KR102056388B1

KR102056388B1 - Hmgb1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법

Info

Publication number: KR102056388B1
Application number: KR1020180047858A
Authority: KR
Inventors: 안종균; 김동수; 신동직; 배윤선; 남지호
Original assignee: (주)메디젠휴먼케어; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2018-04-25
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2019-12-16
Also published as: WO2019209048A2; WO2019209048A3; KR20190123928A

Abstract

본 발명은 HMGB1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법에 관한 것이다. 가와사키병은 주로 5세 미만의 영유아에게서 발생하는 급성 열성 발진증으로, 정맥내 면역글로불린 (IVIG)을 적절히 사용하는 치료를 받지 않으면 관상동맥 병변이 발생할 수 있다. 그러나 가와사키병 환자에게서 정맥내 면역글로불린 저항성이 발생하는 경우가 많아, 치료에 어려움이 있는 실정이다.
본 발명의 HMGB1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법은 HMGB1 유전자와 가와사키병 증상에 있어서의 연관성을 규명하는 것으로서, 가와사키병 환자에게서 관상동맥 병변 형성 가능성, 또는 정맥내 면역글루불린 저항성이 발생할 가능성을 사전에 예측 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Description

HMGB1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법{A method for pathogenesis prediction to kawasaki disease using the HMGB1 genes SNP}

본 발명은 HMGB1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법에 관한 것이다.

가와사키병(Kawasaki disease; KD)은 주로 5세 미만의 영유아에게서 발생하는 급성 열성 발진증으로, 그 원인은 아직 밝혀지지 않았지만, 전신의 계통적 혈관염이 주된 병태이다. 한국은 일본에 이어 세계 2번째로 높은 유병율을 보이고 있는데, 정맥내 면역글로불린 (IVIG)을 적절히 사용하는 치료를 받지 않으면 관상동맥 병변이 발생할 수 있다. 선진국에서는 가와사키병이 후천성 심장병의 가장 흔한 원인으로 지목되었다. 그러나 가와사키병 환자에게서 정맥내 면역글로불린 저항성이 발생하는 경우가 많아, 치료에 어려움이 있는 실정이다. 가와사키병의 증상은 다른 전염성 질환의 증상과 유사하며, 질병의 진행은 대개 자연적으로 제한된다. 이러한 이유로 한때는 가와사키병이 전염병으로 여겨졌으나, 환자에게서 감염성 원인 유기체가 분리되지 않고, 지리적 · 혈연적 유대성이 높으므로, 최근에는 유전적 소인에 의한 발현 질환으로 여겨지고 있다.

한편, 단일염기다형성(Single-nucleotide polymorphism; SNP)은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A,T,G,C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하는 것으로, 단일 염기 다형 현상은 각 개인마다 많은 변이를 보이는 부분이므로 DNA 지문 분석에 주로 이용된다.

최근 SNP를 이용한 연구에서 가와사키병과 연관된 유전자들이 공지되고 있으나, 가와사키병의 특정 증상과 HMGB1 유전자와의 연관성은 연구가 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, HMGB1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법에 관한 것이다. 본 발명의 증상 예측 방법은 가와사키병 환자에게서 관상동맥 병변 형성 가능성, 또는 정맥내 면역글루불린 저항성이 발생할 가능성을 사전에 예측 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, HMGB1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법에 관한 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구체예에서 "가와사키병(Kawasaki disease; KD)"이란, 소아에서 발생하는 원인 불명의 급성 열성 혈관염으로, 전신에 다양하게 침범한다. 피부, 점막, 임파절, 심장 및 혈관, 관절, 간 등에 기능 이상을 가져올 수 있고, 위장관 장애, 담낭수종, 드물게 뇌수막 등의 염증이 나타날 수 있다.

