JP5936002B2 - 組合わせ医薬製剤 - Google Patents
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Description
また、フコシル化はフコシルトランスフェラーゼ(FUT)という糖転移酵素によって触媒されていることから、フコシル化糖鎖産生細胞のフコシルトランスフェラーゼを標的分子として標的化することも考えられるが、同酵素は小胞体からゴルジ装置にかけて局在する膜結合型タンパク質であり、細胞表面に存在しないため、これを直接的な標的分子とすることもできない。したがって、フコシル化糖鎖産生細胞特異的に薬剤などの物質を送達する技術はこれまで存在しなかった。
フコシル化分子産生細胞にフコースを特異的に結合する機構が存在することはこれまで全く知られていなかった。また、特許文献1、2および非特許文献3には、フコースを含む担体が記載されているが、フコシル化分子産生細胞への物質送達を特異的に促進することについては教示されていない。
(1)細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第1のリガンドを含む第1の成分と、該第1のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第2のリガンドで標的化された、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬剤を含む第2の成分とを含む、標的細胞に関連する疾患を処置するための組合わせ医薬製剤。
(2)第1の成分と第2の成分とが、同時投与または逐次投与される、(1)に記載の医薬製剤。
(3)第1のリガンドがマンノースまたは末端にマンノースを有する化合物であり、第2のリガンドがフコースまたはこれを末端に含む分子であり、標的細胞がフコシル化分子産生細胞である、(1)または(2)に記載の医薬製剤。
(4)疾患が、腫瘍性疾患および炎症性疾患からなる群から選択される、(3)に記載の医薬製剤。
(5)腫瘍性疾患が、固形腫瘍および白血病からなる群から選択される、(4)に記載の医薬製剤。
(6)細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第1のリガンドを含む第1の成分と、該第1のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第2のリガンドで標的化された担体を含む第2の成分とを含む、標的細胞特異的に物質を送達するための組合わせ医薬組成物。
(8)標識が、気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、放射性同位体、磁性体、核磁気共鳴する元素、核磁気共鳴する元素の緩和時間に影響を与える物質、標識化物質に結合する物質、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、酵素、ビオチンもしくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体、または、これらの1または2以上を含む物質からなる群から選択される、(7)に記載の医薬組成物。
(9)細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第1のリガンドを含む第1の成分と、該第1のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第2のリガンドで標的化された標識剤を含む第2の成分とを含む、標的細胞またはこれを含む組織を標識するための組合わせ医薬組成物。
(10)細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第1のリガンドと、該第1のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第2のリガンドで標的化された、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬剤とを、単独でまたは組み合わせて含む1または2以上の容器を含む、標的細胞に関連する疾患を処置するためのキット。
(11)細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第1のリガンドを含む、該第1のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第2のリガンドで標的化された担体、薬剤または標識剤の標的特異性強化剤。
(i)フコシル化分子産生細胞に対する標的化のための有効量のフコースを含む、前記細胞に標的化された担体。
(ii)フコースがL−フコースである、上記(i)に記載の担体。
(iii)フコシル化分子がI型糖鎖を含む、上記(i)または(ii)に記載の担体。
(iv)フコシル化分子がO結合型フコースを含む、上記(i)または(ii)に記載の担体。
(v)フコシル化分子産生細胞が、フコシルトランスフェラーゼを発現する、上記(i)〜(iv)のいずれかに記載の担体。
(vi)フコシルトランスフェラーゼが、FUT1、FUT2、FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT8、FUT9、FUT10、FUT11、POFUT1、POFUT2からなる群から選択される、上記(v)に記載の担体。
(vii)高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、微小球およびナノ小球から選択される形態を有する、上記(i)〜(vi)のいずれかに記載の担体。
