JP2019512014A - がん診断法および治療法におけるｐｉＲＮＡを使用する組成物および方法 - Google Patents

がん診断法および治療法におけるｐｉＲＮＡを使用する組成物および方法 Download PDF

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Abstract

異常に発現されるｐｉＲＮＡ、遺伝的に関連するｐｉＲＮＡ、ならびにそれらの、がんのリスクおよび重症度との関係が提供される。がんを処置するための、ｐｉＲＮＡを使用する組成物および方法が提供される。がんを処置するための、対象を診断し、活性薬剤の有効性を決定する方法も提供される。バリアントｐｉＲＮＡをがんと相関させる方法も開示される。一局面では、脳がんについて対象を処置する方法が提供され、この方法は、有効量の野生型ｐｉＲ−２７９９、ｐｉＲ−１８９１３、ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１１７１４、ｐｉＲ−３２６６、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子を上記対象に投与して、上記対象の細胞内におけるｐｉＲＮＡの発現を増加させるステップを含む。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年２月２６日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／３００，７４８（これは、その全体が参考として援用される）の利益およびそれに対する優先権を主張する。
連邦政府によって資金供与を受けた研究または開発についての声明
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＡｇｒｅｅｍｅｎｔ Ｙａｌｅ／ＮＣＩ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒａｎｔ Ｒ０１ ＣＡ１５４６５３の下、Ｙａｌｅ基金および／または政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列表の参照
「ＹＵ＿６９０１＿ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前で、２０１７年２月２７日に作成され、３９，５７７バイトのサイズを有するテキストファイルとして提出された配列表が、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従って、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は概して、がんの治療法および診断法を扱う分野のものである。
がんに対するより有効な診断および処置戦略を至急開発する必要がある。例えば、化学および／または放射線療法などの従来の療法は、腫瘍特異性、薬物／放射線抵抗性、および重大な副作用のため、大抵はがんを根絶することができない。
低分子ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）は、細胞の発達、生理および病理における遺伝子発現およびゲノム完全性の重要な調節因子としての役割を考慮すると、がんの処置において大きな治療可能性を有する。ｎｃＲＮＡベースの治療法についての現行のトランスレーショナルリサーチは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ベースの手法に注目しており、これらは現在、治験において試験されている。これらの高い有効性、標的特異的な作用および低い毒性により、がんの現行の従来処置に重要な利点がもたらされる。歴史的には、６種類のＮＡベースの産物：アンチセンス、リボ核酸阻害（ＲＮＡｉ）、遺伝子療法、ヌクレオシドアナログ、リボザイム、およびアプタマーが存在する。
ＰＩＷＩ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）は、転移因子の可動化からの生殖細胞系幹細胞の保護において、高度に保存された機能を有する低分子（大部分が２６〜３２ｎｔ）ノンコーディングＲＮＡである。マイクロＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡと同様に、ｐｉＲＮＡは、アルゴノートタンパク質（ＡＧＯサブファミリータンパク質よりもＰＩＷＩ、図１Ａ）とともに、配列特異的な遺伝子調節におけるガイドとして作用し、しかしよりはるかに豊富に存在する−３０，０００種より多くのｐｉＲＮＡがヒトにおいて特定されているが、その他の哺乳動物細胞では数百万種が特定されているため、この数字はよりはるかに大きくなる可能性がある。ＰＩＷＩ−ｐｉＲＮＡリボ核タンパク質複合体は、クロマチンリモデリング機構を相補的ゲノム標的に動員し、そこで遺伝性のエピジェネティック修飾が確立される（哺乳動物ではＤＮＡメチル化を介して）。最近の研究では、ｐｉＲＮＡがｍＲＮＡサイレンシングにおいて転写後に作用する可能性も提案されている。
トランスポゾンなどの可動遺伝エレメントは、ゲノムにとって常なる脅威である。ＰＩＷＩ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）は、ハエ、魚および哺乳動物と多岐にわたる生物において、生殖細胞系細胞をトランスポゾンから保護する。ｐｉＲＮＡは、ｐｉＲＮＡが結合するＰＩＷＩクレードタンパク質に応じて長さ２５〜３３ｎｔである。ｐｉＲＮＡはｐｉＲＮＡクラスターと呼ばれる特徴的なトランスポゾンに由来するが、各座位由来のｐｉＲＮＡはトランスポゾンの大部分に及ぶ配列の複雑な混合物を特徴とする。ｐｉＲＮＡクラスターはセンスまたはアンチセンス方向に転写され、長い一本鎖ＲＮＡがｐｉＲＮＡ産生の基盤として機能する。
ｐｉＲＮＡのバイオジェネシスはダイサーとは無関係であり、その他のヌクレアーゼが必要である。２つのバイオジェネシス経路がｐｉＲＮＡ産生において重要である。まず、一次プロセシング経路で一次ｐｉＲＮＡが生成され、次いでこれらが、ピンポンループと呼ばれる増幅サイクルで増幅される。一次バイオジェネシス経路では、長鎖トランスポゾン転写物がまずヌクレアーゼｚｕｃｃｈｉｎｉにより切断され（図１Ａおよび１Ｂ）、それによりおそらく、一次ｐｉＲＮＡの５’末端が生成される。
ピンポンサイクル（図１Ｂの下右パネルを参照のこと）では、成熟センス一次ｐｉＲＮＡが、ＰＩＷＩクレードタンパク質を同一のｐｉＲＮＡクラスター由来のアンチセンス転写物の相補的配列に導く。ＰＩＷＩタンパク質は、自身の、標的アンチセンス転写物を切断して新たな５’末端を生成するスライサー活性を使用する。この５’末端には、別のＰＩＷＩタンパク質が結合する。その後のステップでは、３’末端が成熟ｐｉＲＮＡの長さにトリミングされ、成熟アンチセンス二次ｐｉＲＮＡが生じ、ここでこれが、ｐｉＲＮＡクラスターから転写されたセンス転写物を標的とすることができる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒでは、２つのＰＩＷＩタンパク質ＡｕｂｅｒｇｉｎｅおよびＡｇｏ３が二次ｐｉＲＮＡ産生において協働し、センスおよびアンチセンスｐｉＲＮＡを生成する。しかし、アンチセンスｐｉＲＮＡが優位を占め、Ｅ３リガーゼおよびＴｕｄｏｒドメインを含有するＱｉｎと呼ばれるタンパク質が、このような異型のピンポンサイクルをモジュレートすると考えられる。マウス生殖細胞系では、ＰＩＷＩタンパク質ＭＩＬＩおよびＭＩＷＩがｐｉＲＮＡ生成において共同で働く。トリミング後、メチルトランスフェラーゼＨＥＮ１によりｐｉＲＮＡは３’末端にメチル基を受け取る。一次ｐｉＲＮＡもこのような修飾を有する。
ｐｉＲＮＡは、ＰＩＷＩタンパク質を転移因子由来の相補的ＲＮＡに導く。ＲＮＡ干渉と同様に、ＰＩＷＩタンパク質はトランスポゾンＲＮＡを切断し、サイレンシングをもたらす。ハエでは、（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒでＰＩＷＩタンパク質をコードする）ｐｉｗｉ、ａｕｂおよびＡｇｏ３における変異が、生殖細胞系におけるトランスポゾンサイレンシングに必要である。マウスＰＩＷＩタンパク質ＭＩＬＩおよびＭＩＷＩが遺伝的に不活化されると同様の知見が得られた。ここで、長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）および末端反復配列（ＬＴＲ）レトロトランスポゾンが蓄積した。
ＰＩＷＩ−ｐｉＲＮＡ経路の活性が生殖細胞系に限定されるという長年にわたる見解にもかかわらず、体細胞組織、特にがんの状況における役割についての証拠が急速に積み上がっている。１１のがん型において異常なＰＩＷＩファミリータンパク質発現が好ましくない予後と関連しており、１４のがん型においてｐｉＲＮＡ発現が観察されている。現在までに、生殖細胞系以外でのｐｉＲＮＡ発現についての最も包括的な研究では、Ｍａｒｔｉｎｅｚらが、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ ＡｔｌａｓのＲＮＡ−ｓｅｑデータを利用して、１１の解剖学的部位（膀胱、乳房、結腸、頭部／頸部、腎臓、肺、卵巣、前立腺、胃、甲状腺、および子宮）のそれぞれに由来する正常および悪性組織の両方で数百種のｐｉＲＮＡが発現し、ｐｉＲＮＡ発現プログラムが、臨床的に意義のある、腫瘍型特異的な様式で調節不全となることを実証した。
異常なｐｉＲＮＡ発現ががんの特質となり得ることを研究が示している。ただし、ヒトゲノムにおける２０，０００種より多くのｐｉＲＮＡ遺伝子および変則的なｐｉＲＮＡ発現が、がん型に特異的であると考えられる。したがって、その異常な発現が特定のがんの頻度および／または重症度と相関するｐｉＲＮＡを特定し、それに基づく治療手段を設計する必要が依然としてある。
したがって、本発明の目的は、神経膠芽腫、肝臓がん、前立腺がん、肺がん、および乳がんを含む特定のがん型における、遺伝的に関連するか異常に発現されるその特異的なｐｉＲＮＡを提供することである。
本発明の別の目的は、それを必要とする対象における異常なｐｉＲＮＡ発現を矯正するまたは補償するための治療剤およびその使用方法を提供することである。
本発明の別の目的は、対象を診断する方法または対象の疾患の重症度を予測する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、治療介入の有効性を決定する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、新たな異常なｐｉＲＮＡをスクリーニングする方法を提供することである。
異常に発現されるｐｉＲＮＡが開示される。ｐｉＲＮＡの異常な発現は、がんの有病率および予後と相関し得る。一部の例では、１つまたは複数の野生型ｐｉＲＮＡが、正常または対照組織と比較してがん組織において減少していることがある。このような例では、野生型ｐｉＲＮＡ、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、標的ｐｉＲＮＡの発現を増加させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。さらに、またはあるいは、１つまたは複数の野生型ｐｉＲＮＡが、正常または対照組織と比較してがん組織において増加していることがある。このような例では、ｐｉＲＮＡの阻害剤が、標的ｐｉＲＮＡの発現を減少させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。
さらに、ｐｉＲＮＡをコードするゲノム配列が、野生型と比較して１つまたは複数の変異（例えば、一塩基多型などの多型）を含有することがあり、このような変異が、がんの有病率および予後と関連し得ることが分かっている。通常、野生型ｐｉＲＮＡ、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、標的ｐｉＲＮＡの発現を増加させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。
異常に発現されるｐｉＲＮＡ、ならびにこれらの、がんのリスクおよび重症度との関連性の検出は、がんのバイオマーカーとしても、がんを処置するための処置戦略を開発するのにも使用可能である。したがって、がんを処置するための、ｐｉＲＮＡを使用する組成物および方法が提供される。がんを処置するための、対象を診断し、活性薬剤の有効性を決定する方法も提供される。バリアントｐｉＲＮＡをがんと相関させる方法も開示される。
図１Ａは、Ｋｉｍら、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０巻（２号）：１２６〜３９頁、２００９年から得た、そのバイオジェネシス機構およびそれが関連するアルゴノートタンパク質の種類に基づき３種のクラスに分類される低分子ＲＮＡを描写する模式図である：マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、内在性低分子干渉ＲＮＡ（エンド−ｓｉＲＮＡまたはｅｓｉＲＮＡ）およびＰＩＷＩ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）。ｐｉＲＮＡは、クロマチンおよび転写物の両方を標的とし、これにより、広範なサーベイランスの下、ゲノムおよびトランスクリプトームの両方を維持することができる、２０〜３０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡである。図１Ｂは、体細胞エピジェネティックプログラミング、幹細胞機能および記憶における役割を有する（Ｒｏｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ、５０５巻、３５３〜３５９頁、２０１４年）、体細胞におけるｐｉＲＮＡの機能を示す模式図であり、数百種のｐｉＲＮＡが、組織特異的様式で１０種の臓器部位のそれぞれの正常体細胞組織において発現され（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．５巻、論文番号１０４２３、２０１５年）、非トランスポゾンタンパク質コード遺伝子の調節が為される（Ｆｕ、ＪａｃｏｂｓおよびＺｈｕ、ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．、１１巻（１０号）：１３０１〜１２頁、２０１４年）。
図２Ａは、ｐｉＲＮＡバリアントおよび神経膠腫の関連解析の結果を示すマンハッタンプロットである。神経膠腫リスクとの統計的に有意なまたは示唆に富む関連を実証する５種のＳＮＰが標識されている：ｐｉＲ−２７９９、ｐｉＲ−１８９１３、ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１１７１４およびｐｉＲ−３２６６；点線は、ボンフェローニ調整された有意性閾値を表し、Ｐ＝３．５０×１０−５である。ｐｉＲＮＡ ＳＮＰは、ｘ軸に物理的ゲノム順序に従ってプロットされる。図２Ｂ〜図２Ｆは、ｐｉＲ−２７９９、ｐｉＲ−１８９１３、ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１１７１４およびｐｉＲ−３２６６領域におけるＭＡＦ＞１％を有する、全１，０００種のゲノムＳＮＰの領域インピュテーションを示すプロットである。関連結果は、ｐｉＲＮＡ Ｂａｎｋ由来のｐｉＲＮＡ、公知のタンパク質コード遺伝子、およびＨａｐＭａｐ ＣＥＵ集団由来の連鎖不平衡（ＬＤ）パターンの状況で提示されている。 図２Ａは、ｐｉＲＮＡバリアントおよび神経膠腫の関連解析の結果を示すマンハッタンプロットである。神経膠腫リスクとの統計的に有意なまたは示唆に富む関連を実証する５種のＳＮＰが標識されている：ｐｉＲ−２７９９、ｐｉＲ−１８９１３、ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１１７１４およびｐｉＲ−３２６６；点線は、ボンフェローニ調整された有意性閾値を表し、Ｐ＝３．５０×１０−５である。ｐｉＲＮＡ ＳＮＰは、ｘ軸に物理的ゲノム順序に従ってプロットされる。図２Ｂ〜図２Ｆは、ｐｉＲ−２７９９、ｐｉＲ−１８９１３、ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１１７１４およびｐｉＲ−３２６６領域におけるＭＡＦ＞１％を有する、全１，０００種のゲノムＳＮＰの領域インピュテーションを示すプロットである。関連結果は、ｐｉＲＮＡ Ｂａｎｋ由来のｐｉＲＮＡ、公知のタンパク質コード遺伝子、およびＨａｐＭａｐ ＣＥＵ集団由来の連鎖不平衡（ＬＤ）パターンの状況で提示されている。 図２Ａは、ｐｉＲＮＡバリアントおよび神経膠腫の関連解析の結果を示すマンハッタンプロットである。神経膠腫リスクとの統計的に有意なまたは示唆に富む関連を実証する５種のＳＮＰが標識されている：ｐｉＲ−２７９９、ｐｉＲ−１８９１３、ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１１７１４およびｐｉＲ−３２６６；点線は、ボンフェローニ調整された有意性閾値を表し、Ｐ＝３．５０×１０−５である。ｐｉＲＮＡ ＳＮＰは、ｘ軸に物理的ゲノム順序に従ってプロットされる。図２Ｂ〜図２Ｆは、ｐｉＲ−２７９９、ｐｉＲ−１８９１３、ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１１７１４およびｐｉＲ−３２６６領域におけるＭＡＦ＞１％を有する、全１，０００種のゲノムＳＮＰの領域インピュテーションを示すプロットである。関連結果は、ｐｉＲＮＡ Ｂａｎｋ由来のｐｉＲＮＡ、公知のタンパク質コード遺伝子、およびＨａｐＭａｐ ＣＥＵ集団由来の連鎖不平衡（ＬＤ）パターンの状況で提示されている。
図３Ａ〜図３Ｃは、ｐｉＲ−５９８の構造および転写の影響を説明する。図３Ａは、ｐｉＲ−５９８の予測される二次構造およびｒｓ１４７０６１４７９（配列番号４８）の位置の図である。この図は、Ｍｆｏｌｄ ｖ．３．６ ＲＮＡフォールディングアルゴリズムによる予測から適応された。対形成した塩基は、接続線によって表示される。図３Ｂは、Ｕ８７におけるｐｉＲ−５９８模倣物の過剰発現によって影響される転写物が、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析に従って、示されている分子機能における役割を有するものについて濃縮されたことを示すベン図である。機能アノテーションに従って影響される遺伝子の濃縮のためのフィッシャーの直接検定を使用して、Ｐ値を生成した。図３Ｃは、Ｕ８７細胞のｐｉＲ−５９８処理後に、細胞死および細胞周期進行に関する、差次的に発現される転写物の機能的相互関係性を示すネットワーク視覚化である。陰影は、変化の程度に対応する色の強度により、それぞれ陰性対照と比べた、ｐｉＲ−５９８誘導性転写物過剰発現（「＊」で記す）および過少発現（「＃」で記す）を表示し；実線および点線は、それぞれ直接および間接の関係性を示す。 図３Ａ〜図３Ｃは、ｐｉＲ−５９８の構造および転写の影響を説明する。図３Ａは、ｐｉＲ−５９８の予測される二次構造およびｒｓ１４７０６１４７９（配列番号４８）の位置の図である。この図は、Ｍｆｏｌｄ ｖ．３．６ ＲＮＡフォールディングアルゴリズムによる予測から適応された。対形成した塩基は、接続線によって表示される。図３Ｂは、Ｕ８７におけるｐｉＲ−５９８模倣物の過剰発現によって影響される転写物が、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析に従って、示されている分子機能における役割を有するものについて濃縮されたことを示すベン図である。機能アノテーションに従って影響される遺伝子の濃縮のためのフィッシャーの直接検定を使用して、Ｐ値を生成した。図３Ｃは、Ｕ８７細胞のｐｉＲ−５９８処理後に、細胞死および細胞周期進行に関する、差次的に発現される転写物の機能的相互関係性を示すネットワーク視覚化である。陰影は、変化の程度に対応する色の強度により、それぞれ陰性対照と比べた、ｐｉＲ−５９８誘導性転写物過剰発現（「＊」で記す）および過少発現（「＃」で記す）を表示し；実線および点線は、それぞれ直接および間接の関係性を示す。 図３Ａ〜図３Ｃは、ｐｉＲ−５９８の構造および転写の影響を説明する。図３Ａは、ｐｉＲ−５９８の予測される二次構造およびｒｓ１４７０６１４７９（配列番号４８）の位置の図である。この図は、Ｍｆｏｌｄ ｖ．３．６ ＲＮＡフォールディングアルゴリズムによる予測から適応された。対形成した塩基は、接続線によって表示される。図３Ｂは、Ｕ８７におけるｐｉＲ−５９８模倣物の過剰発現によって影響される転写物が、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析に従って、示されている分子機能における役割を有するものについて濃縮されたことを示すベン図である。機能アノテーションに従って影響される遺伝子の濃縮のためのフィッシャーの直接検定を使用して、Ｐ値を生成した。図３Ｃは、Ｕ８７細胞のｐｉＲ−５９８処理後に、細胞死および細胞周期進行に関する、差次的に発現される転写物の機能的相互関係性を示すネットワーク視覚化である。陰影は、変化の程度に対応する色の強度により、それぞれ陰性対照と比べた、ｐｉＲ−５９８誘導性転写物過剰発現（「＊」で記す）および過少発現（「＃」で記す）を表示し；実線および点線は、それぞれ直接および間接の関係性を示す。
図４Ａ〜図４Ｄは、野生型（ＷＴ）またはバリアント（Ｖ）ｐｉＲ−５９８処理後の、グリア細胞生存率および軟寒天コロニー形成を示す棒グラフである。図４Ａ〜図４Ｃは、条件につき６回複製により、９６ウェルプレートにおいて、およそ２．５×１０３個のＵ８７（４Ａ）、Ａ１７２（４Ｂ）またはＮＨＡ（４Ｃ）細胞に、２５ｎＭ ｐｉＲ−５９８−ＷＴもしくはｐｉＲ−５９８−Ｖ模倣物または対照ＲＮＡオリゴをトランスフェクトした後の、対照と比べた生存率を示す。トランスフェクション後４８および９６時間目にＭＴＳを使用して、細胞生存率を定量化した。図４Ｄは、およそ１×１０４個の細胞に、示されているオリゴをトランスフェクトし、単細胞懸濁で軟寒天に２４時間後に三連で播種した後に形成されたコロニーの数を示す。播種３週間後にＩｍａｇｅＪを使用して、コロニーを計数した。ＮＣ：陰性対照；ＮＨＡ：正常ヒト星状細胞。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；エラーバーは、反復実験の標準偏差を表示する。 図４Ａ〜図４Ｄは、野生型（ＷＴ）またはバリアント（Ｖ）ｐｉＲ−５９８処理後の、グリア細胞生存率および軟寒天コロニー形成を示す棒グラフである。図４Ａ〜図４Ｃは、条件につき６回複製により、９６ウェルプレートにおいて、およそ２．５×１０３個のＵ８７（４Ａ）、Ａ１７２（４Ｂ）またはＮＨＡ（４Ｃ）細胞に、２５ｎＭ ｐｉＲ−５９８−ＷＴもしくはｐｉＲ−５９８−Ｖ模倣物または対照ＲＮＡオリゴをトランスフェクトした後の、対照と比べた生存率を示す。トランスフェクション後４８および９６時間目にＭＴＳを使用して、細胞生存率を定量化した。図４Ｄは、およそ１×１０４個の細胞に、示されているオリゴをトランスフェクトし、単細胞懸濁で軟寒天に２４時間後に三連で播種した後に形成されたコロニーの数を示す。播種３週間後にＩｍａｇｅＪを使用して、コロニーを計数した。ＮＣ：陰性対照；ＮＨＡ：正常ヒト星状細胞。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；エラーバーは、反復実験の標準偏差を表示する。
図５Ａは、正常プール脳組織検体と比べた多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）における（平均腫瘍組織シグナル強度 対 平均対照組織シグナル感度）、アレイに基づくｐｉＲＮＡ発現プロファイリングの結果およびｐｉＲ−８０４１過少発現の確認を示すプロットである。検出可能な発現レベルを有するｐｉＲＮＡが、各組織型における平均ｌｏｇ２（シグナル強度）に従ってプロットされる。そのうちいくつかがその後の細胞増殖解析において試験されたｐｉＲ−８０４１および他の著明なｐｉＲＮＡ（ｐｉＲ−５４０２２、ｐｉＲ−２０２４９、ｐｉＲ−１５９８８、ｐｉＲ−８２３、ｐｉＲ−６５１）が標識される。図５Ｂは、ｑＰＣＲによる個々の正常組織検体 対 腫瘍組織検体におけるｐｉＲ−８０４１発現レベルの検証を示すドットプロットである（Ｕ６（正常）および腫瘍細胞と比べたｐｉＲ−８０４１発現）。データは、低分子ＲＮＡ Ｕ６発現と比べたｌｏｇ２（ｐｉＲ−８０４１発現レベル）として提示される；線は、組織型による平均発現レベルを表示する。図５Ｃは、ｑＰＣＲによる正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）ならびに神経膠腫細胞株Ｕ８７およびＡ１７２におけるｐｉＲ−８０４１発現の測定値を示す棒グラフである。スチューデントｔ検定によって、正常検体 対 腫瘍検体ならびにＮＨＡと比べたＵ８７およびＡ１７２細胞株に関してｑＰＣＲ測定由来の発現レベルを解析した。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；エラーバーは、三連の測定値の標準偏差を表示する。
図６Ａ〜図６Ｄは、ｐｉＲ−８０４１および他のＧＢＭ過少発現ｐｉＲＮＡが、ＧＢＭ細胞増殖を低下させることを示す棒グラフである。図６Ａは、正常脳組織と比べて腫瘍において過少発現されるｐｉＲＮＡ（図の説明文に記される倍数変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ））または腫瘍および正常脳組織において等しく発現されるｐｉＲＮＡ（関連なし）のトランスフェクション後のＵ８７細胞増殖を示す。値は、陰性対照（ＮＣ）処理細胞と比べた、ｐｉＲＮＡ処理細胞のＭＴＳ曝露後の発色の比を表示する；点線は、ｐｉＲＮＡまたは陰性対照ＲＮＡ曝露後の等価な細胞生存率を表す。各時点でｐｉＲＮＡおよびＮＣ処理細胞生存率を比較することにより、統計的有意性を評価した。図６Ｂは、ｐｉＲ−８０４１上方調節後のＮＨＡ、Ａ１７２およびＵ８７細胞増殖を示す。値は、ｐｉＲ−８０４１処理細胞 対 ＮＣ処理細胞の相対的生存率を表示し、点線によって表示されるＮＣ処理からの逸脱により統計的有意性を評価した。図６Ｃは、ｐｉＲ−８０４１またはＮＣトランスフェクションの２１日後に軟寒天に形成されたＵ８７コロニーを示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、コロニーを計数した。図６Ｄは、１（０日目のみ）または２（０日目および３日目）回のｐｉＲ−８０４１処理後６日目のＵ８７細胞生存率を示す。ＮＳ、有意でない；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；エラーバーは、全図について、三連の実験の標準偏差を表示する。 図６Ａ〜図６Ｄは、ｐｉＲ−８０４１および他のＧＢＭ過少発現ｐｉＲＮＡが、ＧＢＭ細胞増殖を低下させることを示す棒グラフである。図６Ａは、正常脳組織と比べて腫瘍において過少発現されるｐｉＲＮＡ（図の説明文に記される倍数変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ））または腫瘍および正常脳組織において等しく発現されるｐｉＲＮＡ（関連なし）のトランスフェクション後のＵ８７細胞増殖を示す。値は、陰性対照（ＮＣ）処理細胞と比べた、ｐｉＲＮＡ処理細胞のＭＴＳ曝露後の発色の比を表示する；点線は、ｐｉＲＮＡまたは陰性対照ＲＮＡ曝露後の等価な細胞生存率を表す。各時点でｐｉＲＮＡおよびＮＣ処理細胞生存率を比較することにより、統計的有意性を評価した。図６Ｂは、ｐｉＲ−８０４１上方調節後のＮＨＡ、Ａ１７２およびＵ８７細胞増殖を示す。値は、ｐｉＲ−８０４１処理細胞 対 ＮＣ処理細胞の相対的生存率を表示し、点線によって表示されるＮＣ処理からの逸脱により統計的有意性を評価した。図６Ｃは、ｐｉＲ−８０４１またはＮＣトランスフェクションの２１日後に軟寒天に形成されたＵ８７コロニーを示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、コロニーを計数した。図６Ｄは、１（０日目のみ）または２（０日目および３日目）回のｐｉＲ−８０４１処理後６日目のＵ８７細胞生存率を示す。ＮＳ、有意でない；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；エラーバーは、全図について、三連の実験の標準偏差を表示する。
図７Ａ〜図７Ｂは、ｐｉＲ−８０４１が、細胞周期進行を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す。図７Ａは、ｐｉＲ−８０４１またはＮＣ処理４８時間後の細胞周期分布を示す棒グラフである。ヨウ化プロピジウムで染色することにより、ＤＮＡ含量のフローサイトメトリー解析によって細胞周期の段階を決定した；Ｄｅａｎ−Ｊｅｔｔ−Ｆｏｘ細胞周期モデリングアルゴリズムによるＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、割合を決定した。図７Ｂは、アネキシンＶおよびＰＩ染色のフローサイトメトリー解析によって決定される通り、ｐｉＲ−８０４１またはＮＣ処理４８時間後の初期または後期アポトーシス／壊死におけるＵ８７細胞の割合を示す棒グラフである。初期アポトーシス細胞は、アネキシンＶで染色されるが、ＰＩを排除する細胞として定義し、後期アポトーシス／壊死は、両方のプローブで染色される細胞であった。ＮＳ、有意でない；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；エラーバーは、三連の実験の標準偏差を表示する。
図８Ａは、ｐｉＲ−８０４１上方調節が、タンパク質合成、細胞生存および他の神経膠腫関連性機能に関する遺伝子の発現に影響することを示すヒストグラムである。列挙されている生物学的機能は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析に従って、多重比較のための調整後に、Ｕ８７細胞においてｐｉＲ−８０４１上方調節によって差次的に発現される遺伝子の間で統計的に有意に濃縮されている。バーは、特定の機能アノテーションにより影響される遺伝子の数を示す；菱形は、対数変換されたＦＤＲ調整Ｐ値を表示する（点線は、０．０５のＦＤＲ調整Ｐ値を示す）。図８Ｂは、Ｕ８７細胞のｐｉＲ−８０４１処理後の「結合組織細胞の減少した細胞生存率」および「減少したタンパク質合成」に関する、差次的に発現される転写物の上位ネットワークの図である。陰影は、変化の程度に対応する色の強度により、ｐｉＲ−８０４１上方調節後の陰性対照と比べた、転写物過剰発現（「＊」によって記される）および過少発現（「＃」によって記される）を表示し、（「！」）は、予測されるシグナル伝達経路阻害を表示する。実線および点線は、それぞれ直接および間接の関係性を示す。 図８Ａは、ｐｉＲ−８０４１上方調節が、タンパク質合成、細胞生存および他の神経膠腫関連性機能に関する遺伝子の発現に影響することを示すヒストグラムである。列挙されている生物学的機能は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析に従って、多重比較のための調整後に、Ｕ８７細胞においてｐｉＲ−８０４１上方調節によって差次的に発現される遺伝子の間で統計的に有意に濃縮されている。バーは、特定の機能アノテーションにより影響される遺伝子の数を示す；菱形は、対数変換されたＦＤＲ調整Ｐ値を表示する（点線は、０．０５のＦＤＲ調整Ｐ値を示す）。図８Ｂは、Ｕ８７細胞のｐｉＲ−８０４１処理後の「結合組織細胞の減少した細胞生存率」および「減少したタンパク質合成」に関する、差次的に発現される転写物の上位ネットワークの図である。陰影は、変化の程度に対応する色の強度により、ｐｉＲ−８０４１上方調節後の陰性対照と比べた、転写物過剰発現（「＊」によって記される）および過少発現（「＃」によって記される）を表示し、（「！」）は、予測されるシグナル伝達経路阻害を表示する。実線および点線は、それぞれ直接および間接の関係性を示す。
図９Ａは、ｐｉＲＮＡ−８０４１または対照正常細胞ＲＮＡのいずれかで処理した、Ｕ８７−ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）モデルにおける異種移植片腫瘍成長の数日間（０〜３１）にわたるルミネセンスの線グラフである。複数の時点におけるルシフェラーゼ発現頭蓋内腫瘍の生物ルミネセンス測定値。Ｐ値は、対照強度のパーセンテージとして、平均ｐｉＲ−８０４１処理腫瘍強度と共に提示される。ｐｉＲ−８０４１は、同所性異種移植片モデルにおける処理の１０日後に、Ｕ８７細胞成長をほぼ５０％有意に低下させる。図９Ｂは、腫瘍植え込み後１０日目の各処理群由来の代表的なマウスの画像を示す。
図１０は、２３，０００種のヒトｐｉＲＮＡを網羅するＡｒｒａｙＳｔａｒ ｐｉＲＮＡ発現マイクロアレイを使用した、１２対の肝臓がんおよびマッチする非悪性肝臓検体のためのｐｉＲＮＡ発現プロファイリング解析の結果を示すボルケーノ（ｖｏｌｃａｎｏ）プロットである。破線は、ｘ軸に沿った腫瘍および正常試料の間の２倍の差次的発現、ならびにｙ軸に沿ったＰ＝０．０５の有意性閾値を表示する。左上および右上セクションのドットは、これらの閾値の両方を超えるｐｉＲＮＡを示す（ｎ＝３１種のｐｉＲＮＡ）。特に興味深いのは、３倍以上で統計的に有意に差次的に発現された、３種のｐｉＲＮＡのｐｉＲ−３７２１３、ｐｉＲ−１７６５６およびｐｉＲ３３４０４（図に標識）である。