가와사키병의 원인은 아직 불명확하지만, 현재까지는 유전학적 요인이 있는 소아가 병원체에 감염되면 과민반응이나 비정상적인 면역학적 반응을 일으켜 가와사키병이 발생한다고 추정하고 있다. 주로 5세 이하의 영유아가 전체 발생의 86%를 차지할 정도로 흔하며, 6개월에서 2세의 연령에서 가장 높은 발생 빈도를 보이고, 재발률은 3% 정도이다.

가와사키병은 전형적인 임상 증상이 나타나는 경우가 많으나, 비전형적으로 특징적인 증상이 모두 나타나지 않는 경우도 흔하다. 전형적인 증상은 38.5℃ 이상의 고열, 사지말단의 부종, 피부의 부정형 발진, 양측 안구 결막의 충혈, 입술의 홍조 및 균열, 딸기 모양의 혀, 구강 점막의 발적, 비화농성 경부 임파절 종창, BCG 접종 부위의 발적이 있다. 발열은 대개 항생제에 반응이 없으며, 열은 치료하지 않으면 대개 1~2주 이상 지속되고, 어떤 경우에는 3~4주 동안 열이 있기도 한다. 초기에는 심하게 보채며, 경우에 따라 설사, 복통, 두통 소화장애, 기침 등을 보인다. 이 때 심장의 침범으로 심근염, 경한 심낭 삼출증, 판막 역류 등이 흔하게 관찰된다. 이러한 급성기를 1~2주 겪은 후 아급성기에 접어들면서 열을 비롯한 급성기 증상들은 거의 사라진다. 아급성기는 특징적으로 손가락, 발가락 끝, 항문 주위의 막양 낙설(desquamation)을 보이고, 혈소판의 수가 증가하며, 관상 동맥류로 인한 급사의 위험이 가장 높은 시기이다. 거대 관상 동맥류는 파열, 협착, 혈전 형성 폐쇄에 의한 심근 경색의 위험이 있는 합병증이다. 회복기는 이러한 모든 임상 증상이 사라지기 시작하는 시기이며, 혈액검사 소견이 정상화된다.

관상동맥 합병증 외의 다른 임상 증상은 대체로 완전히 회복된다. 가와사키병으로 인한 사망률은 약 0.01% 정도로 보고되고 있다. 내경이 8mm 이상의 거대 관상동맥류는 완전히 회복되기 힘들며, 대개 관상동맥 혈전이나 협착이 생기기 쉽다. 그러나 관상동맥 치료 방법인 정맥내 면역글로불린 투여에 대하여 저항성이 발생하는 경우가 많아, 치료에 어려움이 있는 실정이다.

본 발명의 일 구체예에서 "HMGB1(High mobility group box 1)"이란, 활성화된 수지상 세포, 대식세포, 및 사멸 세포로부터 분비되는 단백질로, 세포 구조가 붕괴되는 손상 혹은 괴사된 세포에 의해 방출된다. 염증반응 유발에 중요한 역할을 하고, 지속적으로 유리될 경우 만성 염증반응을 유발하여 만성 질환의 중요 기전으로 활발히 연구되고 있다. HMGB1 유전자는 HMGB1 단백질을 코딩하는 유전자로, 최근 Hoshina T 등의 연구(Scand J Rheumatol 2008;37:445-9.)와 Eguchi T 등의 연구(Pediatr Infect Dis J 2009;28:339-41.)에서 혈청 HMGB1 수준과 가와사키병 사이의 연관성이 보고 되었으나, HMGB1 내에서 가와사키병에 영향을 미치는 구체적 SNP에 대한 연구는 미비한 실정이다.

본 발명의 일 구체예에서 "단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)"이란, 유전자 다형성, 유전 다형성, 염기 다형성 등과 동일한 의미를 가지며, SNP로 약기된다. SNP는 염색체의 단일부위에서 여러 가지 DNA 염기들 중의 하나에 나타나는 일반적인 돌연변이로, 인간의 게놈(genome)에는 약 3백만 개의 SNP가 존재하여 약 500 ~1,000염기당 1개꼴로 나타나며, 그 중 약 20만개가 단백질을 만드는 유전자에 존재하는 cSNP일 것으로 추정된다.

