。MMP9是MMP家族的重要成员，是LDH易感基因的候选基因，染色质位置20q13.12，含有13个外显子。该基因编码的酶降解IV型和V型胶原。
对恒河猴的研究表明该酶参与了IL-8诱导的骨髓造血祖细胞的动员，而小鼠的研究表明这种酶在肿瘤相关组织重塑中起作用。MMP9基因多态性与 ONFH相关性尚未查到文献报道。但已经证明MMP9参与骨重建过程。研究还表明MMP9启动子-1562C-->T多态性影响基因转录。在1114名日本男性和1087 名女性中检测了这种多态性与骨密度(BMD)的可能关系。在CT或TT基因型男性联合组或CT基因型男性中，全身、腰椎、股骨颈、转子或Ward's三角的BMD 显著低于CC基因型男性。在绝经前和绝经后妇女中，MMP9基因型的骨密度没有显著差异。因此，MMP9的-1562C-->T的多态性与外周骨密度有关。
另一项研究探讨MMP-9基因的常见变异与LDH的风险、严重程度和临床特征变量的关系。对845例患者和1751例健康对照者进行了完全覆盖MMP9基因的 14TagSNPs单核苷酸多态性分析，结果显示rs17576位点与LDH易感性显著相关，单倍型分析也证实了相关于LDH易感性。结果说明MMP9基因位点rs17576的A 等位基因平均降低了23％的LDH风险，MMP9基因rs17576位点的G等位基因与更严重的椎间盘退变相关。这个结果为MMP9基因在LDH发病机制中的重要作用提供了新的证据。
三、关于MMP2和MMP10基因；
为了评估MMP基因超家族与酒精性ONFH的相关性，以308例对照组，300 例酒精性ONFH患者为病例组，从MMPs中筛选出23个SNPs，并进行卡方检验、 Fisher精确检验、t检验和遗传模型分析。结果表明在等位基因模型和对数加性模型中，MMP2基因rs243849位点分别为1.355(1.014-1.811)、1.34(1.01-1.78)。但按性别和年龄调整后没有观察到统计学结果。酒精性ONFH在所有ONFH患者中所占比例为30.7％，中国大陆ONFH患者中男性占70.1％。
MMP2基因编码MMP2酶，染色质位置16q12.2，含有17个外显子，该基因是基质金属蛋白酶基因家族的一员，该基因编码的蛋白质是一种明胶酶A，IV 型胶原酶，也是一种锌依赖性酶，能够切割细胞外基质成分和参与信号转导的分子，能促进破骨细胞迁移、附着和骨基质降解，在其催化位点包含三个纤维连接蛋白II重复序列，允许变性的IV型和V型胶原与弹性蛋白结合。与大多数 MMP家族成员不同，这种蛋白的激活可以发生在细胞膜上。这种酶可以在细胞外被蛋白酶激活，或者在细胞内通过S-谷胱甘肽化而激活，而不需要蛋白质水解去除pro结构域。这种蛋白被认为与多种通路有关，包括在神经系统中的作用、子宫内膜经期破裂、血管化调控和转移。该基因突变与结节性关节病骨溶解 (NAO)综合征有关。
一项病例对照研究探讨MMP2与酒精性ONFH的关系。共有299名酒精性 ONFH患者和396名健康对照者被纳入病例对照研究。利用Pearsonχ检验和无条件logistic回归分析，对MMP2基因5个SNPs进行基因分型，并检验它们与酒精诱发ONFH的风险和治疗反应的相关性。确定了3个携带者的风险等位基因： rs243849位点等位基因“T”在等位基因模型、未调整的对数加性模型和调整年龄的对数加性模型中增加了酒精性ONFH风险。相反，rs7201位点中的“CC”基因型和rs243832位点的“CC”基因型降低了酒精性ONFH风险。MMP2基因的“TT”单倍型在酒精性ONFH患者中更为常见。MMP2可能与中国北方男性酒精性 ONFH的发生有关。
另一项探讨中国汉族人群MMP2和MMP10基因多态性与类固醇诱导的 ONFH相关性研究，应用Agena-MassARRAYRS1000系统对286例激素性ONFH 患者和309例健康对照者进行MMP2和MMP10基因多态性分型。通过卡方检验、遗传模型分析、单倍型分析和分层分析，结果发现MMP10基因rs470154位点微小等位基因T频率与激素性ONFH风险增加相关。在遗传模型分析中，发现 MMP2基因rs2241146位点和MMP10基因rs470154位点与激素性ONFH风险增加有关。6个SNPs(rs470154、rs243866、rs243864、rs865094、rs11646643和rs2241146) 与不同临床表型显著相关。从而证实了MMP2和MMP10基因的遗传多态性与激素性ONFH易感性有关，为MMP2和MMP10在ONFH发病机制中的作用提供了新的见解。
四、关于VDR基因；
骨质疏松症是一种以骨密度降低为特征的全身性骨骼疾病。维生素D代谢可能在其病理生理学中起着关键作用。在一个健康沙特女性人群中，确定VDR 基因多态性与骨密度的关系，以及与骨转换生化标志物的关系。在沙特阿拉伯王国麦地那地区泰巴大学进行横断面研究。
VDR基因染色体位置12q13.11，含有12个外显子，编码维生素D3受体，是配体诱导转录因子核激素受体超家族成员，这种受体也可以作为次级胆汁酸，石胆酸的受体。维生素D3受体的下游靶点主要参与矿物质代谢，尽管该受体调节多种其他代谢途径，如参与免疫反应和癌症的代谢途径。该基因突变与II型维生素D抵抗性佝偻病有关。起始密码子的单核苷酸多态性导致下游三个密码子交替翻译起始位点。另外，该基因编码不同亚型的剪接转录变体已经被描述。 VDR基因多态性与ONFH风险相关性尚未见报道。而VDR基因多态性与绝经后骨质疏松症(PMOP)易感性和骨密度(BMD)的关系研究结果也不均衡。
一项研究的总体结果显示，VDR-ApaI、VDR-FokI与PMOP敏感性之间存在显著相关性。亚组分析显示VDR-ApaI多态性显著降低了高加索绝经后妇女骨质疏松的风险。在亚洲人群中，VDR-BsmI和VDR-FokI与PMOP风险增加相关。而VDR多态性与骨密度的关系显示携带ApaI-AA基因型的白种人PMOP女性股骨颈骨密度高，而FokI-Ff基因型的白种人PMOP女性股骨颈骨密度低。与GG基因型PMOP女性相比，Cdx2-GA基因型的PMOP女性在整体和白人人群中腰椎骨密度较低。不同VDR基因多态性对PMOP风险和BMD有不同的影响。
另一项研究采集300名受试者血样，测定钙、磷、碱性磷酸酶、甲状旁腺激素骨钙素和1，25-OH2D3，并对VDR基因位点rs2228570、rs731236和rs11568820 基因分型。结果显示VDR基因位点rs2228570的CC、CT、TT基因分型之间存在显著差异。携带TT等位基因与骨密度降低的风险增加和维生素D3水平较低的骨质减少有关。VDR基因rs731236位点为CC等位基因携带者有显著的骨质疏松风险。rs11568820位点的AA基因型表现出较低的体力活动水平、骨密度、Z评分、血清骨钙素、磷和甲状旁腺激素水平。VDR基因rs2228570位点的TT等位基因和CC基因型的rs731236等位基因与骨质疏松、骨密度降低以及维生素D功能紊乱有关。
上述这些遗传分子病因学研究结果清晰地提示，ONFH属于多个微效基因联合参与并由环境因素诱导的复杂病，ONFH分子发病机理的重要研究进展是陆续提出了多系列基因多态性与ONFH的发病风险相关，它们或者与另外一些基因形成连锁不平衡共同影响ONFH的发病，或者影响其它易感基因的表达功能，在ONFH的发生发展中起协同作用。
然而，目前国内外关于ONFH的基因多态性研究领域存在的主要瓶颈问题，零散研究基因位点的资料多，系统研究多基因位点的资料少，不利于多种微效基因联合致病的分子病因学与分子发病机理的阐述。这些瓶颈问题是阐述 ONFH分子发病机理的严重束缚，也是ONFH分子病因学的最新成果与临床防治实施对接的关键障碍。
发明内容
针对目前国内外关于ONFH的基因多态性研究领域存在的主要瓶颈问题，本发明率先阐述MMP3基因单核苷酸多态位点rs650108(G/A)、rs679620(T/C)、 rs522616(C/T)，MMP9基因单核苷酸多态位点rs17576(A/G)、rs3918249(T/C)、 rs3918241(A/T)、rs2274755(T/G)，MMP2基因单核苷酸多态位点rs243847 (C/T)、rs243832(C/G)、rs14070(T/C)，VDR基因单核苷酸多态位点rs731236 (A/G)基因分型、等位基因频率、基因-基因交互作用与ONFH发病风险的关联，为建立ONFH的分子水平防治对策提出关键分子靶点，用于ONFH的易感人群筛查及早期干预，促进分子病因学的研究成果与ONFH的临床防治及早对接，在非创伤性股骨头坏死分子预警、分子诊断及治疗药物靶标中具有重要应用价值。