(viii)リポソームの形態を有し、フコースと、リポソームに含まれる脂質とのモル比が8:1〜1:8である、上記(i)〜(vii)のいずれかに記載の担体。
(x)フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物が抗炎症剤および抗腫瘍剤からなる群から選択される、上記(ix)に記載の組成物。
(xi)薬物と、担体とを、医療の現場またはその近傍で混合してなる、上記(ix)または(x)に記載の組成物。
(xii)上記(i)〜(viii)のいずれかに記載の担体と、標識とを含む組成物。
(xiii)標識が、気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、放射性同位体、磁性体、核磁気共鳴する原子、核磁気共鳴する原子の緩和時間に影響を与える物質、標識化物質に結合する物質、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、酵素、ビオチンもしくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体、または、これらの1または2以上を含む物質からなる群から選択される、上記(xii)に記載の組成物。
(xiv)フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物と、フコース供与体、ならびに、必要に応じてフコース以外の担体構成物質を、単独でまたは組み合わせて含む1つまたはそれ以上の容器を含む、上記(ix)〜(xi)のいずれかに記載の組成物の調製キット。
(xvi)疾患が、腫瘍性疾患および炎症性疾患からなる群から選択される、上記(xv)に記載の方法。
(xvii)腫瘍性疾患が、固形腫瘍および白血病からなる群から選択される、上記(xvi)に記載の方法。
(xviii)検出に有効な量の上記(xii)または(xiii)に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、フコシル化分子産生細胞を前記対象において検出する方法。
(xix)細胞がイメージングにより検出される、上記(xviii)に記載の方法。
(xx)細胞が腫瘍細胞および炎症細胞からなる群から選択される、上記(xviii)または(xix)に記載の方法。
(xxi)検出に有効な量の上記(xii)または(xiii)に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を診断する方法。
(xxii)上記(i)〜(viii)のいずれに記載の担体を利用した、フコシル化分子産生細胞へ物質を送達する方法。
このため、本発明の医薬製剤および医薬組成物において、標的化リガンドとして、例えばフコースを用いた場合には、所望の物質や物体、例えば標識や、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を処置するための薬物等をフコシル化分子産生細胞に効率的に運搬することにより、最大の効果および最小の副作用において、所望の効果、例えばフコシル化分子産生細胞の活性や増殖の抑制、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の治癒、進行の抑制または発症や再発の予防などを可能にする。また、本発明の医薬組成物において、標的化リガンドとして、フコースを用いた場合には、フコシル化分子産生細胞特異的に物質を送達することができるため、フコシル化分子産生細胞特異的な標識や、遺伝子導入などに利用できる。
本発明において、細網内皮系細胞における多特異性レクチンには、細網内皮系細胞、例えば、脾洞内皮細胞、脾索細網細胞、リンパ細網細胞、リンパ内皮細胞、クッパー細胞、肝類洞内皮細胞、骨髄毛細血管内皮細胞、単球、組織球、肺胞大食細胞、小膠細胞、マクロファージ等において発現している任意の多特異性レクチン、すなわち、複数の糖に対する結合能を有するレクチンが含まれる。かかるレクチンとしては、限定されずに、例えば、マンノース受容体およびフコース受容体が挙げられる。
本発明の一態様において、フコシル化分子産生細胞は、好ましくは正常細胞以外の細胞である。かかる細胞としては、例えば、上記の腫瘍細胞や炎症部位の細胞が挙げられる。
本発明におけるフコシル化糖脂質は、フコースを糖部分に含む任意の糖脂質を含み、限定されずに、例えば、フコシルGM1などを包含する。糖脂質の糖鎖はI型糖鎖、II型糖鎖、母核糖鎖を包含する種々の構造を有してよい。
投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記薬剤を、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
標的細胞がフコシル化分子産生細胞である場合、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物としては、限定されずに、例えば、フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を含む。ここで、フコシル化分子産生細胞の活性とは、同細胞が示す分泌、取り込み、遊走等の種々の活性を指すが、例えば、腫瘍細胞においては、腫瘍の発症、進行、再発および/または転移、悪液質などの症状の発現や増悪化などに関与する活性を意味する。かかる活性としては、例えば、限定することなく、副甲状腺ホルモン関連タンパク質(PTHrP)や免疫抑制酸性タンパク(IAP)などの産生・分泌が挙げられる。