SNP는 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고, 이에 의하여 개인의 유전적 다양성이 발생한다. 즉 DNA사슬의 특정부위에 어떤 사람은 아데닌(adenine; A)을 가지고 있는 반면 어떤 사람은 시토신(cytosine; C)을 가지고 있는 것이다. 이런 미세한 차이(SNP)에 의하여 각 유전자의 기능이 달라질 수 있고 이런 것들이 상호 작용하여 서로 다른 모양의 사람을 만들고 서로 다른 질병에 대한 감수성의 차이를 만들어 낸다. 따라서 예를 들어, 간염에 걸리는 사람과 걸리지 않는 사람 간의 유전적 차이를 찾아낼 수 있다면 어떤 이유에서 간염에 대한 감수성이 달라지는지의 기능을 알아낼 수 있게 된다. 이를 이용하여 간염의 예방이나 치료에 사용되는 약품을 개발할 수 있을 것이라는 것이 인간유전체 연구의 궁극적인 목적이다.

본 발명의 일 구체예에서 “리얼타임 PCR(Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)” 이란, 실시간 중합효소연쇄반응, 큐 PCR(quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)이라고도 하며, 목표 DNA분자의 증폭과 양을 동시에 측정하는 분자생물학 실험 기법이다. 일반적으로 사용되는 RT-PCR은 역전사 중합연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction)을 말하며, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)이 아니다. 그러나 모든 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자들이 이것을 명확하게 구분하여 명명하는 것은 아니다. 실시간 중합효소연쇄반응은 DNA 샘플에서 하나 또는 그 이상의 특정 서열을 위해 절대적인 유전자 복제 수 또는 상대적인 양을 검출할 수 있다.

실험의 진행은 일반적인 중합효소연쇄반응을 따른다. 중요한 특징은, 증폭된 DNA가 실시간으로 측정된다는 것이다. 이 점이 마지막에서 DNA가 관측이 되는 기본적인 중합효소연쇄반응과의 차이점이다. 두가지의 일반적인 방법이 실시간 중합효소연쇄반응에서 사용된다. (1) 아무 DNA 이중나선에 끼어들어갈 수 있는 불특정한 형광염색, (2) 올리고뉴클레오티드로 이루어진 서열-특이적 DNA탐침, 형광으로 보고자가 라벨되어있고, 상보적인 DNA목표에 결합한 뒤 검출된다. 종종, 실시간 중합효소연쇄반응은 세포 또는 조직의 mRNA와 코팅되지 않은 RNA(non-coding RNA)를 수량화하기 위해 역전사 중합연쇄반응과 결합되어 행해진다.

본 발명의 일 구체예에서 "유전자 발현 억제"란, 유전자 염기서열에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA 등으로 유전자의 발현을 억제하는 것을 의미한다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)으로서, 생체 내 뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다. 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있는 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

상기 siRNA(small interfering RNA)는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 사용된다. 본 발명에서 siRNA 분자가 이용되는 경우, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조 또는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 불일치(mismatch)(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 팽창/돌출(bulge)(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 상기 siRNA분자는 이에 제한되지는 않으나, 전체 길이가 15 내지 30 염기, 바람직하게는 19 내지 21 염기일 수 있다.

상기 shRNA(short hairpin RNA)은 45 내지 70 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서, 타겟유전자 siRNA 염기서열의 센스가닥과 상보적인 안티센스가닥 사이에 3-10개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후, 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노 바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 루프(loop)가 있는 헤어핀 구조의 shRNA가 만들어지고 세포내의 다이서(dicer)에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다.

상기 마이크로 RNA(microRNA)는 발생, 분화, 증식, 보존 및 아폽토시스 등 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 마이크로 RNA는 일반적으로 타겟 mRNA를 불안정하게 하거나, 번역을 방해함으로써 타겟 mRNA를 코딩하는 유전자의 발현을 조절한다.