本发明提供了一种检测物质，所述物质用于检测VDR和\或MMP2和\或 MMP3和\或MMP9基因的与非创伤性股骨头坏死风险性有关的位点或具有交互作用两个位点组合的多态性或等位基因或基因型；所述物质在诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；或所述物质在评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；所述的与非创伤性股骨头坏死风险性有关的位点或具有交互作用两个位点组合为以下(1)至(13)中的任意一个或多个：
(1)VDR基因rs731236(A/G)位点；
(2)MMP2基因rs243832(C/G)位点；
(3)MMP2基因rs14070(T/C)位点；
(4)MMP2基因rs243847(C/T)位点与MMP3基因rs522616(C/T)位点的组合；
(5)MMP2基因rs243832(C/G)位点与MMP9基因rs3918249(T/C) 位点的组合；
(6)MMP2基因rs243832(C/G)位点与MMP9基因rs17576(A/G)位点的组合；
(7)MMP3基因rs650108(G/A)位点与MMP9基因rs17576(A/G)位点的组合；
(8)MMP3基因rs679620(T/C)位点与MMP9基因rs17576(A/G)位点的组合；
(9)VDR基因rs731236(A/G)位点与MMP2基因rs243832(C/G)位点的组合；
(10)MMP2基因rs14070(T/C)位点与MMP2基因rs243832(C/G)位点的组合；
(11)MMP9基因rs3918241(A/T)位点与MMP9基因rs17576(A/G) 位点的组合；
(12)MMP9基因rs3918249(T/C)位点与MMP9基因rs2274755(T/G) 位点的组合；
(13)MMP9基因rs2274755(T/G)位点与MMP9基因rs17576(A/G) 位点的组合。
进一步的，所述物质为制备预测或辅助预测非创伤性股骨头坏死风险性的产品，或所述物质为制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品，所述产品中包括记载有如下A至M中至少一种条件的可读性载体：
A.所述rs731236(A/G)最小等位基因G频率低于对照组的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
B.所述rs243832(C/G)位点遗传学显性模型(CC+CGvsGG)相关于降低创伤性股骨头坏死风险性；
C.所述rs14070(T/C)位点遗传学显性模型(TT+TCvsCC)相关于降低创伤性股骨头坏死风险性；
D.同时携带所述rs243847(C/T)位点最小纯合基因型CC型与所述rs522616 (C/T)位点最小纯合基因型CC型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
E.同时携带所述rs243832(C/G)位点最小纯合基因型CC型与所述 rs3918249(T/C)位点最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
F.同时携带所述rs243832(C/G)位点最小纯合基因型CC型与所述rs17576 (A/G)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
G.同时携带所述rs650108(G/A)位点最小纯合基因型GG型与所述rs17576(A/G)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
H.同时携带所述rs679620(T/C)位点最小纯合基因型TT型与所述rs17576 (A/G)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
I.同时携带所述rs731236(A/G)位点最小纯合基因型AA型与所述rs243832 (C/G)位点最小纯合基因型CC型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
J.同时携带rs14070(T/C)位点最小纯合基因型TT型与所述rs243832(C/G) 位点最小纯合基因型CC型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
K.同时携带rs3918241(A/T)位点最小纯合基因型AA型与所述rs17576 (A/G)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
L.同时携带rs3918249(T/C)位点最小纯合基因型TT型与所述rs2274755 (T/G)位点最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
M.同时携带rs2274755(T/G)位点最小纯合基因型TT型与所述rs17576 (A/G)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加。
进一步的，所述rs731236位点为人类基因组12号染色体自5'末端起第 47844974位核苷酸；所述rs731236位点的核苷酸为A或G。所述rs243832位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第55505279位核苷酸；所述rs243832 位点的核苷酸为C或G。所述rs14070位点为人类基因组16号染色体自5'末端起55502815位核苷酸；所述rs14070位点的核苷酸为T或G。所述rs243847 位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第55490086位核苷酸；所述rs243847 位点的核苷酸为C或T。所述rs522616位点为人类基因组11号染色体自5'末端起第102844317位核苷酸；所述rs522616位点的核苷酸为C或T。所述 rs3918249位点为人类基因组20号染色体自5'末端起第46009497位核苷酸；所述rs3918249位点的核苷酸为T或C。所述rs17576位点为人类基因组20号染色体自5'末端起第46011586位核苷酸；所述rs17576位点的核苷酸为A或G。所述rs650108位点为人类基因组11号染色体自5'末端起第102838056位核苷酸；所述rs650108位点的核苷酸为T或C。所述rs679620位点为人类基因组 11号染色体自5'末端起第102842889位核苷酸；所述rs67962位点的核苷酸为 G或A。所述rs3918241位点为人类基因组20号染色体自5'末端起第46007096 位核苷酸；所述rs3918241位点的核苷酸为A或T。所述rs2274755位点为人类基因组20号染色体自5'末端起第460110531位核苷酸；所述rs2274755位点的核苷酸为T或G。
进一步的，所述物质为用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种SNP分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。
进一步的，所述用于检测rs731236位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对甲或成套单链DNA分子甲，所述引物对甲由SEQIDNO.1所示的单链 DNA分子组成和SEQIDNO.2所示的单链DNA分子组成，所述成套单链DNA 分子甲由SEQIDNO.1所示的单链DNA、SEQIDNO.2所示的单链DNA和 SEQIDNO.3所示的单链DNA组成。
进一步的，所述用于检测rs243832位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对乙或成套单链DNA分子乙，所述引物对乙由SEQIDNO.4所示的单链 DNA分子组成和SEQIDNO.5所示的单链DNA分子组成，所述成套单链DNA 分子乙由SEQIDNO.4所示的单链DNA、SEQIDNO.5所示的单链DNA和 SEQIDNO.6所示的单链DNA组成。
进一步的，所述用于检测rs14070位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丙或成套单链DNA分子丙，所述引物对丙由SEQIDNO.7所示的单链DNA 分子组成和SEQIDNO.8所示的单链DNA分子组成，所述成套单链DNA分子丙由SEQIDNO.7所示的单链DNA、SEQIDNO.8所示的单链DNA和 SEQIDNO.9所示的单链DNA组成。