本明細書において、標識は、それ自体、またはそれが付されたものを直接的または間接的に検出せしめることができる任意の物質を指す。標識は、当業者に公知な任意のもの、例えば、気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、任意の放射性同位体、磁性体、核磁気共鳴する元素(例えば、水素、リン、ナトリウム、フッ素等)、核磁気共鳴する元素の緩和時間に影響を与える物質(例えば、金属原子もしくはこれを含む化合物)、標識化物質に結合する物質(例えば抗体)、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、酵素、ビオチンもしくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体などから選択することができる。
具体的な蛍光標識としては、限定されることなく、例えば、CyTMシリーズ(例えば、CyTM2、3、5、5.5、7など)、DyLightTMシリーズ(例えば、DyLightTM 405、488、549、594、633、649、680、750、800など)、Alexa Fluor(R)シリーズ(例えば、Alexa Fluor(R) 405、488、549、594、633、647、680、750など)、HiLyte FluorTMシリーズ(例えば、HiLyte FluorTM 488、555、647、680、750など)、ATTOシリーズ(例えば、ATTO488、550、633、647N、655、740など)、FAM、FITC、テキサスレッド、GFP、RFP、Qdotなどを用いることができる。in vivoイメージングに適した蛍光標識としては、例えば、生体透過性が高く、自家蛍光の影響を受けにくい波長、例えば、近赤外波長の蛍光を発するものや、蛍光強度の強いものが挙げられる。かかる蛍光標識としては、限定することなく、例えば、CyTMシリーズ、DyLightTMシリーズ、Alexa Fluor(R)シリーズ、HiLyte FluorTMシリーズ、ATTOシリーズ、テキサスレッド、GFP、RFP、Qdotおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
具体的な発光標識としては、限定されることなく、例えば、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン、イクオリンなどを用いることができる。
本発明のこの側面における細網内皮系細胞、多特異性レクチン、第1のリガンド、第2のリガンド、標的化、担体、第1の成分と第2の成分との比率および投与順序については、本発明の組合わせ医薬製剤について上述したとおりである。ただし、本発明の組合わせ医薬組成物が送達する物質は、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物に限られず、投与部位から標的細胞が存在する病変部位へ、生物の体内を物理的に移動できるような大きさのものであれば任意の物質を含む。したがって、本発明の医薬組成物は、原子、分子、化合物、タンパク質、核酸等はもとより、ベクター、ウイルス粒子、細胞、1以上の要素で構成された薬物放出システム、マイクロマシン等の物質をも運搬することができる。前記物質は、好ましくは標的細胞および/またはその周囲に何らかの影響を与える性質を有し、例えば、標的細胞を標識するものや、標的細胞および/またはその周囲に存在する細胞の活性または増殖を制御する(例えば、これを増強または抑制する)ものを含む。
本発明の医薬組成物の一態様において、送達される物質は、本発明の組合わせ医薬製剤について上述した標識および/または標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物である。
本発明のこの側面における細網内皮系細胞、多特異性レクチン、第1のリガンド、第2のリガンド、標的化、第1の成分と第2の成分との比率および投与順序については、本発明の組合わせ医薬製剤について上述したとおりである。ここで、標識剤は、第2のリガンドで標的化された標識のみで構成されても、第2のリガンドで標的化された担体に担持された標識であっても、第2のリガンドで標的化された担体に担持された第2のリガンドで標的化された標識であってもよい。標識については、本発明の組合わせ製剤に関して上記したとおりである。
本発明のこの側面における細網内皮系細胞、多特異性レクチン、第1のリガンド、第2のリガンド、標的化、担体、薬剤、標識剤、標的特異性については、本発明の組合わせ医薬製剤および組合わせ医薬組成物について上述したとおりである。
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
標的細胞に関連する疾患の可能性は、標的細胞に関連する疾患と関連性の高い指標の存在を含み、かかる指標としては、例えば、正常個体より多い標的細胞の数、正常個体より高い標的細胞の活性、正常個体における標的細胞の検出結果と異なる検出結果等が含まれる。
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる製剤または組成物の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、1日多数回(すなわち1日2、3、4回または5回以上)、1日1回、数日毎(すなわち2、3、4、5、6、7日毎など)、1週間に数回(例えば、1週間に2、3、4回など)、1週間毎、数週間毎(すなわち2、3、4週間毎など)であってもよい。この場合、各投与において、本医薬製剤または医薬組成物の第1の成分および第2の成分を両方とも投与することが好ましいが、投与頻度が多い場合、例えば、1日多数回投与する場合には、第1の成分の投与頻度を第2の成分の投与頻度に対して減少させることも可能である。ここで、各投与とは、第2の成分の1回の投与あたり第1の成分を複数回投与する場合には、これら一連の投与を含む。