상기 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예를 들어, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 그의 결합) 역시 당분야에서 공지된 내용으로부터 적절히 선택할 수 있으며, 상기 유전자의 발현 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA 외에도 상기 유전자의 발현을 억제하는 물질이면 어떤 것이든 가능하다.

본 발명의 일 구체예에서 "단백질 활성 억제"란, 단백질에 특이적인 항체 또는 그 항원 결합 단편으로 타겟 단백질의 활성을 억제하는 것을 의미한다.

상기 항체란, 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 보다 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(Light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(Heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 일 구체예에서 "예방"이란, HMGB1 유전자와 가와사키병 증상 발생에 있어서의 연관성을 규명하고, 분석된 데이터를 바탕으로 가와사키병 증상 발생 이전에 그 위험도를 예측하여 적절한 관리를 하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서 “진단”이란, HMGB1 유전자와 가와사키병 증상에 있어서의 연관성을 규명하고, 분석된 데이터를 바탕으로 가와사키병 증상을 확인하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 생물학적 시료로부터 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125를 확인하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 증상 예측 방법을 제공하고, 상기 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 의 존재가 확인될 경우에 관상동맥 병변이 형성될 가능성이 높을 것으로 예측하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 증상 예측 방법을 제공하며, 상기 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 의 존재가 확인될 경우에 정맥내 면역글로불린저항성이 높을 것으로 예측하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 증상 예측 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, HMGB1 유전자 다형성 rs1412125의 스크리닝용 프라이머, 또는 지노타이핑용 프라이머를 포함하는 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트를 제공하고, 상기 키트는 관상동맥 병변이 형성될 가능성을 예측하는 것인 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트를 제공하며, 상기 키트는 정맥내 면역글로불린 저항성을 예측하는 것인 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체에에서, HMGB1 유전자 다형성 rs1412125의 발현 억제제, 또는 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 가 발현된 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 발현 억제제는 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드,　siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 발현된 단백질의 활성 억제제는 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 에 특이적인 항체, 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 것인 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 관상동맥 병변을 치료하는 것인 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 정맥내 면역글로불린 저항성을 감소시키는 것인 가와사키병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명은 HMGB1 유전자 다형성을 이용한 가와사키병 증상 예측 방법에 관한 것으로, 본 발명의 증상 예측 방법은 가와사키병 환자에게서 관상동맥 병변 형성 가능성, 또는 정맥내 면역글루불린 저항성이 발생할 가능성을 사전에 예측 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 가와사키병 환자의 시료로부터 HMGB1 유전자의 시퀀싱 수행

본 연구는 2012년부터 2015년까지 서울 세브란스 아동병원 소아과에서 모집된 가와사키병 환자를 대상으로 수행하였다. 가와사키병의 판정은 일본 가와사키병 연구위원회 (Kawasaki Disease Research Committee)의 기준에 따라 소아과 의사가 진단하였다. 불완전하거나 비정형인 가와사키병 환자는 제외하였다. 대조군으로는 과거 가와사키병 병력이 없고, 미용상의 이유로 병원을 방문한 건강한 유아를 선정하였다. 모든 실험은 참가자들의 서명 동의를 받아 연세대학교 윤리위원회의 승인을 받았으며(승인번호 4-2008-0055), 임상 실습에 관한 국가 규정(ICH E6)과 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행하였다. 환자군 및 대조군 아동에 대한 관상동맥 병변(coronary artery lesions; CAL)은 미국 심장 협회(American Heart Association; AHA)와 일본 보건성의 기준에 따른 동맥류(Z 점수> 2.5)로서, 심초음파로 측정하였다. 정맥내 면역글로불린(intravenous immunoglobulin; IVIG) 저항성은 정맥내 면역글로불린 치료 완료 후 36 시간 이상 지속되거나 재발하는 열(38℃ 이상)이 있는 경우로 정의하였다.