进一步的，所述用于检测rs243847位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丁或成套单链DNA分子丁，所述引物对丁由SEQIDNO.10所示的单链 DNA分子组成和SEQIDNO.11所示的单链DNA分子组成，所述成套单链DNA 分子丁由SEQIDNO.10所示的单链DNA、SEQIDNO.11所示的单链DNA和 SEQIDNO.12所示的单链DNA组成。
进一步的，所述用于检测rs522616位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对戊或成套单链DNA分子戊，所述引物对戊由SEQIDNO.13所示的单链 DNA分子组成和SEQIDNO.14所示的单链DNA分子组成，所述成套单链DNA 分子丁由SEQIDNO.13所示的单链DNA、SEQIDNO.14所示的单链DNA和 SEQIDNO.15所示的单链DNA组成。
进一步的，所述用于检测rs3918249位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对己或成套单链DNA分子己，所述引物对己由SEQIDNO.16所示的单链 DNA分子组成和SEQIDNO.17所示的单链DNA分子组成，所述成套单链DNA 分子己由SEQIDNO.16所示的单链DNA、SEQIDNO.17所示的单链DNA和 SEQIDNO.18所示的单链DNA组成。
进一步的，所述用于检测rs17576的单核苷酸基因多态性的物质为引物对庚或成套单链DNA分子庚，所述引物对庚由SEQIDNO.19所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.20所示的单链DNA分子组成，所述成套单链DNA分子庚由SEQIDNO.19所示的单链DNA、SEQIDNO.20所示的单链DNA和 SEQIDNO.21所示的单链DNA组成。
进一步的，所述用于检测rs650108位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对辛或成套单链DNA分子辛，所述引物对辛由SEQIDNO.22所示的单链 DNA分子组成和SEQIDNO.23所示的单链DNA分子组成，所述成套单链DNA 分子辛由SEQIDNO.22所示的单链DNA、SEQIDNO.23所示的单链DNA和 SEQIDNO.24所示的单链DNA组成。
进一步的，所述用于检测rs679620位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对壬或成套单链DNA分子壬，所述引物对壬由SEQIDNO.25所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.26所示的单链DNA分子组成，所述成套单链DNA 分子壬由SEQIDNO.25所示的单链DNA、SEQIDNO.26所示的单链DNA和 SEQIDNO.27所示的单链DNA组成。
进一步的，所述用于检测rs3918241位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对癸或成套单链DNA分子癸，所述引物对癸由SEQIDNO.28所示的单链 DNA分子组成和SEQIDNO.29所示的单链DNA分子组成，所述成套单链DNA 分子癸由SEQIDNO.28所示的单链DNA、SEQIDNO.29所示的单链DNA和 SEQIDNO.30所示的单链DNA组成。
进一步的，所述用于检测rs2274755位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对子或成套单链DNA分子子，所述引物对子由SEQIDNO.31所示的单链 DNA分子组成和SEQIDNO.32所示的单链DNA分子组成，所述成套单链DNA 分子子由SEQIDNO.31所示的单链DNA、SEQIDNO.32所示的单链DNA和 SEQIDNO.33所示的单链DNA组成。
进一步的，所述预测或辅助预测非创伤性股骨头坏死风险性的产品或所述评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品为试剂盒，所述试剂盒包括所述用于检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关的(1)至(13)位点或位点组合的单核苷酸多态性的物质。
所述试剂盒中包括用于检测所述rs731236(A/G)位点的单核苷酸基因多态性的物质、用于检测所述rs243832(C/G)位点的单核苷酸基因多态性的物质、用于检测所述rs14070(T/C)位点的单核苷酸基因多态性的物质、用于检测所述rs243847(C/T)位点的单核苷酸基因多态性的物质、用于检测所述 rs522616(C/T)位点的单核苷酸基因多态性的物质、用于检测所述rs3918249 (T/C)位点的单核苷酸基因多态性的物质、用于检测所述rs17576(A/G)位点的单核苷酸基因多态性的物质、用于检测所述rs650108(G/A)位点的单核苷酸基因多态性的物质、用于检测所述rs679620(T/C)位点的单核苷酸基因多态性的物质、用于检测所述rs3918241(A/T)位点的单核苷酸基因多态性的物质、用于检测所述rs2274755(T/G)位点的单核苷酸基因多态性的物质。
本发明还提供一种靶向治疗药物，所述药物为以所述与非创伤性股骨头坏死有关的(1)至(13)位点或具有交互作用的位点组合中的任意一个或多个为靶标基因的药物。
本发明中所述待测人的最适人群为中国汉族人群。
本发明中通过中国汉族人群ONFH临床病例对照体系研究，本发明的发明人通过中国汉族人群ONFH临床病例对照体系研究，通过中国汉族人群ONFH 临床病例对照体系研究，首次阐述了所述11SNPs与ONFH发病风险的关联，对ONFH分子预警及分子水平防治具有重大价值，具体如下：
(1)发现VDR基因单核苷酸多态位点rs731236(A/G)最小等位基因G 频率显著相关于降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
(2)发现MMP2基因单核苷酸多态位点rs243832(C/G)遗传学显性模型 (CC+CGvsGG)显著相关于减低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物；
(3)发现MMP2基因单核苷酸多态位点rs14070(T/C)遗传学显性模型 (TT+TCvsCC)显著相关于减低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物；
(4)发现MMP2基因rs243847(C/T)与MMP3基因rs522616(C/T)之间的交互作用显著相关于降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物；
(5)发现MMP2基因rs243832(C/G)与MMP9基因rs3918249(T/C) 之间的交互作用显著相关于降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物；
(6)发现MMP2基因rs243832(C/G)与MMP9基因rs17576(A/G)之间的交互作用显著相关于降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物；
(7)发现MMP3基因rs650108(G/A)与MMP9基因rs17576(A/G)之间的交互作用亦显著增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标；
(8)发现MMP3基因rs679620(T/C)与MMP9基因rs17576(A/G)之间的交互作用亦显著增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标；
(9)发现VDR基因rs731236(A/G)与MMP2基因rs243832(C/G)之间的交互作用显著相关于增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标；
(10)发现MMP2基因rs14070(T/C)与MMP2基因rs243832(C/G)之间的交互作用显著相关于增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标；
(11)发现MMP9基因rs3918241(A/T)与MMP9基因rs17576(A/G) 之间的交互作用显著增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标；