図１１Ａ〜図１１Ｂは、ｐｉＲ−３７２１３のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗がん効果を示す。ｐｉＲ−３７２１３は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞増殖を低下させる。図１１Ａは、ｐｉＲ−３７２１３模倣物トランスフェクション後の、Ｈｅｐ３Ｂ肝臓腫瘍細胞およびＴＨＬＥ−３正常肝臓細胞における細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）によって測定される細胞成長への影響を示す線グラフである。エラーバーは、標準誤差を表す。図１１Ｂは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞への対照低分子ＲＮＡ（左バー）またはｐｉＲ−３７２１３（右バー）によるトランスフェクション２週間後の実験結果を示す棒グラフである。ｐｉＲ−３７２１３トランスフェクトＨｅｐ３Ｂプレートにおけるコロニーの数は、対照オリゴ処理プレートにおいて形成されたコロニーの数と比べておよそ７０％低下した（図２Ｂ、Ｐ＜０．０１）。 図１１Ａ〜図１１Ｂは、ｐｉＲ−３７２１３のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗がん効果を示す。ｐｉＲ−３７２１３は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞増殖を低下させる。図１１Ａは、ｐｉＲ−３７２１３模倣物トランスフェクション後の、Ｈｅｐ３Ｂ肝臓腫瘍細胞およびＴＨＬＥ−３正常肝臓細胞における細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）によって測定される細胞成長への影響を示す線グラフである。エラーバーは、標準誤差を表す。図１１Ｂは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞への対照低分子ＲＮＡ（左バー）またはｐｉＲ−３７２１３（右バー）によるトランスフェクション２週間後の実験結果を示す棒グラフである。ｐｉＲ−３７２１３トランスフェクトＨｅｐ３Ｂプレートにおけるコロニーの数は、対照オリゴ処理プレートにおいて形成されたコロニーの数と比べておよそ７０％低下した（図２Ｂ、Ｐ＜０．０１）。
図１２は、ｐｉＲ−３７２１３に影響された細胞周期および細胞増殖関連遺伝子のネットワークが、ｐｉＲ−３７２１３により、細胞周期および細胞増殖関連遺伝子の転写の変化が誘導されることを説明することを示すチャートである。
図１３Ａは、前立腺がんのＧＥＮＥＶＡ研究のアフリカ系アメリカ人対象由来の帰属されたｐｉＲＮＡバリアントの関連結果を表示するマンハッタンプロットである。有意に関連するバリアントのｒｓ６１１０１７８５（ｐｉＲ−０２１１６３に位置）は、矢印で示されている。図１３Ｂは、矢印で示されるｒｓ６１１０１７８５を包含する領域の微細マッピングの結果を表示するマンハッタンプロットである。図１３Ｃは、ＰＬＣＯ研究のコーカサス人種対象由来の帰属されたｐｉＲＮＡバリアントの関連結果を表示するマンハッタンプロットである。バリアントｒｓ８０１０９６９およびｒｓ１１６２５９０７は、矢印で示されている。 図１３Ａは、前立腺がんのＧＥＮＥＶＡ研究のアフリカ系アメリカ人対象由来の帰属されたｐｉＲＮＡバリアントの関連結果を表示するマンハッタンプロットである。有意に関連するバリアントのｒｓ６１１０１７８５（ｐｉＲ−０２１１６３に位置）は、矢印で示されている。図１３Ｂは、矢印で示されるｒｓ６１１０１７８５を包含する領域の微細マッピングの結果を表示するマンハッタンプロットである。図１３Ｃは、ＰＬＣＯ研究のコーカサス人種対象由来の帰属されたｐｉＲＮＡバリアントの関連結果を表示するマンハッタンプロットである。バリアントｒｓ８０１０９６９およびｒｓ１１６２５９０７は、矢印で示されている。 図１３Ａは、前立腺がんのＧＥＮＥＶＡ研究のアフリカ系アメリカ人対象由来の帰属されたｐｉＲＮＡバリアントの関連結果を表示するマンハッタンプロットである。有意に関連するバリアントのｒｓ６１１０１７８５（ｐｉＲ−０２１１６３に位置）は、矢印で示されている。図１３Ｂは、矢印で示されるｒｓ６１１０１７８５を包含する領域の微細マッピングの結果を表示するマンハッタンプロットである。図１３Ｃは、ＰＬＣＯ研究のコーカサス人種対象由来の帰属されたｐｉＲＮＡバリアントの関連結果を表示するマンハッタンプロットである。バリアントｒｓ８０１０９６９およびｒｓ１１６２５９０７は、矢印で示されている。
図１４Ａは、１，１７３種のｐｉＲＮＡバリアントに関する肺がんの関連研究の結果を表示するマンハッタンプロットである。バリアントｒｓ１１６９３４７は、プロットにおいてアノテートされる。図１４Ｂは、肺がんにおけるｐｉＲＮＡの二次発現解析の結果を表示する散布図である。 図１４Ａは、１，１７３種のｐｉＲＮＡバリアントに関する肺がんの関連研究の結果を表示するマンハッタンプロットである。バリアントｒｓ１１６９３４７は、プロットにおいてアノテートされる。図１４Ｂは、肺がんにおけるｐｉＲＮＡの二次発現解析の結果を表示する散布図である。
図１５Ａは、低分子ＲＮＡ−ｓｅｑデータのための計数に基づく差次的発現パイプラインの概要である。図１５Ｂは、乳がんにおける４種のｐｉＲＮＡ遺伝子の差次的発現のドットプロットである。図１５Ｃは、ＲＴ−ｑＰＣＲによる、乳房正常および腫瘍細胞株における４種のｐｉＲＮＡ遺伝子の差次的発現の検証を示す棒グラフである。図１５Ｄは、ｐｉＲ＿０１８２９２（オリゴ濃度＝３０ｎＭ）の過剰発現後の乳房細胞の阻害率を示す棒グラフである。 図１５Ａは、低分子ＲＮＡ−ｓｅｑデータのための計数に基づく差次的発現パイプラインの概要である。図１５Ｂは、乳がんにおける４種のｐｉＲＮＡ遺伝子の差次的発現のドットプロットである。図１５Ｃは、ＲＴ−ｑＰＣＲによる、乳房正常および腫瘍細胞株における４種のｐｉＲＮＡ遺伝子の差次的発現の検証を示す棒グラフである。図１５Ｄは、ｐｉＲ＿０１８２９２（オリゴ濃度＝３０ｎＭ）の過剰発現後の乳房細胞の阻害率を示す棒グラフである。 図１５Ａは、低分子ＲＮＡ−ｓｅｑデータのための計数に基づく差次的発現パイプラインの概要である。図１５Ｂは、乳がんにおける４種のｐｉＲＮＡ遺伝子の差次的発現のドットプロットである。図１５Ｃは、ＲＴ−ｑＰＣＲによる、乳房正常および腫瘍細胞株における４種のｐｉＲＮＡ遺伝子の差次的発現の検証を示す棒グラフである。図１５Ｄは、ｐｉＲ＿０１８２９２（オリゴ濃度＝３０ｎＭ）の過剰発現後の乳房細胞の阻害率を示す棒グラフである。 図１５Ａは、低分子ＲＮＡ−ｓｅｑデータのための計数に基づく差次的発現パイプラインの概要である。図１５Ｂは、乳がんにおける４種のｐｉＲＮＡ遺伝子の差次的発現のドットプロットである。図１５Ｃは、ＲＴ−ｑＰＣＲによる、乳房正常および腫瘍細胞株における４種のｐｉＲＮＡ遺伝子の差次的発現の検証を示す棒グラフである。図１５Ｄは、ｐｉＲ＿０１８２９２（オリゴ濃度＝３０ｎＭ）の過剰発現後の乳房細胞の阻害率を示す棒グラフである。
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「担体」または「賦形剤」という用語は、１つまたは複数の活性成分が組み合わされる、製剤中の有機または無機成分、天然または合成の不活性成分を指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性物質を意味する。
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、処置される障害、疾患、または状態の１つまたは複数の症状を緩和するか、そうでなければ、望ましい薬理的および／または生理的効果をもたらすのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、対象に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康状態など）、処置される疾患または障害、ならびに投与される薬剤の投与経路および薬物動態などの様々な因子によって変動するものである。
本明細書で使用される場合、「予防」または「予防する」という用語は、疾患または障害の特定の症状の終息、疾患または障害の１つまたは複数の症状の低下または予防、疾患または障害の重症度の低下、疾患または障害の完全な消失、疾患または障害の発生または進行の安定化または遅延を引き起こすため、疾患または障害によって引き起こされる１つまたは複数の症状のリスクがあるか素因を有する対象または系に組成物を投与することを意味する。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントがそこに挿入され、挿入されたセグメントの複製が引き起こされ得る、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンである。本明細書に記載されるベクターは発現ベクターであってよい。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、１つまたは複数の発現制御配列を含むベクターである。
本明細書で使用される場合、「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターなどの組換えヌクレオチドが導入され得る原核および真核細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「形質転換された」および「トランスフェクトされた」は、当技術分野で公知のいくつかの技術による、細胞への核酸（例えばベクター）の導入を包含する。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）の有無にかかわらず、任意の長さのアミノ酸鎖を指す。ポリペプチドという用語は、タンパク質およびその断片を含む。ポリペプチドは、細菌細胞により産生されたヒトポリペプチドなど、「異種」であること、すなわち、利用される宿主細胞にとって外来性であることを意味する「外因性」であってよい。ポリペプチドは、本明細書ではアミノ酸残基配列として開示される。これらの配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、左から右へ記載される。標準的な命名法に従って、アミノ酸残基配列は以下に示す通り３文字または１文字記号のいずれかで命名される：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
本明細書で使用される場合、「バリアント」は、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは異なるものの、基本的な特徴は維持しているポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。ポリペプチドの典型的なバリアントは、別の参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。概して、参照ポリペプチドおよびバリアントの配列が全体的に非常に類似しており、多くの領域では同一となるように差が限定される。バリアントおよび参照ポリペプチドは、１つまたは複数の修飾（例えば置換、付加、および／または欠失）により、アミノ酸配列が異なっていてよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされるものであってもなくてもよい。ポリペプチドのバリアントは、アレルバリアントなどの天然に存在するものであってもよく、天然に存在しないと考えられるバリアントであってもよい。
本開示のポリペプチドの構造に修飾および変更を行って、それでもそのポリペプチドと同様の特性を有する分子を得ることができる（例えば保存的アミノ酸置換）。例えば、活性を大きく失うことなく、ある特定のアミノ酸で配列中のその他のアミノ酸を置換することができる。ポリペプチドの生物学的機能活性を規定するのはそのポリペプチドの相互作用の能力および性質であるため、ポリペプチド配列に特定のアミノ酸配列置換を行って、それでも同様の特徴を有するポリペプチドを得ることができる。
このような変更を行うにあたって、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮され得る。ポリペプチドに相互作用の生物学的機能を付与するにあたってのハイドロパシーアミノ酸指数の重要性が、概して当技術分野で理解されている。特定のアミノ酸で、同様のハイドロパシー指数またはスコアを有するその他のアミノ酸を置換して、それでも同様の生物学的活性を有するポリペプチドが生じ得ることが公知である。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられている。その指数は：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性により、生じたポリペプチドの二次構造が決定され、それによりポリペプチドと、酵素、基質、受容体、抗体、抗原、および補因子などのその他の分子との相互作用が規定されると考えられている。アミノ酸が同様のハイドロパシー指数を有する別のアミノ酸で置換され、それでも機能的に同等のポリペプチドが得られることが当技術分野で公知である。このような変更において、ハイドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらにより特に好ましい。
同様のアミノ酸の置換を、特に、それにより生み出される生物学的機能において同等のポリペプチドまたはペプチドが免疫学的実施形態で使用を意図するものである場合に、親水性に基づいて行うこともできる。以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（ｇｌｕｔａｍｎｉｎｅ）（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；スレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸で、同様の親水性値を有する別のものを置換して、それでも生物学的に同等の、具体的には免疫学的に同等のポリペプチドが得られることが理解される。このような変更において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらにより特に好ましい。
先に概説したように、アミノ酸置換は概して、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。各種上記特性を考慮した例示的な置換が当業者に周知であり、（元の残基：例示的な置換）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、および（Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）を含む。したがって、本開示の実施形態は、先に示すポリペプチドの機能的または生物学的同等物を企図する。具体的には、ポリペプチドの実施形態は、目的のポリペプチドへの約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有するバリアントを含み得る。
「パーセント（％）配列同一性」という用語は、最大パーセントの配列同一性が達成されるように、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後の、参照核酸配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸と同一である、候補配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージとして定義される。パーセント配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技量の範囲内の各種方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータは、公知の方法で決定可能である。
本明細書での目的のため、所与の核酸配列Ｄへの、核酸配列Ｄとの、または核酸配列Ｄに対する、所与のヌクレオチドまたはアミノ酸配列Ｃ（あるいは、所与の配列Ｄへの、配列Ｄとの、または配列Ｄに対する特定の％配列同一性を有するか含む所与の配列Ｃと表現することができる）の％配列同一性が以下の通り算出される：
分数Ｗ／Ｚを１００倍
式中、Ｗは、配列アラインメントプログラムにより、そのプログラムでのＣおよびＤのアラインメントにおいて同一の一致として採点されたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、ＺはＤにおけるヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さと等しくない場合、ＣのＤへの％配列同一性はＤのＣへの％配列同一性と等しくならないことを理解されたい。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、構成要素が通常の機能を果たすように構成された、並置状態を指す。例えば、コード配列に作動可能に連結した制御配列またはプロモーターは、コード配列の発現を引き起こすことができ、タンパク質に作動可能に連結したオルガネラ局在化配列は、連結されたタンパク質を特定のオルガネラで局在化するように指向させることとなる。
本明細書で使用される場合、「個体」、「個体」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ヒト、マウスおよびラットなどのげっ歯類、ならびにその他の実験動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は概して、異型の変異体型とは異なる、天然の状態の個体に普及している株、遺伝子、または特性を意味する。
本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は概して、野生型から分岐した株、遺伝子、または特性を意味する。
ＩＩ．異常に発現されるｐｉＲＮＡおよび遺伝的に関連するｐｉＲＮＡ
異常に発現されるｐｉＲＮＡが開示される。発現の最大の差、またはがんとの最も強い相関関係を有する特定の好ましい実施形態が詳細に論じられるが、以下の実施例で提供される実験および図表において論じられる他の実施形態も使用可能であることを理解されたい。様々なｐｉＲＮＡが様々な組織で発現され、かつ増加、減少する、すなわちその変異体発現は、典型的には、異常な発現が見つかる単一または複数のがん型に特異的である。
ｐｉＲＮＡの異常な発現は、がんの有病率および予後と相関し得る。一部の例では、１つまたは複数の野生型ｐｉＲＮＡが、正常または対照組織と比較してがん組織において減少していることがある。例えば、ｐｉＲＮＡの下流標的のうち１つまたは複数ががん遺伝子またはその他の腫瘍原性遺伝子である場合、ｐｉＲＮＡ発現の減少によりがん遺伝子またはその他の腫瘍原性遺伝子の発現増加がもたらされ、がんが生じる可能性がある。このような例では、野生型ｐｉＲＮＡ、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、候補ｐｉＲＮＡの発現を増加させ、その標的がん遺伝子の発現を減少させ、がんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。
さらに、またはあるいは、１つまたは複数の野生型ｐｉＲＮＡが、正常または対照組織と比較してがん組織において増加していることがある。例えば、ｐｉＲＮＡの下流標的のうち１つまたは複数が腫瘍サプレッサーである場合、ｐｉＲＮＡ発現の増加により腫瘍サプレッサーの発現減少がもたらされ、がんが生じる可能性がある。このような例では、ｐｉＲＮＡの阻害剤が、標的ｐｉＲＮＡの発現を減少させ、その標的腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を増加させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。
さらに、ｐｉＲＮＡをコードするゲノム配列が、野生型と比較して１つまたは複数の変異（例えば、一塩基多型：ＳＮＰなどの多型）を含有することがあり、このような変異ががんの有病率および予後と関連し得ることが分かっている。このような異常に発現されるｐｉＲＮＡは、遺伝的に関連するｐｉＲＮＡとも呼ぶことができる。変異が原因で、ｐｉＲＮＡが、たとえ変異体ｐｉＲＮＡが正常なレベルで発現されていても、あたかも野生型発現が減少しているように挙動する。例えば、変異により、ｐｉＲＮＡの、その標的遺伝子と相互作用する能力が減少するのであれば、野生型ｐｉＲＮＡが典型的にがん遺伝子またはその他の腫瘍原性遺伝子を標的とする場合、変異体ｐｉＲＮＡによりそのがん遺伝子またはその他の腫瘍原性遺伝子の発現増加がもたらされ、がんが生じる可能性がある。このような例では、野生型ｐｉＲＮＡ、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、標的ｐｉＲＮＡの発現を増加させ、その標的がん遺伝子の発現を減少させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。野生型と比較して、変異は、がんの発生からの保護効果をもたらすこともある（すなわち、対象が多型を有するとき、がんの有病率または重症度などが低下する）。
ｐｉＲＮＡが腫瘍形成に直接的または間接的に寄与し得るその他のやり方には、標的ｍＲＮＡ発現の調節におけるｐｉＲＮＡの役割とは無関係に生じ得る、（１）「幹細胞様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）」状態のゲノムサイレンシングおよび促進をもたらす異常なＤＮＡメチル化、（２）ヒストン修飾を変化させることにより、ユークロマチン状態を誘導すること、および（３）細胞周期を調節不全にすることが含まれるが、これらに限定されない。ｐｉＲＮＡが腫瘍サプレッサーとして間接的に作用している他の実施形態と同様に、野生型ｐｉＲＮＡ、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、標的ｐｉＲＮＡの発現を増加させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。
したがって、異常に発現されるｐｉＲＮＡ、ならびにこれらの、がんのリスクおよび重症度との関連性の検出は、がんのバイオマーカーとしても、がんを処置するための処置戦略を開発するのにも使用可能である。
本明細書で論じられるように、「正常な組織」は、最も典型的には、非がん性組織または細胞を意味し、最も典型的には、比較されるがん性組織または細胞と同一または同様の組織または細胞である。
Ａ．脳がん
１．一塩基多型
表１に列挙されるｐｉＲＮＡは、以下の実施例でより詳細に論じられる、ＧＷＡＳ（ゲノムワイド関連研究）後解析で特定された、神経膠腫リスクと関連する上位ｐｉＲＮＡ ＳＮＰである。解析により、神経膠腫リスクと、染色体２ｑ３３．１上でｐｉＲ−２７９９の３’末端付近に位置する稀なバリアントｒｓ１４９３３６９４７（Ｐ＝２．３４×１０−５；ＦＤＲ調整後Ｐ＝０．０３３）との間の、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正された（Ｐ＜０．０５／１，４２８ＳＮＰ＝３．５０×１０−５）統計的に有意な関連性が明らかとなった。ｐｉＲ−２７９９は、脳を含む人体において広く発現されるアポトーシス阻害因子ＣＦＬＡＲの第４イントロンにマッピングされる、３０ヌクレオチドのｐｉＲＮＡである（図２Ａ）。４つのさらなる、中程度の目的の関連性が、染色体６ｑ２７上のｐｉＲ−１８９１３におけるｒｓ６２４３５８００（Ｐ＝１．１３×１０−４；ＦＤＲ調整後Ｐ＝０．０５４）、染色体８ｑ１３．１上のｐｉＲ−５９８におけるｒｓ１４７０６１４７９（Ｐ＝１．６９×１０−４；ＦＤＲ調整後Ｐ＝０．０６０）、染色体９ｑ２２．１上のｐｉＲ−１１７１４におけるｒｓ１４２７４２６９０（Ｐ＝１．１０×１０−４；ＦＤＲ調整後Ｐ＝０．０７９）、および染色体１０ｑ２４．２上のｐｉＲ−３２６６におけるｒｓ３５７１２９６８（Ｐ＝３．１１×１０−４；ＦＤＲ調整後Ｐ＝０．０８９）で観察された（表１）。
したがって、野生型ｐｉＲ−２７９９、ｐｉＲ−１８９１３、ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１１７１４、ｐｉＲ−３２６６、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、ｐｉＲＮＡの発現を増加させて神経膠腫などの脳がんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。対象は、ｐｉＲＮＡの１つまたは複数の染色体コピーに、ｐｉＲＮＡの活性を低下させる１つまたは複数の変異を有する可能性がある。例えば、野生型ｐｉＲ−２７９９は、少なくとも１つのｒｓ１４９３３６９４７ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−１８９１３は、少なくとも１つのｒｓ６２４３５８００ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−５９８は、少なくとも１つのｒｓ１４７０６１４７９ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−１１７１４は、少なくとも１つのｒｓ１４２７４２６９０ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−３２６６は、少なくとも１つのｒｓ３５７１２９６８ＳＮＰを有する対象に投与可能である、など。
２．調節不全の発現
以下の実施例で論じられるように、アレイベースのｐｉＲＮＡプロファイリング後に、３５３種のｐｉＲＮＡが正常および腫瘍組織の両方で発現されていることが観察された（図５Ａ）。１４５種のｐｉＲＮＡについては、比較群間で少なくとも２倍の発現差が観察された（以下の表３）。表３のｐｉＲＮＡのいずれも、本明細書で論じられる診断および処置戦略で利用可能である。例えば、ｐｉＲ−８０４１、ｐｉＲ−５４０２２、ｐｉＲ−２０２４９、およびｐｉＲ−１５９８８は全て、正常な組織と比較してがんにおいて過少発現されている。したがって、野生型ｐｉＲ−８０４１、ｐｉＲ−５４０２２、ｐｉＲ−２０２４９、および／またはｐｉＲ−１５９８８、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、ｐｉＲＮＡの発現を増加させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。一部の実施形態で、処置される対象は、ｐｉＲ−８０４１、ｐｉＲ−５４０２２、ｐｉＲ−２０２４９、および／またはｐｉＲ−１５９８８の発現減少を特徴とするがんを有する。
３．診断および処置されるがん
組成物および方法を、良性および悪性の脳腫瘍およびがんに適用することができる。脳腫瘍には、頭蓋内部、または中枢の脊柱管内の腫瘍全てが含まれる。これらは、通常、脳自体（ニューロン、グリア細胞（星状細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、ミエリン形成シュワン細胞、リンパ組織、血管）、脳神経、脳膜（髄膜）、頭蓋骨、下垂体および松果体に存在するか、または、最初はその他の臓器に位置するがんから拡散した（転移性腫瘍）、異常かつ制御されない細胞分裂によって生み出される。脳腫瘍の例には、神経膠芽腫、乏突起膠腫、髄膜腫、テント上上衣腫（ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ ｅｐｅｎｄｙｍｏｎａ）、松果体部腫瘍、髄芽腫、小脳星状細胞腫、テント下上衣腫（ｉｎｆｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ ｅｐｅｎｄｙｍｏｎａ）、脳幹神経膠腫、神経鞘腫、下垂体腫瘍、頭蓋咽頭腫、視神経膠腫、および星状細胞腫が含まれるが、これらに限定されない。
「原発性」脳腫瘍は脳で発生したものであり、「二次性」（転移性）脳腫瘍は、体のその他の部位から遊走したがん細胞に由来するものである。原発性脳がんは中枢神経系を超えて拡散することはほとんどなく、頭蓋骨の限られた空間内での制御されない腫瘍増殖から死に至る。転移性脳がんは進行した疾患を示し、予後不良を有する。原発性脳腫瘍はがん性の場合も非がん性の場合もあり得る。どちらの型も脳内の空間を占め、重篤な症状（例えば視力または聴力喪失）および合併症（例えば脳卒中）を引き起こす可能性がある。がん性脳腫瘍は全て、攻撃性および侵襲性を有するため生命に関わるもの（悪性）である。非がん性の原発性脳腫瘍は、生命維持に必須の構造（例えば動脈）を損なうと生命に関わる。特定の実施形態では、開示される組成物および方法を使用して、脳の外部（例えば、肺、乳房、黒色腫）から転移し脳に遊走したがん細胞または腫瘍が処置される。
Ｂ．肝臓がん
１．調節不全の発現
以下の実施例でより詳細に論じられるように、ｐｉＲＮＡ発現プロファイリング解析において、２３，０００のヒトｐｉＲＮＡを網羅するＡｒｒａｙＳｔａｒ ｐｉＲＮＡ発現マイクロアレイを使用して、１２対の、ＨＣＣおよび対応する非悪性肝臓検体を比較した。３１種の目的のｐｉＲＮＡが特定された。ｐｉＲＮＡのいずれも、本明細書で論じられる診断および処置戦略で利用可能である。特に興味深いのは、３倍以上で統計的に有意に差次的に発現された、３種のｐｉＲＮＡのｐｉＲ−３７２１３、ｐｉ−Ｒ１７６５６、およびｐｉＲ−３３４０４であった。
ｐｉＲ−３７２１３は、正常な組織と比較して腫瘍組織において過少発現されていた。したがって、野生型ｐｉＲ−３７２１３、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、ｐｉＲＮＡの発現を増加させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。一部の実施形態で、処置される対象は、ｐｉＲ−３７２１３の発現減少を特徴とするがんを有する。
ｐｉ−Ｒ１７６５６およびｐｉＲ−３３４０４は、正常な組織と比較して腫瘍組織において過剰発現されていた。したがって、野生型ｐｉ−Ｒ１７６５６および／またはｐｉＲ−３３４０４の阻害剤が、ｐｉＲＮＡの発現を減少させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。一部の実施形態で、処置される対象は、ｐｉ−Ｒ１７６５６および／またはｐｉＲ−３３４０４の発現増加を特徴とするがんを有する。
２．診断および処置されるがん
組成物および方法を、良性および悪性の肝臓腫瘍およびがんに適用することができる。良性の肝臓増殖には、血管腫、肝細胞腺腫、および限局性結節性過形成が含まれる。肝臓がんには例えば、場合によりヘパトーマもしくはＨＣＣとも呼ばれる肝細胞癌（ＨＣＣ）、線維層板状癌、胆管癌（胆管がん）、血管肉腫、および肝芽腫が含まれ得る。一般的な二次性肝臓がんは、乳がん、腸がん、または肺がんに由来する。特に好ましい実施形態では、対象は肝細胞癌を有する。
Ｃ．前立腺がん
１．一塩基多型
以下でより詳細に論じられる実施例は、前立腺がんと関連するｐｉＲＮＡ変異を特定するため、１８４７のバリアントについて実施された関連解析を含む。ｐｉＲ−０２１１６３に位置するバリアントｒｓ６１１０１７８５は、前立腺がんのリスク増加と関連していた。その他の上位ヒットは表４（以下）に列挙される。したがって、野生型ｐｉＲ−０２１１６３、ｐｉＲ−００３１２３、ｐｉＲ−００８０６１、ｐｉＲ−０１３７８３、ｐｉＲ−１４２４６、ｐｉＲ−００８２８６、ｐｉＲ−０１８４９５、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、ｐｉＲＮＡの発現を増加させて前立腺がんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。対象は、ｐｉＲＮＡの１つまたは複数の染色体コピーに、ｐｉＲＮＡの活性を低下させる１つまたは複数の変異を有する可能性がある。例えば、野生型ｐｉＲ−０２１１６３は、少なくとも１つのｒｓ６１１０１７８５ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−００３１２３は、少なくとも１つのｒｓ６２４３９７２１ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−００８０６１は、少なくとも１つのｒｓ１１０７４１８４ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−０１３７８３および／またはｐｉＲ−１４２４６は、少なくとも１つのｒｓ８０１０９６９ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−００８２８６は、少なくとも１つのｒｓ００８２８６ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−０１８４９５は、少なくとも１つのｒｓ８０２０３７８ＳＮＰを有する対象に投与可能である、など。
好ましい実施形態では、野生型ｐｉＲ−０２１１６３、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、ｐｉＲＮＡの発現を増加させて前立腺がんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。一部の実施形態で、対象は少なくとも１つのｒｓ６１１０１７８５ＳＮＰを有する。
２．診断および処置されるがん
組成物および方法を、良性および悪性の前立腺腫瘍およびがんに適用することができる。前立腺がんの前駆状態は、前立腺上皮内腫瘍として公知である。前立腺がんには、例えば、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、前立腺腺癌、小細胞癌、扁平上皮癌、前立腺肉腫、および移行上皮癌が含まれる。
Ｄ．肺がん
１．一塩基多型
以下でより詳細に論じられる実施例は、ｐｉＲＮＡバリアントと肺がんリスクの間の関連性を探索する、関連性結果、発現プロファイリング結果、および機能解析結果を組み合わせたＧＷＡＳ後研究を含む。上位ヒットは表４（以下）に提示され、ｐｉＲ−２１６２６におけるｒｓ１３３８２７４８、ｐｉＲ−１６８２８におけるｒｓ６０５３４７２２を含む。肺がんのリスク増加と有意に関連する、１つのＳＮＰ（ｒｓ１１６３９３４７）によるバリアントが特定された。バリアント（第１５染色体：７９０２４３５０）ならびに２種のｐｉＲＮＡのｐｉＲ−５２４７（第１５染色体：７９０２４３３３〜７９０２４３６１）およびｐｉＲ−５６７１（第１５染色体：７９０２４３２７〜７９０２４３５５）の位置は遺伝子間領域にある。このことは、２種のｐｉＲＮＡにより引き起こされる機能的変化が、それら自体の機能に起因し得ることを示す。