가와사키병 환자와 대조군에서 관상동맥 병변 형성과 정맥내 면역글로불린 저항성을 비교한 결과를 표 1에 기재하였다.

Characteristics	KD Cases (N = 265)	Controls (N = 203)
Male gender	172 (64.9%)	77 (37.9%)
Mean (SD) age (months)	35.31±28.07	116.96±33.77
CAL formation	45 (17.0%)
IVIG resistance	38 (14.3%)

24명의 피험자(12명의 환자군 및 12명의 대조군)로부터 수득된 각 전혈 시료에 대한 게놈 DNA는 QIAmp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였고, Epoch 마이크로플레이트 분광광도계(BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 정량화하였다.

원인 변이를 확인하기 위해 각 시료의 HMGB1 유전자를 염기서열 분석하였다. 분석을 위한 게놈 서열은 GenBank(http: //www.ncbi/nlm.nih.gov/) 데이터베이스로부터 얻었고, 유전자의 엑손 및 프로모터 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머는 Primer3 소프트웨어(http://carbon.bineer.co.kr/primer3plus)를 사용하여, 유전자의 엑손 및 프로모터 영역을 증폭시킨 PCR 프라이머를 설계 하였다. PCR 반응액은 2.5 mM MgCl₂, 10x 반응 완충액, 각 dNTP 2.5 mM, 각 프라이머 0.5 μμM, Taq DNA 중합 효소(SolgTM) 0.25 U, 및 게놈 DNA 10 ng을 포함하는 총 30 ㎕의 볼륨으로 설계하였고, 표 2의 조건으로 PCR 수행하였다.

1	initial denaturation	96C for 5 min
2	35 cycles	96C for 30 s
		62C for 30
		72C for 60 s
3	final extension cycle	72C for 10 min

PCR 산물은 MEGA quick-spin total Fragment DNA 정제 키트(iNtRON Biotechnology, Korea)로 처리하여 정제하였고, 제조사의 프로토콜에 따라 ABI Prism 3730xl DNA 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)상의 BigDye Terminator chemistry를 사용하여 시퀀싱하였다. DNA 다형성은 PolyPhred 프로그램 (http://droog.gs.washington.edu/polyphred/)을 사용하여 확인하였다. Haploview 소프트웨어 버전 4.2(Availability: http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)를 사용하여 태깅SNP를 선택하였다.

태깅SNP의 유전자 타이핑은 TaqMan® fluorogenic 5'-nuclease assay(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 중복으로 수행하였다. 보다 구체적으로, PCR은 QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여 15 ng의 게놈 DNA, 및 40 나노 TaqMan SNP Genotyping Assay가 들어있는 TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)를 포함하는 10 ㎕의 최종 부피로 하되, 온도 조건은 95 ℃에서 10 분간 초기 변성시킨 후, 95 ℃에서 15 초 변성, 및 60 ℃에서 1 분간 신장을 45 사이클로 반복하였다. PCR 후, 형광을 측정하고 QuantStudio ™ 6 FlexReal-Time PCR 소프트웨어 v1.2 (Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다.

실시예 2. 가와사키병 환자의 시료로부터 HMGB1 유전자의 연관성 분석

실시예 1의 데이터에 대한 모든 통계 분석은 Windows 10 플랫폼에서 R 소프트웨어 (버전 3.4.0)를 사용하여 수행하였다. 가와사키병 환자와 대조군 사이의 유전자형과 대립 유전자 빈도의 통계적 차이는 χ2 검사 또는 Fisher 's exact test를 사용하여 평가하였다. 관상동맥 병변 형성이 있거나 없는 가와사키병 소아, 및 정맥내 면역글로불린 저항성 또는 감수성이 있는 환자의 유전자형과 대립 유전자 빈도의 통계적 차이를 χ2 검정으로 평가하였고, Bonferroni 테스트는 여러 테스트값의 보정을 위해 사용하였다. odds ratio(OR), 95 % CI(confidence interval), 및 상응하는 P 값에 대한 이원 다중 로지스틱 회귀 분석을 연령과 성별에 따라 실시하였다.

