CN112011609A - Bmp6和bmp7基因与onfh风险性有关单核苷酸多态位点及组合检测物质及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了BMP7和BMP6基因7SNPs标志物或标志物的组合用于ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。6SNPs的两两交互作用显著相关于ONFH发病风险，且这些风险相关性与单一SNP对ONFH发病风险所表现的作用部分或完全不同，基因交互作用的结果更清晰地发现了多个SNPs对ONFH风险的协同效应，进一步验证了ONFH是多个微效基因联合引起的复杂病，阐述这些分子遗传学位点的联合效应，对ONFH早期分子预警及分子防控对策建立具有重要价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及BMP7基因单核苷酸多态位点 rs230205(A/G)、rs12438(T/C)、rs17404303(T/C)，BMP6基因单核苷酸多态位点rs3812163(T/A)、rs1235192(A/C)、rs1107495(G/A)、rs1043784(C/T) 标志物或标志物的组合在制备诊断或辅助诊断、制备评价或辅助评价待测人患ONFH风险性产品中的应用，进一步用于ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
背景技术
股骨头坏死(osteonecrosisofthefemoralhead，ONFH)是由遗传因素与环境因素共同作用引起的复杂性疾病。在近10多年来，ONFH的发病率呈现逐年增加的趋势。据估计在美国年均20000～30000位患者被新诊断为ONFH，在中国每年新增ONFH病例为150000～200000，而且目前中国成年人ONFH患者812 万人，主要发病群体为40岁至50岁之间的青壮年，致残率高，导致严重社会与家庭经济负担，是目前人类健康面临主要挑战之一。及早发现ONFH遗传学分子诊断标志物进而实施早期分子预警，使其防治时段前移，是降低ONFH发病率的关键。
近年来ONFH分子发病机理的重要研究进展是陆续提出了多系列基因多态性与ONFH的发病风险相关，它们或者与另外一些基因形成连锁不平衡共同影响ONFH的发病，或者影响其它易感基因的表达功能，在ONFH的发生发展中起协同作用。这些遗传分子病因学研究结果清晰地提示，ONFH属于多个微效基因联合参与并由环境因素诱导的复杂病。
一、关于BMP7基因的研究如下：
BMP7基因多态性与ONFH发病风险相关的研究尚未见报告。
一项研究ONFH患者骨形成和骨重建调控因子(BMP-2，BMP-7，Runx2，骨钙素，骨保护素[OPG])的基因表达水平，并与原发性骨关节炎(OA)患者进行比较。用骨钙素免疫组织方法检测骨基质的细胞和大分子组成，并用显微 CT分析骨小梁的三维组织结构。结果表明BMP-2，BMP-7，Runx2的基因表达在ONFH患者中升高，细胞外骨钙素沉积也增加，可能由于大量成骨细胞与 Runx2活性增加有关。此外，观察到骨钙素免疫反应性和成骨细胞/骨细胞细胞数量增加，而骨小梁微结构没有明显变化。
另一项研究为了确定BMP7多态性与绝经后骨密度和骨质疏松性骨折易感性的关系，对920名欧美人群有或无骨质疏松性骨折的妇女进行了病例对照研究。对BMP7基因的8个SNPs进行基因分型，结果只有BMP7基因TGTG单倍型与全髋骨密度相关，BMP7基因的8个单核苷酸多态性和9个单倍型与 L1-4、股骨颈骨密度和骨质疏松性骨折无关。
与传统的双能X线骨密度测量法及定量CT分别测量骨小梁和皮质骨密度 (vBMD)相比，与人类骨小梁和皮质vBMD相关的基因变异知之甚少，尽管这些基因对于确定骨强度和骨质疏松风险十分重要。通过对男性骨质疏松性骨折研究中的822名65岁以上白人男性的383个骨代谢候选基因进行标记和潜在功能性SNPs基因分型，验证了与股骨颈骨小梁和皮质vBMD相关的基因变异的假设。随后通过来自同一研究的另外1155名男性的复制实验，发现了骨小梁 vBMD密切相关的包括BMP7等9个基因相关的SNPs,这个结果提出了BMP7 为相关于皮质和小梁vBMD的新基因变体。
二、关于BMP6基因的研究如下；
BMP6基因染色质位置6p24.3，含有7个外显子，编码TGFβ超家族的分泌配体。该家族的配体结合各种转化生长因子β受体，导致SMAD家族转录因子的募集和激活，这些转录因子调节基因表达。编码的前蛋白经蛋白质水解处理后生成二硫键连接的同二聚体亚单位。这种蛋白质调节广泛的生物学过程，包括铁稳态、脂肪和骨骼发育以及排卵。BMP6基因的差异表达可能与乳腺癌和前列腺癌的进展有关。BMP6基因突变可能与人类患者的铁超载有关。
BMP6基因多态性与ONFH发病风险的研究也未见报告。
BMPs在成骨细胞分化中起着重要作用，为了研究BMPsSNPs与骨密度 (BMD)之间的关系，对20-39岁的韩国健康男性(n＝237)和女性(n＝276) 进行了横断面研究。采用双能X线骨密度仪测量跟骨和桡骨远端骨密度。用5'- 核酸酶法测定BMP2、BMP4和BMP6(c.1283C>G，IVS4-6838A>G， IVS5+24C>T)的单核苷酸多态性。结果BMP2c.584G>A、c.893T>A基因型与男性跟骨及女性桡骨远端骨密度存在显著相关性。BMP2c.893AA基因型的男性跟骨骨密度高16％，而具有此基因型的女性桡骨远端的骨密度比其他基因型低 7％。BMP4IVS1-160C>T与男性跟骨BMD之间也存在显著相关性。这些结果表明，在韩国男性和女性中，BMP2和BMP4的一个或多个SNPs与外周骨密度有关。