(12)发现MMP9基因rs3918249(T/C)与MMP9基因rs2274755(T/G) 之间的交互作用显著增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标；
(13)发现MMP9基因rs2274755(T/G)与MMP9基因rs17576(A/G) 之间的交互作用也显著相关于增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
本发明涉及MMP3基因单核苷酸多态位点rs650108、rs679620、rs522616， MMP9基因单核苷酸多态位点rs17576、rs3918249、rs3918241、rs2274755， MMP2基因单核苷酸多态位点rs243847、rs243832、rs14070及VDR基因单核苷酸多态位点rs731236标志物或标志物的组合在制备诊断或辅助诊断、制备评价或辅助评价待测人患ONFH风险性产品中的应用，进一步用于ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
下述实施例中所用的实验材料及试剂如无特殊说明均可通过商业途径购买。
实施例1.VDR，MMP2，MMP3，MMP9基因多态性组合在检测非创伤性股骨头坏死的分子预警、分子诊断及治疗药物靶标中的应用。
一、建立ONFH病例对照研究体系
建立在知情同意基础上，ONFH病例对照研究体系共600例，其中健康对照组300例，ONFH患者组300例。
ONFH病例来自于2012年6月至2018年10月期间分别就诊于吉林大学第二和第三临床医学院骨科的住院临床患者，其中男性204例，女性96例，年龄 54.49±11.8岁。排除明显髋关节的外伤史和髋关节先天性疾病、髋关节感染性疾病及髋关节肿瘤，按Ficat诊断与分期标准进行ONFH的临床诊断与分期。
健康对照组来自2013年11月至2014年3月期间在吉林大学第二临床医学院体检中心的健康体检者，其中男性131名，女性169名，年龄56.5±8.61岁。其空腹血糖、血清甘油三脂及总胆固醇均居于正常人群参考值水平，腹腔脏器超声检查及胸部X线摄片无异常，并排除心脑血管疾病等重大疾病史。
以上病例-对照研究体系均为中国汉族人，个体之间无血缘关系。
二、提取外周血白细胞基因组DNA
空腹状态下采集肘静脉血液2ml，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书的规程操作，主要步骤依次为：抗凝血2ml，2000rpm离心10min，取血浆-80℃保存；剩余细胞加入红细胞裂解液A型1ml并轻柔颠倒混匀；10000g室温离心2min，弃上清；将沉淀重悬于500μl的红细胞裂解液A型中，轻柔吹打混匀后，10000g室温离心min，去上清；加入0.6mL溶液A，轻柔吹打混匀，室温作用5min；加入0.2mL氯仿和0.3mL溶液B，立即颠倒混匀；室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5mL塑料离心管；加入0.7ml异丙醇，颠倒混匀 5-8次，出现絮状DNA沉淀；加入1mL75％乙醇，13000g离心min，弃上清后空气中挥发乙醇，加入0.2mlTris-EDTA反应溶解DNA；取1μl提取DNA，应用Nanodrop2000检测DNA含量及纯度；将DNA分装，-80℃保存。
三、目标基因及其SNPs的优化筛选
应用Hapmap数据库以及相关文献查询VDR、MMP2、MMP3、MMP9基因的SNPs，通过多种生物信息库比对各SNPs位点在不同国家、民族、地区人群的分布，尤其在亚洲人群的分布数据，基因多态性的分布符合Hardway平衡，分别在基因编码区、启动子区及内含子及选择11SNPs作为研究的靶位点，所选择的目标基因11SNPs位点见表1。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述VDR、MMP2、MMP3、MMP9基因11SNPs序列信息见表2。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE002
四、MassarraySNP分型
(一)引物设计及合成、稀释
1.基因序列的获取：
①在Myagena网站中注册成用户；
②在NCBI网页(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)中输入该SNP 位点的名称，按照dbSNPbatchreportor格式显示；
③将SNP位点所在序列发送到Myagena网站注册的邮箱中；
④在Myagena网站的TOOLS工具栏中选择Genotyping；
⑤点击RSformat，在Browse按钮中选择NCBI网站发送到邮箱的文件；
⑥网站对序列的格式化完成后在Sentto栏中，选择ProxSNP；
⑦开始ProxSNP，点击BeginStart；
⑧上述步骤完成后，在Sentto栏中选择PreXTEND；
⑨开始ProxSNP，点击BeginStart；
⑩在产生的结果中，选择OUTPUT，并把文件内容复制在新的文本文件.txt 中。
2.采用AssayDesigner3.1软件进行引物设计PCR反应和单碱基扩展引物，并交由生物公司合成：
①在软件SNPGroup栏中选择Browse按钮，找到上述产生的txt文件；
②在AassyDesign栏中选择SBEMassExtend，并在SBEstopmix栏中选择 iPlex，在MμltiplexLevel中按照实际情况选择不同的反应重数；
③SNPcapture，Extendprimerdesign，MASSMμltiplexing均选择默认参数；
④参数设定后，点击Run；
⑤在txt文件目录相应位置找到产生的引物序列文件，MMP3、MMP9、MMP2、VDR基因11SNPsPCR引物及测序引物序列见表3。
表3
Figure BDA0002709809370000191
3.引物稀释：
PCRmastermix引物配置，稀释单管PCRmaster至浓度100μM，加入去离子水混合所有单管PCRmaster使最终反应PCRmastermix浓度为0.5μM；
EXTENDMix引物配置：稀释单管延伸引物至终浓度500μM，加入引物混合后使得各引物浓度为8μM、10μM、15μM。按照DNA合成产品使用说明计算该条引物分子量、质量数和摩尔数，进而根据所需的浓度计算需加入去离子水的量。
将混合好的单管延伸引物根据分子量大小，分别取(小于6300Da)1倍， (6300Da至7200Da)1.2倍，(大于7200Da)1.5倍体积量进行混合待用。
(二)AgenaMassArray系统基因分型步骤
分型原理：通过PCR反应扩增出含有待检SNP位点的目的片段，然后用 SAP酶去除PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物，所述 PPARγ、CEBPA、CREBBPPCR引物及测序引物序列表见表3，再加入单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨SNP位点，且与目的片段上的碱基完全互补，采用四种ddNTP替代dNTP，这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。
1.PCR扩增反应：
①取1.5mlEP管中配置PCRmastermix，并振荡低速离心，反应组分如下：
Figure BDA0002709809370000201
ThefinalMgCl2concentrationis3.5mM，1.875mMfromthePCRbufferand1.625mMfromtheMgCl2
②选用8道移液器，在384孔板的每个加样孔中加入4μlPCRmastermix，最后加入1μl模板DNA(20ng/μl)混匀，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。1000rpm离心1minute；③设置如下PCR 扩增反应程序：94℃5min；94℃20sec，56℃30sec，72℃1min，45cycles；72℃ 3min；4℃∞。将PCR反应板放置于PCR仪上，启动程序。
2.产物碱性磷酸酶处理：
①在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs；
②在新1.5mlEP管中配制碱性磷酸酶处理反应液，SAPMix反应组分如下：
Figure BDA0002709809370000211