가와사키병과 정상 대조군에서 HMGB1 유전자의 유전자형과 대립 형질 빈도를 표 4에 나타내었다. 연구 대상자는 265명의 가와사키병 환자와 203명의 대조군으로 구성하였다. 이들의 평균 연령은 환자군이 35.31 개월, 대조군은 116.96 개월이었다. 분석 결과, 265명의 환자군 중 45명(17.0 %)에서 관상동맥 병변이 발생했으며, 38명(14.3 %)이 초기 정맥내 면역글로불린 치료에 저항성을 보였다. 원인 SNP 발견을 위한 전체 HMGB1 유전자 시퀀싱에 의해 총 2개의 SNP를 확인하였다. 상기 SNP의 염기서열 등에 대한 정보는 dbSNP 데이터베이스 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)에서 확인 가능하다.

형질 분석의 결과에 기초하여 유전자형 분석을 위해 두 개의 태깅 SNP(rs1412125 및 rs117077167)를 선택하였다. 상기 SNP들의 다형성 정보를 하기 표 3에 나타내었다.

해당 유전자	RS명	다형성정보
HMGB1	rs1412125	HMGB1 유전자의 9,543번째에 위치하는 염기 C가 T로 치환
HMGB1	rs117077167	HMGB1 유전자의 9,050번째에 위치하는 염기 G가 T로 치환

그러나 태깅 SNP는 5 가지 유전 모델(공동 우성, 우성, 열성, 과도한, 또는 로그 첨가 모델) 하에서 환자군 및 대조군의 유전자형 또는 대립 유전자 빈도와 유의한 상관 관계가 없는 것으로 나타났다. 이를 하기 표 4에 나타내었다.

SNP	rs1412125					rs117077167
Genotype	AA	GA	GG			CC	CA
KD (%) (n = 265)	159 (60)	90 (34)	16 (6)			250 (94.3)	15 (5.7)
Control (%)(n = 203)	124 (61.1)	69 (34)	10 (4.9)			194 (95.6)	9 (4.4)
Model	Codominant	Dominant	Recessive	Overdominant	Log-additive	Codominant	Log-additive
P value	0.287	0.413	0.288	0.182	0.781	0.796	0.796
Allele	A	G				C	A
KD (%)(n = 265)	408 (77)	122 (23)				515 (97.2)	15 (2.8)
Control (%)(n= 203)	317 (78.1)	89 (21.9)				397 (97.8)	9 (2.2)
P value	0.690					0.556

관상동맥 병변이 있거나 없는 가와사키병 환자에서 HMGB1 SNP rs1412125 유전자형과의 연관성을 분석하였다. 분석 결과, 열성 모델에서 SNP rs1412125와 관상동맥 병변 형성은 관련이 있는 것으로 나타났다. 상기 결과를 표 5에 나타내었다. HMGB1(rs1412125)의 GG 유전자형을 지닌 개체의 경우, 관상동맥 병변을 동반하는 가와사키병 환자의 빈도는 15.6%, 관상동맥 병변을 동반하지 않는 가와사키병 환자의 빈도는 4.1% 였다. GG 유전자형을 지닌 개체의 경우에는 관상동맥 병변을 동반한 가와사키병 환자의 빈도가 더 높았다(OR = 4.98, 95 % CI = 1.69-14.66, P = 0.005). HMGB1 SNP rs117077167 유전자형은 가와사키병 환자의 관상동맥 병변 발생과 통계적으로 유의한 연관성이 없는 것으로 나타났다.