骨折愈合能力受患者基因型的影响，为了研究骨折愈合延迟或受损的患者在一系列与骨形成相关的基因SNPs相关，对延迟骨折愈合人群病例进行了对照研究。62名成人长骨骨折是从外科数据库中确定，其中33例患者出现萎缩性骨不连(延迟愈合)，29例骨折愈合正常。应用微阵列技术对这些患者接受了进行SNP基因分型，检测了30个与骨折愈合相关基因中的144个SNPs，结果在加性遗传模型中，4个基因5个SNPs相关于骨折延迟愈合，其中3SNPs 风险系数大于1，表明等位基因增加了骨不连的风险。而BMP6基因rs270393 位点显示降低骨折延迟愈合的风险(OR＝0.30，p＝0.015)。大约有10-15％骨折患者的愈合受到损害，一项系统性回顾研究分析了骨折患者中特定基因异常的类型和频率，并确定某些患者发生骨折不愈合或术后不愈合事件的趋势是否存在遗传关联。GO和KEGG分析被用来确定相关基因的可能功能，RegulomeDB 和GTEx评估了SNPs功能意义。研究分析29个基因和89SNPs。发现NOS2、NOG、BMP4、CYR61、IL1β和FGFR1基因多态性明显导致骨折不愈合，而MMP13、BMP6和FAM5C基因的多态性可能对骨折不愈合起保护作用。生物信息学分析表明，这些基因在炎症途径中富集，提示炎症可能是骨折不愈合的一个潜在因素。因此确定了一些可能导致骨折不愈合遗传易感性的基因及其多态性。上述这些遗传分子病因学研究结果清晰地提示，ONFH属于多个微效基因联合参与并由环境因素诱导的复杂病，ONFH分子发病机理的重要研究进展是陆续提出了多系列基因多态性与ONFH的发病风险相关，它们或者与另外一些基因形成连锁不平衡共同影响ONFH的发病，或者影响其它易感基因的表达功能，在ONFH的发生发展中起协同作用。
然而，目前国内外关于ONFH的基因多态性研究领域存在的主要瓶颈问题，零散研究基因位点的资料多，系统研究多基因位点的资料少，不利于多种微效基因联合致病的分子病因学与分子发病机理的阐述。这些瓶颈问题是阐述 ONFH分子发病机理的严重束缚，也是ONFH分子病因学的最新成果与临床防治实施对接的关键障碍。
发明内容
本发明联合应用分子技术的创新集成在国内外率先阐述涉及BMP7基因单核苷酸多态位点rs230205的基因分型和等位基因频率和不同遗传模型、BMP7 基因2SNPs(rs12438、rs17404303)和BMP6基因4SNPs(rs3812163、rs1235192、 rs1107495、rs1043784)之间的交互作用与ONFH发病风险的关联，为建立ONFH 的分子水平防治对策提出关键分子靶点，用于ONFH的易感人群筛查及早期干预，促进分子病因学的研究成果与ONFH的临床防治及早对接。
本发明提供了检测BMP7和\或BMP6基因的与非创伤性股骨头坏死风险性有关的位点或具有交互作用两个位点的多态性或等位基因或基因型的物质；所述物质在诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；或所述物质在评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；所述的与非创伤性股骨头坏死风险性有关的位点或具有交互作用两个位点为以下(1)至(4)中的任意一个或多个：
(1)BMP7基因rs230205(A/G)位点；
(2)BMP6基因rs1043784(C/T)位点与BMP7基因rs17404303(T/C) 位点的组合；
(3)BMP6基因rs3812163(T/A)位点与BMP6基因rs1235192(A/C)位点的组合；
(4)BMP6基因rs1107495(G/A)位点与BMP7基因rs12438(T/C)位点的组合；
进一步的，所述制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品或制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品中包括记载有如下A至 E中至少一种条件的可读性载体：
A.所述rs230205(A/G)位点最小等位基因A频率低于对照组的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
B.所述rs230205(A/G)位点遗传学显性模型(AA+AGvsGG)相关于降低创伤性股骨头坏死风险性；
C.同时携带所述rs1043784(C/T)位点最小纯合基因型CC型与所述 rs17404303(T/C)位点最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
D.同时携带所述rs3812163(T/A)位点最小纯合基因型TT型与所述 rs1235192(A/C)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
E.同时携带所述rs1107495(G/A)位点最小纯合基因型GG型与所述rs12438 (T/C)最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低。