したがって、野生型ｐｉＲ−２１６２６、ｐｉＲ−１６８２８、ｐｉＲ−５２４７、ｐｉＲ−５６７１、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、ｐｉＲＮＡの発現を増加させて肺がんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。対象は、ｐｉＲＮＡの１つまたは複数の染色体コピーに、ｐｉＲＮＡの活性を低下させる１つまたは複数の変異を有する可能性がある。例えば、野生型ｐｉＲ−２１６２６は、少なくとも１つのｒｓ１３３８２７４８ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−１６８２８は、少なくとも１つのｒｓ６０５３４７２２ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−５２４７および／またはｐｉＲ−５６７１は、少なくとも１つのｒｓ１１６３９３４７ＳＮＰを有する対象に投与可能である、など。
特に好ましい実施形態では、野生型ｐｉＲ−５２４７および／またはｐｉＲ−５６７１、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、ｐｉＲＮＡの発現を増加させて肺がんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に、より好ましくは少なくとも１つのｒｓ１１６３９３４７ＳＮＰを有する対象に投与され得る。
２．調節不全の発現
実施例では、ｐｉＲ−１４６２０、ｐｉＲ−２０００９、ｐｉＲ−３１６３７、ｐｉＲ−２７３２、ｐｉＲ−５１８０９、ｐｉＲ−１９５２１、およびｐｉＲ−１５２３２を含む上位ヒット７つ（表５を参照のこと）を特定した発現解析についてもより詳細に記載しており、５種のｐｉＲＮＡ：ｐｉＲ−１４６２０、ｐｉＲ−２７３２、ｐｉＲ−５１８０９、ｐｉＲ−１９５２１、およびｐｉＲ−１５２３２が最も統計的に有意であった。表５のｐｉＲＮＡのいずれも、本明細書で論じられる診断および処置戦略で利用可能である。例えば、ｐｉＲ−１４６２０、ｐｉＲ−２０００９、ｐｉＲ−２７３２、ｐｉＲ−５１８０９、ｐｉＲ−１９５２１、およびｐｉＲ−１５２３２は全て、正常な組織と比較して腫瘍組織において過剰発現されていた。したがって、野生型ｐｉＲ−１４６２０、ｐｉＲ−２０００９、ｐｉＲ−２７３２、ｐｉＲ−５１８０９、ｐｉＲ−１９５２１、および／またはｐｉＲ−１５２３２の阻害剤が、ｐｉＲＮＡの発現を減少させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。一部の実施形態で、処置される対象は、ｐｉＲ−１４６２０、ｐｉＲ−２０００９、ｐｉＲ−２７３２、ｐｉＲ−５１８０９、ｐｉＲ−１９５２１、および／またはｐｉＲ−１５２３２の発現増加を特徴とするがんを有する。
ｐｉＲ−３１６３７は、正常な組織と比較して腫瘍組織において過少発現されていた。したがって、野生型ｐｉＲ−３１６３７、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、ｐｉＲＮＡの発現を増加させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。一部の実施形態で、処置される対象は、ｐｉＲ−３１６３７の発現減少を特徴とするがんを有する。
３．診断および処置されるがん
組成物および方法を、良性および悪性の肺腫瘍およびがんに適用することができる。肺がんには、例えば、腺癌、上皮内腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、および大細胞神経内分泌腫瘍などの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、中皮腫、およびカルチノイド腫瘍が含まれる。
Ｅ．乳がん
１．一塩基多型
以下でより詳細に論じられる実施例は、乳がんリスクに関連する、ｐｉＲＮＡが含有する４種のＳＮＰを特定した関連解析を含む。特定された上位のＳＮＰ、ｐｉＲ−１７３１９におけるｒｓ２８６４９１２５は、保護的バリアントアレルの高いＭＡＦおよび対応する人口寄与危険度７．８％により、特に興味深い。その他の上位ヒットは表７（以下）に列挙される。したがって、野生型ｐｉＲ−１７３１９、ｐｉＲ−９４２２、ｐｉＲ−１６５５６、およびｐｉＲ−３４６７、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、ｐｉＲＮＡの発現を増加させて前立腺がんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。対象は、ｐｉＲＮＡの１つまたは複数の染色体コピーに、ｐｉＲＮＡの活性を低下させる１つまたは複数の変異を有する可能性がある。例えば、野生型ｐｉＲ−１７３１９は、少なくとも１つのｒｓ２８６４９１２５ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−９４２２は、少なくとも１つのｒｓ１１９１４０１７ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−１６５５６は、少なくとも１つのｒｓ１０５１８２６３ＳＮＰを有する対象に投与可能であり、野生型ｐｉＲ−３４６７は、少なくとも１つのｒｓ７２７５５１５８ＳＮＰを有する対象に投与可能である、など。
好ましい実施形態では、野生型ｐｉＲ−１７３１９、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、ｐｉＲＮＡの発現を増加させて乳がんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。一部の実施形態では、対象は少なくとも１つのｒｓ２８６４９１２５ＳＮＰを有する。
２．調節不全の発現
実施例では、それぞれが、正常な細胞と比較して腫瘍細胞において発現減少を有するｐｉＲ＿０１６９７５、ｐｉＲ＿０１９１６９、ｐｉＲ＿０１８２９２、ｐｉＲ＿０１７１７８、ｐｉＲ＿０１９３６８、ｐｉＲ＿０１９９１１、ｐｉＲ＿０００５６０、ｐｉＲ＿００１２０７、ｐｉＲ＿０１２７５３、ｐｉＲ＿００３７２８、ｐｉＲ＿００１０７８、およびｐｉＲ＿０１２９２５、ならびに、それぞれが、正常な細胞と比較して腫瘍細胞において発現増加を有するｐｉＲ＿０２０５８２およびｐｉＲ＿００４９８７を含む上位ヒット１５個（表１０を参照のこと）を特定した発現解析についてもより詳細に記載している。
表１０のｐｉＲＮＡのいずれも、本明細書で論じられる診断および処置戦略で利用可能である。例えば、ｐｉＲ＿０１６９７５、ｐｉＲ＿０１９１６９、ｐｉＲ＿０１８２９２、ｐｉＲ＿０１７１７８、ｐｉＲ＿０１９３６８、ｐｉＲ＿０１９９１１、ｐｉＲ＿０００５６０、ｐｉＲ＿００１２０７、ｐｉＲ＿０１２７５３、ｐｉＲ＿００３７２８、ｐｉＲ＿００１０７８、およびｐｉＲ＿０１２９２５は全て、正常な組織と比較して腫瘍組織において過少発現されていた。したがって、野生型ｐｉＲ＿０１６９７５、ｐｉＲ＿０１９１６９、ｐｉＲ＿０１８２９２、ｐｉＲ＿０１７１７８、ｐｉＲ＿０１９３６８、ｐｉＲ＿０１９９１１、ｐｉＲ＿０００５６０、ｐｉＲ＿００１２０７、ｐｉＲ＿０１２７５３、ｐｉＲ＿００３７２８、ｐｉＲ＿００１０７８、および／またはｐｉＲ＿０１２９２５、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が、ｐｉＲＮＡの発現を増加させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。一部の実施形態で、処置される対象は、ｐｉＲ＿０１６９７５、ｐｉＲ＿０１９１６９、ｐｉＲ＿０１８２９２、ｐｉＲ＿０１７１７８、ｐｉＲ＿０１９３６８、ｐｉＲ＿０１９９１１、ｐｉＲ＿０００５６０、ｐｉＲ＿００１２０７、ｐｉＲ＿０１２７５３、ｐｉＲ＿００３７２８、ｐｉＲ＿００１０７８、および／またはｐｉＲ＿０１２９２５の発現減少を特徴とするがんを有する。
ｐｉＲ＿０２０５８２およびｐｉＲ＿００４９８７は全て、正常な組織と比較して腫瘍組織において過剰発現されていた。したがって、野生型ｐｉＲ＿０２０５８２および／またはｐｉＲ＿００４９８７の阻害剤が、ｐｉＲＮＡの発現を減少させてがんを処置または予防するための有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。一部の実施形態で、処置される対象は、ｐｉＲ＿０２０５８２および／またはｐｉＲ＿００４９８７の発現増加を特徴とするがんを有する。
３．診断および処置されるがん
組成物および方法を、良性および悪性の乳房腫瘍およびがんに適用することができる。乳がんの型には、例えば、ＤＣＩＳ−非浸潤性乳管癌（Ｄｕｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｉｎ Ｓｉｔｕ）、ＩＤＣ−浸潤性乳管癌（Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｄｕｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＩＤＣ型：乳房管状癌（Ｔｕｂｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｅａｓｔ）、ＩＤＣ型：乳房髄様癌（Ｍｅｄｕｌｌａｒｙ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｅａｓｔ）、ＩＤＣ型：乳房粘液性癌（Ｍｕｃｉｎｏｕｓ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｅａｓｔ）、ＩＤＣ型：乳房乳頭状癌（Ｐａｐｉｌｌａｒｙ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｅａｓｔ）、ＩＤＣ型：乳房篩状癌（Ｃｒｉｂｒｉｆｏｒｍ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｅａｓｔ）、ＩＬＣ−浸潤性小葉癌、炎症性乳がん、ＬＣＩＳ−非浸潤性小葉癌（Ｌｏｂｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｉｎ Ｓｉｔｕ）、男性乳がん、乳頭パジェット病、乳房葉状腫瘍、再発性および転移性乳がんが含まれる。
乳がんは、ルミナルＡ、ルミナルＢ、トリプルネガティブ／基底細胞様、高ＨＥＲ２、および正常様を含む内因性または分子サブタイプに基づいて分類することもできる。
上記の好ましい異常なｐｉＲＮＡについての表における全受託番号、および本明細書で開示されるその他の全受託番号が、その全体にわたって参照により明確に組み込まれる。本明細書のいくつかの箇所では、ｐｉＲＮＡはＤＮＡ配列（例えば、ｐｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列）であり、いくつかの箇所ではＲＮＡ配列である。ＤＮＡ配列が開示されている場合、ＲＮＡ配列も明確に開示される（例えば「Ｔ」を「Ｕ」で置き換えることで）。同様に、ＲＮＡ配列が開示されている場合、対応するＤＮＡ配列も明確に開示される（例えば「Ｕ」を「Ｔ」で置き換えることで）。
ＩＩＩ．組成物
Ａ．活性薬剤
１．異常ｐｉＲＮＡの発現を増加させるための薬剤
上に紹介する通り、異常ｐｉＲＮＡの発現を増加させるための薬剤は、例えば、野生型ｐｉＲＮＡまたは野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子であってもよい。近似バリアントは典型的には、野生型ｐｉＲＮＡと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する配列バリアントである。最も典型的には、近似バリアントの活性は、対応する野生型と比べて同一もしくは同様の、またはさらに改善された活性（例えば、その標的ｍＲＮＡ（複数可）の調節）を有する。野生型と比べてｐｉＲＮＡの活性を有意に低下させるバリアントは、本明細書に開示されている治療法に有効ではない場合があり、除外することができる。
ｐｉＲＮＡ発現の刺激因子は、例えば、ｐｉＲＮＡのゲノム発現を増加させる、小分子、タンパク質、核酸などであってもよい。例えば、標的ｐｉＲＮＡの発現を増加させる転写因子は、該ｐｉＲＮＡの発現の刺激因子であってもよい。
ｐｉＲＮＡおよびその模倣物を作製、発現および使用する方法は、当該技術分野で公知であり、後述する実施例に開示されている。例えば、そのあらゆる補足材料と共に、その全体が特に参照により本明細書に組み込まれる、Ｊａｃｏｂｓら、Ｃａｎ． Ｅｐｉ． Ｂｉｏｌ． Ｐｒｅｖ．、２５巻（７号）：１０７３〜８０頁、２０１６年）も参照されたい。
２．異常ｐｉＲＮＡの発現を低下させるための薬剤
異常ｐｉＲＮＡの発現を低下させる薬剤は、機能的核酸であってもよい。機能的核酸は、標的分子との結合または特異的反応の触媒など、特異的な機能を有する核酸分子である。より詳細に後述する通り、機能的核酸分子は、次の非限定的なカテゴリーに分けることができる：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉおよび外部ガイド配列。機能的核酸分子は、標的分子によって保有される特異的活性のエフェクター、阻害剤、モジュレーターおよび刺激因子として作用することができる、または機能的核酸分子は、他のいずれかの分子とは独立してｄｅ ｎｏｖｏ活性を保有することができる。
機能的核酸は典型的には、ｐｉＲＮＡそれ自体、またはｐｉＲＮＡをコードするゲノム配列を標的とするように設計され、これにより、その発現を低下させる。多くの場合、機能的核酸は、標的分子および機能的核酸分子の間の配列相同性に基づき他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況では、機能的核酸分子および標的分子の間の特異的認識は、機能的核酸分子および標的分子の間の配列相同性に基づかず、むしろ特異的認識が起こることを可能にする三次構造の形成に基づく。
したがって、組成物は、ｐｉＲＮＡ遺伝子の発現またはｐｉＲＮＡそれ自体を低下させるように設計された１種または複数の機能的核酸を含むことができる。
一部の実施形態では、機能的核酸は、ＲＮＡ干渉により遺伝子サイレンシングを誘導する。遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、高度に特異的な様式で有効にサイレンシングすることもできる。このサイレンシングは本来、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の添加により観察された（Ｆｉｒｅら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ、３９１巻：８０６〜１１頁；Ｎａｐｏｌｉら（１９９０年）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２巻：２７９〜８９頁；Ｈａｎｎｏｎ（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻：２４４〜５１頁）。ｄｓＲＮＡは、細胞に進入すると、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ様酵素のダイサーによって、３’端に２ヌクレオチドオーバーハングを含有する２１〜２３ヌクレオチドの長さの二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと切断される（Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１年）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１５巻：１８８〜２００頁；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ、４０９巻：３６３〜６頁；Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ、４０４巻：２９３〜６頁）。ＡＴＰ依存性ステップにおいて、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列へとガイドする、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知のマルチサブユニットタンパク質複合体へと統合されるようになる（Ｎｙｋａｎｅｎら（２００１年）Ｃｅｌｌ、１０７巻：３０９〜２１頁）。ある時点で、ｓｉＲＮＡ二重鎖は巻き戻り、アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣに結合したままとなり、エンドおよびエキソヌクレアーゼの組み合わせにより、相補的ｍＲＮＡ配列の分解を導くと思われる（Ｍａｒｔｉｎｅｚら（２００２年）Ｃｅｌｌ、１１０巻：５６３〜７４頁）。しかし、ｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡの効果またはそれらの使用は、いかなる種類の機構にも限定されない。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導し、これにより、遺伝子発現を減少またはさらには阻害することができる二本鎖ＲＮＡである。一例では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡおよび標的ＲＮＡの両方の間の配列同一性の領域内の、ｐｉＲＮＡなど、相同ＲＮＡ分子の特異的分解を誘発する。例えば、ＷＯ０２／４４３２１は、３’オーバーハング端と塩基対形成されたときに、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が可能なｓｉＲＮＡを開示し、このようなｓｉＲＮＡを作製する方法のため、これが参照により本明細書に組み込まれる。
配列特異的遺伝子サイレンシングは、酵素ダイサーによって産生されるｓｉＲＮＡを模倣する合成低分子二本鎖ＲＮＡを使用して、哺乳動物細胞において達成することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ、４１１巻：４９４ ４９８頁）（Ｕｉ−Ｔｅｉら（２０００年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、４７９巻：７９〜８２頁）。ｓｉＲＮＡは、化学的にもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成してもよく、または細胞の内側でｓｉＲＮＡへとプロセシングされる低分子二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の結果であってもよい。合成ｓｉＲＮＡは一般に、アルゴリズムおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して設計される。供給業者は、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、ＭＷＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｓｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）およびＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｔｏ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含む。ｓｉＲＮＡは、ＡｍｂｉｏｎのＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キットなどのキットを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することもできる。
ベクターからのｓｉＲＮＡの産生は、低分子ヘアピンＲＮＡｓｅ（ｓｈＲＮＡ）の転写により、より一般的に為される。例えば、ＩｍｇｅｎｅｘのＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ（商標）構築キットならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢＬＯＣＫ−ＩＴ（商標）誘導性ＲＮＡｉプラスミドおよびレンチウイルスベクターなど、ｓｈＲＮＡを含むベクターの産生のためのキットを利用することができる。
一部の実施形態では、機能的核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、組成物は、機能的核酸を発現するベクターを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、リボザイムおよびアプタマーなど、機能的核酸のｉｎ ｖｉｖｏ発現のためのベクターを作製および使用する方法は、当該技術分野で公知である。
一部の実施形態では、機能的核酸は、遺伝子編集組成物である。遺伝子編集組成物は、標的細胞のゲノムにおける一本または二本鎖切断を誘導する１種または複数のエレメントをコードする核酸、および任意選択でポリヌクレオチドを含むことができる。組成物を使用して、例えば、ｐｉＲＮＡの発現を低下または他の方法で改変することができる。遺伝子改変のための系は、当該技術分野で公知であり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよび転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。
Ｂ．活性薬剤を配置する組成物および方法
ｐｉＲＮＡおよび機能的核酸を含む核酸活性薬剤は、それを必要とする対象に投与することができる。ｐｉＲＮＡまたは機能的核酸は、それを必要とする対象に投与されるベクターまたはウイルスによってコードされてもよい。例えば、ｐｉＲＮＡまたは機能核酸をコードする配列は、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）に取り込まれてよい。ｐｉＲＮＡまたは機能的核酸をコードする配列は、対象のゲノムＤＮＡに組み込まれてもよい。
核酸は、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）などの市販の調製物によって送達することができる。ウイルスベクター送達は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージすることができるレトロウイルスベクター系など、ウイルス系を介して為すことができる（例えば、Ｐａｓｔａｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８５巻：４４８６頁；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８６年）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．６巻：２８９５頁を参照）。続いて、組換えレトロウイルスを使用して感染させ、これにより、薬剤をコードする核酸を感染細胞に送達することができる。変更された核酸を哺乳動物細胞に導入する的確な方法は、当然ながら、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５巻：９４１〜９４８頁（１９９４年））、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ ８４巻：１４９２〜１５００頁（１９９４年））、レンチウイルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２巻：２６３〜２６７頁（１９９６年））、偽型レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌら、Ｅｘｐｅｒ． Ｈｅｍａｔｏｌ．２４巻：７３８〜７４７頁（１９９６年））の使用を含む、他の技法を、この手順に広く利用することができる。
Ｃ．核酸修飾
本明細書に開示されている治療法に利用される活性薬剤の多くは、核酸に基づく治療法である。ｐｉＲＮＡおよびその阻害剤は典型的に、ＲＮＡとして活性であるが、活性薬剤が、活性を増加させる、分解を低下させる、またはこれらの組み合わせのために１種または複数の修飾を含むことが認められるであろう。よって、一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡまたはｐｉＲＮＡを標的とする機能的核酸、またはｐｉＲＮＡもしくは機能核酸を含むいずれかのベクターもしくはウイルスは、その所望の活性を防止しないのであれば、次の修飾のうち１種または複数を含む。
本開示は、複素環塩基（核酸塩基）、複素環塩基に取り付けられた糖部分、および糖部分のヒドロキシル官能基をエステル化するホスフェート部分を典型的に含む、ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオチドまたはこれらの組み合わせであってもよく、またはこれを含んでもよい。天然に存在する主要なヌクレオチドは、複素環塩基としてのウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン、ならびにホスホジエステル結合によって連結されるリボースまたはデオキシリボース糖を含む。
一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ対応物と比べて、安定性、半減期、または標的受容体に対する特異性もしくは親和性を改善するように化学修飾されたヌクレオチドアナログで構成される。化学修飾は、ヌクレオベース、糖部分、ヌクレオチド連結またはこれらの組み合わせの化学修飾を含む。本明細書において、「修飾されたヌクレオチド」または「化学修飾されたヌクレオチド」は、複素環塩基、糖部分またはホスフェート部分構成要素のうち１種または複数の化学修飾を有するヌクレオチドを定義する。一部の実施形態では、修飾されたヌクレオチドの電荷は、同じヌクレオベース配列のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較して低下される。例えば、核酸は、低い負電荷、無電荷または正電荷を有することができる。
典型的には、ヌクレオシドアナログは、標準ポリヌクレオチド塩基へとワトソン・クリック塩基対形成によって水素結合することができる塩基を支持し、アナログ骨格は、オリゴヌクレオチドアナログ分子と、標準ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）における塩基との間の配列特異的様式での斯かる水素結合を可能にする様式で塩基を提示する。一部の実施形態では、アナログは、実質的に無電荷のリン含有骨格を有する。
１．複素環塩基
天然に存在する主要なヌクレオチドは、複素環塩基としてウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンを含む。核酸は、そのヌクレオベース構成要素に対する化学修飾を含むことができる。複素環塩基または複素環塩基アナログの化学修飾は、結合親和性または標的配列結合の安定性の増加に有効であり得る。化学修飾された複素環塩基として、イノシン、５−（１−プロピニル）ウラシル（ｐＵ）、５−（１−プロピニル）シトシン（ｐＣ）、５−メチルシトシン、８−オキソ−アデニン、シュードシトシン、シュードイソシトシン、５および２−アミノ−５−（２’−デオキシ−．ベータ．−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン（２−アミノピリジン）ならびに様々なピロロおよびピラゾロピリミジン誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
２．糖修飾
核酸は、修飾された糖部分または糖部分アナログを有するヌクレオチドを含有することもできる。糖部分修飾として、２’−Ｏ−アミノエトキシ、２’−Ｏ−アミノ（ａｍｏｎｉｏ）エチル（２’−ＯＡＥ）、２’−Ｏ−メトキシ、２’−Ｏ−メチル、２−グアニドエチル（２’ＯＧＥ）、２’Ｏ，４’Ｃメチレン（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−（メトキシエチル）（２’−ＯＭＥ）および２’−Ｏ−（Ｎ−（メチル）アセトアミド）（２’−ＯＭＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。中性ｐＨでプロトン化され、これにより、ＴＦＯおよび標的二重鎖の間の電荷斥力を抑制するため、２’−Ｏ−アミノエチル糖部分置換が特に好まれる。この修飾は、リボースまたはデオキシリボース（ｄｅｘｙｒｉｂｏｓｅ）のＣ３’−エンドコンフォメーションを安定化し、また、二重鎖のプリン鎖におけるｉ−１ホスフェートと架橋を形成する。
一部の実施形態では、核酸は、モルフォリノである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは典型的には、１〜３個の原子長であり、あるモノマーのモルフォリノ窒素を隣接するモノマーの５’環外炭素へと連結する、リン含有連結によって連結された、ポリヌクレオチドにおける塩基への塩基特異的水素結合による結合に有効なプリンまたはピリミジン塩基対形成部分を含有する２個またはそれよりも多い（ｔｗｏ ｍｏｒｅ）モルフォリノモノマーで構成される。プリンまたはピリミジン塩基対形成部分は典型的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。モルフォリノオリゴマーの合成、構造および結合特徴は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号および同第５，５０６，３３７号に詳述されている。
モルフォリノに基づくサブユニットの重要な特性は典型的には、安定な無電荷骨格連結によってオリゴマー形態で連結される能力；形成されたポリマーが、１０〜１４塩基の短さのオリゴマーであっても、高Ｔｍで標的ＲＮＡを含む相補的塩基標的核酸とハイブリダイズすることができるように、ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシルまたはイノシン）を支持する能力；哺乳動物細胞へと能動的に輸送されるオリゴマーの能力；およびＲＮＡｓｅ分解に抵抗するオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の能力を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、上述の通り、無電荷連結によって連結された塩基対形成部分を保有するモルフォリノに基づくサブユニットを用いる。
３．ヌクレオチド間連結
２個のヌクレオシド部分の間の化学的連結を指すヌクレオチド間結合によって接続された核酸。ＤＮＡまたはＲＮＡのホスフェート骨格に対する修飾は、オリゴヌクレオチドの結合親和性もしくは安定性を増加させることができる、またはヌクレアーゼ消化に対するオリゴヌクレオチドの感受性を低下させることができる。ジエチル−エチレンジアミド（ＤＥＥＤ）またはジメチル−アミノプロピルアミン（ＤＭＡＰ）が挙げられるがこれらに限定されない、カチオン性修飾は、オリゴヌクレオチドおよび標的の間の静電斥力の減少により特に有用であり得る。ホスフェート骨格の修飾は、ホスホジエステル連結における非架橋酸素の１個の代わりに硫黄原子を使用することを含み得る。この置換は、ホスホジエステル連結の代わりにホスホロチオエートヌクレオシド間連結を作製する。ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでより安定であることが示された。
低下した電荷を有する修飾されたヌクレオチドの例として、上に記す通り、アキラルおよび無電荷サブユニット間連結（例えば、Ｓｔｅｒｃｈａｋ， Ｅ． Ｐ．ら、Ｏｒｇａｎｉｃ． Ｃｈｅｍ．、５２巻：４２０２頁（１９８７年））を有するホスフェートアナログ、ならびにアキラルサブユニット間連結（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号を参照）を有する無電荷モルフォリノに基づくポリマーなど、修飾されたヌクレオチド間連結が挙げられる。一部のヌクレオチド間連結アナログは、モルホリデート、アセタールおよびポリアミド連結複素環を含む。
別の実施形態では、核酸は、ロックト核酸で構成される。ロックト核酸（ＬＮＡ）は、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである（例えば、Ｂｒａａｓｃｈら、Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．、８巻（１号）：１〜７頁（２００１年）を参照）。ＬＮＡは、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドよりも安定であるＤＮＡとのハイブリッドを形成し、これは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）／ＤＮＡハイブリッドと同様の特性である。したがって、ＬＮＡは、ＰＮＡ分子と同様に使用することができる。ＬＮＡ結合効率は、一部の実施形態では、これに正電荷を加えることにより増加させることができる。市販の核酸合成機および標準ホスホラミダイト化学は、ＬＮＡの作製に使用される。
一部の実施形態では、核酸は、ペプチド核酸で構成される。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、オリゴヌクレオチドのホスフェート骨格の全体が、反復するＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位によって置き換えられ、ホスホジエステル結合が典型的には、ペプチド結合によって置き換えられた、合成ＤＮＡ模倣物である。様々な複素環塩基が、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結される。ＰＮＡは、従来のＤＮＡオリゴヌクレオチドと同様の複素環塩基の間隔を維持するが、アキラルおよび中性に荷電した分子である。ペプチド核酸は、ペプチド核酸モノマーで構成される。
他の骨格修飾は、ペプチドおよびアミノ酸変種および修飾を含む。よって、ＰＮＡなど、オリゴヌクレオチドの骨格構成要素は、ペプチド連結であってもよく、あるいは、非ペプチドペプチド連結であってもよい。例として、アセチルキャップ、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（本明細書において、Ｏ−リンカーと称される）などのアミノスペーサー、リシンなどのアミノ酸（ＰＮＡにおいて正電荷が所望の場合、特に有用である）その他が挙げられる。ＰＮＡの化学的アセンブリのための方法は、周知である。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号および同第５，７８６，５７１号を参照されたい。