SNP	rs1412125
Genotype	AA	GA	GG
CAL (%)(n = 45)	26 (57.8)	12 (26.7)	7 (15.6)
Without (%) (n = 220)	133 (60.5)	78 (35.5)	9 (4.1)
Allele	A	G
CAL (%) (n = 45)	64 (71.1)	26 (28.9)
Without (%) (n = 220)	344 (78.2)	96 (21.8)
Dominant P value	0.722
Recessive P value	0.005^*
Allelic P value	0.147
*Significant (P < 0.05) values are in bold.

마지막으로, 정맥내 면역글로불린 저항성이 있거나 없는 가와사키병 환자에서 HMGB1 SNP rs1412125 유전자형과의 연관성을 분석하였다. 상기 결과를 표 6에 나타내었다. 분석 결과, SNP rs1412125는 열성 (OR = 4.11, 95 % CI = 1.38-12.23, P = 0.017), 및 대립 형질(OR = 1.80, 95 % CI = 1.06-3.06, P = 0.027)에서 정맥내 면역글로불린 저항성과 관련이 있었다. HMGB1(rs1412125)의 GG 유전자형을 지닌 개체의 경우, 정맥내 면역글로불린 저항성을 동반하는 가와사키병 환자의 빈도는 15.8%, 정맥내 면역글로불린 저항성을 동반하지 않는 가와사키병 환자의 빈도는 4.4% 였다. GG 유전자형을 가진 가와사키병 소아는 정맥내 면역글로불린 반응이 없는 비율이 더 높았다. rs1412125 G 대립 유전자의 경우는 정맥내 면역글로불린 저항성(32.9%)이 정맥내 면역글로불린 감수성(21.4 %)빈도보다 유의하게 높았다.

HMGB1 SNP rs117077167 유전자형은 가와사키병 환자의 정맥내 면역글로불린 저항성과통계적으로 유의한 연관성이 없는 것으로 나타났다.

SNP	rs1412125
Genotype	AA	GA	GG
Resistant (%) (n = 38)	19 (50.0)	13 (34.2)	6 (15.8)
Responsive (%)(n = 227)	140 (61.7)	77 (33.9)	10 (4.4)
Allele	A	G
Resistant (%) (n = 38)	51 (67.1)	25 (32.9)
Responsive (%) (n = 227)	357 (78.6)	97 (21.4)
Dominant P value	0.164
Recessive P value	0.017^*
Allelic P value	0.027^*
*Significant (P < 0.05) values are in bold.

상기 결과로부터 가와사키병이 HMGB1 유전자의 SNP와 깊은 연관성이 있다는 것을 알 수 있었고, 특히 SNP rs1412125 유전자형인 경우에, 가와사키병 환자의 관상동맥 병변 형성, 또는 정맥내 면역글로불린 저항성이 발생하는 빈도가 높다는 것을 알 수 있었다.

Claims

생물학적 시료로부터 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125를 확인하는 단계를 포함하는 가와사키병에 대한 증상 예측 방법으로서,
상기 증상은 관상동맥 병변 형성, 또는 정맥내 면역글로불린저항성인 것인, 가와사키병에 대한 증상 예측 방법.
제 1항에 있어서,
상기 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 의 존재가 확인될 경우에 관상동맥 병변이 형성될 가능성이 높을 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 증상 예측 방법.
제 1항에 있어서,
상기 HMGB1 유전자 다형성 rs1412125 의 존재가 확인될 경우에 정맥내 면역글로불린저항성이 높을 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 가와사키병에 대한 증상 예측 방법.
HMGB1 유전자 다형성 rs1412125의 스크리닝용 프라이머, 또는 지노타이핑용 프라이머를 포함하는 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트로서,
상기 증상은 관상동맥 병변 형성, 또는 정맥내 면역글로불린저항성인 것인, 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트.
제 4항에 있어서,
상기 키트는 관상동맥 병변이 형성될 가능성을 예측하는 것인, 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트.
제 4항에 있어서,
상기 키트는 정맥내 면역글로불린 저항성을 예측하는 것인, 가와사키병에 대한 증상 예측용 키트.
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