进一步的，所述物质为用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于SNP分型方法的试剂。更进一步的，所述SNP分型方法为基于杂交的方法或基于引物延伸的方法或基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。
进一步的，用于检测rs230205位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对甲或成套单链DNA分子甲：所述引物对甲由SEQIDNO.1所示的单链DNA 分子组成和SEQIDNO.2所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子甲由SEQIDNO.1所示的单链DNA、SEQIDNO.2所示的单链DNA和 SEQIDNO.3所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs3812163位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对乙或成套单链DNA分子乙：所述引物对乙由SEQIDNO.4所示的单链DNA 分子组成和SEQIDNO.5所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子乙由SEQIDNO.4所示的单链DNA、SEQIDNO.5所示的单链DNA和 SEQIDNO.6所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs1235192位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丙或成套单链DNA分子丙：所述引物对丙由SEQIDNO.7所示的单链DNA 分子组成和SEQIDNO.8所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子丙由SEQIDNO.7所示的单链DNA、SEQIDNO.8所示的单链DNA和 SEQIDNO.9所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs1107495位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丁或成套单链DNA分子丁：所述引物对丁由SEQIDNO.10所示的单链DNA 分子组成和SEQIDNO.11所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子丁由SEQIDNO.10所示的单链DNA、SEQIDNO.11所示的单链DNA和 SEQIDNO.12所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs12438位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对戊或成套单链DNA分子戊：所述引物对戊由SEQIDNO.13所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.14所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子丁由SEQIDNO.13所示的单链DNA、SEQIDNO.14所示的单链DNA和 SEQIDNO.15所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs1043784位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对己或成套单链DNA分子己：所述引物对己由SEQIDNO.16所示的单链DNA 分子组成和SEQIDNO.17所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子己由SEQIDNO.16所示的单链DNA、SEQIDNO.17所示的单链DNA和 SEQIDNO.18所示的单链DNA组成。
进一步的，用于检测rs17404303的单核苷酸基因多态性的物质为引物对庚或成套单链DNA分子庚：所述引物对庚由SEQIDNO.19所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.20所示的单链DNA分子组成：所述成套单链DNA分子庚由 SEQIDNO.19所示的单链DNA、SEQIDNO.20所示的单链DNA和SEQIDNO.21 所示的单链DNA组成。
进一步的，所述预测或辅助预测非创伤性股骨头坏死风险性的产品或所述评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品为试剂盒，所述试剂盒包括所述用于检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关的(1)至(4)位点或具有交互作用的位点组合的单核苷酸多态性的物质。
本发明还提供一种靶向治疗药物，所述药物为以与非创伤性股骨头坏死有关的(1)至(4)位点或具有交互作用的位点组合中的任意一个或多个为靶标基因的药物。
进一步的，所述rs230205(A/G)位点为人类基因组20号染色体自5'末端起第257216700位核苷酸；所述rs230205位点的核苷酸为A或G。