また、標識をin vitroまたはin vivoで検出することにより、標的細胞の数、分布など、標的細胞に関連する疾患の診断に資する情報を得ることができる。したがって、本発明は、前記標識含有組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、標的細胞に関連する疾患の診断を補助する方法にも関する。同方法は、標的細胞に関連する疾患の診断に資する情報を、医師に提供することをさらに含んでもよい。
ここで標識のシグナル強度は、標識から発せられる種々のシグナル、例えば、蛍光シグナル、発光シグナル、磁性シグナル、放射性シグナルなどの強さまたはこれに類する測定値を意味し、典型的には適切な検出手段で測定される。検出手段の具体例は、すでに上述した。シグナル強度は、対象の全体から得られるものであっても、対象の特定の部位または領域から得られるものであってもよい。また、シグナル強度は、測定する部位の面積または体積に対する平均値であってもよいし、積算値であってもよい。シグナル強度が経時的に変化する場合、本方法におけるシグナル強度は、ある特定の時点のものであってもよいし、ある期間について積算されたものであってもよい。疾患の進行に従って標的細胞の数、活性等が増大する場合、シグナル強度の増大は疾患の存在または進行の指標となり得、逆にシグナル強度の低減は、疾患の改善の指標となり得る。
本発明の方法においては、シグナル強度とシグナル分布とを組み合わせて評価することも可能である。どの位置にどの程度の強度のシグナルが検出されるかを評価することにより、より精確な判定や、より正確な情報の提供を行うことができる。
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる剤の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、1日多数回(すなわち1日2、3、4回または5回以上)、1日1回、数日毎(すなわち2、3、4、5、6、7日毎など)、1週間に数回(例えば、1週間に2、3、4回など)、1週間毎、数週間毎(すなわち2、3、4週間毎など)であってもよい。この場合、各投与において、標的特異性強化剤および第2のリガンドで標的化された担体等を両方とも投与することが好ましいが、投与頻度が多い場合、例えば、1日多数回投与する場合には、標的特異性強化剤の投与頻度を担体等の投与頻度に対して減少させることも可能である。また、担体等の1回の投与に対し、標的特異性強化剤を複数回(2、3、4回または5回以上など)投与してもよく、これらの投与は担体等の投与と同時、および/または投与の前および/もしくは後であってもよい。したがって、例えば、標的特異性強化剤を、担体等の投与前に1回、担体等の投与と同時に1回、さらに担体等の投与後に1回といったタイミングで複数回投与することができる。
また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および/または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、標的細胞に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
本発明の組成物においては、担体に含まれるフコースが標的化分子として機能する態様で存在する限り、担体は、送達物をその内部に含んでも、送達物の外部に付着して存在しても、また、送達物と混合されていてもよい。したがって、投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記組成物を、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
したがって、本発明の組成物は、1または2以上の薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および/または賦形剤を含む医薬組成物とすることができる。薬学的に許容し得る担体、希釈剤等は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。
本発明の実施例に用いた細胞培養方法を以下に示す。膵癌細胞株KP4、PK−59、PK−45H、MIAPaCa2およびPANC−1、胆道癌細胞株HuCCT1、RBE、TGBC24TKB、TGBC14TKB、SSP−25、YSCCC、TKKKおよびHuH−28、胃癌細胞株MKN45、MKN74、NUGC−4およびKATO−IIIは理研バイオリソースセンターより、膵癌細胞株AsPC−1およびBxPC−3、大腸癌細胞株SW1116、COLO205、HT−29およびHCT−15、胃癌細胞株NCI−N87、白血病細胞株HL−60、RPMI8226、KG−1およびMOLT−4はアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)より、大腸癌細胞株LS174Tは東北大学より、大腸癌細胞株LS180はDSファーマより、胃癌細胞株OCUG−1はJCRBより、胃癌細胞株JR−StおよびHSC−39はIBLよりそれぞれ入手した。
各種膵癌細胞株の細胞5×106個を25cm2フラスコに播種し、無血清培地Opti−MEM(R)3mlで48時間培養した。培養上清中のフコシル化糖鎖抗原腫瘍マーカー、CA19−9、Span−1およびDupan−2の濃度はELISA法で検討した。結果を図1(a)に示す。これに基づいて、PK59、AsPC−1をフコシル化糖鎖高産生株、MIAPaCa2、PANC−1をフコシル化糖鎖低産生株とした。