③将SAPmix加入384孔PCR反应板，对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应总体积为7μl，其中PCR产物5μl，SAPmix2μl；④移液完成后，小心盖上 384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序；⑤设置SAP反应程序：37℃20min；85℃5min；4℃∞。并将384 孔反应板放置于PCR仪上，启动程序。
3.单碱基延伸反应：
①在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl；
②在新1.5mlEP管中配制单碱基延伸反应液，EXTENDMix反应组分如下：
Figure BDA0002709809370000212
③将EXTENDMix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系EXTENDMix2μl；SAP+PCRreaction7μl，TotalVolume9μ；④移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序：94℃30sec；[94℃5sec，(52℃5sec，80℃5sec) 5cycles]40cycles；4℃∞。
4.树脂纯化：①在384/6MGDimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干；②在384样本板的每个孔中加16μl水；③将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中；④将384样本板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟。
5.芯片点样：启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384-wellSpectroCHIPbioarray上。
6.质谱检测及数据输出：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF 质谱仪分析，检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果保存入相应存储媒介并递交生物信息室分析。
(三)统计分析；
基因型频率和等位基因频率计算，检验Hardy-Weinberg平衡和MAF，通过Person卡方检验比较病例组和对照组之间基因型和等位基因分布情况。
单个SNP关联分析，通过Pearson卡方检验或Fisher精确检验，分析ONFH 组和疾病组在每个位点上基因型和等位基因的差异，寻找与疾病相关的位点。
多个SNPs之间的两两交互作用与ONFH发病风险的相关性，通过PLINK 软件基因交互作用(上位效应，epistasis)分析完成。
所述的风险性降低指的是患非创伤性股骨头坏死的风险性小于其他等位基因或其他基因型或其他遗传学模型的待测人。所述的风险性增加指的是患非创伤性股骨头坏死的风险性大于其他等位基因或其他基因型或其他遗传学模型的待测人。
五、实验结果分析
(一)MMP3、MMP9，MMP2，VDR基因11SNPs基因分型与ONFH风险的相关性。测序结果PLINK卡方分析发现MMP3、MMP9、MMP2、VDR 基因11SNPs基因分型在ONFH组与对照组之间无统计学显著性，具体11SNPs 基因型在ONFH组与对照组的分布如表4所示。
表4
Figure BDA0002709809370000221
Figure BDA0002709809370000231
(二)MMP3、MMP9、MMP2、VDR基因11SNPs等位基因频率与ONFH 发病风险的相关性
MMP3、MMP9、MMP2、VDR基因11SNPs等位基因频率在病例组与对照组的分布如表5所示，测序结果发现ONFH组VDR基因单核苷酸多态位点 rs731236(A/G)最小等位基因G频率显著低于对照组，OR(CI)：0.529 (0.356-1.010)，P＝0.050，也就是说，rs731236(A/G)最小等位基因G频率显著相关于降低ONFH发病风险，等位基因为G的待测人患ONFH的概率小于等位基因为A的待测人，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
表5
Figure BDA0002709809370000232
Figure BDA0002709809370000241
(三)MMP3、MMP9、MMP2、VDR基因11SNPs不同遗传模型与ONFH 发病风险的相关性见表6；不同遗传学模型分析结果进一步发现，ONFH组 MMP2基因rs243832(C/G)位点显性模型(CC+CGvsGG)显著低于对照组， P＝0.036，也就是说，MMP2基因rs243832(C/G)位点显性模型(CC+CGvsGG) 显著相关于降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物，。
遗传学模型分析结果进一步发现，MMP2基因rs14070(T/C)显性模型 (TT+TCvsCC)也显著低于对照组，P＝0.043，也就是说，MMP2基因rs14070 (T/C)显性模型(TT+TCvsCC)也显著相关于降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
表6
Figure BDA0002709809370000242
Figure BDA0002709809370000251
*PLINK卡方统计
(四)MMP3、MMP9、MMP2、VDR基因11SNPs交互作用与ONFH发病风险相关性。
应用PLINK软件基因交互作用(上位效应，epistasis)分析方法对rs650108 (G/A)、rs679620(T/C)、rs522616(C/T)、rs17576(A/G)、rs3918249(T/C)、 rs3918241(A/T)、rs2274755(T/G)、rs243847(C/T)、rs243832(C/G)、rs14070 (T/C)、rs731236(A/G)位点的两两交互作用分析。所述rs650108位点为人类基因组11号染色体自5'末端起第102838056位核苷酸；所述rs650108位点的核苷酸为T或C；所述rs679620位点为人类基因组11号染色体自5'末端起第102842889位核苷酸；所述rs67962位点的核苷酸为G或A；所述rs522616 位点为人类基因组11号染色体自5'末端起第102844317位核苷酸；所述 rs522616位点的核苷酸为C或T；所述rs17576位点为人类基因组20号染色体自5'末端起第46011586位核苷酸；所述rs17576位点的核苷酸为A或G；所述 rs3918249位点为人类基因组20号染色体自5'末端起第46009497位核苷酸；所述rs3918249位点的核苷酸为T或C；所述rs3918241位点为人类基因组20号染色体自5'末端起第46007096位核苷酸；所述rs3918241位点的核苷酸为A或T；所述rs2274755位点为人类基因组20号染色体自5'末端起第460110531位核苷酸；所述rs2274755位点的核苷酸为T或G；所述rs243847位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第55490086位核苷酸；所述rs243847位点的核苷酸为C或T。
所述rs243832位点为人类基因组16号染色体自5'末端起第55505279位核苷酸；所述rs243832位点的核苷酸为C或G；所述rs14070位点为人类基因组 16号染色体自5'末端起55502815位核苷酸；所述rs14070位点的核苷酸为T 或G；
PLINK软件分析基因-基因之间交互作用结果见表7；
表7
Figure BDA0002709809370000261
Figure BDA0002709809370000271
*PLINK卡方统计；#PLINK基因交互作用(上位epistasis)分析
结果表明：
MMP2基因rs243847(C/T)位点与MMP3基因rs522616(C/T)位点之间的交互作用显著相关于降低ONFH发病风险，OR：0.6983，P＝0.04461，见表7 中序号3，也就是说，同时携带MMP2基因rs243847(C/T)最小纯合基因型 CC型与MMP3基因rs522616(C/T)最小纯合基因型CC型显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