进一步的，所述rs3812163位点为人类基因组6号染色体自5'末端起第 7725527位核苷酸；所述rs3812163位点的核苷酸为T或A。
进一步的，所述rs1235192位点为人类基因组6号染色体自5'末端起第 7866813位核苷酸；所述rs1235192位点的核苷酸为A或C。
进一步的，所述rs1107495位点为人类基因组6号染色体自5'末端起第7725824位核苷酸；所述rs1107495位点的核苷酸为G或A。
进一步的，所述rs12438位点为人类基因组20号染色体自5'末端起第 57168849位核苷酸；所述rs12438位点的核苷酸为T或C。
进一步的，所述rs1043784位点为人类基因组6号染色体自5'末端起第 7881698位核苷酸；所述rs1043784位点的核苷酸为C或T。
进一步的，所述rs17404303位点为人类基因组20号染色体自5'末端起第57228631位核苷酸；所述rs17404303位点的核苷酸为T或C。
本发明中所述待测人的最适人群为中国汉族人群。
本发明的发明人通过中国汉族人群ONFH临床病例对照体系研究，发现 BMP7基因单核苷酸多态位点rs230205(A/G)最小等位基因A频率显著相关于降低ONFH发病风险，遗传学显性模型(AA+AGvsGG)也显著相关于减低 ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
本发明还发现BMP6基因rs1107495(G/A)位点与BMP7基因rs12438(T/C) 位点之间的交互作用亦显著相关于降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物；BMP6基因rs3812163(T/A)位点与BMP6基因rs1235192 (AC)位点之间的交互作用显著相关于增加ONFH发病风险，BMP6基因 rs1043784(C/T)位点与BMP7基因rs17404303(T/C)位点之间的交互作用也显著相关于增加ONFH发病风险，可作为ONFH分子预警、临床分子诊断与分型、药物治疗靶标。
本发明首次阐述了BMP7和BMP6基因多态性组合与ONFH发病风险的关联，可用于ONFH分子预警、分子诊断及治疗药物靶标，对ONFH分子水平防治具有重大价值。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
下述实施例中所用的实验材料及试剂如无特殊说明均可通过商业途径购买。
实施例1、BMP7和BMP6基因多态性组合在检测非创伤性股骨头坏死的分子预警、分子诊断及治疗药物靶标中的应用；
一、建立ONFH病例对照研究体系
建立在知情同意基础上，ONFH病例对照研究体系共600例，其中健康对照组300例，ONFH患者组300例。
ONFH病例来自于2012年6月至2018年10月期间分别就诊于吉林大学第二和第三临床医学院骨科的住院临床患者，其中男性204例，女性96例，年龄 54.49±11.8岁。排除明显髋关节的外伤史和髋关节先天性疾病、髋关节感染性疾病及髋关节肿瘤,按Ficat诊断与分期标准进行ONFH的临床诊断与分期。
健康对照组来自2013年11月至2014年3月期间在吉林大学第二临床医学院体检中心的健康体检者，其中男性131名，女性169名，年龄56.5±8.61岁。其空腹血糖、血清甘油三脂及总胆固醇均居于正常人群参考值水平，腹腔脏器超声检查及胸部X线摄片无异常，并排除心脑血管疾病等重大疾病史。以上病例-对照研究体系均为中国汉族人，个体之间无血缘关系。
二、提取外周血白细胞基因组DNA
空腹状态下采集肘静脉血液2ml，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书的规程操作，主要步骤依次为：抗凝血2ml，2000rpm离心10min，取血浆-80℃保存；剩余细胞加入红细胞裂解液A型1ml并轻柔颠倒混匀；10000g室温离心2min，弃上清；将沉淀重悬于500μl的红细胞裂解液A型中，轻柔吹打混匀后，10000g室温离心min，去上清；加入0.6mL溶液A，轻柔吹打混匀，室温作用5min；加入0.2mL氯仿和0.3mL溶液B，立即颠倒混匀；室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5mL塑料离心管；加入0.7ml异丙醇，颠倒混匀 5-8次，出现絮状DNA沉淀；加入1mL75％乙醇，13000g离心min，弃上清后空气中挥发乙醇，加入0.2mlTris-EDTA反应溶解DNA；取1μl提取DNA，应用Nanodrop2000检测DNA含量及纯度；将DNA分装，-80℃保存。
三、目标基因及其SNPs的优化筛选
应用Hapmap数据库以及相关文献查询BMP7、BMP6基因的SNPs，通过多种生物信息库比对各SNPs位点在不同国家、民族、地区人群的分布，尤其在亚洲人群的分布数据，基因多态性的分布符合Hardway平衡，分别在基因编码区、启动子区及内含子及选择7SNPs作为研究的靶位点，所选择的目标基因 7SNPs位点见表1。
表1
所述BMP7、BMP6基因7SNPs序列信息见表2。
表2
四、MassarraySNP分型
(一)引物设计及合成、稀释