核酸は、オリゴヌクレオチドの安定性および／またはその標的に対する親和性を増加させるために、いずれか一末端または両末端に、１個または複数の末端残基または修飾を任意選択で含む。一般的に使用される正に荷電した部分は、アミノ酸のリシンおよびアルギニンを含むが、他の正に荷電した部分が有用となる場合もある。核酸は、プロピルアミン基を使用して、分解を防止するために、末端キャッピングされるようにさらに修飾されてもよい。オリゴヌクレオチドを３’または５’キャッピングするための手順は、当該技術分野で周知である。
一部の実施形態では、核酸は、一本鎖または二本鎖である。
Ｄ．送達ビヒクル
開示されている薬剤は、送達ビヒクルの助けありまたはなしで、対象の細胞に投与および取り入れることができる。開示されている薬剤に適切な送達ビヒクルは、当該技術分野で公知であり、特定の阻害剤に適するように選択することができる。
リポソーム送達ならびに受容体媒介性および他のエンドサイトーシス機構など、物理的形質導入技法を使用することもできる（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ８７巻：４７２〜４７８頁（１９９６年）を参照）。例えば、一部の実施形態では、薬剤は、リポソームを介して送達することができる。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）など、市販のリポソーム調製物、ならびに当該技術分野で標準の手順に従って開発された他のリポソームが、周知である。加えて、開示されている核酸またはベクターは、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）から利用でき、ＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機械（ＩｍａＲｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚ．）を用いた技術である、エレクトロポレーションによってｉｎ ｖｉｖｏで送達することができる。本開示の組成物および方法は、上述および他の一般的に使用される遺伝子移入方法のいずれかと併せて使用することができる。
一部の実施形態では、送達ビヒクルは、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、合成リポタンパク質粒子またはカーボンナノチューブに取り込まれるまたはこれに被包される。例えば、組成物は、薬剤の制御放出を提供するポリマーマイクロ粒子などのビヒクルに取り込まれ得る。一部の実施形態では、薬物（複数可）の放出は、マイクロ粒子からの薬剤の拡散、および／または加水分解および／または酵素分解によるポリマー粒子の分解によって制御される。適したポリマーは、エチルセルロースおよび他の天然または合成のセルロース誘導体を含む。ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリエチレンオキシドなど、緩徐に可溶性であり、水性環境でゲルを形成するポリマーも、薬物含有マイクロ粒子のための材料として適することができる。他のポリマーとして、ポリ酸無水物、ポリ（エステル無水物）、ポリヒドロキシ酸、例えば、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ−３−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）およびこれらのコポリマー、ポリ−４−ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）およびこれらのコポリマー、ポリカプロラクトンおよびこれらのコポリマー、ならびにこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
薬剤は、水溶液に不溶性または水溶液に緩徐に可溶性であるが、酵素分解、胆汁酸の界面活性物質作用および／または機械的浸食を含む手段によりＧＩ管内で分解することができる材料に取り込むことができるまたはこれから調製することができる。本明細書において、用語「水に緩徐に可溶性」は、３０分間の期間以内に水に溶解されない材料を指す。好まれる例として、脂肪、脂肪性物質、ワックス、ワックス様物質およびこれらの混合物が挙げられる。適した脂肪および脂肪性物質は、脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリド（モノ、ジおよびトリグリセリド）および水素化脂肪が挙げられるがこれらに限定されない、脂肪アルコール（ラウリル、ミリスチル、ステアリル、セチルまたはセトステアリルアルコールなど）、脂肪酸および誘導体を含む。具体例として、水素化植物油、水素化綿実油、水素化ヒマシ油、商品名Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標）で入手できる水素化油、ステアリン酸、カカオバターおよびステアリルアルコールが挙げられるがこれらに限定されない。適したワックスおよびワックス様材料は、天然または合成のワックス、炭化水素および通常のワックスを含む。
ワックスの具体例として、蜜ろう、グリコワックス（ｇｌｙｃｏｗａｘ）、キャスターワックス（ｃａｓｔｏｒ ｗａｘ）、カルナウバろう、パラフィンおよびカンデリラろうが挙げられる。本明細書において、ワックス様材料は、室温で通常固体であり、約３０〜３００℃の融点を有するいずれかの材料として定義される。
核酸薬物の送達のための例示的なビヒクルとして、ポリマーに基づくナノ粒子およびポリプレックスナノゲル製剤が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、これらそれぞれの全体が特に参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｉｌｌａｉｒｅａｕら、Ｊ． Ｎａｎｏｓｃｉ． Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６巻（９〜１０号）：２６０８〜１７頁（２００６年）、Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖら、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、１０７巻（１号）：１４３〜５７頁（２００５年）およびＶｉｎｏｇｒａｄｏｖ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．、４巻（１号）：５〜１７頁（２００７年）を参照されたい。
Ｅ．標的化シグナルまたはドメイン
組成物は、１種または複数の標的化シグナル、リガンドまたはドメインを含むように任意選択で修飾されてよい。標的化シグナルは、活性薬剤、またはマイクロ粒子などの送達ビヒクルと作動可能に連結されてよい。例えば、一部の実施形態では、標的化シグナルは、活性薬剤に直接的にまたは間接的に連結またはコンジュゲートされる。一部の実施形態では、標的化シグナルは、リポソームまたはナノ粒子などの送達ビヒクルと直接的にまたは間接的に連結、コンジュゲートまたは会合される。標的化シグナルまたは配列は、宿主、組織、臓器、細胞、オルガネラ、非核オルガネラまたは細胞区画に特異的であってもよい。
一部の実施形態では、標的化シグナルは、組成物またはその送達ビヒクルと細胞膜を互いに十分に近付けて、細胞への組成物または送達ビヒクルの浸透を可能にするためになど、標的細胞の表面に位置するそのリガンドまたは受容体に結合する。好まれる実施形態では、標的化分子は、抗体またはその抗原結合性断片、抗体ドメイン、抗原、細胞表面受容体、細胞表面接着分子、主要組織適合性遺伝子座タンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、および規定の細胞に特異的に結合するファージディスプレイによって選択されるペプチドからなる群より選択される。
特異的細胞への組成物または送達ビヒクルの標的化は、特異的細胞および組織標的化シグナルを発現するように開示されている組成物または送達ビヒクルを修飾することにより達成することができる。このような配列は、特異的細胞および組織を標的とするが、一部の実施形態では、細胞と標的化シグナルとの相互作用は、伝統的な受容体：リガンド相互作用を介して起こらない。真核細胞は、いくつかの別個の細胞表面分子を有する。各分子の構造および機能は、細胞の起源、発現、特徴および構造に特異的であってもよい。特異的細胞型の分子の特有の細胞表面補体の決定は、当該技術分野で周知の技法を使用して決定することができる。
当業者は、標的化シグナルを単に変化させることにより、記載されている組成物または送達ビヒクルの指向性を変更することができることを認めるであろう。特異的な一実施形態では、標的細胞への活性薬剤の送達を標的化するために、組成物または送達ビヒクルへの細胞表面抗原特異的抗体の添加を可能にする組成物が提供される。
哺乳動物生物の組織におけるほぼ全ての細胞型が、いくつかの特有の細胞表面受容体または抗原を保有することが当該技術分野で公知である。よって、標的化シグナルとして、細胞表面受容体または抗原に対するほぼいかなるリガンドも取り込むことが可能である。例えば、ペプチジルホルモンを標的化部分として使用して、斯かるホルモンに対する受容体を保有する細胞への送達を標的化することができる。ケモカインおよびサイトカインを同様に、標的化シグナルとして用いて、その標的細胞への複合体の送達を標的化することができる。がん抗原に結合する化合物を標的化シグナルとして用いて、その標的がん細胞への複合体の送達を標的化することができる。ある特定の細胞または細胞状態において優先的に発現される遺伝子を同定するための種々の技術が開発されており、当業者であれば、斯かる技術を用いて、目的の標的組織において優先的にまたは特有に発現される標的化シグナルを同定することができる。
一部の実施形態では、標的化シグナルは、細胞浸透ペプチド（ＣＰＰＳ）としても公知の、タンパク質形質導入ドメインであるまたはこれを含む。ＰＴＤは当該技術分野で公知であり、受容体非依存的機構で細胞膜を横切ることができるタンパク質の小領域が挙げられるがこれらに限定されない（Ｋａｂｏｕｒｉｄｉｓ， Ｐ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１１巻）：４９８〜５０３頁（２００３年））。最も一般的に用いられるＰＴＤのうち２種は、ＨＩＶのＴＡＴ（ＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏ、Ｃｅｌｌ、１２月２３日；５５巻（６号）：１１８９〜９３頁（１９８８年））タンパク質およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来のアンテナペディア転写因子（そのＰＴＤは、ペネトラチンとして公知である）（Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６９巻（１４号）：１０４４４〜５０頁（１９９４年））に由来する。
アンテナペディアホメオドメインは、６８アミノ酸残基長であり、４個のアルファヘリックスを含有する。ペネトラチンは、アンテナペディアの３番目のヘリックスに由来する１６アミノ酸配列からなる、このタンパク質の活性ドメインである。ＴＡＴタンパク質は、８６アミノ酸からなり、ＨＩＶ−１の複製に関与する。ＴＡＴ ＰＴＤは典型的には、取り込みに決定的であると思われる親タンパク質の１１アミノ酸配列ドメインからなる。その上、塩基性ドメインＴａｔ（４９〜５７）は、ＰＴＤであることが示された。
グルタミンからアラニンへの置換、すなわち、ＱからＡを含む、ＴＡＴに対するいくつかの修飾は、哺乳動物細胞における９０％から最大３３倍の間のいずれかの細胞取り込みの増加を実証した（Ｈｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１巻（２号）：４７４〜７頁（２００１年））。修飾されたタンパク質の最も効率的な取り込みは、１１アルギニンストレッチが、細胞間送達ビヒクルとして数桁も効率的であったことを示す、ＴＡＴ−ＰＴＤの変異誘発実験によって明らかにされた。よって、一部の実施形態は、カチオン性または両親媒性であるＰＴＤを含む。その上、例示的なＰＴＤとして、ポリ−Ａｒｇ；ＰＴＤ−５；トランスポータン；およびＫＡＬＡが挙げられるがこれらに限定されない。
Ｄ．製剤
１種または複数の活性薬剤を含む医薬組成物も開示されている。
１．医薬組成物
活性薬剤および任意選択で標的化部分、送達ビヒクルまたはこれらの組み合わせを含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、非経口的（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、経皮（受動的またはイオン導入もしくはエレクトロポレーションの使用のいずれか）または経粘膜（鼻、腟、直腸または舌下）投与経路による、または生体で侵食され得る挿入物を使用した投与のためのものであってもよく、各投与経路に適切な剤形で製剤化することができる。
組成物は、例えば、注射または注入によって全身性に投与することができる。ある特定の実施形態では、組成物は、例えば、処置されるべき部位（例えば、腫瘍）へと注射によって直接的に局所的に投与される。一部の実施形態では、組成物は、注射される、外用適用される、または他の仕方で脈管構造へと直接的に投与される。典型的には、局所的投与は、全身性投与によって達成され得るものを超える、組成物の局在濃度増加を引き起こす。
ａ．非経口的投与のための製剤
活性薬剤を含む組成物は、非経口的注射によって、水溶液において投与することができる。製剤は、懸濁液またはエマルションの形態であってもよい。一般に、有効量の活性薬剤を含む医薬組成物が提供され、これは、薬学的に許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体を任意選択で含む。斯かる組成物は、希釈剤、滅菌水、様々な緩衝液内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の緩衝食塩水；ならびに任意選択で、洗剤および可溶化薬剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、これは、ポリソルベート２０または８０とも称される）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）および保存料（例えば、チメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加物を含む。非水性溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロコシ油などの植物油、ゼラチン、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。製剤は、凍結乾燥し、使用直前に再溶解／再懸濁することができる。製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過により、組成物に滅菌剤を取り込むことにより、組成物に照射することにより、または組成物を加熱することにより滅菌することができる。
ｂ．経口製剤
経口製剤は、チューインガム、ゲルストリップ、錠剤またはロゼンジの形態であってもよい。腸溶性経口製剤の調製のための被包物質は、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびメタクリル酸エステルコポリマーを含む。カプセル剤または錠剤など、固体経口製剤が好まれる。エリキシル剤およびシロップも、周知の経口製剤である。エアロゾル製剤の構成成分は、可溶化活性成分、抗酸化剤、溶液製剤のための溶媒ブレンドおよび噴霧体、ならびに懸濁液製剤のための微粒子化および懸濁された活性成分、分散剤および噴霧体を含む。本発明の経口、エアロゾルおよび経鼻製剤は、先行技術の注射用調製物から区別することができる。なぜなら、斯かる製剤が無菌的でなくてもよいが、注射用調製物は、無菌的でなければならないからである。
ｃ．外用投与のための製剤
活性薬剤は、外用で適用することができる。外用投与は、肺、鼻、口（舌下、頬側）、腟または直腸粘膜への適用を含むことができる。
組成物は、約５ミクロン未満の空気力学直径を有するエアロゾルまたはスプレー乾燥粒子のいずれかとして送達された場合、吸入しながら肺へと送達し、肺上皮内層を横切って血流に向かうことができる。
ネブライザー、定量吸入器および粉末吸入器が挙げられるがこれらに限定されない、治療用製品の肺送達のために設計された広範囲の機械的デバイスを使用することができ、これら全て当業者によく知られている。市販のデバイスの一部の具体例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）；Ａｃｏｒｎ（登録商標）ＩＩネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ（登録商標）定量吸入器（Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、Ｎ．Ｃ．）；およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ（登録商標）粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）である。Ｎｅｋｔａｒ、ＡｌｋｅｒｍｅｓおよびＭａｎｎｋｉｎｄは全て、承認されたまたは臨床治験中の吸入可能インスリン粉末調製物を有し、この技術を本明細書に記載されている製剤に適用することができる。
粘膜への投与のための製剤は典型的には、錠剤、ゲル、カプセル、懸濁液またはエマルションに取り込むことができるスプレー乾燥薬物粒子である。標準的な薬学的賦形剤は、いずれかの処方業者から入手することができる。
経皮製剤を調製することもできる。これは典型的には、軟膏、ローション、スプレーまたはパッチとなり、これら全て、標準技術を使用して調製することができる。経皮製剤は、浸透賦活薬を含むことができる。
２．有効量
一部のｉｎ ｖｉｖｏアプローチにおいて、組成物は、治療有効量で対象に投与される。本明細書において、用語「有効量」または「治療有効量」は、処置されている障害の１種または複数の症状の処置、阻害または軽減に、または所望の薬理的および／または生理的効果を他の仕方でもたらすのに十分な投与量を意味する。
がんの処置において使用される活性薬剤の治療有効量は一般に、腫瘍細胞を死滅させる、または腫瘍細胞の増殖もしくは転移を阻害するであろう。がんの症状は、腫瘍負荷など、物理学的、または増殖、アポトーシスに対する抵抗性、遊走、軟寒天におけるコロニー形成など、生物学的となり得る。活性薬剤の実際の有効量は、投与される具体的な活性薬剤、製剤化される特定の組成物、投与機序、および処置されている対象の年齢、体重、状態、ならびに投与経路および疾患または障害を含む因子に応じて変動し得る。
活性薬剤の有効量は、対照と比較することができる。適した対照は、当該技術分野で公知である。典型的な対照は、活性薬剤投与の前と後での対象の状態または症状の比較である。状態または症状は、生化学的、分子的、生理的または病理学的読み出し情報であってもよい。別の実施形態では、対照は、異なる治療剤を投与されるマッチした対象である。したがって、本明細書に開示されている組成物は、処置されるべき疾患または状態のための他の技術分野で認識されている処置と比較することができる。
活性薬剤は、がん細胞の腫瘍形成能の低下に、がん細胞の１種もしくは複数の表現型の低下もしくは逆転に、がんを有する対象の生存の改善に、またはこれらの組み合わせに有効な量で投与することができる。
正確な投与量は、対象に依存した変数（例えば、年齢、免疫系の健康状態など）、疾患およびもたらされている処置など、種々の因子に応じて変動するであろう。さらなる研究が行われると、様々な患者における様々な状態の処置に適切な投与量レベルに関する情報が現れ、当業者は、レシピエントの治療状況、年齢および総体的な健康を考慮して、妥当な投薬を確かめることができるであろう。選択される投与量は、所望の治療効果、投与経路、および所望の処置の持続時間に依存する。一般に、毎日０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルが哺乳動物に投与される。一般に、静脈内注射または注入のため、投与量は、より低くなることができる。
ＩＶ．使用方法
Ａ．がん処置方法
上に紹介する通り、がん処置方法は典型的には、それを必要とする対象に有効量の活性薬剤を投与して、異常に発現されたｐｉＲＮＡの効果を変更するステップを伴う。それを必要とする対象は典型的には、がんを発症する増加した見込みを有するまたはそれがある。本方法は典型的には、組成物が、罹患したまたは他の標的細胞（例えば、がん細胞またはがん性になる可能性がある細胞）に進入し、異常に発現されるｐｉＲＮＡの効果を変更するように実行される。よって、本明細書に開示されている治療法は多くの場合、核酸またはその阻害剤などの活性薬剤による標的細胞のトランスフェクションを含む。最も典型的には、十分な数の効果細胞が、疾患経過を変化させるように、例えば、腫瘍またはがん進行を、例えば、低下、防止または逆転するように処置される。
ｐｉＲＮＡが、正常組織と比べて腫瘍において増加する場合、本方法は、ｐｉＲＮＡの発現を低下させる有効量の薬剤を、それを必要とする対象に投与して、がんを処置するステップを含むことができる。ｐｉＲＮＡが、正常組織と比べて腫瘍において低下する場合、または対象が、コンセンサス野生型配列と比べてｐｉＲＮＡにおける変異（例えば、ＳＮＰ）を示す場合、本方法は、ｐｉＲＮＡの発現を増加させる有効量の薬剤を、それを必要とする対象に投与して、がんを処置するステップを含むことができる。本方法は、治療的であっても、または予防的であってもよい。
より詳細に上に述べ、下に例証する通り、特異的ｐｉＲＮＡは、特異的ながんおよびその予後に関連付けられる。よって、がんそれ自体は、投与または標的化されるべきｐｉＲＮＡの選択を駆動して、がんを処置することができる。
活性薬剤を含む医薬組成物は、１回または２回以上、例えば、２、３、４、５またはそれよりも多い回数投与することができる。組成物の連続的投与は、数日間、数週間または数ヶ月間離して行うことができる。
組成物は、１種または複数の追加的な治療剤と組み合わせて使用することができる。用語「組み合わせ」または「組み合わせた」は、２種またはそれよりも多い薬剤の随伴性、同時または逐次投与のいずれかを指すように使用される。したがって、組み合わせは、随伴性に（例えば、混合物として）、別々にただし同時に（例えば、別々の静脈内ラインを介して同じ対象に）または逐次に（例えば、化合物または薬剤の１種が先ず与えられ、続いて２種目が与えられる）のいずれかで投与することができる。追加的な治療剤は、対象に局所的にもしくは全身性に投与することができる、またはデバイスもしくはグラフト上にもしくは内部にコーティングもしくは取り込むことができる。
開示されている組成物の投与は、外科的、放射線学的、他の治療アプローチと結び付けて、腫瘍およびがんを処置することができる。
１．外科手術
開示されている組成物および方法は、外科手術の補助として使用することができる。外科手術は、多くの種類の良性および悪性腫瘍のための一般的な処置である。多くの場合、外科手術の際に腫瘍細胞を全て除去することは不可能であるため、原発性腫瘍量の切除の後に開示されている組成物を使用して、残存するがん細胞を処置することができる。
好まれる実施形態では、開示されている組成物および方法は、神経系外科手術の補助または代替として使用される。組成物は特に、外科的処置が困難な脳の区域、例えば、脳幹、運動皮質、基底核または内包の高悪性度腫瘍の処置によく適する。これらの位置における高悪性度神経膠腫は一般に、手術不能と考慮される。組成物が役立つことができる追加的な状況は、腫瘍が、重大な脈管構造に巻きつく、または外科的処置が困難な区域にある、のいずれかである領域に見られる。
２．治療剤
組成物は、単独で、または処置されるべき状態、障害もしくは疾患に基づき選択される１種もしくは複数の追加的な治療剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することができる。適した薬理的な薬剤および薬物の様々なクラスの記載は、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第１１版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）（２００５年）に見出すことができる。
追加的な治療剤は、化学療法剤、サイトカイン、ケモカインおよび放射線療法など、従来のがん治療薬を含む。化学療法薬の大部分は、次の通りに分けることができる：アルキル化剤、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤および他の抗腫瘍剤。これらの薬物は全て、細胞分裂またはＤＮＡ合成に影響を与え、何らかの仕方で機能する。追加的な治療薬は、ある特定の種類のがん（慢性骨髄性白血病、胃腸管間質腫瘍）における分子の異常性を直接的に標的とする、モノクローナル抗体およびチロシンキナーゼ阻害剤、例えば、イマチニブメシル酸塩（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）またはＧＬＩＶＥＣ（登録商標））を含む。
代表的な化学療法剤として、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ（ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピポドフィロトキシン、エピルビシン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テニポシド、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソールおよびこれらの誘導体、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、セツキシマブおよびリツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）またはＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ならびにこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。代表的なアポトーシス促進性薬剤として、フルダラビンスタウロスポリン（ｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、ラクトシルセラミド、１５ｄ−ＰＧＪ（２）およびこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
好まれる化学療法薬は、他の活性薬剤（複数可）の活性を縮小することなく、腫瘍またはがん細胞に影響を与えるであろう。
組成物は、増殖因子受容体または腫瘍特異的抗原に特異的な抗体またはその抗原結合性断片と共に投与することができる。代表的な増殖因子受容体として、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ；ＨＥＲ１）；ｃ−ｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２）；ｃ−ｅｒｂＢ３（ＨＥＲ３）；ｃ−ｅｒｂＢ４（ＨＥＲ４）；インスリン受容体；インスリン様増殖因子受容体１（ＩＧＦ−１Ｒ）；インスリン様増殖因子受容体２／マンノース−６−リン酸受容体（ＩＧＦ−ＩＩ Ｒ／Ｍ−６−Ｐ受容体）；インスリン受容体関連キナーゼ（ＩＲＲＫ）；血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）；コロニー刺激因子−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）（ｃ−Ｆｍｓ）；ｓｔｅｅｌ受容体（ｃ−Ｋｉｔ）；Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３；線維芽細胞増殖因子受容体１（Ｆｌｇ／Ｃｅｋ１）；線維芽細胞増殖因子受容体２（Ｂｅｋ／Ｃｅｋ３／Ｋ−Ｓａｍ）；線維芽細胞増殖因子受容体３；線維芽細胞増殖因子受容体４；神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）（ＴｒｋＡ）；ＢＤＮＦ受容体（ＴｒｋＢ）；ＮＴ−３−受容体（ＴｒｋＣ）；血管内皮増殖因子受容体１（Ｆｌｔ１）；血管内皮増殖因子受容体２／Ｆｌｋ１／ＫＤＲ；肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦ−Ｒ／Ｍｅｔ）；Ｅｐｈ；Ｅｃｋ；Ｅｅｋ；Ｃｅｋ４／Ｍｅｋ４／ＨＥＫ；Ｃｅｋ５；Ｅｌｋ／Ｃｅｋ６；Ｃｅｋ７；Ｓｅｋ／Ｃｅｋ８；Ｃｅｋ９；Ｃｅｋ１０；ＨＥＫ１１；９ Ｒｏｒ１；Ｒｏｒ２；Ｒｅｔ；Ａｘｌ；ＲＹＫ；ＤＤＲ；およびＴｉｅが挙げられるがこれらに限定されない。
Ｖ．異常ｐｉＲＮＡ発現に基づく診断および予後方法
異常に発現されるｐｉＲＮＡのいずれかを、がんの重症度および処置可能性を診断またはグレード分類するためのバイオマーカーとして使用することもできる。
Ａ．調節不全ｐｉＲＮＡ
本明細書に開示されている調節不全ｐｉＲＮＡを使用して、それに関連するがんを検出、診断または予後診断することができる。本方法は典型的には、調節不全ｐｉＲＮＡの１種または複数の測定値を得るステップを含む。本方法は典型的には、生物学的試料における１種または複数のｐｉＲＮＡのレベルを測定するステップと、これを対照または参照値と比較するステップとを含む。生物学的試料は、腫瘍試料であってもよい。さらに、ｍｉＲＮＡと同様に、ｐｉＲＮＡは、大部分は循環中に分解されずに残り、研究室で定期的に使用される広範囲のインキュベーションおよび貯蔵条件に抵抗する能力を有する（Ｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ（２０１６年）１５巻：５号ＤＯＩ １０．１１８６／ｓ１２９４３−０１６−０４９１−９（１３頁））。胃がんにおけるｐｉＲＮＡに関する近年の研究は、現存するｍｉＲＮＡに基づくバイオマーカー検出系と比較して、ｐｉＲＮＡが、より高い感度および特異性をもたらしたことを見出した。よって、一部の実施形態では、試料は、血液試料であってもよい。血液試料は、全血、血清または血漿に由来することができる。
一部の実施形態では、対象ががんを有するかまたは対象ががんを発症する可能性があるかを決定するために、測定レベル（複数可）は、参照値と比較される。参照レベルが、正常血液または組織におけるｐｉＲＮＡのレベルである場合、ｐｉＲＮＡが、本明細書で論じられる相関に従って参照値と比べて測定値において過剰または過少発現される場合に、対象は、がんと診断される。例えば、選択されるｐｉＲＮＡが、本明細書に記載されている通り、正常組織と比べてがんにおいて増加する場合、生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルが、対照と比べて増加する場合に、対象は、例えば、診断、選択され得る。同様に、選択されるｐｉＲＮＡが、本明細書に記載されている通り、正常組織と比べてがんにおいて減少する場合、生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルが、対照と比べて減少する場合に、対象は、例えば、診断、選択され得る。
その上またはそれに代えて、参照レベルが、以前のがん診断の血液または組織におけるｐｉＲＮＡのレベルである場合、ｐｉＲＮＡが、本明細書で論じられる相関に従って参照値と比べて測定値において同一もしくは同様である場合に、対象は、がんと診断される。参照値は、絶対値または絶対値の範囲であってもよい。参照値は、相対値または相対値の範囲であってもよい。
一部の実施形態では、測定値および参照値の比較は、測定値および参照値の間の倍数の差の計算を含む。一部の実施形態では、正常参照値および測定値の間の倍数の差は、少なくとも２、３、４または５倍である。
一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡのレベルは、全生存および腫瘍進行と関連するため、予後値をもたらす。ｐｉＲＮＡレベルを測定する方法については、より詳細に後述する。
例示的な方法が提供される。例えば、個体におけるがんは、個体の生物学的試料におけるｐｉＲＮＡの量を定量化することにより診断または検出することができ、対照または参照値と比較して、個体の生物学的試料における増加または減少した量のｐｉＲＮＡは、がんを示す。
一部の実施形態では、対象におけるがんを診断するための方法は、第１の生物学的試料および第１の試料後の期間に採取された第２の生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルを決定するステップを含むこともでき、第１の試料と比較した、第２の試料におけるｐｉＲＮＡのレベルの増加または減少は、がんの発症または悪化を示す。
がんの重症度を決定するための方法も開示されている。方法は、（ａ）対象由来の生物学的試料におけるｐｉＲＮＡを決定するステップと、（ｂ）生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルを、がんの疾患重症度と相関するｐｉＲＮＡの参照レベルと比較して、対象におけるがんの重症度を決定するステップとを含むことができる。
がんの重症度の決定は、個体の生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルを定量化し、個体の生物学的試料におけるｐｉＲＮＡの量を、がんの異なるステージを示すｐｉＲＮＡの量（複数可）と相関させることにより検出または評価することもできる。