MMP2基因rs243832(C/G)与MMP9基因rs3918249(T/C)之间的交互作用显著相关于降低ONFH发病风险，OR：0.6517，P＝0.02948，见表7中序号6，也就是说，同时携带MMP2基因rs243832(C/G)最小纯合基因型CC 型与MMP9基因rs3918249(T/C)最小纯合基因型TT型显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
MMP2基因rs243832(C/G)与MMP9基因rs17576(A/G)之间的交互作用显著相关于降低ONFH发病风险，OR：0.6752，P＝0.04269，见表7中序号7，也就是说，同时携带MMP2基因rs243832(C/G)最小纯合基因型CC型与MMP9 基因rs17576(A/G)最小纯合基因型AA型显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
MMP3基因rs650108(G/A)与MMP9基因rs17576(A/G)之间的交互作用显著增加ONFH发病风险，OR：1.454，P＝0.03096，见表7中序号1，也就是说，同时携带MMP3基因rs650108(G/A)最小纯合基因型GG型与MMP9 基因rs17576(A/G)最小纯合基因型AA型的个体显著增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
MMP3基因rs679620(T/C)与MMP9基因rs17576(A/G)之间的交互作用亦显著增加ONFH发病风险，OR：1.469，P＝0.03873，见表7中序号2，也就是说，同时携带MMP3基因rs679620(T/C)最小纯合基因型TT型与MMP9 基因rs17576(A/G)最小纯合基因型AA型的个体显著增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
VDR基因rs731236(A/G)与MMP2基因rs243832(C/G)之间的交互作用显著相关于增加ONFH发病风险，OR：2.254，P＝0.04166，见表7中序号4，也就是说，同时携带VDR基因rs731236(A/G)最小纯合基因型AA型与MMP2 基因rs243832(C/G)最小纯合基因型CC型的个体显著增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
MMP2基因rs14070(T/C)与MMP2基因rs243832(C/G)之间的交互作用显著相关于增加ONFH发病风险，OR：1.589，P＝0.03618，见表7中序号5，也就是说，同时携带MMP2基因rs14070(T/C)最小纯合基因型TT型与MMP2 基因rs243832(C/G)最小纯合基因型CC型的个体显著增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
MMP9基因rs3918241(A/T)与MMP9基因rs17576(A/G)之间的交互作用亦显著增加ONFH发病风险，OR：2.241，P＝0.0475，见表7中序号8，也就是说，同时携带MMP9rs3918241(A/T)最小纯合基因型AA型与MMP9基因rs17576(A/G)最小纯合基因型AA型的个体显著增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
MMP9基因rs3918249(T/C)与rs2274755(T/G)之间的交互作用亦显著增加ONFH发病风险，OR：2.303，P＝0.03865，见表7中序号9，也就是说，同时携带MMP9基因rs3918249(T/C)最小纯合基因型TT型与rs2274755(T/G) 最小纯合基因型TT型的个体显著增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
MMP9基因rs2274755(T/G)与MMP9基因rs17576(A/G)之间的交互作用也显著相关于增加ONFH发病风险，OR：2.271，P＝0.04484，见表7中序号10，也就是说，同时携带MMP9基因rs2274755(T/G)最小纯合基因型TT 型与MMP9基因rs17576(A/G)最小纯合基因型AA型的个体显著增加ONFH 发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
本发明提供了MMP3、MMP9、MMP2、VDR基因11SNPs标志物或标志物的组合在制备诊断或辅助诊断、制备评价或辅助评价待测人患ONFH风险性产品中的应用，用于ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。首次发现MMP3、MMP9、MMP2、VDR基因11SNPs的两两交互作用显著相关于ONFH发病风险，且这些风险相关性与单一SNP对ONFH发病风险所表现的作用部分或完全不同，基因交互作用的结果更清晰地发现了多个SNPs对 ONFH风险的协同效应，进一步验证了ONFH是多个微效基因联合引起的复杂病，阐述这些分子遗传学位点的联合效应，对ONFH早期分子预警及分子防控对策建立具有重要价值。
本领域技术人员将能通过检测SNP位点的任何方法或技术在个体的核酸中进行在本文所公开的SNP标记上存在的核苷酸的分析。例如，一个人能用本发明的方法通过进行Tagman法、质谱法、DNA微阵列法、微测序、杂交、限制性酶切分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-HRM或联合应用上述方法检测SNP位点标记，当然，这一列表仅是示例性的，并且决不用于限制本发明。本领域技术人员可使用任何合适的方法来实现这种检测。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> ONFH易感相关VDR、MMP2、MMP3、MMP9基因SNP的检测物质及应用
<130> 20200921
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgttggatg tctgcagtgt gttggacagg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg tgtgccttct tctctatccc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtcctggat ggcctc 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgttggatg aagcttcttc cctatgccag 30
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<213> 人工序列
<400> 5
acgttggatg agaaagaaga gaccgtgacc 30
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<213> 人工序列
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tctggcacac agaag 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg tggttcactg tgtctgtttc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg ttccaggcat ctgcgatgag 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gaaaatggat cctggctt 18
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgttggatg ccaaaatcag accctggtag 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acgttggatg gggaagacaa gagcagtgac 30
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acccgatgct gctactcacc tcc 23