1、基因序列的获取：①在Myagena网站中注册成用户；②在NCBI网页 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)中输入该SNP位点的名称,按照dbSNPbatchreportor格式显示；③将SNP位点所在序列发送到Myagena网站注册的邮箱中；④在Myagena网站的TOOLS工具栏中选择Genotyping；⑤点击 RSformat，在Browse按钮中选择NCBI网站发送到邮箱的文件；⑥网站对序列的格式化完成后在Sentto栏中，选择ProxSNP；⑦开始ProxSNP，点击BeginStart；⑧上述步骤完成后，在Sentto栏中选择PreXTEND；⑨开始ProxSNP，点击 BeginStart；⑩在产生的结果中，选择OUTPUT，并把文件内容复制在新的文本文件.txt中。PCR引物序列表信息见表3。
2、采用AssayDesigner3.1软件进行引物设计PCR反应和单碱基扩展引物，并交由生物公司合成：①在软件SNPGroup栏中选择Browse按钮，找到上述产生的txt文件；②在AassyDesign栏中选择SBEMassExtend，并在SBEstopmix 栏中选择iPlex，在MμltiplexLevel中按照实际情况选择不同的反应重数；③ SNPcapture，Extendprimerdesign，MASSMμltiplexing均选择默认参数；④参数设定后，点击Run；⑤在txt文件目录相应位置找到产生的引物序列文件，7SNPs 的PCR引物及测序引物序列见表3。
表3
3、引物稀释：①PCRmastermix引物配置，稀释单管PCRmaster至浓度 100μM，加入去离子水混合所有单管PCRmaster使最终反应PCRmastermix浓度为0.5μM；②EXTENDMix引物配置：稀释单管延伸引物至终浓度500μM，加入引物混合后使得各引物浓度为8μM、10μM、15μM。按照DNA合成产品使用说明计算该条引物分子量、质量数和摩尔数，进而根据所需的浓度计算需加入去离子水的量。②将混合好的单管延伸引物根据分子量大小，分别取(小于6300Da)1倍，(6300Da至7200Da)1.2倍，(大于7200Da)1.5倍体积量进行混合待用。
(二)Agena Mass Array系统基因分型步骤
分型原理：通过PCR反应扩增出含有待检SNP位点的目的片段，然后用 SAP酶去除PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物，所述引物及测序引物序列表见表3，再加入单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨SNP 位点，且与目的片段上的碱基完全互补，采用四种ddNTP替代dNTP，这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。
1、PCR扩增反应
①取1.5mlEP管中配置PCRmastermix，并振荡低速离心，反应组分如下：
ThefinalMgCl2concentrationis3.5mM，1.875mMfromthePCRbufferand1.625mMfromtheMgCl2
②选用8道移液器，在384孔板的每个加样孔中加入4μlPCRmastermix，最后加入1μl模板DNA(20ng/μl)混匀，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。1000rpm离心1minute；③设置如下PCR 扩增反应程序：94℃5min；94℃20sec，56℃30sec，72℃1min，45cycles；72℃ 3min；4℃∞。将PCR反应板放置于PCR仪上，启动程序。
2、产物碱性磷酸酶处理
①在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs；
②在新1.5mlEP管中配制碱性磷酸酶处理反应液，SAPMix反应组分如下：
③将SAPmix加入384孔PCR反应板，对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应总体积为7μl，其中PCR产物5μl，SAPmix2μl；④移液完成后，小心盖上 384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序；⑤设置SAP反应程序：37℃20min；85℃5min；4℃∞。并将384 孔反应板放置于PCR仪上，启动程序。
3、单碱基延伸反应
①在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl；
②在新1.5mlEP管中配制单碱基延伸反应液，EXTENDMix反应组分如下：
③将EXTENDMix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系EXTENDMix2μl；SAP+PCRreaction7μl，TotalVolume9μ；④移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序：94℃30sec；[94℃5sec，(52℃5sec，80℃5sec) 5cycles]40cycles；4℃∞。
4、树脂纯化
①在384/6MGDimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干；②在384 样本板的每个孔中加16μl水；③将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中；④将384样本板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟。