処置のための対象を選択する方法も提供される。方法は、（ａ）対象から得られる生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルを決定するステップと、（ｂ）生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルを、対照におけるｐｉＲＮＡのレベルと比較するステップと、（ｃ）生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルが、対照におけるｐｉＲＮＡのレベルよりも高いまたは低い場合、処置のための対象を選択するステップとを含むことができる。処置のための対象を選択するための方法は、第１の生物学的試料および第１の試料の後に採取された第２の生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルを決定するステップと、第２の生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルが、第１の試料におけるｐｉＲＮＡのレベルよりも高いまたは低い場合、処置のための対象を選択するステップとを含むこともできる。
がんの異なるステージまたは重症度の異なるレベルと相関するｐｉＲＮＡの量は、がんの異なるステージの患者におけるｐｉＲＮＡを定量化することにより予め決定することができる。
方法のいずれかは、２種またはそれよりも多いｐｉＲＮＡのレベルを測定するステップを含むことができる。方法のいずれかは、処置方法と組み合わせることができる。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡの下流標的が、ｐｉＲＮＡの発現の測定に加えてまたはこれに代えて測定される。ｐｉＲＮＡによって影響されるタンパク質発現レベルおよびシグナル伝達経路を含む下流標的の例は、下に例証される、当該技術分野で公知である、および／または実験によって決定することができる。
Ｂ．ｐｉＲＮＡバリアント（変異体）の発現
本明細書に開示されている変異体ｐｉＲＮＡを使用して、これに関連するがんを発症する可能性がある対象を検出、診断または予後診断または同定することができる。本方法は典型的には、変異体またはバリアントｐｉＲＮＡが、対象から得られる試料において発現されるか、または対象のゲノムに存在するかを決定するステップを含む。
変異体またはバリアントｐｉＲＮＡが発現されるかどうかを決定する場合、試料は、上に論じられる通り、腫瘍試料または血液試料であってもよい。しかし、変異体またはバリアントｐｉＲＮＡは、変異体またはバリアントゲノム配列にコードされるため、変異体またはバリアントｐｉＲＮＡは、ｐｉＲＮＡのゲノム配列を決定することにより同定することもできる。いずれか適した試料は、配列決定に利用することができる。
例えば、一部の実施形態では、バリアントまたは変異体ｐｉＲＮＡが、対象由来の試料において発現されるか、または対象のゲノムにコードされるかを決定することにより、対象におけるがんを診断するため、または対象が、がんを発症する増加した見込みを有することを決定するための方法が提供される。
処置のための対象を選択する方法も提供される。方法は、（ａ）変異体またはバリアントｐｉＲＮＡが、対象から得られる生物学的試料において発現されるか、または対象のゲノムにコードされるかを決定するステップと、（ｂ）生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルが、対照におけるｐｉＲＮＡのレベルよりも高いまたは低い場合、処置のための対象を選択するステップと、任意選択で（ｃ）遺伝的関連研究から同定された保護的形態のｐｉＲＮＡアレル（野生型またはバリアント）（がん処置に直接的に使用することができる）を対象に投与するステップとを含むことができる。
方法のいずれかは、２種またはそれよりも多いバリアントまたは変異体ｐｉＲＮＡの存在を検出または決定するステップを含むことができる。方法のいずれかは、機能障害性ｐｉＲＮＡの検出に関する前述の方法および／または処置方法と組み合わせることができる。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡの下流標的が、ｐｉＲＮＡの発現の測定または遺伝的なその存在の検出に加えてまたはこれに代えて測定される。
Ｃ．治療有効性を決定する方法
一部の実施形態では、本明細書に開示されている組成物および方法は、がんのための処置の治療有効性の決定に使用される。活性薬剤は、機能障害性ｐｉＲＮＡを低下、軽減または逆転する場合、効果的と見出され得る。例えば、一部の実施形態では、対象における活性薬剤の治療有効性を決定するための方法は、活性薬剤による処置前の第１の生物学的試料および活性薬剤による１回または複数の処置後の期間に採取された第２の生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルを決定するステップを含むことができ、第１の試料と比較した第２の試料におけるｐｉＲＮＡのレベルの増加または減少は、効果的な活性薬剤を示す。典型的には、調節不全ｐｉＲＮＡが、正常組織と比べてがんにおいて増加する場合、処置は、ｐｉＲＮＡの発現を低下させるのであれば効果的である。同様に、調節不全ｐｉＲＮＡが、正常組織と比べてがんにおいて減少する場合、処置は、ｐｉＲＮＡの発現を増加させるのであれば効果的である。
一部の実施形態では、本明細書に開示されている組成物および方法は、投薬レジメンの確立または修飾に使用される。例えば、対象は、第１の用量の組成物を第１の投薬期間にわたり；および第２の用量の組成物を第２の投薬期間にわたり、任意選択で、続いて１または複数の追加的な用量を１回または複数の追加的な投薬期間にわたり、投与され得る。第１の投薬期間は、１週間未満、１週間または１週間超であってもよい。
一部の実施形態では、投薬レジメンは、用量増大投薬レジメンである。第１の用量は、低用量であってもよい。用量増大は、満足のいく生化学的または臨床応答に達するまで続けることができる。次に、投与量を、維持し得るかまたは維持用量へと着実に低下させ得る。本方法を使用して、治療法の用量レベル、用量頻度または持続時間を標準化、最適化またはカスタマイズすることができる。
有効性および投薬を決定する方法として、本明細書に開示されている特異的な処置方法が挙げられるがこれに限定されない。本方法は、化学療法剤、免疫療法などが挙げられるがこれらに限定されない、がんの処置のための他の活性薬剤の調査にも有用である。
方法のいずれかは、２種またはそれよりも多い機能障害および／またはバリアントまたは変異体ｐｉＲＮＡの存在を検出または決定するステップを含むことができる。方法のいずれかは、機能障害性および／またはバリアントまたは変異体ｐｉＲＮＡを検出する前述の方法、および／または処置方法のいずれかと組み合わせることができる。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡの下流標的が、ｐｉＲＮＡの発現の測定または遺伝的なその存在の検出に加えてまたはこれに代えて測定される。
ＶＩ．異常ｐｉＲＮＡのスクリーニング方法
異常ｐｉＲＮＡのスクリーニング方法も提供される。後述する実施例で例証される２種の好まれる方法は、（１）正常組織と比べてがんまたは腫瘍型において増加するｐｉＲＮＡを同定するステップ（例えば、発現プロファイリング）と、（２）正常組織と比べてがんまたは腫瘍型のｐｉＲＮＡにおける変異を同定するステップ（例えば、ＳＮＰプロファイリング）とを含む。これらの方法は、一般に、例えば、核酸アレイ、配列決定ならびに他の研究室およびｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールを使用して、下に例証する方法に従って創出することができる。これらの方法は、単に上記および下記に論じられたがんに適用するのみならず、膀胱、脳、乳房、子宮頸部（ｃｅｒｖｉｃａｌ）、結腸直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣、精巣および血液学的がんが挙げられるがこれらに限定されない、他のがんにおける異常ｐｉＲＮＡ発現の役割の調査に使用することもできる。
Ａ．発現プロファイリング
発現プロファイリングは典型的に、組織型（腫瘍および正常）毎に等しい割合で全ＲＮＡを先ずプールすることにより実行される。発現レベルは、当該技術分野で公知のいずれか適した手段を使用して決定することができるが、最も好まれる方法は、ｐｉＲＮＡ発現アレイを使用している。ｐｉＲＮＡ発現アレイは、市販されており、数千種の成熟ヒトｐｉＲＮＡに対するプローブを含む。
Ｂ．変異プロファイリング
例えば、ｐｉＲＮＡバリアント（すなわち、ｐｉＲＮＡ変異）は、ｐｉＲＮＡＢａｎｋデータベースなどのリソースから得られる実験的に観察されるｐｉＲＮＡのゲノム座標を使用して同定することができる。例えば、以前に調製された参照セット由来の一塩基多型（ＳＮＰ）をこのような座標内に同定することができる。
＞１００個のゲノム遺伝子座にマッピングするｐｉＲＮＡにおけるＳＮＰを除外することができる。なぜなら、このようなｐｉＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子調節に関与する可能性が低いからである。
同定されたＳＮＰを調査して、その発現が、異なるがん型の有病率と相関するかどうか（すなわち、ＳＮＰが、対応する正常組織が、野生型ｐｉＲＮＡを発現する場合と比べてがん型において発現されるかどうか）を決定することができる。
例えば、がんに関連する異常ｐｉＲＮＡを同定する方法は、正常組織試料において発現されるｐｉＲＮＡの配列を、がん組織において発現されるｐｉＲＮＡの配列と比較するステップと、がん組織由来のｐｉＲＮＡの配列が、正常組織における対応するｐｉＲＮＡとは異なる場合（例えば、バリアント、変異体など）、がんに関連する異常ｐｉＲＮＡを同定するステップとを含むことができる。正常組織における対応するｐｉＲＮＡは典型的に、がん組織における変異体またはバリアントｐｉＲＮＡと同じゲノム位置にコードされるｐｉＲＮＡを意味する。一部の実施形態では、変種または変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。一部の実施形態では、この差は、その標的ｍＲＮＡに結合するがんｐｉＲＮＡの該能力を変更する。ｍＲＮＡは、癌遺伝子であってもよい。一部の実施形態では、野生型ｐｉＲＮＡの発現は、がんの腫瘍形成能を低下させる。
ＶＩＩ．候補ｐｉＲＮＡを検出する方法
いずれか適した手段を使用して、発現されるｐｉＲＮＡを検出することができる、および／またはその配列を決定することができる。本方法は典型的に、ｍＲＮＡの検出に使用される方法と同様または同一である。例示的な方法として、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、逆転写リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、次世代配列決定を使用したトランスクリプトーム解析、アレイハイブリダイゼーション解析、デジタルＰＣＲ、ノーザン解析、ドット−ブロットおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが挙げられるがこれらに限定されない。
同様に、ｐｉＲＮＡのゲノム配列は、いずれか適した手段を使用して決定することができる。例として、配列決定およびマイクロアレイが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明は、次の非限定的な実施例を参照することによりさらに理解されるであろう。
（実施例１：ＧＷＡＳ後解析によって同定された神経膠腫関連ｐｉＲＮＡ）
原発性悪性脳および中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍のほぼ２３，４００例の新たな症例が、２０１４年に米国で診断されるであろうと推定された；そのうち、およそ２，２４０例が、０〜１４歳の小児で診断され、５４０例が、１５〜１９歳の青年で診断されるであろう。全死亡率は、この１０年間で有意に変化しなかった。発生率および死亡率の両方が、他の人種／民族群の者よりも白人で高い。全人種／民族群において、男性は、女性よりも高い発生率および死亡率を有する。脳腫瘍は、小児における固形腫瘍がんによる死亡の主因である。脳およびＣＮＳ腫瘍は、全小児期がんのおよそ２１パーセントを構成する。小児における脳およびＣＮＳがんの発生率は、１９８０年代半ば以来、比較的安定であったが、この期間にわたって死亡率は降下した。
大部分の脳およびＣＮＳがんの原因は不明である。しかし、ある特定の種類の脳腫瘍を発症するリスクを増加し得る因子は、放射線への曝露、塩化ビニルへの曝露、およびある特定の遺伝的症候群を有することを含む。脳およびＣＮＳがんのスクリーニング検査は存在しない。成人脳がんのための標準処置は、慎重な経過観察、外科手術、放射線療法、化学療法および標的化療法を含む。生物学的療法および陽子線放射線療法など、成人脳がんのためのより新しい処置は、臨床治験で研究中である。発生率および生存率が、近年の傾向に従うと仮定すると、２０１４年に米国で脳がんケアに４９億ドルが費やされることになると推定される。
化学療法は、細胞の死滅または細胞分裂の停止のいずれかにより、がん細胞の成長を停止するための薬物を使用するがん処置である。化学療法が、口により服用または静脈もしくは筋肉に注射される場合、薬物は、血流に進入し、全身にわたりがん細胞に達することができる（全身性化学療法）。化学療法が、脳脊髄液、臓器または腹部などの体腔に直接的に置かれる場合、薬物は主に、これらの区域におけるがん細胞に影響を与える（限局性化学療法）。併用化学療法は、２種以上の抗がん薬を使用した処置である。脳腫瘍を処置するために、外科手術によって腫瘍が除去された後に、溶解するウエハを使用して、脳腫瘍部位に抗がん薬を直接的に送達することができる。化学療法が与えられる仕方は、腫瘍の型およびグレード、ならびに脳内のどこに存在するかに依存する。
脳および脊髄腫瘍を処置するために口または静脈によって与えられる抗がん薬は、血液脳関門を通過し、脳および脊髄を囲む液に進入することができない。その代わりに、抗がん薬は、液で満たされた空間に注射されて、そこでがん細胞を死滅させる。これは、髄腔内化学療法と呼ばれる。
生分解性ポリ酸無水物ポリ−（１，３ビス［ｐ−カルボキシフェノキシ］プロパン−ｃｏ−セバシン酸またはｐ［ＣＰＰ：ＳＡ、２０：８０］を使用した、局所的な持続した薬物放出は、脳腫瘍の処置に対するいくつかの化学療法剤の抗神経膠腫有効性を改善する。Ｐ［ＣＰＰ：ＳＡ、２０：８０］は、全身性または局所的毒性の証拠がなく、脳において生体適合性であることが示された、局所的薬物送達のＦＤＡ承認された方法であり、現在、ＢＣＮＵ（ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標））の局所的送達のために臨床使用されている。
全身性がんの全生存率における多大な改善にもかかわらず、原発性脳悪性疾患は依然として、全てのヒトがんの中で最も悪い５年生存率のいくつかを有する（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ．、Ｌｉｖｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ − ｍｅｄｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅｓ： Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｌｏｎｄｏｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ａｎｄ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１１年）。
グリア細胞から生じる神経膠腫は、全中枢神経系悪性疾患のおよそ８０％を占める神経系の腫瘍である。星状細胞性グリア細胞から生じる多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、このような腫瘍のうち最も一般的かつ攻撃性であり、高度に浸潤性の挙動を有する低分化星状細胞によって典型的に表される。２０１０年の時点で、標準治療処置を受けている患者の生存期間中央値は、僅か１５ヶ月間であった。ＧＢＭのゲノムの特徴付けにおける顕著な進行およびテモゾロミドの導入後の生存における中程度の改善にもかかわらず、この致命的な腫瘍の処置における主なブレークスルーは、理解しづらいままである。したがって、ＧＢＭ腫瘍進行の生物学の理解の拡大および新たな治療機会の調査が、最も重要である。
材料と方法
ＧＷＡＳ（ゲノムワイド関連研究）後解析を行って、神経膠腫関連ｐｉＲＮＡを同定した。研究集団は、ＧｌｉｏｍａＳｃａｎコンソーシアム由来の新たに診断された神経膠腫を有する１，８４０名の対象および２，４０１名のがんがない対照を含む、１４種のコホート研究、３種の症例対照研究および１種の集団に基づく症例のみ研究から引き出されたヨーロッパ祖先の対象を含んだ。
研究対象およびデータ
ＧｌｉｏｍａＳｃａｎコホートに基づくゲノムワイド関連研究の参加者の個体レベルの遺伝子型データおよび表現型対象特徴を、データアクセス承認を受けた後に、遺伝子型および表現型のデータベース（ｄｂＧａＰ、研究受託ｐｈｓ０００６５２．ｖ１．ｐ１）からダウンロードした。最終解析に含まれる１，８４０症例（ＩＣＤＯ−３コード９３８０−９４８０）および２，４０１対照が存在した。
ｐｉＲＮＡバリアントの同定
全ての実験的に観察されるヒトｐｉＲＮＡのゲノム座標を、ｐｉＲＮＡＢａｎｋデータベースから得た。１，０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｐｈａｓｅ ３参照バリアントセット（ｎ＝７７，８１８，３３２両アレルＳＮＰ）に含まれる、一塩基多型（ＳＮＰ）を、このような座標内に同定した。＞１００個のゲノム遺伝子座にマッピングするｐｉＲＮＡにおけるＳＮＰを除外した。なぜなら、このようなｐｉＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子調節に関与する可能性が低いからである。
ｐｉＲＮＡバリアント遺伝子型インピュテーション
遺伝子型および表現型データを、Ｙａｌｅ大学の安全なサーバーへとダウンロードし、ｄｂＧａＰガイドラインに従って解読および抽出を行った。１，０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｈａｓｅ ３ハプロタイプを、ＩＭＰＵＴＥ ｖ２．３．１ソフトウェアを使用したインピュテーションの参照パネルとしての使用のためにダウンロードした。インプットデータは、ＰＬＩＮＫツールセットを使用して、コール率≧９０％およびＨＷＥ Ｐ＞０．０００１によりＳＮＰに制限した。５−Ｍｂチャンク（ｃｈｕｎｋ）におけるＭＡＦ＞１％により、全ＳＮＰのインピュテーションにより微細マッピングを行い、領域アノテーションは、ＵＣＳＣゲノムブラウザに由来した。
関連研究のための統計解析
ＥＩＧＥＮＳＯＦＴ ｖ６．０集団遺伝学パッケージにおけるｓｍａｒｔＰＣＡアルゴリズムによって生成される、性別、年齢、研究設計および最初の２種の主成分について調整する相加的アレルロジスティック回帰分析モデルを適用するＳＮＰＴＥＳＴ ｖ２．５ソフトウェアにより、バリアント−神経膠腫関連のオッズ比（ＯＲ）および９５％信頼区間（ＣＩ）を推定した。ボンフェローニ補正された有意性閾値に勝る関連を統計的に有意であると考慮し、偽発見率調整されたＰ値＜０．１０を生じる関連を中程度の目的の関連であると考慮した。
細胞株および試薬
ＡＴＣＣから購入した神経膠腫細胞株Ｕ８７およびＡ１７２、ならびにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｒｅから購入した不死化正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）は、１０％ ＦＢＳを補充したＥＭＥＭ（Ｕ８７）またはＤＭＥＭ（Ａ１７２、ＮＨＡ）に維持した。ｐｉＲＮＡ模倣物は、ＩＤＴから購入し、同様のサイズの一本鎖非標的化ＲＮＡ配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において陰性対照として使用した（ＱＩＡＧＥＮ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのため、リポフェクタミン ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者の指示に従って細胞をリバーストランスフェクトした；ｓｉＧＬＯ蛍光トランスフェクション対照オリゴ（ＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、トランスフェクション効率を確認した。
ｐｉＲＮＡ発現の測定
ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、Ｕ８７、Ａ１７２およびＮＨＡ細胞ライセートから全ＲＮＡを単離し、ＮＣｏｄｅ ｍｉＲＮＡ第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｃＤＮＡを変換した。ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＡＢＩ−７５００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてｑＰＣＲを行った。カスタム低分子ｐｉＲＮＡフォワードプライマーおよび付属のポリ（Ａ）テイルを標的とするユニバーサルリバースプライマーを用いて、三連で増幅反応を行った。核内低分子ＲＮＡ Ｕ６発現に対して発現レベルを正規化した。デフォルトパラメータを使用したＭｆｏｌｄ ｖ３．６ ＲＮＡフォールディングアルゴリズムによって、ｐｉＲＮＡの予測される二次構造を生成した。
ゲノムワイド発現プロファイリング
Ｕ８７細胞に、野生型ｐｉＲ−５９８または非標的対照（ＮＣ）ＲＮＡのいずれかをリバーストランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後に細胞を収集し、全ＲＮＡを単離し、およそ１μｇを、生物学的に２回複製した、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＨＴ−１２ ｖ４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐプラットフォームにおけるゲノムワイド発現プロファイリングのためのゲノム解析のためのＹａｌｅ Ｃｅｎｔｅｒに提出した。ＦＤＲ調整されたＰ＝０．０５の有意性閾値を越えて、ＮＣおよびｐｉＲ−５９８−ＷＴ処理の間で発現レベル差を示す遺伝子は、差次的に発現されたと考慮した。ＧＡＰＤＨに対するインプット正規化を用いたｑＰＣＲによる発現検証のために５種の遺伝子を選択した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析ソフトウェアを使用して、ネットワークおよび経路解析を行った；特定の機能アノテーションによる影響される遺伝子の濃縮のためのフィッシャーの直接検定を使用して、影響される機能経路のＰ値を計算した。アレイデータは、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓリポジトリに寄託した（受託番号ＧＳＥ７８９３５）。
細胞生存率アッセイ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｐｉＲＮＡ−５９８および陰性対照ＲＮＡ処理細胞集団において細胞生存率を評価した。手短に説明すると、トランスフェクション後４８および９６時間目に細胞生存率を定量化した。４９０ｎｍの吸光度でマイクロプレート分光光度計を使用して、ＭＴＳの添加１時間後に発色を評価した。条件につき６回複製を使用したスチューデントｔ検定を使用して、生存率の差を解析した。
軟寒天コロニー形成アッセイ
Ｕ８７細胞に、ｐｉＲＮＡ−５９８または陰性対照オリゴをリバーストランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、０．３６％寒天入りの温めたＥＭＥＭに再懸濁した。この混合物を、６０ｍｍ細胞培養皿内の、０．７５％寒天の予め凝固させた基層上に蒔いた。５日間毎に５００μＬ完全培地を添加しつつ、３７℃で皿をインキュベートした。３週間後に、ＰＢＳ中０．０４％クリスタルバイオレット−２％エタノールでコロニーを染色し、写真を撮った。ＩｍａｇｅＪ ｖ１．４８ソフトウェアを使用して、コロニーを計数し、スチューデントｔ検定を使用して、条件間を比較した。実験は、三連で行った。
結果
ｐｉＲＮＡコード配列における遺伝バリアントが、成人神経膠腫発症のリスクに関連するかどうかを決定するために、ＧｌｉｏｍａＳｃａｎコンソーシアムに含まれる、新たに診断された神経膠腫を有する１，８４０名の対象および２，４０１名のがんがない対照において遺伝的関連解析を行った。症例のおよそ６７％が、高悪性度神経膠腫（グレードＩＩＩまたはＩＶ）と診断され、その大部分（８２％）が、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）サブタイプのものであり、対象の５５．２％が男性であった。
ｐｉＲＮＡコード配列における２，５１４種の目的のＳＮＰのうち、３１種（１．２％）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＨａｐ６６０Ｗプラットフォームにおいて直接的に遺伝子型判定し、１，３９７種（５５．６％）で遺伝子型を帰属させた；ｐｉＲＮＡコード遺伝子間領域における低いアレイカバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）のため、十分に高品質で帰属させることができなかったため、１，０８６種のＳＮＰ（４３．２％）を除外した。全体として、性別、年齢、研究設計および最初の２種の主成分について調整して、神経膠腫リスクとの関連について１，４２８種のＳＮＰを解析した。このモデルを使用したインプット遺伝子型データにおいて、根底にある集団下部構造または他の因子由来の系統的バイアスの証拠は検出されなかった（ゲノムインフレーション因子（ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｆｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）λ＝１．００９）。
マンハッタンプロットは、全１，４２８種のｐｉＲＮＡ ＳＮＰ神経膠腫関連検査結果を説明する。解析は、神経膠腫リスクと、染色体２ｑ３３．１におけるｐｉＲ−２７９９の３’端付近に位置する稀なバリアントｒｓ１４９３３６９４７と（Ｐ＝２．３４×１０−５；ＦＤＲ調整されたＰ＝０．０３３）の間のボンフェローニ補正された（Ｐ＜０．０５／１，４２８ ＳＮＰ＝３．５０×１０−５）統計的に有意な関連を明らかにした。ｐｉＲ−２７９９は、脳を含むヒトの身体において広く発現されるアポトーシス阻害剤ＣＦＬＡＲの４番目のイントロンにマッピングする３０ヌクレオチドｐｉＲＮＡである（図２Ａ）。
４種の追加的な中程度の目的の関連が、染色体６ｑ２７のｐｉＲ−１８９１３におけるｒｓ６２４３５８００（Ｐ＝１．１３×１０−４；ＦＤＲ調整されたＰ＝０．０５４）、染色体８ｑ１３．１のｐｉＲ−５９８におけるｒｓ１４７０６１４７９（Ｐ＝１．６９×１０−４；ＦＤＲ調整されたＰ＝０．０６０）、染色体９ｑ２２．１のｐｉＲ−１１７１４におけるｒｓ１４２７４２６９０（Ｐ＝１．１０×１０−４；ＦＤＲ調整されたＰ＝０．０７９）および染色体１０ｑ２４．２のｐｉＲ−３２６６におけるｒｓ３５７１２９６８（Ｐ＝３．１１×１０−４；ＦＤＲ調整されたＰ＝０．０８９）において観察された（表１）。
より高い分解能でこれらの関連を試験するために、５種の関連ＳＮＰ周囲の３００ｋｂ領域における全ＳＮＰについて遺伝子型を帰属させた。ｐｉＲ−２７９９に関して、この解析は、連鎖不平衡のほぼ２５０ｋｂ領域に及ぶｒｓ１４９３３６９４７に匹敵する規模の関連を有するほぼ１００種のＳＮＰを明らかにした（図２Ｂ〜図２Ｆ）。この領域は、４種の遺伝子を含有し、１種の遺伝子の上流である。対照的に、増強された関連シグナルを示すＳＮＰのクラスターが、ｐｉＲ−１８９１３におけるｒｓ６２４３５８００、ｐｉＲ−５９８におけるｒｓ１４７０６１４７９、ｐｉＲ−１１７１４におけるｒｓ１４２７４２６９０およびｐｉＲ−３２６６におけるｒｓ３５７１２９６８周囲の連鎖不平衡のより狭い領域において観察された。ｐｉＲ−１８９１３およびｐｉＲ−５９８の両方は、少数のｐｉＲＮＡをコードする遺伝的領域にマッピングし、タンパク質コード遺伝子を欠く。ｐｉＲ−１１７１４は、タンパク質コード遺伝子をコードしないｐｉＲＮＡ高密度ハプロタイプに位置し、ＳＰＩＮ１のほぼ５０ｋｂ上流であり、ｐｉＲ−３２６６は、ＨＰＳＥ２の３’ＵＴＲにマッピングする。
ｑＰＣＲに基づく方法を使用して、ｐｉＲＮＡ発現測定を行った。結果は、検査した全細胞株（Ｕ８７、Ａ１７２およびＮＨＡ）におけるｐｉＲ−１８９１３、ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１１７１４およびｐｉＲ−３２６６の発現を示した。ｐｉＲ−２７９９の発現は、細胞株のいずれにおいても検出されなかった。
試験した細胞株において発現されることが見出された４種の候補ｐｉＲＮＡ（ｐｉＲ−１８９１３、ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１１７１４およびｐｉＲ−３２６６）の中で、ｐｉＲ−５９８は、最大規模の神経膠腫リスクまたは保護を付与するバリアントを有し、したがって、追加的なｉｎ ｖｉｔｒｏ機能解析の対象であった。ｐｉＲ−５９８の予測される二次構造は、図３Ａに説明されている。最も熱力学的に安定な構造において、ｐｉＲＮＡは、５番目の塩基から１９番目の塩基へと小さなヘアピンループを形成する；３１塩基の２９番目に位置するバリアントｒｓ１４７０６１４７９は、予測されるループ構造に関与しない。Ｕ８７細胞におけるｐｉＲＮＡの一過性上方調節後に、トランスクリプトームワイド発現プロファイリング２４時間を行って、神経膠腫の状況におけるこのｐｉＲＮＡの発現の影響を試験した。非標的化対照処理細胞と比べて、総計５１８種の転写物が、ＦＤＲ調整されたＰ＜０．０５で差次的に発現されることが観察され、その大部分（７１．２％）は、ｐｉＲ−５９８処理細胞において過少発現されることが観察された。ｑＰＣＲによる発現アレイデータの検証のために選択された５種の転写物の発現差は一般に、アレイ結果と一貫した。
その後のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析は、ｐｉＲ−５９８に影響される遺伝子が、細胞死および生存（Ｐ＝３．４３×１０−３）、細胞周期進行（Ｐ＝２．６３×１０−３）ならびに細胞アセンブリおよび組織化（Ｐ＝２．３９×１０−３）に関与するものに関して有意に濃縮されたことを示した（図３Ｂ）。ネットワーク視覚化解析は、ｐ５３媒介性アポトーシスの鍵となる調節因子であるＢＡＸおよび発癌性転写因子ＪＵＮを含む機能的に相互関係する分子のコアを明らかにした（図３Ｃ）。
野生型およびバリアントｐｉＲ−５９８模倣物は、神経膠腫（Ｕ８７およびＡ１７２）および正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）細胞株において非依存的に過剰発現され、細胞生存率を測定した。非標的化対照ＲＮＡと比べて、野生型ｐｉＲ−５９８のトランスフェクションは、Ｕ８７およびＡ１７２細胞の両方の増殖を急激に低下させ、注目すべきことに、Ｕ８７においてトランスフェクション９６時間後にほぼ４０％阻害が測定された。しかし、野生型ｐｉＲ−５９８ではなく変異体のトランスフェクションは、バリアントアレルを含有し、抗増殖性影響を有意に減弱した。正常グリア細胞株ＮＨＡにおいて同じパターンが観察された（図４Ａ〜図４Ｃ）。
足場非依存的成長能のモデルである軟寒天でのＵ８７コロニー形成において、ｐｉＲＮＡバリアントの機能的影響も試験した。野生型ｐｉＲ−５９８による処理は、形成されたコロニーの数を、陰性対照処理後に形成される数のおよそ半分まで低下させた。しかし、野生型ｐｉＲＮＡではなくバリアントによる処理は、ｐｉＲＮＡの抗増殖性効果を排除させるだけでなく、野生型ｐｉＲ−５９８処理と比べて４倍超のコロニー形成能増加の付与にも十分であった（図４Ｄ）。
このＧＷＡＳ後研究は、５種のｐｉＲＮＡ遺伝子座における遺伝バリアント（ＦＤＲ調整されたＰ＜０．１０）は、最大の公開されている神経膠腫ＧＷＡＳデータセットであるＧｌｉｏｍａＳｃａｎコホートにおいて神経膠腫リスクに関連することを示す。これらの関連のいずれも、以前の刊行物には報告されなかった。８ｑ２４および９ｐ２１におけるゲノム遺伝子座は、以前のＧＷＡＳ（３８、３９）における神経膠腫に関連付けられた；しかし、ｒｓ１４７０６１４７９（８ｑ１３のｐｉＲＮＡ−５９８）およびｒｓ１４２７４２６９０（９ｑ２２のｐｉＲＮＡ−１１７１４）において、これらの染色体において観察される関連は、以前のシグナルとは無関係であり、ｐｉＲＮＡバリアントを有する遺伝的リスク遺伝子座が、ＧＷＡＳ後アプローチから同定されたことを示す。
ボンフェローニ調整された有意な関連が、神経膠腫リスクおよびｐｉＲ−２７９９におけるｒｓ１４９３３６９４７の間に検出された。領域インピュテーションは、この関連が、アポトーシス調節因子ＣＦＬＡＲを含む４種の遺伝子ならびにいくつかのがんに対する感受性に関連付けられたイニシエーターカスパーゼＣＡＳＰ１０およびＣＡＳＰ８のプロモーター領域を有する連鎖不平衡の大領域にわたって延長したことを示した。よって、ｒｓ１４９３３６９４７における関連は、ｐｉＲ−２７９９とは無関係の機能的多型を反映することができ、おそらく、さらなる追跡のそれ自体が価値ある神経膠腫リスクの別々の低頻度バイオマーカーを表す。Ｕ８７、Ａ１７２またはＮＨＡ細胞株においてｐｉＲ−２７９９発現が検出不能であったという観察は、この概念をさらに支持する。
対照的に、ｐｉＲＮＡのｐｉＲ−１８９１３、ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１１７１４およびｐｉＲ−３２６６を有する他の４種の領域の領域インピュテーションは、周囲の区域と比べて増幅された関連シグナルを有するＳＮＰの狭いクラスターを明らかにした。ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１８９１３およびｐｉＲ−１１７１４をコードする領域にタンパク質コード遺伝子は存在しない。さらに、これらのｐｉＲＮＡのうち全４種の発現は、正常グリアおよび神経膠腫細胞株の両方において検出可能であった。これらの知見は、さらなる試験を保証する、神経膠腫形成におけるこれらのｐｉＲＮＡおよびそれらのバリアントの潜在的な生物学的役割を示す。