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acgttggatg cgtagctgct ccataaatag 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acgttggatg catgtgtaga agacaaggac 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gcggtaagca atgtaattca tttca 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg aagcactggt gtctggaaag 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acgttggatg tcccaaagtg ctgggattac 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggactgccca gcagggacta 20
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acgttggatg tataatgtgc tgtctccgcc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg agggtttccc atcagcattg 30
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<212> DNA
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<400> 21
tcagcattgc cgtcc 15
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg tcaggtagag gtgacaagtg 30
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<212> DNA
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<400> 23
acgttggatg cactgtctca ttgtgtgttt g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ggggctatat gattttcaag ggctac 26
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
acgttggatg ccactgtcct ttctcctaac 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acgttggatg gagtgaccta aaaactatac 30
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
caaactgttt cacatctttt t 21
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
acgttggatg tcgtgactgc aaagcagatg 30
<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acgttggatg aatgagactg tgagatggag 30
<210> 30
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tcaacttttc tgtaaaggaa g 21
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acgttggatg ttcgacgatg acgagttgtg 30
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<400> 32
acgttggatg tgagtgggag agaatgaagg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gacatgggca agggcgtcgg t 21

Claims (7)

1.检测VDR和\或MMP2和\或MMP3和\或MMP9基因的与非创伤性股骨头坏死风险性有关的位点或具有交互作用两个位点组合的多态性或等位基因或基因型的物质；其特征在于：
所述物质在诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；
或所述物质在评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；
所述的与非创伤性股骨头坏死风险性有关的位点或具有交互作用两个位点组合为以下(1)至(13)中的任意一个或多个：
(1)VDR基因rs731236(A/G)位点；
(2)MMP2基因rs243832(C/G)位点；
(3)MMP2基因rs14070(T/C)位点；
(4)MMP2基因rs243847(C/T)位点与MMP3基因rs522616(C/T)位点的组合；
(5)MMP2基因rs243832(C/G)位点与MMP9基因rs3918249(T/C)位点的组合；
(6)MMP2基因rs243832(C/G)位点与MMP9基因rs17576(A/G)位点的组合；
(7)MMP3基因rs650108(G/A)位点与MMP9基因rs17576(A/G)位点的组合；
(8)MMP3基因rs679620(T/C)位点与MMP9基因rs17576(A/G)位点的组合；
(9)VDR基因rs731236(A/G)位点与MMP2基因rs243832(C/G)位点的组合；
(10)MMP2基因rs14070(T/C)位点与MMP2基因rs243832(C/G)位点的组合；
(11)MMP9基因rs3918241(A/T)位点与MMP9基因rs17576(A/G)位点的组合；
(12)MMP9基因rs3918249(T/C)位点与MMP9基因rs2274755(T/G)位点的组合；
(13)MMP9基因rs2274755(T/G)位点与MMP9基因rs17576(A/G)位点的组合。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于：所述制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品或制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品中包括记载有如下A至M中至少一种条件的可读性载体：
A.所述rs731236(A/G)最小等位基因G频率低于对照组的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
B.所述rs243832(C/G)位点遗传学显性模型(CC+CGvsGG)相关于降低创伤性股骨头坏死风险性；
C.所述rs14070(T/C)位点遗传学显性模型(TT+TCvsCC)相关于降低创伤性股骨头坏死风险性；
D.同时携带所述rs243847(C/T)位点最小纯合基因型CC型与所述rs522616(C/T)位点最小纯合基因型CC型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
E.同时携带所述rs243832(C/G)位点最小纯合基因型CC型与所述rs3918249(T/C)位点最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
F.同时携带所述rs243832(C/G)位点最小纯合基因型CC型与所述rs17576(A/G)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
G.同时携带所述rs650108(G/A)位点最小纯合基因型GG型与所述rs17576(A/G)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
H.同时携带所述rs679620(T/C)位点最小纯合基因型TT型与所述rs17576(A/G)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
I.同时携带所述rs731236(A/G)位点最小纯合基因型AA型与所述rs243832(C/G)位点最小纯合基因型CC型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