5、芯片点样：启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384-wellSpectroCHIPbioarray上。
6、质谱检测及数据输出：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF 质谱仪分析，检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果保存入相应存储媒介并递交生物信息室分析。
(三)统计分析；
基因型频率和等位基因频率计算，检验Hardy-Weinberg平衡和MAF，通过PLNK卡方检验比较病例组和对照组之间基因型和等位基因分布情况。
单个SNP关联分析，通过PLNK卡方检验，分析ONFH组和疾病组在每个位点上基因型和等位基因的差异，寻找与疾病相关的位点。
6个SNPs之间的两两交互作用与ONFH发病风险的相关性，通过PLINK 软件基因交互作用(上位效应，epistasis)分析完成。
五、实验结果分析
(一)BMP7和BMP6基因7SNPs基因分型与ONFH风险的相关性。
测序结果见表4，PLINK卡方分析发现BMP7和BMP6基因7SNPs基因分型在ONFH组与对照组之间无统计学显著性。
表4
*PLINK卡方统计分析
(二)BMP7和BMP6基因7SNPs等位基因频率与ONFH发病风险的相关性，测序结果见表5，可发现ONFH组BMP7基因rs230205(A/G)位点最小等位基因A频率显著低于对照组，P＝0.0401，OR(95％CI)：0.733(0.604-0.989)，也就是说，BMP7基因rs230205(A/G)位点最小等位基因A频率显著降低ONFH 发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
所述rs230205位点为人类基因组20号染色体自5'末端起第257216700位核苷酸；所述rs230205位点的核苷酸为A或G。
表5
*PLINK卡方统计
(三)BMP7和BMP6基因7SNPs不同遗传模型与ONFH发病风险的相关性，不同遗传学模型分析结果见表6，发现ONFH组BMP7基因rs230205(A/G) 位点显性模型(AA+AGvsGG)显著低于对照组，P＝0.049，也就是说，BMP7 基因rs230205(A/G)位点最小纯合基因型AA频率显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH风险的分子保护标志物。
表6
*PLINK卡方统计
(四)BMP7和BMP6基因6SNPs交互作用与ONFH发病风险相关性
应用PLINK软件基因交互作用(上位效应，epistasis)分析方法rs12438 (T/C)、rs17404303(T/C)、rs3812163(T/A)、rs1235192(AC)、rs1107495 (GA)、rs1043784(C/T)的两两交互作用分析。
PLINK软件分析基因之交互作用的结果见表7。
表7
*PLINK卡方统计；#PLINK基因交互作用(上位epistasis)分析。
BMP6基因rs1043784(C/T)位点与BMP7基因rs17404303(T/C)位点之间的交互作用显著增加ONFH发病风险，OR：3.218，P＝0.048，见表7中的序号3，也就是说，同时携带BMP6基因rs1043784(C/T)位点最小纯合基因型CC型与BMP7基因rs17404303(T/C)位点最小纯合基因型TT型的个体显著增加ONFH发病风险，可作为的分子预警、分子诊断及治疗药物的靶标。
BMP6基因rs3812163(T/A)位点与BMP6基因rs1235192(A/C)位点之间的交互作用显著增加ONFH发病风险，OR：1.524，P＝0.045，见表7中的序号1，也就是说，同时携带BMP6基因rs3812163(T/A)最小纯合基因型TT 型与BMP6基因rs1235192(A/C)位点最小纯合基因型AA型的个体显著增加 ONFH发病风险，可作为的分子预警、分子诊断及治疗药物的靶标。
BMP6基因rs1107495(GA)位点与BMP7基因rs12438(T/C)位点之间的交互作用显著降低ONFH发病风险，OR：0.6434，P＝0.0202，见表7中的序号2，也就是说，同时携带BMP6基因rs1107495(G/A)位点最小纯合基因型 GG型与BMP6基因rs12438(T/C)位点最小纯合基因型TT型的个体显著降低ONFH发病风险，可作为降低ONFH发病风险的分子保护标志物。
本发明首次发现BMP7、BMP6基因6SNPs的两两交互作用显著相关于 ONFH发病风险，且这些风险相关性与单一SNP对ONFH发病风险所表现的作用部分或完全不同，基因交互作用的结果更清晰地发现了多个SNPs对ONFH 风险的协同效应，进一步验证了ONFH是多个微效基因联合引起的复杂病，阐述这些分子遗传学位点的联合效应，对ONFH早期分子预警及分子防控对策建立具有重要价值。
基因交互作用，又称上位效应(epistaticeffect)是指影响同一性状的两对非等位基因，其中一对基因(显性或隐性的)抑制(或掩盖)另一对显性基因的作用时所表现的作用。