同定されたｐｉＲＮＡの１種、ｐｉＲ−５９８の機能的有意性を、追跡転写プロファイリングおよびネットワーク解析において調査したところ、細胞死および生存経路におけるこのｐｉＲＮＡの関与を示した。アポトーシスリプレッサーＢｃｌ−２を阻害することにより細胞死を促進するタンパク質をコードするＢＡＸ転写物の上方調節された発現が、特に興味深かった。別のＢｃｌ−２相互作用およびアポトーシス促進タンパク質をコードする密接に関係しているＧＯＳ２遺伝子の発現が、ＢＡＸ発現を誘導することが示された、ＨＤＡＣ１と同様に上方調節された。細胞生存率が損なわれる前に初期ｐｉＲＮＡ誘導性転写変化を検出するために、比較的短い処理期間（２４時間）の後に発現プロファイリングを行った；この実験における遺伝子発現差は、結果として規模が大きくなる傾向がなかった。
その後のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、発現プロファイリング解析から同定される細胞成長におけるｐｉＲ−５９８の役割を確認し、遺伝的バリアントの機能的影響をさらに実証した。野生型ｐｉＲＮＡ−５９８模倣物の送達は、対照処理と比べて細胞生存率を有意に縮小した。しかし、野生型ｐｉＲ−５９８ではなくバリアントの上方調節は、野生型ｐｉＲＮＡにより観察される抗増殖性応答を急激に減弱した。追加的な証拠は、野生型ｐｉＲ−５９８処理が、軟寒天に播種したＵ８７細胞の長期コロニー形成を限定したが、代わりにバリアントｐｉＲＮＡによる処理は、ｐｉＲ−５９８の抗増殖性効果の排除に十分であり、コロニー形成を実際に促進したという観察から得られる。バリアントｐｉＲＮＡに起因し得る成長速度増加は、より長期のコロニー形成アッセイで起こるより多い数の集団倍加により、より容易に明らかにしたため、２種のアッセイにおける陰性対照処理に関するバリアントｐｉＲＮＡの効果における矛盾は、ｐｉＲＮＡ処理後の細胞成長の期間の差（４日間 対 ２１日間）に起因し得る可能性があった。これらの結果は、ｒｓ１４７０６１４７９に関連する神経膠腫リスク増加に一貫した機能的支持をもたらす。
（実施例２：発現プロファイリング解析によって同定された神経膠腫関連ｐｉＲＮＡ）
ＰＩＷＩ−ｐｉＲＮＡ経路は、生殖細胞系幹細胞におけるトランスポゾン抑制において高度に保存された調節性役割を果たすことが実証された。この状況の外部のその有意性の大部分は謎のままであるが、ＰＩＷＩファミリータンパク質が、異所的に発現され、幅広いがん型にわたってより悪い転帰に関連し、さらに近年では、ｐｉＲＮＡが、対応する正常組織とは著明に異なる腫瘍型特異的パターンで発現されるという知見には際だった一貫性があった。しかし、現在までに、神経膠腫を含む多くのがん型におけるｐｉＲＮＡ発現の性質に関する情報は報告されておらず、調節不全ｐｉＲＮＡ発現の機能的意義の大部分は未解明である。次の実施例における結果は、ｐｉＲＮＡのサブセットが、正常脳組織と比べてＧＢＭにおいて差次的に発現される一部を含む神経膠細胞組織において発現されることを実証する。データは、腫瘍で過少発現されるいくつかのｐｉＲＮＡが、ＧＢＭ細胞株にトランスフェクトされると、抗増殖性効果を示すことをさらに実証する。
材料と方法
ＧＢＭおよび正常脳のｐｉＲＮＡ発現レベルおよび差を試験するために、７対のＧＢＭおよび正常脳組織検体を、ＡｒｒａｙＳｔａｒ ｈｇ１９ ｐｉＲＮＡマイクロアレイを使用して、２３，６７７種のｐｉＲＮＡの発現についてプロファイルした。
研究検体および加工
年齢、人種および性別がマッチした、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）原発性ＧＢＭ（ｎ＝７）および正常脳検体（ｎ＝７；死後に、またはてんかん管理のための切除から採取された検体）を、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋから購入した。本研究は、Ｙａｌｅ大学の施設内審査委員会（ＩＲＢ）（ＨＩＣプロトコール＃：１２１２０１１２０２）によって承認され、書面のインフォームドコンセントを参加者から受けた。腫瘍検体を提供する対象は、切除時に放射線または化学療法を受けていない。ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ ＦＦＰＥキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、各検体に由来するおよそ８〜１０ｍｇの組織に対応する切片からＲＮＡを単離した。
ｐｉＲＮＡ発現プロファイリング
組織型毎に（腫瘍および正常）等しい割合で全ＲＮＡをプールし、２３，６７７種の成熟ヒトｐｉＲＮＡに対するプローブを含むＡｒｒａｙＳｔａｒ Ｈｕｍａｎ ４ｘ４４Ｋ ｐｉＲＮＡ発現アレイを使用した、二連でのｐｉＲＮＡ発現プロファイリングのためにＡｒｒａｙＳｔａｒ施設に試料を提出した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ １２．１ソフトウェアによりデータを分位正規化し、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓリポジトリ（ＧＳＥ７９４３８）に寄託した。シグナル強度＞２，０００を有するｐｉＲＮＡを、発現されると考慮し、試料型間の差を計算して、生物学的に有意な変化を評価した。
細胞株および試薬
ＡＴＣＣから購入した神経膠腫細胞株Ｕ８７およびＡ１７２、ならびにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｒｅから購入した不死化正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）は、１０％ＦＢＳを補充したＥＭＥＭ（Ｕ８７）またはＤＭＥＭ（Ａ１７２、ＮＨＡ）に維持した。全ＡＴＣＣ細胞株は、夾雑物について検査し、発送に先立ち認証した；蘇生後に６ヶ月間未満継代したため、細胞は再度認証しなかった。ｐｉＲＮＡ模倣物は、ＩＤＴから購入し（表２）、同様のサイズの一本鎖非標的化ＲＮＡ配列を陰性対照として使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのため、リポフェクタミン ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者の指示に従って細胞をリバーストランスフェクトした；ｓｉＧＬＯ蛍光トランスフェクション対照オリゴ（ＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、トランスフェクション効率を確認した。
ｐｉＲＮＡ発現の確認
増強された特異性および感度のために、ロックト核酸プローブを用いたｑＰＣＲによって、個々の患者検体ならびにＵ８７、Ａ１７２およびＮＨＡ全ＲＮＡにおけるｐｉＲ−８０４１発現を定量化した。手短に説明すると、ＥｘｉｑｏｎユニバーサルｃＤＮＡ合成キットを使用して、ＲＮＡを逆転写し、カスタムｐｉＲ−８０４１プライマーとＥｘｉＬＥＮＴ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｅｘｉｑｏｎ）を使用して三連で標的を増幅し、核内低分子ＲＮＡ Ｕ６発現に対する正規化を行った。ノーザンブロッティングも行った。
ｐｉＲＮＡ誘導性宿主遺伝子発現およびメチル化
ｐｉＲ−８０４１または陰性対照によるトランスフェクション４８時間後に、それぞれＵ８７ＲＮＡおよびＤＮＡを使用して、ｐｉＲ−８０４１宿主遺伝子ＳＡＰＳ２の遺伝子発現およびＤＮＡメチル化を測定した。遺伝子発現を、三連でｑＰＣＲによって測定し、ＧＡＰＤＨに対する正規化を行った。ＭＳ−ＰＣＲによって、ｐｉＲ−８０４１がマッピングするＳＡＰＳ２エクソンおよびおよそ１ｋｂ下流のイントロンＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化を評価した。
結果
ＧＢＭ組織検体における差次的に発現されるｐｉＲＮＡ
アレイに基づくｐｉＲＮＡプロファイリング後に、３５３種のｐｉＲＮＡは、正常および腫瘍組織の両方において発現されることが観察された（図５Ａ）。１４５種のｐｉＲＮＡに関して、比較群間における少なくとも２倍の発現差が観察された（表３）。これらの差次的に発現されるｐｉＲＮＡの中で、がんにおいて調節不全になることが以前に見出された２種、ｐｉＲ−６５１およびｐｉＲ−８２３が挙げられる。第２２染色体上のタンパク質コード遺伝子ＳＡＰＳ２の１２番目のエクソンにコードされる２６−ｎｔ ｐｉＲＮＡである、１０．３倍ＧＢＭで過少発現されるｐｉＲ−８０４１が特に興味深い。アレイプロファイリングによって観察される発現差が、ＬＮＡプローブを使用したｑＰＣＲによって個々の試料において確認された（図５Ｂ）。臨床検体における観察に合致して、ｐｉＲ−８０４１は、ＮＨＡ細胞と比べて、それぞれ２種のＧＢＭ細胞株Ｕ８７およびＡ１７２においておよそ１５および３５倍過少発現されることが判明した（図５Ｃ）。ｐｉＲ−８０４１発現は、これらの細胞株においてノーザンブロットによって検出不能であった。
その上、ＳＡＰＳ２ ｍＲＮＡ発現を測定して、ｐｉＲ−８０４１が、シスで作用して、宿主遺伝子ＳＡＰＳ２を調節するかどうかを決定し、ｐｉＲ−８０４１上方調節後に４倍低下を観察した。しかし、ｐｉＲ−８０４１相補的配列に近接した２個のＣｐＧアイランドにおけるメチル化レベルは、高く、ｐｉＲ−８０４１トランスフェクション後に変化しないことが判明した。
（実施例３：発現解析から同定されたｐｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果）
材料と方法
細胞生存率および軟寒天アッセイ
細胞生存率のため、細胞に、ｐｉＲＮＡまたは陰性対照オリゴをリバーストランスフェクトし、マイクロプレート分光光度計を使用して、ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加１時間後に発色を評価した。軟寒天アッセイのため、細胞に、ｐｉＲＮＡまたは陰性対照オリゴをリバーストランスフェクトした。２４時間後に、０．３６％寒天入りの温めた培養培地に細胞を再懸濁し、６０ｍｍ皿内の、０．７５％寒天の基層上に播種した。３週間後にＰＢＳ中の０．０４％クリスタルバイオレット−２％エタノールでコロニーを染色し、ＩｍａｇｅＪ ｖ１．４８ソフトウェアを使用して計数した。三連で実験を行い、スチューデントｔ検定を使用して、生存率およびコロニー数の差を解析した。
ゲノムワイドトランスクリプトームプロファイリング
トランスフェクション２４時間後に、ｐｉＲ−８０４１または対照ＲＮＡでトランスフェクトされたＵ８７細胞のＲＮＡプロファイリングを、生物学的に２回複製して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＨＴ−１２ ｖ４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐプラットフォームにおいて行った。発現差≧｜１．２｜倍を有し、ＦＤＲ調整されたＰ＝０．０５の有意性閾値を越える遺伝子は、差次的に発現されると考慮され、ＧＡＰＤＨに対するインプット正規化を伴うｑＰＣＲによる発現検証のために５種の遺伝子を選択した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析ソフトウェアを使用して、特異的機能アノテーションを有する遺伝子の濃縮に関するフィッシャーの直接検定を使用して、ネットワーク解析を行い、影響される機能経路を同定した。発現アレイデータは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓリポジトリ（ＧＳＥ７９４３８）に寄託された。
細胞周期およびアポトーシスアッセイ
細胞周期解析のため、細胞を７０％エタノールに固定し、洗浄し、ＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）、続いてＰＢＳ中のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（４０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。次に、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにおいて細胞を解析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖ１０を使用して、Ｇ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍの割合を決定した。アポトーシスアッセイのため、製造業者の指示に従って、アネキシンＶ ＦＩＴＣおよびＰＩによる死細胞アポトーシスキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞を調製した。ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーターおよび付随するソフトウェアを使用して、アネキシンＶ染色およびＰＩ排除について細胞を解析した。三連の実験のためのスチューデントｔ検定によって、アポトーシスおよび細胞周期分布の差を解析した。
細胞浸潤および遊走アッセイ
細胞浸潤アッセイのため、ｐｉＲ−８０４１または陰性対照でトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクション４８時間後に、無血清培地において、ＢｉｏＣｏａｔマトリゲル浸潤チャンバー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の頂部チャンバーに移した。２４時間後に、浸潤細胞を固定および染色し、次いで、ＱＩｍａｇｉｎｇ ＣＣＤデジタルカメラを備えるＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡を使用して計数した。細胞遊走アッセイのため、コラーゲンコーティングされた６ウェルプレートにおいて細胞をリバーストランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間目に、無菌ピペットチップを使用して引っ掻き傷を作り、ベースライン、引っ掻き６時間および１２時間後に、条件毎に３個の別々の視野における写真を撮った。ギャップ幅を測定して、ベースラインと比べて閉鎖パーセンテージを計算した。三連で実験を行った。両側スチューデントｔ検定を使用して、それぞれ細胞浸潤および遊走アッセイにおいて、ｐｉＲＮＡ処理および対照条件の間で浸潤細胞の平均計数および平均閉鎖パーセンテージを比較した。
結果
ＧＢＭ過少発現ｐｉＲＮＡの回復した発現は、ＧＢＭ細胞増殖を低下させる
知見の生物学的有意性を調査するために、ｐｉＲ−８０４１および他のＧＢＭ過少発現ｐｉＲＮＡの外因的過剰発現後に、Ｕ８７細胞増殖に対する影響を測定した。ｐｉＲ−８０４１トランスフェクションの９６時間後に、細胞集団生存率の３０％超の低下を観察した。３種の他の過少発現ｐｉＲＮＡ（ｐｉＲ−５４０２２、ｐｉＲ−２０２４９およびｐｉＲ−１５９８８）による処理の細胞生存率に対する効果も試験したところ、これらのｐｉＲＮＡの送達も、ｐｉＲ−８０４１よりも低い程度であるが、Ｕ８７細胞の生存率を低下させたことが判明した。注目すべきことに、腫瘍および正常検体の間で同じ程度で発現された２種のｐｉＲＮＡ（ｐｉＲ−１６７９２およびｐｉＲ−１０４７）の送達は、Ｕ８７細胞集団の生存率に有意に影響を与えなかった（図６Ａ）。
２種の他のグリア細胞株を使用した実験は、ｐｉＲ−８０４１も、神経膠腫細胞株Ａ１７２の細胞増殖を阻害したが、正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）の増殖に影響を与えなかったことを示した（図６Ｂ）。その上、軟寒天アッセイを行って、長期Ｕ８７コロニー形成に対するｐｉＲ−８０４１処理の効果を試験した。一貫して、ｐｉＲ−８０４１処理は、３週間後に形成されたコロニーの数を有意に低下させた（＞５０％）（図６Ｃ）。初回トランスフェクションの３日後のｐｉＲ−８０４１による２回目のＵ８７細胞処理の効果も試験した。初回トランスフェクションの６日後のＵ８７生存率は、対照処理細胞生存率の４０％未満であり、１回だけ処理した細胞より統計的に有意に少ない（図６Ｄ）。
ｐｉＲ−８０４１過剰発現は、細胞周期停止およびアポトーシスを誘導するが、ＧＢＭ細胞の浸潤にも遊走にも影響を与えない
ｐｉＲ−８０４１処理の潜在的抗増殖性機構を調査するために、細胞周期およびアポトーシスアッセイを行った。ＤＮＡ含量解析は、ｐｉＲ−８０４１処理４８時間後の、Ｇ０／Ｇ１チェックポイントにおけるＵ８７細胞の蓄積と、Ｓ期の割合の随伴する減少を明らかにした（図７Ａ）。Ｇ２／Ｍの細胞の割合に差は観察されなかった。その上、ｐｉＲ−８０４１処理は、初期アポトーシスおよび後期アポトーシス／壊死細胞の割合の統計的に有意な増加を誘導することが判明した（図７Ｂ）。しかし、Ｕ８７およびＡ１７２細胞が、ｐｉＲ−８０４１または対照オリゴ処理後に比較的浸潤性であったことが観察された。Ｕ８７およびＡ１７２細胞株の両方におけるコラーゲンコーティングされた表面における匹敵する創傷閉鎖速度によって実証される通り、ｐｉＲ−８０４１処理によってＧＢＭ細胞の遊走能力も影響されなかった。
ｐｉＲ−８０４１は、細胞ストレスおよび生存経路における転写変化を誘導する
ｐｉＲ−８０４１処理に対する細胞応答を特徴付けるために、ｐｉＲ−８０４１曝露Ｕ８７細胞のゲノムワイド転写プロファイリングを行った。解析は、差次的に発現された２１４種の転写物を生じた；ｐｉＲ−８０４１処理細胞において、１０８種は上方調節され、１０６種は下方調節された。上位５種の差次的に発現された転写物のｑＰＣＲによって測定される遺伝子発現変化は、アレイ結果と一貫することが判明した。
Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析に従って、細胞死および生存、細胞成長および増殖ならびに細胞発生を含む７種の主な機能カテゴリーにおいて、多重比較のための調整後に、ｐｉＲ−８０４１に影響された転写物は、統計的に有意に濃縮され（図８Ａ）、転写変化は、「結合組織細胞の細胞生存率減少」および「タンパク質の合成減少」と一貫すると予測された。ネットワーク解析は、熱ショックタンパク質および関連するＤＮＡＪタンパク質シャペロンファミリーのいくつかのメンバーが、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路タンパク質をコードするいくつかの転写物と同様に、ｐｉＲ−８０４１処理後に抑制されたことを示し、細胞ストレスおよび生存経路に対する転写の影響を示す（図８Ｂ）。
その上、ＳＡＰＳ２ ｍＲＮＡ発現を測定して、ｐｉＲ−８０４１が、シスで作用して、宿主遺伝子ＳＡＰＳ２を調節するかどうかを決定し、ｐｉＲ−８０４１上方調節後に４倍低下を観察した。しかし、ｐｉＲ−８０４１相補的配列に近接した２個のＣｐＧアイランドにおけるメチル化レベルは、高く、ｐｉＲ−８０４１トランスフェクション後に変化しないことが判明した。
（実施例４：同定されたｐｉＲ−８０４１のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果）
材料と方法
ｉｎ ｖｉｖｏでのＵ８７腫瘍進行に対するｐｉＲ−８０４１トランスフェクションの影響を測定した。リポフェクタミンを使用して、Ｕ８７ｌｕｃ細胞に、ｐｉＲ−８０４１をトランスフェクトした。対照Ｕ８７ｌｕｃ細胞に、非標的化対照ＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション２日後に、５×１０４個の細胞をマウス脳に投与した。硝子体内ルシフェリン注射後に、ＩＶＩＳ ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、Ｕ８７神経膠腫の発生をモニターした。ルミネセンス強度に基づき腫瘍体積を定量化した。
ヌードマウス（１群当たりｎ＝９）を麻酔し、定位フレームに置き、切開を入れ、右線条体の上に孔を穿った。外科手術２４時間前にｐｉＲ−８０４１または対照ＲＮＡをトランスフェクトした、リン酸緩衝食塩水に懸濁したおよそ５×１０４個のルシフェラーゼ発現Ｕ８７細胞を、脳に注射し、骨ろうで孔を閉鎖し、外科的ステープルで頭皮を閉鎖した。外科手術後に、硝子体内ルシフェリン注射後にＩＶＩＳ ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して腫瘍を画像化し、生物ルミネセンス強度を測定し、スチューデントｔ検定により各時点で比較した。臨床症状または実質的な体重の減少により、倫理的に必要な場合は、マウスを屠殺した。動物関連の全作業は、Ｙａｌｅ大学施設内実験動物委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
結果
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長は、ｐｉＲ−８０４１処理後に一時的に制限される
ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍成長を制限するｐｉＲ−８０４１の能力を評価するために、ｐｉＲ−８０４１または陰性対照ＲＮＡによるルシフェラーゼ発現Ｕ８７細胞の植え込み前トランスフェクション後に、ヌードマウスの頭蓋内に腫瘍を播種した。植え込み後３、１０、１７、２４および３１日目の生物ルミネセンス画像化により、生きている動物における腫瘍成長を評価した。図９Ａを参照されたい。植え込み１０日後に、ｐｉＲＮＡ処理腫瘍は、ほぼ半分のサイズであり、対照処理腫瘍よりも統計的に有意に小さく、１７日目に僅かに有意により小さかった（図９Ｂ）。ｐｉＲＮＡ処理腫瘍は依然として、測定値が取られた最後の２週間においてサイズが低下されたが、これらの差は、はっきりせず統計的に有意でなく、およそ１０日後の単一のｐｉＲ−８０４１処理の影響縮小を示す。
ｐｉＲ−８０４１は、同所性異種移植片モデルにおいてＵ８７細胞成長を一時的に制限する。ルシフェラーゼ発現頭蓋内腫瘍の生物ルミネセンス測定を複数の時点で行った。硝子体内ルシフェリン注射後に、ＩＶＩＳ ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、腫瘍体積の代理としてルミネセンス強度を測定した。各時点で処理条件間のスチューデントｔ検定によって統計的有意性を評価し；対照強度のパーセンテージとして、平均ｐｉＲ−８０４１処理腫瘍強度と共にＰ値を関連付けた。腫瘍植え込み後１０日目に、各処理群の代表的マウスの画像を作成した。色は、右に提示するルミネセンススケールに対応し、陰影は、それぞれ高および低ルミネセンス強度を表す。結果は、ｐｉＲ−８０４１によるトランスフェクションが、腫瘍進行を有意に遅延したことを実証した。接種後３週間の終わりまでに、ｐｉＲ−８０４１トランスフェクション群における平均腫瘍体積は、対照処理群の約１／３であり、ｐｉＲ−８０４１が、脳がん処置のための治療剤として有用となる筈であることを示す。
実施例２〜４の結論
アレイに基づくｐｉＲＮＡ発現プロファイリング結果は、ほぼ３５０種のｐｉＲＮＡが、正常およびＧＢＭ脳組織の両方において発現されることを示した。ｐｉＲＮＡのサブセットは、腫瘍組織において差次的に発現され、特異的ｐｉＲＮＡが、腫瘍形成過程に関与し得るという可能性を生じる。ｑＰＣＲによって差次的ｐｉＲ−８０４１発現が確認されたが、ｐｉＲＮＡは、ノーザンブロットによって解像不能であり、ＲＮＡの低発現レベルを強調する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ解析は、ｐｉＲＮＡ模倣物トランスフェクションの際の細胞集団生存率の有意な低下によって実証される通り、いくつかのｐｉＲＮＡが、その腫瘍抑制特性により、ＧＢＭ組織において過少発現されることを明らかにした。注目すべきことに、ｐｉＲＮＡ送達の観察される効果は、ｐｉＲＮＡ−および細胞型−特異的の両方であり、これは、ｐｉＲＮＡ標的および標的機能、標的の到達性もしくは存在量、および／または要求されるＰＩＷＩタンパク質もしくは関連する仕組みの発現の差に帰する可能性がある。ＧＢＭ過少発現ｐｉＲ−８０４１は、検査したｐｉＲＮＡのうち最強の抗増殖性効果を有することが示された（トランスフェクション９６時間後にＵ８７の３０％を超える阻害であり、反復処理後にさらにより大きい効果）が、ｐｉＲＮＡの送達は、正常ヒト星状細胞細胞株の増殖に有意に影響を与えなかった。この観察は、上述の通り標的もしくは仕組みの差、またはＵ８７よりもおよそ１５倍高いことが判明した、ＮＨＡ細胞株におけるｐｉＲ−８０４１のより高いベースライン内在性発現に起因し得る可能性がある。頭蓋内異種移植片マウスモデルにおいて、植え込み前ｐｉＲ−８０４１処理は、およそ１０日間の陰性対照処理と比べて腫瘍成長を有意に阻害したが、成長はその後、加速した。このことは、反復処理が、腫瘍抑制用量のｐｉＲ−８０４１の持続に要求されるであろうことを示し、これは、診療において、血液脳関門を横切り、腫瘍部位に有効用量を送達することができる薬物送達ビヒクルの利用能に重度に依存するであろう。
さらなる機能解析は、ｐｉＲ−８０４１が、主に、Ｇ１／Ｓチェックポイントにおける細胞周期停止の誘導および少ない割合の細胞におけるアポトーシスの誘導により、細胞増殖を低下させることを示した。このことは、その活性化がＧ１／Ｓ期細胞周期進行に要求される、ＥＲＫ１／２マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達の下方調節を示す転写プロファイリングデータと共に、その阻害が複数のがん型におけるアポトーシスを促進することが示された、ＴＧＦ−β活性化キナーゼをコードする関連するＭＡＰ３Ｋ７の観察される転写下方調節と一貫する。また、サイクリンＤ１蓄積の阻害により、Ｇ１／Ｓ期移行における細胞周期停止を媒介することが示され、アポトーシス細胞死を誘導することも示される、腫瘍サプレッサーをコードするＲＡＳＳＦ１の観察される転写上方調節が、表現型結果と一貫する。さらに、ｐｉＲ−８０４１は、妥当なタンパク質フォールディングおよび輸送を容易にし、細胞増殖の促進および細胞死経路（ｄｅａｔｈ ｐａｔｈｗａｙ）の阻害による細胞ストレスおよび腫瘍形成と広範に関連付けられてきた、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）およびＤＮＡＪタンパク質ファミリーのいくつかのメンバーを転写的に下方調節した；ＨＳＰ（特に、ＨＳＰ９０）の小分子阻害剤は、多数のＨＳＰ依存性腫瘍性タンパク質の活性破壊による抗がん治療薬としての見込みを示した。まとめると、転写プロファイリングは、ｐｉＲ−８０４１の抗増殖特性が、一連の発癌性因子の直接または間接阻害に帰する可能性があることを示す。
結果は、複数の異常に発現されるｐｉＲＮＡが、腫瘍形成において腫瘍抑制的役割を果たし得ること、特に、ｐｉＲ−８０４１（ＧＢＭにおける）の下方調節が、細胞ストレスおよび生存経路の調節におけるその腫瘍抑制的機能による腫瘍形成を支持することを示す。他の同定された差次的に発現されるｐｉＲＮＡは、その特異的調節性標的のために、神経膠腫形成における腫瘍抑制的または発癌性役割を果たすこともできる。観察されるｐｉＲ−８０４１媒介性転写変化が、性質が直接または間接のいずれかとなることができたこと、また、将来の研究が、がん状況におけるｐｉＲ−８０４１および他のｐｉＲＮＡの直接標的および詳細な作用機構の決定に要求されるであろうことに留意されたい。ｐｉＲ−８０４１宿主遺伝子ＳＡＰＳ２発現が、限局性ＤＮＡメチル化に認識できる変化を伴うことなく、ｐｉＲ−８０４１トランスフェクション後に低下するという知見は、ｐｉＲ−８０４１が、ｓｉＲＮＡ様様式で作用して、相補的標的をサイレンシングし得ることを示し、これは、転写後ｐｉＲＮＡ活性を示す近年の研究と一貫する。しかし、ＳＡＰＳ２それ自体は、腫瘍形成に明らかな関連性がないため、ｐｉＲ−８０４１の腫瘍抑制的効果は、不完全相補性の他の未知の配列の標的化によって媒介される可能性がある。
総合すると、これらの研究において同定されたＧＢＭにおけるｐｉＲＮＡ発現の機能的に関連性がある調節不全は、腫瘍形成の生物学に新たな光を投じ、正常ｐｉＲＮＡ発現レベルの回復が、下方調節された腫瘍抑制的マイクロＲＮＡの「マイクロＲＮＡ補充療法」と類似の様式で、実行可能な治療戦略となり得ることを示す。
（実施例５：ｐｉＲＮＡ機能障害は、肝臓がんにおいて腫瘍原性となり得る）
ヒト肝細胞から生じる肝細胞癌（ＨＣＣ）は、肝臓がんの大部分を占める。ＨＣＣは、世界中で６番目に一般的ながん型であり、米国で年間推定２５，０００名の死亡の原因となる。ＨＣＣは、高い死亡率の悪性疾患であり、米国で最も速く増加するがん発生率を有するが、サハラ以南のアフリカおよび東アジアに広く発生する。米国で１９７５年と２００５年の間でＨＣＣ発生率のほとんど３倍の増加が報告された。ＨＣＣの主なリスク因子は、過剰アルコール消費、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、食物のアフラトキシン汚染、肥満、糖尿病および一部の稀な遺伝性代謝障害を含む。ＨＣＣ患者は通常、疾患初期ステージでは無症候性であるが、多くの場合、進行型ステージで診断され、予後不良となる。ＨＣＣ腫瘍形成に関与する分子因子は、未だに不明である。
材料と方法
ｐｉＲＮＡ発現プロファイリング解析において、２３，０００種のヒトｐｉＲＮＡを網羅するＡｒｒａｙＳｔａｒ ｐｉＲＮＡ発現マイクロアレイを使用して、１２対のＨＣＣおよびマッチする非悪性肝臓検体を比較した。機能アッセイ方法は、上述と同じである。
結果
ｐｉＲＮＡ発現プロファイリング解析の結果は、ボルケーノプロットに示されている（図１０）。破線は、ｘ軸に沿って、腫瘍および正常試料の間の２倍の差次的発現を表示し、ｙ軸に沿って、Ｐ＝０．０５の有意性閾値を表示する。左上および右上セクションのドットは、これらの閾値の両方を超えるｐｉＲＮＡを示す（ｎ＝３１種のｐｉＲＮＡ）。特に興味深いのは、３倍以上で統計的に有意に差次的に発現された、図面に記す３種のｐｉＲＮＡであった。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで検査した候補ｐｉＲＮＡの中で、下方調節されたｐｉＲ−３７２１３が、いくつかの機能実験において最強の抗がん効果を示した。図１１Ａは、ｐｉＲ−３７２１３模倣物トランスフェクション後に、Ｈｅｐ３Ｂ肝臓腫瘍細胞およびＴＨＬＥ−３正常肝臓細胞における細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）によって測定される細胞成長への影響を示す。エラーバーは、標準誤差を表す。結果は、ｐｉＲＮＡレベルの回復が、時間依存性様式で肝臓がん細胞における細胞成長を阻害した一方、正常細胞成長に影響を与えなかったことを示した。特に、ｐｉＲ−３７２１３トランスフェクトＨｅｐ３Ｂ細胞において、４８時間目におよそ１９％成長阻害および７２時間目に３５％阻害（ＮＣに対してＰ＜０．０１）が観察された。しかし、肝臓腫瘍試料において異常に発現されなかったｐｉＲＮＡは、送達されたときに抗増殖性効果を示さなかった。
コロニー形成アッセイも行って、ＨＣＣ関連ｐｉＲＮＡの回復の延長した効果を調査した。手短に説明すると、トランスフェクション２週間後にＨｅｐ３Ｂ細胞コロニーをクリスタルバイオレットで染色し、計数した。図１１Ｂは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞への対照低分子ＲＮＡ（左）またはｐｉＲ−３７２１３（右）によるトランスフェクション２週間後の実験結果を示す。ｐｉＲ−３７２１３トランスフェクトＨｅｐ３Ｂプレートにおけるコロニーの数は、対照オリゴ処理プレートに形成されたコロニーの数と比べておよそ７０％低下した（Ｐ＜０．０１）。同様に、軟寒天アッセイは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の足場非依存的成長が、ｐｉＲ−３７２１３によるトランスフェクト後に約６５％低下したことを示した。
増殖アッセイ結果と一貫して、ｐｉＲ−３７２１３処理Ｈｅｐ３Ｂ細胞の転写プロファイリングは、細胞周期、増殖、複製およびＤＮＡ修復に関与する遺伝子が、有意に下方調節されたことを示した。影響された細胞周期および細胞増殖関連遺伝子のネットワークは、図１２に説明されている。ｐｉＲＮＡによって有意に影響される５５種の転写物の中で、５２種の転写物が１．５倍超下方調節された。熱ショックタンパク質遺伝子ＨＳＰ７０およびＨＳＰＡ８が特に興味深かった。細胞内熱ショックタンパク質は通常、肝臓がん細胞において高度に発現されるため、これらのタンパク質および関連経路のｐｉＲ−３７２１３誘導性下方調節は、抗がん処置としてのその有用性を示す。加えて、主なＤＮＡ修復遺伝子であるＸＲＣＣ６およびＰＡＲＰ１は、有意にほぼ２倍低下し、処理したがん細胞における細胞周期停止の誘導および限定的な生存を示す。これらの観察に基づき、その標的遺伝子（複数可）のｐｉＲ−３７２１３媒介性調節が、細胞成長、生存および修復を限定するように機能すると考えられる。
総合すると、これらの知見は、肝臓腫瘍形成における腫瘍サプレッサーとしての、過少発現されるｐｉＲＮＡの以前に同定されていない機能的役割を明らかにし、正常ｐｉＲＮＡレベルの回復が、肝臓がんの処置のための戦略であることを示す。
（実施例５：ｐｉＲＮＡ配列バリアントは、前立腺がんリスクの予後徴候である）
前立腺がんは、男性に最も一般的ながんであり、男性は、このがんを発症する１５％生涯リスクに直面しており、総計２２０，８００例の新たな症例に対し、２０１５年の男性の新たながん症例の２６％を構成すると予測される。その上、２０１５年における男性のがん関連死の９％を占めると予測される１。２００７〜２０１１年の期間において、前立腺がんの発生率は、アフリカ系アメリカ人で、コーカサス人種よりも約１．６５倍高かった１。その上、近年の研究は、人種が、肥満による前立腺がんのリスクを修飾し、肥満が、アフリカ系アメリカ人において、コーカサス人種よりも強力なリスク因子であることを実証した。他の因子の中で、これら２人種間での前立腺がんリスクの差が、遺伝的構成成分を有することが仮定された。アフリカ系アメリカ人およびコーカサス人種試料の両方において本研究を行うことにより、これらの人種差に対する遺伝的寄与を調査することができた。