J.同时携带rs14070(T/C)位点最小纯合基因型TT型与所述rs243832(C/G)位点最小纯合基因型CC型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
K.同时携带rs3918241(A/T)位点最小纯合基因型AA型与所述rs17576(A/G)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
L.同时携带rs3918249(T/C)位点最小纯合基因型TT型与所述rs2274755(T/G)位点最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
M.同时携带rs2274755(T/G)位点最小纯合基因型TT型与所述rs17576(A/G)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于：所述物质为用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或SNP分型方法的试剂。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于：SNP分型方法为基于杂交的方法或基于引物延伸的方法或基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。
5.如权利要求1所述应用，其特征在于：
所述用于检测rs731236位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对甲或成套单链DNA分子甲：所述引物对甲由SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子甲由SEQ ID NO.1所示的单链DNA、SEQ ID NO.2所示的单链DNA和SEQ ID NO.3所示的单链DNA组成：
所述用于检测rs243832位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对乙或成套单链DNA分子乙：所述引物对乙由SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子乙由SEQ ID NO.4所示的单链DNA、SEQ ID NO.5所示的单链DNA和SEQ ID NO.6所示的单链DNA组成：
所述用于检测rs14070位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丙或成套单链DNA分子丙：所述引物对丙由SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子丙由SEQ ID NO.7所示的单链DNA、SEQ ID NO.8所示的单链DNA和SEQ ID NO.9所示的单链DNA组成：
所述用于检测rs243847位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丁或成套单链DNA分子丁：所述引物对丁由SEQ ID NO.10所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.11所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子丁由SEQ ID NO.10所示的单链DNA、SEQ ID NO.11所示的单链DNA和SEQ ID NO.12所示的单链DNA组成：
所述用于检测rs522616位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对戊或成套单链DNA分子戊：所述引物对戊由SEQ ID NO.13所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.14所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子丁由SEQ ID NO.13所示的单链DNA、SEQ ID NO.14所示的单链DNA和SEQ ID NO.15所示的单链DNA组成：
所述用于检测rs3918249位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对己或成套单链DNA分子己：所述引物对己由SEQ ID NO.16所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.17所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子己由SEQ ID NO.16所示的单链DNA、SEQ ID NO.17所示的单链DNA和SEQ ID NO.18所示的单链DNA组成：
所述用于检测rs17576的单核苷酸基因多态性的物质为引物对庚或成套单链DNA分子庚：所述引物对庚由SEQ ID NO.19所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.20所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子庚由SEQ ID NO.19所示的单链DNA、SEQ ID NO.20所示的单链DNA和SEQ ID NO.21所示的单链DNA组成：
所述用于检测rs650108位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对辛或成套单链DNA分子辛：所述引物对辛由SEQ ID NO.22所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.23所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子辛由SEQ ID NO.22所示的单链DNA、SEQ ID NO.23所示的单链DNA和SEQ ID NO.24所示的单链DNA组成：
所述用于检测rs679620位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对壬或成套单链DNA分子壬：所述引物对壬由SEQ ID NO.25所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.26所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子壬由SEQ ID NO.25所示的单链DNA、SEQ ID NO.26所示的单链DNA和SEQ ID NO.27所示的单链DNA组成：
所述用于检测rs3918241位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对癸或成套单链DNA分子癸：所述引物对癸由SEQ ID NO.28所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.29所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子癸由SEQ ID NO.28所示的单链DNA、SEQ ID NO.29所示的单链DNA和SEQ ID NO.30所示的单链DNA组成：
所述用于检测rs2274755位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对子或成套单链DNA分子子：所述引物对子由SEQ ID NO.31所示的单链DNA分子组成和SEQ ID NO.32所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子子由SEQ ID NO.31所示的单链DNA、SEQ ID NO.32所示的单链DNA和SEQ ID NO.33所示的单链DNA组成。
6.如权利要求3所述应用，其特征在于：所述预测或辅助预测非创伤性股骨头坏死风险性的产品或所述评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品为试剂盒，所述试剂盒包括所述用于检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关的(1)至(13)位点或位点组合的单核苷酸多态性的物质。
7.一种靶向治疗药物，其特征在于：所述药物为以所述与非创伤性股骨头坏死有关的(1)至(13)位点或具有交互作用的位点组合中的任意一个或多个为靶标基因的药物。
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