本领域技术人员将能通过检测SNP位点的任何方法或技术在个体的核酸中进行在本文所公开的SNP标记上存在的核苷酸的分析。例如，本领域技术人员能用本发明的方法通过进行Tagman法、质谱法、DNA微阵列法、微测序、杂交、限制性酶切分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-HRM或联合应用上述方法检测SNP位点标记，当然，这一列表仅是示例性的，并且决不用于限制本发明。本领域技术人员可使用任何合适的方法来实现这种检测。
所述的风险性降低指的是患非创伤性股骨头坏死的风险性小于其他等位基因或其他基因型或其他遗传学模型的待测人。所述的风险性增加指的是患非创伤性股骨头坏死的风险性大于其他等位基因或其他基因型或其他遗传学模型的待测人。
本领域技术人员可使用任何合适的方法来实现这种检测。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> BMP6、BMP7基因的与ONFH风险性有关单核苷酸多态位点及位点组合的检测物
质及应用
<130> 2020
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<212> DNA
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cccggtcccc atggtcatcc tgaa 24
Claims (7)
1.检测BMP7和\或BMP6基因的与非创伤性股骨头坏死风险性有关的位点或具有交互作用两个位点组合的多态性或等位基因或基因型的物质；其特征在于：
所述物质在诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；
或所述物质在评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死中的应用，或在制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品中的应用；
所述的与非创伤性股骨头坏死风险性有关的位点或具有交互作用两个位点组合为以下(1)至(4)中的任意一个或多个：
(1)BMP7基因rs230205(A/G)位点；
(2)BMP6基因rs1043784(C/T)位点与BMP7基因rs17404303(T/C)位点的组合；
(3)BMP6基因rs3812163(T/A)位点与BMP6基因rs1235192(A/C)位点的组合；
(4)BMP6基因rs1107495(G/A)位点与BMP7基因rs12438(T/C)位点的组合。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于：所述物质为制备诊断或辅助诊断非创伤性股骨头坏死风险性的产品，或所述物质为制备评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品，所述产品中包括记载有如下A至E中至少一种条件的可读性载体：
A.所述rs230205(A/G)位点最小等位基因A频率低于对照组的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低；
B.所述rs230205(A/G)位点遗传学显性模型(AA+AGvsGG)相关于降低创伤性股骨头坏死风险性；
C.同时携带所述rs1043784(C/T)位点最小纯合基因型CC型与所述rs17404303(T/C)位点最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
D.同时携带所述rs3812163(T/A)位点最小纯合基因型TT型与所述rs1235192(A/C)位点最小纯合基因型AA型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性增加；
E.同时携带所述rs1107495(G/A)位点最小纯合基因型GG型与所述rs12438(T/C)最小纯合基因型TT型的待测人患非创伤性股骨头坏死风险性降低。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于：所述物质为用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于SNP分型方法的试剂。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于：所述SNP分型方法为基于杂交的方法或基于引物延伸的方法或基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。
5.如权利要求1所述应用，其特征在于：
用于检测rs230205位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对甲或成套单链DNA分子甲；所述引物对甲由SEQIDNO.1所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.2所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子甲由SEQIDNO.1所示的单链DNA、SEQIDNO.2所示的单链DNA和SEQIDNO.3所示的单链DNA组成；