ＰＩＷＩタンパク質および低分子非コードＲＮＡの１クラスであるＰＩＷＩ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）の発見、ならびにこれらの生物学的役割に関するその後の理解は、疾患におけるこのような低分子ＲＮＡの潜在的役割における関心を生み出した。
ｐｉｗｉ遺伝子は、生殖細胞系幹細胞の非対称分裂に影響を与える遺伝子の遺伝的スクリーニングにより、ショウジョウバエで最初に同定され、次いで、生殖細胞系確立および維持に関係づけられるショウジョウバエ生殖細胞系の幹細胞および体細胞に存在する高度に保存されたタンパク質をコードすることが見出された。ＰＩＷＩタンパク質は、一本鎖ＲＮＡに結合するＰＡＺドメイン、ＭＩＤドメイン、およびエンドヌクレアーゼＲＮａｓｅ−Ｈに似ているＰＩＷＩドメインを含有する、タンパク質のアルゴノートファミリーのメンバーである。続いて、ショウジョウバエｐｉｗｉのホモログが、マウスおよびヒトを含む様々な他の生物において同定された。ＰＩＷＩの発見後に、既に特徴付けられたｒａｓｉＲＮＡおよび追加的な低分子ＲＮＡが、ＰＩＷＩタンパク質と相互作用することが示され、よって、ｐｉＲＮＡと命名された。同定されたｐｉＲＮＡは、遺伝子間領域に主にマッピングし、反復性エレメントにおいて濃縮されており、脊椎動物における約２０％が、トランスポゾン配列にマッピングする。
ＰＩＷＩ／ｐｉＲＮＡの機能を決定するための研究は、両者が、転写および転写後機構により転移因子の抑制に関与し、ゲノム完全性を維持する可能性があることを示した１５〜２４。転写調節の観点から、２種のＰＩＷＩであるショウジョウバエｐｉｗｉおよびａｕｂにおける変異が、抑制的ヒストン修飾であるＨ３Ｋ９ｍｅ２／３マークの確立失敗をもたらすことが示された２５〜２７。ショウジョウバエにおいて、この機構は、ヘテロクロマチンタンパク質−１（ＨＰ１）とＰＩＷＩタンパク質との相互作用が関与し、遺伝子座にエピジェネティック修飾因子をリクルートするＰＩＷＩ／ｐｉＲＮＡ複合体の能力を実証する。エピジェネティック変化を誘導する過程は、エピジェネティック調節因子との複合体中のＰＩＷＩを、その作用が起こり得る相補的ＤＮＡ配列または新生転写物へとガイドする、ＰＩＷＩ結合ｐｉＲＮＡが関与する。
ｍｉＲＮＡと相互作用することが公知のタンパク質と同じ遺伝子ファミリーにあることから、ＰＩＷＩ／ｐｉＲＮＡの遺伝子調節性役割の証拠も生じたことは驚くべきことではない。マウスにおいて、配列特異的様式で、遺伝子発現減少に関連するＤＮＡ修飾であるプロモーターのメチル化を導くＰＩＷＩ／ｐｉＲＮＡの証拠がある３１。ショウジョウバエにおいて、細胞質ＰＩＷＩは、その３’ＵＴＲとの相補性によるＣＣＲ４媒介性脱アデニル化による、母方ｍＲＮＡ翻訳の阻害および母方ｍＲＮＡ減衰に関与する。さらに、ｐｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｘｅｎｏｐｕｓおよびマウスにおけるある特定のｍＲＮＡの３’ＵＴＲから生成され得、別の可能な調節方法を提供する。
ＰＩＷＩタンパク質およびｐｉＲＮＡのこれらの機能が解明されるにつれて、がんとそれとの関連の証拠が明らかになった。ＰＩＷＩ発現は、結腸直腸、肝臓、脳、膵臓、精巣、前立腺、乳房、胃腸管、卵巣および子宮内膜がんを含む種々のヒトがんにおいて実証された。その上、ｐｉＲＮＡの発現は、がん細胞株および組織試料において観察された。これらのうち、特異的ｐｉＲＮＡは、隣接正常組織と比較して、腫瘍組織において過少または過剰発現されることが観察され、この異常発現の改善は、細胞増殖の減少の効果を示した。
本明細書で論じられる通り、ｐｉＲＮＡ内の配列バリアントは、腫瘍サプレッサーまたは癌遺伝子発現の異常調節により、がんリスクにおける役割を果たし得ると考えられる。ｐｉＲＮＡは、ＰＩＷＩタンパク質の配列特異的ガイドとして機能するため、ある特定の遺伝子座におけるその作用は、消失され得る、または新たな遺伝子座を異常に標的とし得る。この考えは、ｐｉＲＮＡの単一ヌクレオチド変化が、意図される標的部位における実質的な効率損失をもたらし得るという事実によって支持される。後述するアッセイは、ｐｉＲＮＡ配列に包埋される一塩基多型（ＳＮＰ）との関連を調査することにより、多民族コホート（ＭＥＣ）に由来するアフリカ系アメリカ人集団および感受性のがん遺伝的マーカー（ＣＧＥＭＳ）前立腺、肺、結腸直腸および卵巣がんスクリーニング治験（ＰＬＣＯ）由来のコーカサス人種集団における前立腺がんに関してこの機構を検査する。解析は、１００個またはそれより少ない遺伝子座に由来するｐｉＲＮＡに集中する。なぜなら、低コピー数ｐｉＲＮＡが、タンパク質コード遺伝子発現を調節する可能性がより高いという証拠があるからである。
材料と方法
データ
本研究のデータは、遺伝子型および表現型のデータベース（ｄｂＧａＰ）から得て、これは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ１ＭＤｕｏｖ３＿Ｂプラットフォームにおいて遺伝子型判定されたＧＥＮＥＶＡ前立腺がん研究（ｐｈｓ０００３０６．ｖ４．ｐ１）由来のアフリカ系アメリカ人対象と、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＨａｐ３００ｖ１．１およびＨｕｍａｎＨａｐ２５０Ｓｖ１．０プラットフォームにおいて遺伝子型判定されたＣＧＥＭＳ ＰＬＣＯ前立腺がん研究（ｐｈｓ０００２０７．ｖ１．ｐ１）由来のコーカサス人種対象の遺伝子型および表現型データを含む。ＧＥＮＥＶＡ研究における対象は、ＭＥＣと共に、Ｆｒｅｅｄｍａｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０３巻、１４０６８〜７３頁、２００６年）によって記録された６つの追加的な研究に由来した。ＰＬＣＯ研究における対象は、発生率密度サンプリング方法によってＰＬＣＯコホートから引き出された。
データクリーニング
全データクリーニング／管理は、ＰＬＩＮＫｖ１．０７を使用して行った。両方の研究集団に関して、コンセント群は全て、同じプラットフォームにおいて遺伝子型判定し、合併して、完全データセットを作製した。しかし、コンセント群の合併に先立ち、データをクリーニングして、コール率＜９０％を有する個体、コール率＜９５％を有するＳＮＰ、およびＨＷＥに従わないＳＮＰ（ｐ＜０．０００１）を除去した。低ＭＡＦのＳＮＰは、関連解析に使用されるべきでなく、その後のインピュテーションの通知に役立ち得るため、除去しなかった。偽常染色体領域由来のＹ染色体におけるＳＮＰおよびミトコンドリアＳＮＰを除去した。次に、インピュテーション参照パネルと適合性となるために、データをｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ３７上にリフトし、（＋）ゲノム鎖上にあるように、必要に応じてバリアントコードをフリップした。ｐｌｉｎｋにおけるＩＢＳ解析からの≧＞０．２によって決定される通り、データにおける各関連または重複ペアから一方の試料を除去した。
目的の祖先について自ら宣言しなかった個体も除外した。次に、ＨａｐＭａｐ参照パネルとゲノムワイドデータとを組み合わせ、続いてＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴ５０を使用して主成分解析を行うことにより、祖先チェックを行った。コーカサス人種集団における全対象は、ＨａｐＭａｐコーカサス人種と十分にクラスター形成したことから、除去は行わなかった。
しかし、混合集団であり、ＨａｐＭａｐ試料に関して明らかなクラスター形成がないアフリカ系アメリカ人のため、ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴ５０を使用してＰＣＡを行い、１回反復により、上位１０主成分のいずれかにおける６標準偏差を超える対象を除去した。
ｐｉＲＮＡ ＳＮＰ遺伝子型インピュテーション
ｐｉＲＮＡ Ｂａｎｋを使用して、全ての精選したヒトｐｉＲＮＡ配列の位置、配列およびコピー数を決定した。これは、６６７，９４４種のゲノム遺伝子座にマッピングする３２，１４９種の特有のｐｉＲＮＡを含む。ＩＭＰＵＴＥ２およびｐｉＲＮＡ座標に利用できる１，０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｈａｓｅ ３参照データを使用して、インピュテーションが、参照パネルにおけるバリアントに限定されるため、１００個またはそれより少ない遺伝子座にコードされるｐｉＲＮＡに網羅されるゲノム座標にマッピングする全ＳＮＰを決定した。
次に、プログラムデフォルト設定により、５ＭＢセグメントにおけるＩＭＰＵＴＥ２を使用して、インピュテーションを実行した。プログラムは、個体毎に３種の可能な遺伝子型のそれぞれを有する確率をアウトプットする。次に、ＳＮＰＴＥＳＴは、これらの確率を使用して、その後のセクションに記載するロジスティック回帰分析モデルにおける使用のためのアレル遺伝子量（ａｌｌｅｌｅ ｄｏｓａｇｅ）を決定する。
関連解析
遺伝子量として事後遺伝子型確率（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）をインプットし、インピュテーションによる不確実性を説明する、相加的アレルモデルによる無条件ロジスティック回帰を使用して、ＳＮＰＴＥＳＴｖ２．５において関連解析を実行した５３。解析に先立ち、ＩＭＰＵＴＥ２から単形性ＳＮＰ、およびＭＡＦ＜１％またはｉｎｆｏスコア＜０．９を有するＳＮＰを除外した。アフリカ系アメリカ人における解析に関して、３主成分、年齢カテゴリーを表す順序変数および研究についてモデルを調整した。コーカサス人種における解析は、３主成分、順序年齢カテゴリー変数および前立腺がんの家族歴について制御した。
両方の解析に関して、年齢を１０歳増分で群分けし、ゲノムインフレーション因子（ＧＩＦ）を計算し、ＱＱプロットを点検することにより（両者共にゲノムワイドデータを使用して生成される）、制御するための主成分の数を決定した。ペアワイズＲ２閾値０．５を使用して、ｐｌｉｎｋ４９から生成されるＬＤ剪定データによるＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴにおいて主成分解析を実行した。
微細マッピング
前立腺がんに関連するバリアントを含有する領域において微細マッピングを行った。このため、以前と同じ様式でＩＭＰＵＴＥ２を使用して、関連ＳＮＰの本来の５ＭＢインピュテーションウィンドウにおけるＴｈｏｕｓａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ参照パネル由来の全バリアントを帰属させた。次に、ｐｉＲＮＡバリアント関連解析におけるものと同じ変数の全てを制御しつつ、目的のＳＮＰの中央に置かれた５００ＫＢウィンドウにおける全バリアントについてＳＮＰＴＥＳＴを使用して、関連検査を実行した。ｉｎｆｏ品質測定基準０．６に基づき帰属バリアントを限定した。次に、Ｐ値を使用して、関連シグナルの分布の点検のためのマンハッタンプロットを生成した。
結果
ＧＥＮＥＶＡ研究
ｐｉＲＮＡバリアントインピュテーションの調製におけるデータクリーニング後に、アフリカ系アメリカ人集団は、１，１２１，３３５種のＳＮＰにおける遺伝子型データを含む、総計４，７００個体の、２，２７５症例および２，４２５対照からなった。クリーニングにおいて、ＩＢＳ解析後に４８個体を除去し、祖先プロットの点検により必要であると決定された後に、ＰＣＡ外れ値であるため２２名を除去した。これに続いて、ＩＭＰＵＴＥ２を使用して、あらゆる可能なｐｉＲＮＡバリアントにおいて対象毎にｐｉＲＮＡ ＳＮＰ遺伝子型を帰属させた。
関連検査に先立ち、単形性である、ＭＡＦ＜１％を有する、またはＩＭＰＵＴＥ２品質ｉｎｆｏスコア＜０．９のバリアントを除去した。研究のために関連解析を制御し、１０歳増分でカテゴリー化された年齢、およびＰＣＡ由来の上位３固有ベクトルから対象を引き出した。ゲノムワイド関連研究およびこのような解析から生成されたＱＱプロットの試験から、１．００のＧＩＦの観察に基づき３主成分を制御するための選択を行った。
上述の通り制御された関連解析を１８４７種のバリアントについて実行し、その結果を図１３Ａに表示する。ｐｉＲ−０２１１６３に位置するバリアントｒｓ６１１０１７８５は、オッズ比１．６３により［９５％ＣＩ：１．２９〜２．０５］、前立腺がんのリスク増加に関連した［ＦＤＲ−ｐ＝０．０７０］（表４）。バリアントのＭＡＦは、症例において４．１％、対照において２．６％であり、Ｃｈｒ４：３，０７４，１５８に位置する。ｐｉＲＮＡは、マップ内で、この遺伝子座のみに収まる。
遺伝子座は、ハンチンチンアンチセンス１（ＨＴＴ−ＡＳ１）転写物の最初のイントロン内に位置する（ＵＣＳＣゲノムブラウザ）。ｒｓ６１１０１７８５を包含する領域の微細マッピングは、関連シグナルが、ｐｉＲ−０２１１６３内に収まる該バリアントにおいてピークに達することを明らかにした（図１３Ｂ）。
ＰＬＣＯ研究
データクリーニング後に、５４１，７２１種のバリアントにおいて遺伝子型判定したＰＬＣＯ研究由来の総計２，２４０名のコーカサス人種対象に関して、１，１４２症例および１，０９８対照が存在した。クリーニングにおいて、両方のプラットフォームにおいて遺伝子型判定されていないため、７種の試料を除去し、ＩＢＳ解析後に５３種を除去した。残っている全対象は、ＨａｐＭａｐと十分にクラスター形成した。
上位２主成分におけるコーカサス人種、そこで、ＰＣＡ外れ値除去は行わなかった。次に、関連解析における使用のため、１００個またはそれより少ない遺伝子座にコードされるｐｉＲＮＡ内に収まる全ＳＮＰを帰属させた。１．００のＧＩＦおよびＱＱプロット点検に基づき、前立腺がんの家族歴、１０歳増分でカテゴリー化された年齢およびＰＣＡ由来の上位３主成分について関連検査を調整した。アフリカ系アメリカ人集団と同様に、単形性である、ＭＡＦ＜１％を有する、またはＩＭＰＵＴＥ２ ｉｎｆｏスコア＜０．９のバリアントを除去した。１，３６４種のＳＮＰにおいて関連を検査し、その結果を図１３Ｃに要約する。上位３ヒットは全て、遺伝子間領域に位置する、第１４染色体上の同じｐｉＲＮＡクラスター内に位置する。興味深いことに、この単一のｐｉＲＮＡクラスター内のヒットは全て、単一コピーｐｉＲＮＡに対応する。ｒｓ８０１０９６９およびｒｓ１１６２５９０７を包含するインピュテーション領域において実行された微細マッピングは、原因となるＳＮＰをタギングする可能性があることを明らかにした。
結論
前述の実験は、アフリカ系アメリカ人およびコーカサス人種試料の両方における、ｐｉＲＮＡ内の遺伝的バリアントおよび前立腺がんの間の関連を調査する包括的解析を生じた。本研究は、ＧＥＮＥＶＡ研究の一部として遺伝子型判定されたアフリカ系アメリカ人試料と、ＰＬＣＯ研究から引き出されたコーカサス人種集団に焦点を合わせ、両者共に、ｄｂＧａＰにより利用できる。帰属ｐｉＲＮＡバリアントおよび前立腺がんの間の関連の調査は、アフリカ系アメリカ人研究試料における高度に興味深い関連を明らかにした。単独でコードされるｐｉＲ−０２１１６３、ｒｓ６１１０１７８５内に収まるバリアントは、アフリカ系アメリカ人における前立腺がんのリスク増加と関連した（ＦＤＲ−ｐ＝０．０７０２）。
ｒｓ６１１０１７８５を包含する領域の微細マッピングは、関連シグナルが、このバリアントにおいてピークに達することを実証した。シグナルが本物であると仮定すると、これは、このバリアントの機能的役割の考えを支持する。バリアント（Ｃｈｒ４：３，０７４，１５８）およびｐｉＲＮＡ（Ｃｈｒ４：３，０７４，１４７−３，０７４，１７８）の位置は、ＨＴＴ−ＡＳ１転写物の最初のイントロン内に収まる。ＨＴＴ−ＡＳ１は、ポリＱ拡大を含有する場合にハンチントン病に因果関係的に関連付けられた遺伝子である、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子に対して非コードおよびアンチセンスであり、両者は、ヘッドトゥーヘッドで転写される。ＨＴＴ−ＡＳ１転写物は、部分的にダイサー依存性様式でＨＴＴ遺伝子の発現を調節することが公知である。正常ＨＴＴ遺伝子は、がん発症および進行の重要な側面である細胞生存に関係づけられた５７。
興味深いことに、ｐｉＲＮＡは典型的に、アンチセンス転写物に由来することによりトランスポゾンを標的とし、マウスにおけるＲａｓｇｆｒ１遺伝子座のインプリンティングは、特異的ｐｉＲＮＡによる隣接するアンチセンス転写物の標的化を伴う。推測ではあるが、このｐｉＲＮＡが、アンチセンス転写物に由来し、次いで、ゲノム遺伝子座を標的とし得ることが可能である。このバリアントの別の興味深い側面は、これが、コーカサス人種試料において実質的に単形性であったことであり、２症例のみが、この位置においてヘテロ接合性である。これは、前立腺がんリスクに観察される人種差を部分的に説明することができる。コーカサス人種試料における第１４染色体上のｐｉＲＮＡクラスターに観察される関連は全て、１種が真に存在する場合、同じ機能バリアントを反映する可能性がある。
本研究の強みは、インピュテーションに使用されるＴｈｏｕｓａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ参照パネルである。なぜなら、このデータが、莫大な数のバリアントの高度に包括的なカバレッジを有し、よって、多くのｐｉＲＮＡ包埋ＳＮＰのカバレッジが達成されたからである。しかし、参照パネルに含まれないｐｉＲＮＡ内のバリアントは調査されなかった。その上、これとの連鎖不平衡においてタギングバリアントとなり得るため、これらのバリアントが原因であると決定的に結論付けることができない。最後に、結果は、ｄｂＧａＰデータセットに提供される共変数に限定され、交絡因子を潜在的にさらに制御して、結果を支持することができた。
全体的なこれらの実験は、一部には、前立腺がんリスクにおける人種差を説明することができる、アフリカ系アメリカ人試料から得られる強力な知見により、ｐｉＲＮＡ配列バリアントが、前立腺がんと関連し得ることの最初の証拠を提供する。領域の微細マッピングは、この考えを強化した。したがって、ＰＩＷＩまたはｐｉＲＮＡの異常発現のみが、がんにおける役割を果たし得るのではなく、ｐｉＲＮＡ配列変化も因子となり得ると考えられる。
（実施例６：ｐｉＲＮＡ配列バリアントは、肺がんリスクの予後徴候である）
肺がんは、最も高頻度で診断されるがんであり、世界中で男性および女性の間でがん死亡の第１および第２の主因である。米国では、２０１６年には肺がんの推定２２４，３９０名の新たな症例および１５８，０８０名の新たな死亡が存在することになるであろう。さらに、肺がんの５年相対的生存率は、２００５〜２０１１年で僅か１８．４％であった。現在、肺がん症例の８５％を占める非小細胞肺がん患者に関して、主な処置選択肢は、外科手術、放射線療法および補助的化学療法である。しかし、各処置は、その不可避の副作用を有するため、生存率を増加させると共に、肺がん患者のクオリティ・オブ・ライフを改善するための肺がん処置におけるブレークスルーが必要とされる。標的化療法の出現は、細胞傷害性薬物と比較して、患者に対する毒性を低下させることを可能にする。したがって、将来における肺がんの処置のための標的として機能することができる臨床有意性を有する新たな薬剤を発見することが、特に重要である。
近年、増加する証拠は、ゲノムの非タンパク質コード部分が、がんを含む疾患発症に機能的に重要であることを示す。多くの研究が、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）が、転写または転写後過程のモジュレーションにより機能することを示す。斯かる転写および転写後修飾は、低分子非コードＲＮＡ（ｓｎｃＲＮＡ）が、タンパク質複合体（ＰＰＤまたはアルゴノート）に結合し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成して、その標的配列の発現を阻害する、高度に保存された経路をもたらすであろう。主な低分子サイレンシングＲＮＡは、３種のカテゴリーに分類することができる：低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびＰＩＷＩ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）。
ｐｉＲＮＡ配列の長さは、２６〜３１ヌクレオチド（ｎｔ）の間であり、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ（２１〜２６ｎｔの間）よりも僅かに長い。ｐｉＲＮＡの主要機能は、過程においてダイサーを要求しない高度に保存された経路によりトランスポゾンエレメント（ＴＥ）をサイレンシングすることにより生殖細胞系ゲノムを安定化することである一方、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ誘導サイレンシング経路は、ダイサーを要求する。生殖細胞系におけるｐｉＲＮＡのＴＥサイレンシング機能に加えて、ますます多くの研究が、体細胞におけるその役割を調査している。哺乳動物体細胞組織における４種の主要型のＰＩＷＩタンパク質（ＰＩＷＩＬ１／ＨＩＷＩ、ＰＩＷＩＬ２／ＨＩＬＩ、ＰＩＷＩＬ３およびＰＩＷＩＬ４）の検出は、体細胞ｐｉＲＮＡの存在の証拠を提供する。体細胞ｐｉＲＮＡのバイオジェネシスのために２つの経路が存在する。主要プロセシング経路において、長いｐｉＲＮＡ前駆体が、ｐｉＲＮＡクラスターから転写され、切断され、細胞質においてｍｉｄｉ化（ｍｉｄｉｆｙ）され、次いでＡｕｂｅｒｇｉｎｅ（ＡＵＢ）またはＰｉｗｉタンパク質をロードされて核へと輸送される。一次経路で産生されるｐｉＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｐｉＲＩＳＣ）によって活性化される増幅ループ（ピンポンサイクル）において、ｐｉＲＮＡは、修飾され、増幅されて、スライサー媒介性切断９により活性ＴＥにおいて標的化する。さらに、Ｐｉｗｉ−ｐｉＲＮＡ経路は、ヒストン修飾およびＤＮＡメチル化により、生殖細胞系組織外部のトランスポゾン遺伝子座またはさらには非トランスポゾン遺伝子座を調節することができる。
研究は、ｐｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ様転写物が、ある範囲の腫瘍型における腫瘍形成に関与することを示す。ｐｉＲＮＡの発癌性または腫瘍サプレッサーの役割は両者共に、マイクロアレイスクリーニング、次世代配列決定（ＮＧＳ）およびリアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ（ＰＣＲ）連鎖反応解析によって発見された。いくつかの予備的研究は、セミノーマ、乳がん、子宮頸部がん、神経膠腫、結腸がんなど、いくつかの腫瘍型におけるＰｉｗｉタンパク質の過剰発現を発見した。提案される可能な一機構は、がん組織におけるｐｉＲＮＡおよびＰｉｗｉタンパク質の存在が、腫瘍サプレッサー遺伝子の促進領域の異常ＤＮＡメチル化および過剰サイレンシング（ｏｖｅｒ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）をもたらし、次いで、腫瘍形成を誘発するであろうということであった。よって、ｐｉＲＮＡは、様々な腫瘍型のための新たな予後バイオマーカーまたは新たな治療標的となる高い潜在力を有する。
ｐｉＲＮＡｓ／Ｐｉｗｉ発現および肺がんリスクの間の関連を調査する以前の研究は、ほとんどないと考えられる。したがって、本研究の目的は、１種の症例対照研究および３種のコホート研究由来の３，８１７症例および３，９２１対照のデータを使用して、ｐｉＲＮＡバリアントが、肺がんリスクに関連するかどうかを試験することであり、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能解析により同定された一塩基多型（ＳＮＰ）をさらに検査することである。さらに、発現プロファイリングによるいくつかの腫瘍型におけるｐｉＲＮＡ発現の科学的な報告に由来するデータを使用して、正常肺組織と比較して肺腺癌において有意に異なって発現されるいくつかのｐｉＲＮＡも同定した。
材料と方法
研究集団およびデータ
本研究の集団は、対象が、３種のコホート研究 − アルファ−トコフェロール、ベータ−カロチンがん予防研究（ＡＴＢＣ）、前立腺、肺、結腸、卵巣スクリーニング治験（ＰＬＣＯ）およびがん予防研究ＩＩ栄養コホート（ＣＰＳ−ＩＩ）からプールされた、肺がんのゲノムワイド関連研究に由来する。利用できる個体の遺伝子型および表現型データは、遺伝子型および表現型のデータベース（ｄｂＧａＰ、研究受託：ｐｈｓ０００３３６．ｖ１．ｐ１）から、Ｙａｌｅ大学の安全なサーバーへとダウンロードされ、ｄｂＧａＰガイドラインに従って解読および抽出される。本研究の総集団は、７７３８名であり、３，８１７症例および３，９２１対照を含む。
４９７名の肺腺癌患者および４６名の対照のための２５２種のｐｉＲＮＡの発現データが、科学的な報告（Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２７；５：１０４２３、２０１５年）の補足表２から得られる。ｐｉＲＮＡ発現の単位は、マッピングされた百万読み取りデータ当たりのキロベース当たりの読み取りデータ（ＲＰＫＭ）として定義され、全ＲＰＫＭ値は、科学的な報告から得られる。
データクリーニングおよび管理
データクリーニングおよび管理の全プロセスは、ＰＬＩＮＫ ｖ １．０７によって行われる。４種の研究由来の対象は、４種のプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ２４０Ｋ３００Ｋ、ＨｕｍａｎＨａｐ５５０Ｋ、Ｈｕｍａｎ６１０Ｑｕａｄｖ１およびＨｕｍａｎ１Ｍ−Ｄｕｏｖ３）のうち１種において遺伝子型判定される。３，８１７症例および３，９２１対照における５３９，０００種のＳＮＰのデータは、１個の完全データセットに合併される。１２４対の対象が、家系（ＩＢＤ）解析（ｐｉ−ｈａｔ（π＾）＞＝０．２）による同一性により家族関係性を有することが判明し、１２４対の各メンバーを最終解析から除外した。コール率≧９０％およびハーディ・ワインベルグ平衡検定（ＨＷＥ）Ｐ＞０．０００１を有するＳＮＰに、データセットを制限した。次いで、ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴを使用して、主成分解析（ＰＣＡ）を実行し、１７３名の対象を外れ値として除外した。最後に、試料ファイルは、３７０２症例および３７３９対照における５３３，００２種のＳＮＰを含有した。
発現データのため、最終解析から５２種のｐｉＲＮＡを除外した。なぜなら、これらのｐｉＲＮＡのうち１３種が、重複によりマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）へとマッピングされ、３６種が、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）へとマッピングされ、３種が、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）へとマッピングされるからである。ｐｉＲＮＡＢａｎｋおよびＵＣＳＣゲノムブラウザによる正確なマッピングの確認後に、２００種のｐｉＲＮＡが、最終解析に含まれた。
ｐｉＲＮＡバリアント遺伝子型インピュテーションおよび微細マッピング
コピー数およびゲノム遺伝子座を含むｐｉＲＮＡ ＳＮＰリストが、ｐｉＲＮＡＢａｎｋから得られる。証拠が、より低いコピー数を有するｐｉＲＮＡが、タンパク質コード遺伝子発現の調節に関与する可能性がより高いことを示したため、コピー数＞１００を有するＳＮＰを除外した。インピュテーションのための参照パネルとして、１，０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｈａｓｅ ３ハプロタイプバリアントを使用した。ＩＭＰＵＴＥ ｖ２．３．１ソフトウェアを使用して、インピュテーションを行った。５ＭＢセグメントにおけるマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）＞１％を有する全ＳＮＰのインピュテーションにより微細マッピングを行い、全座標情報は、ＵＳＣＳゲノムブラウザにおけるゲノム参照コンソーシアムＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９から収集する。
関連解析
性別、年齢、本来の研究参加、遺伝子型判定プラットフォームおよび最初の２種の主成分を制御する、無条件回帰および相加的アレルモデルを使用して、ＳＮＰＴＥＳＴ ｖ２．５により関連研究の統計解析を行った。制御するための主成分の数は、研究全体にわたるゲノムインフレーション因子（ＧＩＦ）および対応するＱＱプロットにより決定される。オッズ比（ＯＲ）、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）、名目ｐ値および偽発見率調整された（ＦＤＲ）Ｐ値が関連毎に提供される。ｑｑｍａｎパッケージを使用して、ＲによってマンハッタンプロットおよびＱＱプロットを生成する。
正常および肺腺癌試料の間のｐｉＲＮＡ発現レベルの比較
４９７名の肺腺癌患者および４６名の対照由来の試料の間の含まれる２００種のｐｉＲＮＡの異なる発現レベルを視覚化する散布図を、Ｊ−Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアによって作製した。両側ｔ検定を使用して、含まれる２００種のｐｉＲＮＡに関して、４９７名の肺腺癌患者および４６名の対照由来の試料の間の個々のｐｉＲＮＡ発現レベルの差を検出した。多重比較のためのボンフェローニ調整を適用した。
結果
肺がんリスクに関連する２種の同定されたｐｉＲＮＡ
含まれる３，７０２症例および３，７３９対照のベースライン特徴を表４に示す。対照群において、症例群よりも多くの男性が存在する。年齢分布は、２群間で同様である。より高い割合の対照が、ＰＬＣＯ研究に由来する一方、より多くの症例が、ＡＴＢＣ研究に由来する。そして、症例由来の試料の大部分は、ＨｕｍａｎＨａｐ５５０ＫおよびＨｕｍａｎ６１０Ｑｕａｄｖ１アレイにおいて遺伝子型判定される一方、対照は、全４種のアレイにおいて遺伝子型判定される。全データクリーニングプロセス後に、７，４４１名の総集団における５３３，００２種のＳＮＰの遺伝子型データが、ＰＣＡ解析に含まれた。目的のｐｉＲＮＡにマッピングされ得る総計１，１７３種のＳＮＰが、帰属に成功し、最終関連研究に含まれた。これら１，１７３種のバリアントおよび肺がんリスクの間の関連が、マンハッタンプロットに表示されている（図１４Ａ）。ボンフェローニ補正による多重比較の調整後に、１種のＳＮＰのみ（ｒｓ１１６３９３４７）が、肺がんリスクと統計的に有意に関連した。ｒｓ１１６３９３４７は、２個の重複するｐｉＲＮＡのｐｉＲ−５２４７およびｐｉＲ−５６７１にマッピングされ得る。表５に示される通り、ｒｓ１１６３９３４７のマイナーアレルは、オッズ比（ＯＲ）１．１７（９５％信頼区間（ＣＩ）：１．０９、１．２７）で肺がんリスクを増加させる、リスクのあるアレルである。上位３つの同定されたＳＮＰのＳＮＰ名、マッピングされるｐｉＲＮＡ、位置、アレル、マイナーアレル頻度、ＯＲ、名目Ｐ値およびＦＤＲ Ｐ値に関する情報も含まれる。関連解析は、性別、年齢、本来の研究参加、遺伝子型判定プラットフォームおよび最初の２種の主成分について制御される。
個々のｐｉＲＮＡ発現レベル差
散布図（図１４Ａ）は、４９７名の肺腺癌患者および４６名の正常対照の間における個々のｐｉＲＮＡそれぞれの平均発現レベルを示す。大部分のｐｉＲＮＡは、肺腺癌および正常試料の両方において非常に低い発現レベルを有する。しかし、発現レベルは、正常試料と比較して腫瘍試料において異なる発現パターンを示した、いくつかの外れ（ｏｕｔｌｙｉｎｇ）ｐｉＲＮＡにおいて検出可能であった。腫瘍試料における上位発現の７種のｐｉＲＮＡは、表５に列挙された。ｐｉＲＮＡ名、位置、コード領域、正常試料における平均発現レベル、肺腫瘍試料における平均発現レベル、両側ｔ検定によって生成された名目Ｐ値、およびＦＤＲＰ値に関する情報が提供されている。表５は、正常および腫瘍試料の間で統計的に有意に異なる、上位５種のｐｉＲＮＡ（ｐｉＲ−１４６２０、ｐｉＲ−２７３２、ｐｉＲ−５１８０９、ｐｉＲ−１９５２１およびｐｉＲ−１５２３２）を含む。これらの中で、ｐｉＲ−１４６２０は、最高の発現レベルのものであり、５種のｐｉＲＮＡは全て、腫瘍試料において上方調節される。上位７種のｐｉＲＮＡのうち腫瘍試料において下方調節される唯一のｐｉＲＮＡは、ｐｉＲ−３１６３７であった。しかし、ボンフェローニ補正後に、その発現レベルの差は、統計的に有意ではなかった。
考察
これは、関連結果、発現プロファイリング結果および機能解析結果を組み合わせて、ｐｉＲＮＡバリアントおよび肺がんリスクの間の関連を調査する包括的ＧＷＡＳ後研究である。関連解析から、肺がんの増加リスクと有意に関連する、１種のＳＮＰにおけるバリアント（ｒｓ１１６３９３４７）が同定された。バリアント（第１５染色体：７９０２４３５０）ならびに２種のｐｉＲＮＡであるｐｉＲ−５２４７（第１５染色体：７９０２４３３３−７９０２４３６１）およびｐｉＲ−５６７１（第１５染色体：７９０２４３２７−７９０２４３５５）の位置は、遺伝子間領域にある。これは、２種のｐｉＲＮＡに起因する機能的変化が、それ自体の機能に帰する可能性があることを示す。
発現解析から、肺腺癌試料において上方調節される５種のｐｉＲＮＡを同定した。そのうち、最も高く発現されるｐｉＲＮＡであるｐｉＲ−１４６２０は、遺伝子ＫＩＡＡ０８２５のイントロンに位置する。ｐｉＲ−２７３２は、リボソームタンパク質をコードし、ｐ２１機能の調節によりＤＮＡ修復に関与する遺伝子ＲＰＬ３のイントロンに位置する。ｐｉＲ−５１８０９は、遺伝子ＣＰＡ６のイントロンに位置する。ｐｉＲ−１９５２１は、遺伝子間領域に位置する。ｐｉＲ−１５２３２は、Ｈ２Ｂヒストンタンパク質をコードするＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪのエクソンに位置する。したがって、肺がん発症におけるＫＩＡＡ０８２５、ＣＰＡ６およびＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪの役割を調査するために、将来の研究が必要とされる。ＤＮＡ修復および細胞アポトーシスの調節によるがん発症に関与すると思われるため、ｐｉＲ−２７３２の機能解析をさらに行うべきである。