用于检测rs3812163位点的单核苷酸多态性的物质具体为为引物对乙或成套单链DNA分子乙；所述引物对乙由SEQIDNO.4所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.5所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子乙由SEQIDNO.4所示的单链DNA、SEQIDNO.5所示的单链DNA和SEQIDNO.6所示的单链DNA组成；
用于检测rs1235192位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丙或成套单链DNA分子丙；所述引物对丙由SEQIDNO.7所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.8所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丙由SEQIDNO.7所示的单链DNA、SEQIDNO.8所示的单链DNA和SEQIDNO.9所示的单链DNA组成；
用于检测rs1107495位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对丁或成套单链DNA分子丁；所述引物对丁由SEQIDNO.10所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.11所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丁由SEQIDNO.10所示的单链DNA、SEQIDNO.11所示的单链DNA和SEQIDNO.12所示的单链DNA组成；
用于检测rs12438位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对戊或成套单链DNA分子戊；所述引物对戊由SEQIDNO.13所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.14所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子丁由SEQIDNO.13所示的单链DNA、SEQIDNO.14所示的单链DNA和SEQIDNO.15所示的单链DNA组成；
用于检测rs1043784位点的单核苷酸基因多态性的物质为引物对己或成套单链DNA分子己；所述引物对己由SEQIDNO.16所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.17所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子己由SEQIDNO.16所示的单链DNA、SEQIDNO.17所示的单链DNA和SEQIDNO.18所示的单链DNA组成；
用于检测rs17404303的单核苷酸基因多态性的物质为引物对庚或成套单链DNA分子庚；所述引物对庚由SEQIDNO.19所示的单链DNA分子组成和SEQIDNO.20所示的单链DNA分子组成；所述成套单链DNA分子庚由SEQIDNO.19所示的单链DNA、SEQIDNO.20所示的单链DNA和SEQIDNO.21所示的单链DNA组成。
6.如权利要求1所述应用，其特征在于：所述预测或辅助预测非创伤性股骨头坏死风险性的产品或所述评价或辅助评价非创伤性股骨头坏死风险性的产品为试剂盒，所述试剂盒包括所述用于检测与非创伤性股骨头坏死风险性有关的(1)至(4)位点或具有交互作用的位点组合的单核苷酸多态性的物质。
7.一种靶向治疗药物，其特征在于：所述药物为以所述与非创伤性股骨头坏死有关的(1)至(4)位点或具有交互作用的位点组合中的任意一个或多个为靶标基因的药物。
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| CN (1) | CN112011609A (zh) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN113403382A (zh) * | 2021-06-17 | 2021-09-17 | 西安市红会医院 | Ube2f在诊治股骨头坏死中的应用 |
-
2020
- 2020-09-24 CN CN202011020293.1A patent/CN112011609A/zh active Pending
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| Title |
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| 崔永锋;袁琼红;李恩典;王西迅;: "BMP在ONFH发病和治疗过程中的作用", 中医正骨 * |
| 方钊;孙天威;SANDIP KUMAR YADAV;: "BMP与后纵韧带骨化症易患性的研究进展", 中国修复重建外科杂志 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113403382A (zh) * | 2021-06-17 | 2021-09-17 | 西安市红会医院 | Ube2f在诊治股骨头坏死中的应用 |
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