本研究にはいくつかの強みがある。第一に、関連研究において、１，０００ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｈａｓｅ ３ハプロタイプ参照パネルの使用は、インピュテーションにおけるｐｉＲＮＡ包埋ＳＮＰの広範なカバレッジを保証する。第二に、細胞生存率アッセイの結果は、ｒｓ１１６３９３４７のみが、肺がん細胞成長を促進するように機能することを示し、これが、将来の肺がん処置のための優れた特異的標的となり得ることを示す。第三に、関連研究および発現解析から、肺がんリスクに関連するいくつかのｐｉＲＮＡバリアントを同定し、これらは、タンパク質コード領域および遺伝子間領域に位置する。この知見は、ｐｉＲＮＡが、その非依存的生物学的役割または癌遺伝子もしくは腫瘍サプレッサー遺伝子との相互作用のいずれかにより腫瘍形成において重要な役割を果たすことのさらなる証拠を提供する。最後に、関連研究、発現解析および機能解析の組み合わせは、肺がんリスクと関連する同定されたＳＮＰの包括的理解を提供する。
（実施例６：ＧＷＡＳ研究は、乳がんリスクに関連するｐｉＲＮＡを同定した）
材料と方法
一次インピュテーション解析のための研究対象のＧＷＡＳデータセットの記載は、看護師健康調査コホート内に収まる（ｎｅｓｔ）感受性のがん遺伝的マーカー（ＣＧＥＭＳ）乳がんＧＷＡＳの参加者であろう。ゲノムワイド遺伝子型データは、確認された浸潤性乳がんを有するヨーロッパ家系の１，４３４症例と、年齢、民族性および血液採取時間においてマッチする１，１４２対照に関して遺伝子型および表現型のデータベース（ｄｂＧａＰ）に公に利用可能である（表６）。対象は主に閉経後である；しかし、少数の閉経前女性も含まれている。
ｐｉＲＮＡ ＳＮＰの予備的セットにおいてｐｉＲＮＡバリアントおよび乳がんリスクの間の関連を試験するために、ＣＧＥＭＳ集団において単一コピーｐｉＲＮＡ配列内に保持されるＭＡＦ＞１０％を有する４７９種のＳＮＰについてインピュテーションを行った；同様にこれらの判断基準を満たす６８種のＳＮＰは、直接的に遺伝子型判定した。記載されているデータクリーニング後に、５３１，５４９種のＳＮＰにおける遺伝子型に基づき上述の通りインピュテーションを行った。品質＞０．８０で帰属した遺伝子型への限定後に、４８３種のＳＮＰが関連解析に残った。年齢、乳がんの家族歴および最初の３主成分について関連を調整して、潜在的集団下部構造を調整した。
結果
関連解析結果を表７に示す。示されている通り、ｐｉＲＮＡのｐｉＲ−１７３１９、ｐｉＲ−９４２２、ｐｉＲ−１６５５６およびｐｉＲ−３４６７に保持される４種のＳＮＰは、少なくとも１．２５の効果サイズ（０．８０）および有意性レベルＰ＜０．０１により、乳がんリスクと関連を有することが観察された。特定された上位のＳＮＰ、ｐｉＲ−１７３１９におけるｒｓ２８６４９１２５は、保護的バリアントアレルの高いＭＡＦおよび対応する人口寄与危険度７．８％により、特に興味深い。同定された関連は、多重比較のための厳密な補正に近づくが、これに勝ることはないが（α＝０．０５におけるボンフェローニ補正された有意性閾値は、およそ１×１０−４である）、これは、観察される効果サイズおよび名目有意性レベルによって反映される、これらのバリアントの潜在的な機能的重要性を決して除外しない。研究は、ゲノム全体にわたる有意性の非存在下であっても、例えば、ｍｉＲ−１９６ａ−２におけるｒｓ１１６１４９１３の場合、遺伝的関連研究によって同定される遺伝性バリアントの機能的意義を示す。
（実施例７：次世代配列決定は、乳がんにおいて差次的に発現されるｐｉＲＮＡを同定した）
材料と方法
乳がんの低分子ＲＮＡ−Ｓｅｑデータセット
受託番号ＧＳＥ４００４９を有するＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）から、１４名の患者に由来する１４のマッチした対の組織（ヒトトリプルネガティブ乳がんおよび対応する隣接正常組織）の低分子ＲＮＡ−Ｓｅｑ未加工データをダウンロードした。ＳＯＬｉＤ ４ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりこれらの単一末端の未加工読み取りデータを生成した（表８を参照）。
バイオインフォマティクス解析
ＦａｓｔＱＣ ｖ ０．１１．３を使用して、未加工データにおける品質管理チェックを行った。その後に、Ｃｕｔａｄａｐｔ ｖ １．８．３（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｙｐｉ．ｐｙｔｈｏｎ．ｏｒｇ／ｐｙｐｉ／ｃｕｔａｄａｐｔ）を使用して、未加工読み取りデータをトリミングし、フィルターをかけた。２０よりも低い品質スコアを有し、１６よりも短い読み取りデータを廃棄した。潜在的ｐｉＲＮＡとして、下流解析のためにクリーンな読み取りデータを使用した。続いて、読み取りデータ−計数に基づくＲＮＡ−ｓｅｑ解析のプロトコールを使用して、バイオインフォマティクス解析を処理した。データ処理のパイプラインを図１４Ａに示した。簡潔に説明すると、Ｂｏｗｔｉｅ ｖ １．１．２（ｈｔｔｐ：／／ｂｏｗｔｉｅ−ｂｉｏ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）を使用して、品質読み取りデータを参照ゲノムｈｇ１８にマッピングした。ＨＴＳｅｑ（ｈｔｓｅｑ−計数）ｖ ０．６．１を、ｐｉＲＮＡＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｒｎａｂａｎｋ．ｉｂａｂ．ａｃ．ｉｎ／）からダウンロードし、ＧＴＦ／ＧＦＦフォーマットに変換した転写物アノテーションファイルに従った読み取りデータの計数に使用した。マッピングされた百万読み取りデータ当たりの特有にマッピングされた読み取りデータ（ＲＰＭ）の数により遺伝子発現レベルを正規化した。次に、ＤＥＳｅｑまたはＥｄｇｅ、Ｒパッケージを使用して、ｈｔｓｅｑ−計数由来のアウトプットファイルを解析し、差次的発現解析の結果を視覚化した。図１５Ａは、低分子ＲＮＡ−ｓｅｑデータのための計数に基づく差次的発現パイプラインの概要である。
リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ
乳房細胞株から単離された４種の全ＲＮＡを使用した。これは、ユーザーマニュアルに従ってＮＣｏｄｅ ｍｉＲＮＡ第一鎖合成およびｑＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ポリアデニル化し、逆転写した。続いて、ｐｉＲＮＡのための配列特異的フォワードプライマー（表９を参照）と併せてＮＣｏｄｅユニバーサルリバースプライマーを使用して、ｃＤＮＡを二段階相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ）に付した。ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲマスターミックス、フォワードプライマー、ユニバーサルｑＰＣＲプライマー、ＲＯＸ参照色素および１μＬ鋳型ｃＤＮＡ含むＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲ反応毎にマスターミックスを調製した。ｐｉＲＮＡの相対的定量化のための参照遺伝子としてＲＮＵ６Ｂを使用した。ＡＢＩ ７５００ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲ系を使用して、反応を９６ウェルプレート（ＡＢＩ）に置いた。ＰＣＲサイクリング条件を次に示す：９５℃３分間、続いて４０サイクルの９５℃３秒間および６３℃２５秒間。サイクリング後に、ＡＢＩ配列検出ソフトウェア（ｖ１．３）からＣＴ値を得た。
細胞株
ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を含む３種の乳房細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、次の条件を使用して培養した。自発的不死化正常ヒト乳腺上皮細胞株であるＭＣＦ−１０Ａ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１０３１７（商標））細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１００ｎｇ／ｍｌコレラ毒素を補充した乳腺上皮細胞成長培地（ＭＥＧＭ）（Ｌｏｎｚａ）において培養した。乳がん細胞株であるＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ２２（商標））は、１０％ＦＢＳおよび０．０１ｍｇ／ｍｌヒト組換えインスリンを補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）（ＡＴＣＣ（登録商標）３０２００３（商標））において培養した。上述のこれら細胞は、加湿インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ）において３７℃、５％ＣＯ２で維持した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２６（商標））は、１０％ＦＢＳを補充したＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地（ＡＴＣＣ（登録商標）３０−２００８（商標））においてＣＯ２なしの３７℃で培養した。
ｐｉＲＮＡ模倣物トランスフェクションおよび細胞増殖アッセイ
ｐｉＲ＿０１８２９２（ＤＱ５９５１８６）の可能な効果を研究するために、その模倣物を乳房正常および腫瘍細胞にトランスフェクトした。模倣物は、ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｉｎｃ．により合成した。製造業者の指示に従ってリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、９６ウェルプレートで培養した細胞に、ｐｉＲＮＡ模倣物をトランスフェクトした。非特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖による模擬トランスフェクションを陰性対照として使用した。トランスフェクションの最大効果を可能にするために、細胞を４８〜９６時間処理した。その後に、製造業者の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により細胞生存率を決定した。その結果得られるホルマザン産物を、４９０ｎｍのマルチウェル分光光度計により定量化した。
結果
ＲＮＡ−ｓｅｑ解析に基づくｐｉＲＮＡの差次的発現
正常および悪性乳房組織の間で差次的に発現されるｐｉＲＮＡを同定するために、トリプルネガティブ乳がんおよび隣接正常組織の１４のマッチした対を解析した。マッチした対のｔ検定を使用して、差次的に発現されるｐｉＲＮＡを同定した。差次的に発現される（ｐ＜０．０５）総計２０１種のｐｉＲＮＡ遺伝子座が同定され、上位１４種のｐｉＲＮＡ（ｐ＜０．０１）のリストを表１０に示した。１４種のｐｉＲＮＡのうち、４種のｐｉＲＮＡ（ｐｉＲ＿０１６９７５、ｐｉＲ＿０１９１６９、ｐｉＲ＿０１８２９２およびｐｉＲ＿０１７１７８）が、乳房腫瘍組織において最も有意に下方調節された（図１５Ｂを参照）。
ＲＴ−ｑＰＣＲによる差次的に発現されるｐｉＲＮＡの検証
４種のｐｉＲＮＡの差次的発現を検証するために、４種の乳房細胞株（ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ−１２Ａ、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）から単離された全ＲＮＡを使用して、ＲＴ−ｑＰＣＲにより解析した（図１５Ｃを参照）。結果は、正常細胞株におけるｐｉＲ＿０１７１７８およびｐｉＲ＿０１８２９２の両方の発現レベルが、腫瘍細胞株よりも有意に高かったことを示し、これは、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果に一致した。ｐｉＲ＿０１６９７５に関して、その発現レベルは、２種の正常細胞株において合致しなかった。さらに、ＭＣＦ−１０Ａにおけるその発現レベルは、２種の腫瘍細胞株と同様であった。ｐｉＲ＿０１９１６９の発現は、４種の細胞株において検出できない。
乳房腫瘍細胞におけるｐｉＲ＿０１８２９２過剰発現の生物学的効果
乳房腫瘍細胞におけるｐｉＲ＿０１８２９２の役割に取り組むために、これは、トランスフェクションによって３種の細胞株（ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において過剰発現され、ＭＴＳテトラゾリウムアッセイにより細胞生存率を検出した。結果は、ＭＣＦ−１０Ａと比較して、ｐｉＲ＿０１８２９２の過剰発現が、ＭＣＦ−７の増殖速度を有意に下方調節し得ることを示した。しかし、これは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の増殖および生存率に対する有意な影響ではなかった（図１５Ｄを参照）。

Claims (37)

  1. 脳がんについて対象を処置する方法であって、有効量の野生型ｐｉＲ−２７９９、ｐｉＲ−１８９１３、ｐｉＲ−５９８、ｐｉＲ−１１７１４、ｐｉＲ−３２６６、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子を前記対象に投与して、前記対象の細胞内におけるｐｉＲＮＡの発現を増加させるステップを含む、方法。
  2. （ｉ）野生型ｐｉＲ−２７９９、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ１４９３３６９４７ＳＮＰを有する、
    （ｉｉ）野生型ｐｉＲ−１８９１３、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ６２４３５８００ＳＮＰを有する、
    （ｉｉｉ）野生型ｐｉＲ−５９８、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ１４７０６１４７９ＳＮＰを有する、
    （ｉｖ）野生型ｐｉＲ−１１７１４、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ１４２７４２６９０ＳＮＰを有する、
    （ｖ）野生型ｐｉＲ−３２６６、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ３５７１２９６８ＳＮＰを有する、
    （ｖｉ）これらの組み合わせである、
    請求項２に記載の方法。
  3. 脳がんについて対象を処置する方法であって、前記対象の細胞内におけるｐｉＲＮＡの発現を増加させるための有効量の野生型ｐｉＲ−８０４１、ｐｉＲ−５４０２２、ｐｉＲ−２０２４９、ｐｉＲ−１５９８８、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  4. （ｉ）野生型ｐｉＲ−８０４１、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ−８０４１が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｉｉ）野生型ｐｉＲ−５４０２２、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ−８０４１が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｉｉｉ）野生型ｐｉＲ−２０２４９、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ−８０４１が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｉｖ）野生型ｐｉＲ−１５９８８、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ−８０４１が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、あるいは
    （ｖ）これらの組み合わせである、
    請求項３に記載の方法。
  5. 前記脳がんが、神経膠芽腫、乏突起膠腫、髄膜腫、テント上上衣腫、松果体部腫瘍、髄芽腫、小脳星状細胞腫、テント下上衣腫、脳幹神経膠腫、神経鞘腫、下垂体腫瘍、頭蓋咽頭腫、視神経膠腫、または星状細胞腫である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 肝臓がんについて対象を処置する方法であって、前記対象の細胞内におけるｐｉＲＮＡの発現を増加させるための有効量の野生型ｐｉＲ−３７２１３、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  7. ｐｉＲ−３７２１３が、正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、請求項６に記載の方法。
  8. 肝臓がんについて対象を処置する方法であって、前記対象の細胞内におけるｐｉＲＮＡの発現を減少させるための有効量の野生型ｐｉ−Ｒ１７６５６またはｐｉＲ−３３４０４の阻害剤を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  9. （ｉ）野生型ｐｉ−Ｒ１７６５６の阻害剤が投与され、ｐｉ−Ｒ１７６５６が正常な組織と比較して前記がんにおいて過剰発現されている、
    （ｉｉ）野生型ｐｉＲ−３３４０４の阻害剤が投与され、ｐｉＲ−３３４０４が正常な組織と比較して前記がんにおいて過剰発現されている、または
    （ｉｉｉ）これらの組み合わせである、
    請求項８に記載の方法。
  10. 前記肝臓がんが、場合によりヘパトーマもしくはＨＣＣとも呼ばれる肝細胞癌（ＨＣＣ）、線維層板状癌、胆管癌（胆管がん）、血管肉腫、または肝芽腫である、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前立腺がんについて対象を処置する方法であって、前記対象の細胞内におけるｐｉＲＮＡの発現を増加させための有効量の野生型ｐｉＲ−０２１１６３、ｐｉＲ−００３１２３、ｐｉＲ−００８０６１、ｐｉＲ−０１３７８３、ｐｉＲ−１４２４６、ｐｉＲ−００８２８６、ｐｉＲ−０１８４９５、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  12. （ｉ）野生型ｐｉＲ−０２１１６３、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ６１１０１７８５ＳＮＰを有する、
    （ｉｉ）野生型ｐｉＲ−００３１２３、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ６２４３９７２１ＳＮＰを有する、
    （ｉｉｉ）野生型ｐｉＲ−００８０６１、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ１１０７４１８４ＳＮＰを有する、
    （ｉｖ）野生型ｐｉＲ−０１３７８３、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ８０１０９６９ＳＮＰを有する、
    （ｖ）野生型ｐｉＲ−１４２４６、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ８０１０９６９ＳＮＰを有する、
    （ｖｉ）野生型ｐｉＲ−００８２８６、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ００８２８６ＳＮＰを有する、
    （ｖｉｉ）野生型ｐｉＲ−０１８４９５、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ８０２０３７８ＳＮＰを有する、あるいは
    （ｖｉｉｉ）これらの組み合わせである、
    請求項１１に記載の方法。
  13. 前記前立腺がんが、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、前立腺腺癌、小細胞癌、扁平上皮癌、前立腺肉腫、または移行上皮癌である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 肺がんについて対象を処置する方法であって、前記対象の細胞内におけるｐｉＲＮＡの発現を増加させるための有効量の野生型ｐｉＲ−２１６２６、ｐｉＲ−１６８２８、ｐｉＲ−５２４７、ｐｉＲ−５６７１、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  15. （ｉ）野生型ｐｉＲ−２１６２６、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ１３３８２７４８ＳＮＰを有する、
    （ｉｉ）野生型ｐｉＲ−１６８２８、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ６０５３４７２２ＳＮＰを有する、
    （ｉｉｉ）野生型ｐｉＲ−５２４７、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ１１６３９３４７ＳＮＰを有する、
    （ｉｖ）野生型ｐｉＲ−５６７１、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ１１６３９３４７ＳＮＰを有する、あるいは
    （ｖ）これらの組み合わせである、
    請求項１４に記載の方法。
  16. 肺がんについて対象を処置する方法であって、前記対象の細胞内におけるｐｉＲＮＡの発現を増加させるための有効量の野生型ｐｉＲ−３１６３７、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  17. ｐｉＲ−３１６３７が、正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、請求項１６に記載の方法。
  18. 肺がんについて対象を処置する方法であって、前記対象の細胞内におけるｐｉＲＮＡの発現を減少させるための有効量の野生型ｐｉＲ−１４６２０、ｐｉＲ−２０００９、ｐｉＲ−２７３２、ｐｉＲ−５１８０９、ｐｉＲ−１９５２１、またはｐｉＲ−１５２３２の阻害剤を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  19. （ｉ）野生型ｐｉＲ−１４６２０の阻害剤が投与され、ｐｉＲ−１４６２０が正常な組織と比較して前記がんにおいて過剰発現されている、
    （ｉｉ）野生型ｐｉＲ−２０００９の阻害剤が投与され、ｐｉＲ−２０００９が正常な組織と比較して前記がんにおいて過剰発現されている、
    （ｉｉｉ）野生型ｐｉＲ−２７３２の阻害剤が投与され、ｐｉＲ−２７３２が正常な組織と比較して前記がんにおいて過剰発現されている、
    （ｉｖ）野生型ｐｉＲ−５１８０９の阻害剤が投与され、ｐｉＲ−５１８０９が正常な組織と比較して前記がんにおいて過剰発現されている、
    （ｖ）野生型ｐｉＲ−１９５２１の阻害剤が投与され、ｐｉＲ−１９５２１が正常な組織と比較して前記がんにおいて過剰発現されている、
    （ｖｉ）野生型ｐｉＲ−１５２３２の阻害剤が投与され、ｐｉＲ−１５２３２が正常な組織と比較して前記がんにおいて過剰発現されている、あるいは
    （ｖｉｉ）組み合わせである、
    請求項１８に記載の方法。
  20. 前記肺がんが、腺癌、上皮内腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、および大細胞神経内分泌腫瘍などの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、中皮腫、またはカルチノイド腫瘍である、請求項１８に記載の方法。
  21. 乳がんについて対象を処置する方法であって、前記対象の細胞内におけるｐｉＲＮＡの発現を増加させるための有効量の野生型ｐｉＲ−１７３１９、ｐｉＲ−９４２２、ｐｉＲ−１６５５６、ｐｉＲ−３４６７、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  22. （ｉ）野生型ｐｉＲ−１７３１９、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ２８６４９１２５ＳＮＰを有する、
    （ｉｉ）野生型ｐｉＲ−９４２２、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ１１９１４０１７ＳＮＰを有する、
    （ｉｉｉ）野生型ｐｉＲ−１６５５６、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ１０５１８２６３ＳＮＰを有する、
    （ｉｖ）野生型ｐｉＲ−３４６７、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、前記対象が少なくとも１つのｒｓ７２７５５１５８ＳＮＰを有する、あるいは
    （ｖ）これらの組み合わせである、
    請求項２１に記載の方法。
  23. 乳がんについて対象を処置する方法であって、前記対象の細胞内におけるｐｉＲＮＡの発現を増加させるための有効量の野生型ｐｉＲ＿０１６９７５、ｐｉＲ＿０１９１６９、ｐｉＲ＿０１８２９２、ｐｉＲ＿０１７１７８、ｐｉＲ＿０１９３６８、ｐｉＲ＿０１９９１１、ｐｉＲ＿０００５６０、ｐｉＲ＿００１２０７、ｐｉＲ＿０１２７５３、ｐｉＲ＿００３７２８、ｐｉＲ＿００１０７８、およびｐｉＲ＿０１２９２５、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  24. （ｉ）野生型ｐｉＲ＿０１６９７５、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ＿０１６９７５が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｉｉ）野生型ｐｉＲ＿０１９１６９、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ＿０１９１６９が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｉｉｉ）野生型ｐｉＲ＿０１８２９２、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ＿０１８２９２が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｉｖ）野生型ｐｉＲ＿０１７１７８、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ＿０１７１７８が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｖ）野生型ｐｉＲ＿０１９３６８、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ＿０１９３６８が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｖｉ）野生型ｐｉＲ＿０１９９１１、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ＿０１９９１１が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｖｉｉ）野生型ｐｉＲ＿０００５６０、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ＿０００５６０が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｖｉｉｉ）野生型ｐｉＲ＿００１２０７、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ＿００１２０７が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｉｘ）野生型ｐｉＲ＿０１２７５３、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ＿０１２７５３が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｘ）野生型ｐｉＲ＿００３７２８、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ＿００３７２８が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｘｉ）野生型ｐｉＲ＿００１０７８、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ＿００１０７８が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、
    （ｘｉｉ）野生型ｐｉＲ＿０１２９２５、または野生型と同一もしくは同様の活性を有するその近似バリアント、またはその発現の刺激因子が投与され、ｐｉＲ＿０１２９２５が正常な組織と比較して前記がんにおいて過少発現されている、あるいは
    （ｘｉｉｉ）これらの組み合わせである、
    請求項２３に記載の方法。
  25. 乳がんについて対象を処置する方法であって、前記対象の細胞内におけるｐｉＲＮＡの発現を減少させるための有効量の野生型ｐｉＲ＿０２０５８２またはｐｉＲ＿００４９８７の阻害剤を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  26. （ｉ）野生型ｐｉＲ＿０２０５８２の阻害剤が投与され、ｐｉＲ＿０２０５８２が正常な組織と比較して前記がんにおいて過剰発現されている、
    （ｉｉ）野生型ｐｉＲ＿００４９８７の阻害剤が投与され、ｐｉＲ＿００４９８７が正常な組織と比較して前記がんにおいて過剰発現されている、または
    （ｉｉｉ）組み合わせである、
    請求項２５に記載の方法。
  27. 前記乳がんが、ＤＣＩＳ−非浸潤性乳管癌、ＩＤＣ−浸潤性乳管癌、ＩＤＣ型：乳房管状癌、ＩＤＣ型：乳房髄様癌、ＩＤＣ型：乳房粘液性癌、ＩＤＣ型：乳房乳頭状癌、ＩＤＣ型：乳房篩状癌、ＩＬＣ−浸潤性小葉癌、炎症性乳がん、ＬＣＩＳ−非浸潤性小葉癌、男性乳がん、乳頭パジェット病、乳房葉状腫瘍、または再発性および転移性乳がんである、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記乳がんが、ルミナルＡ、ルミナルＢ、トリプルネガティブ／基底細胞様、高ＨＥＲ２、または正常様である、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 対象における活性薬剤の治療有効性を決定するための方法であって、活性薬剤による処置前または処置中の第１の生物学的試料、および前記活性薬剤による１回または複数の処置後の期間に採取された第２の生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルを決定するステップを含み、正常な組織と比較した前記ｐｉＲＮＡのレベルの減少ががんと相関する場合、前記第１の試料と比較した前記第２の試料中のｐｉＲＮＡのレベルの増加が、有効な活性薬剤を示す、方法。
  30. 対象における活性薬剤の治療有効性を決定するための方法であって、活性薬剤による処置前または処置中の第１の生物学的試料、および前記活性薬剤による１回または複数の処置後の期間に採取された第２の生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルを決定するステップを含み、正常な組織と比較した前記ｐｉＲＮＡのレベルの増加ががんと相関する場合、前記第１の試料と比較した前記第２の試料中のｐｉＲＮＡのレベルの減少が、有効な活性薬剤を示す、方法。
  31. 対象における寛解を決定するための方法であって、活性薬剤による処置前または処置中の第１の生物学的試料、および前記活性薬剤による１回または複数の処置後の期間に採取された第２の生物学的試料におけるｐｉＲＮＡのレベルを決定するステップを含み、正常な組織と比較した前記ｐｉＲＮＡのレベルの変化ががんと相関する場合、前記第１の試料と比較した前記第２の試料中のｐｉＲＮＡのレベルの減少が寛解を示す、方法。
  32. 前記がんが、膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、上咽頭がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がんまたは血液がんである、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. がんと関連する異常なｐｉＲＮＡを特定する方法であって、正常な組織試料で発現されるｐｉＲＮＡの配列を、がん組織で発現されるｐｉＲＮＡの配列と比較するステップ、および前記がん組織由来のｐｉＲＮＡの配列が、正常な組織のゲノム的に対応するｐｉＲＮＡと異なるとき、前記がんと関連する異常なｐｉＲＮＡを特定するステップを含む、方法。
  34. 差が一塩基多型（ＳＮＰ）であるとき、前記がん組織由来の前記ｐｉＲＮＡが、正常な組織の前記ゲノム的に対応するｐｉＲＮＡと異なるものとする、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記差により、前記ｐｉＲＮＡの、その標的ｍＲＮＡに結合する能力が変化する、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記ｍＲＮＡががん遺伝子であり、野生型ｐｉＲＮＡの発現により前記がんの腫瘍原性が低下する、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記がんが、膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、上咽頭がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がんまたは血液がんである、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の方法。
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