PK59、AsPC−1、MIAPaCa2およびPANC−1の各細胞株につき、1×106個の細胞から全RNAを抽出し、RT−PCRを行った。ランダムヘキサマー(100pM)およびMMLV(GIBCO)を用いて、製造者の説明書に従って全RNA(1μg)を逆転写した。使用したPCRプライマー配列を、表1に示す。
フコシル化糖鎖高産生株AsPC−1と、フコシル化糖鎖低産生株PANC−1におけるフコース(特に記載がない限りL−フコースを指す)の結合を放射性標識フコースを用いて検討した。
12ウェルのカルチャープレートに1×105個の細胞を播種後、1晩培養し、0〜200nMの濃度にBSA−PBSで希釈した14C−フコース(比活性:55mCi/mmol)を細胞に添加し4℃で1時間培養した。冷BSA−PBSで洗浄後、1%TritonX100/PBS−0.25%トリプシンで細胞を可溶化し、細胞膜に結合した14C−フコースの放射活性を測定した(図2および3)。
リポソーム(Lipotrust、10nmol)とL−フコース(0〜20nmol)(SIGMA, MO, USA)を懸濁し、5分間室温で放置した後、マイクロパーティションシステム(Sartorion VIVASPIN 5000MWCO PES)により遊離フコースを除去した。次にFAM標識siRNA(random)(センス鎖:5'-CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG-3'(配列番号19)、アンチセンス鎖:5'-GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU-3'(配列番号20)を加えインキュベーション後、チャンバースライドに播種したAsPC−1細胞に添加し、1時間培養した。培養後、細胞をPBSで洗浄し4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBSで洗浄し、DAPIで対比染色して蛍光顕微鏡下に観察した。その結果、リポソーム:フコースのモル比は1:1が最も高い導入効率であることが判明した(図5および6)。
siRNAの導入が、フコシル化分子産生細胞に存在するフコース特異的な受容体様の結合機構によるものであることを確認するため、過剰のフコース存在下におけるsiRNA導入効率を検討した。リポソーム(Lipotrust、10nmol)とフコース(10nmol)とを懸濁し、5分間室温で放置した後、マイクロパーティションシステム(Sartorion VIVASPIN 5000MWCO PES)により遊離フコースを除去した。次に上記と同じFAM標識siRNA(random)を加えインキュベーション後、チャンバースライドに播種したAsPC−1細胞に添加し、1時間培養した(Liposome+F)。また、リポソーム単独群(Liposome)、リポソーム添加前10分間、1μmol(×100)のフコースを加えプレインキュベーションした群(Liposome+F+CE)も同時に検討した。培養後、細胞をPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBSで洗浄し、DAPIで対比染色して蛍光顕微鏡下に観察した。その結果、フコースの存在によりsiRNAの導入が顕著に抑制された(図7)。すなわち、過剰量のフコースによりsiRNAの導入が阻害されたことから、フコシル化リポソームによるsiRNAの導入は、フコース特異的な受容体様の結合機構を介していることが示唆された。
フコシル化糖鎖高産生株と低産生株におけるフコシル化リポソームによるsiRNA導入効率の検討を行った。前述の方法に従い、フコシル化リポソームを作製し、高産生株(PK59、AsPC−1)と低産生株(MIAPaCa2、PANC−1)におけるFAM−siRNAの導入を蛍光顕微鏡下で観察した。この結果、高産生株においては細胞内に多量のFAMの緑色が認められたのに対し、低産生株における細胞内のFAMの緑色は顕著に少なかった(図8および9)。これは、フコシル化リポソームが、フコシル化糖鎖の産生量依存的に細胞に物質を送達することを示すものである。
FUTが、膵癌細胞株のCA19−9産生の原因遺伝子であることを検証するため、細胞をsiRNAでトランスフェクションし、各種FUT遺伝子の発現を阻害した。siRNAオリゴヌクレオチドは、精製され、アニーリングした二本鎖の形で作製した。ヒトFUT遺伝子を標的とする配列を、表2に示す。
以上の結果から、FUT3およびFUT6が、CA19−9の産生に必要であることが示唆された。
本発明のCy5.5およびシス−ジアミンジクロロ白金(II)(シスプラチン、CDDP)を被包するフコシル化リポソームを以下のようにして調製した。始めに、Dahara, S., Indian J. Chem. 1970;7:193−194の方法に従って、CDDP3の合成を行った。テトラクロロ白金(II)酸カリウム(4.15g、10mmol)を蒸留水に溶解した後、ヨウ化カリウム(6.64g、40mmol)を加え、窒素雰囲気下および光遮蔽下において5分間氷上で攪拌した。次いで、アンモニア水溶液(28%、1.35mL)を反応液に加え、3時間氷上で攪拌した。形成した黄色結晶は、蒸留水およびエタノールで洗浄し、減圧下で10時間、40℃で乾燥した。この段階で、4.49gのCDDP2(cis-diamminediiodoplatinum(II))が得られた。CDDP2(2.41g、5mmol)を蒸留水に懸濁した後、硝酸銀(1.68g、9.9mmol)を加え、光遮蔽下で24時間氷上で攪拌した。ヨウ化銀を取り除くために反応液を濾紙に通した後、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、白色結晶が得られた。結晶は、氷冷の蒸留水およびエタノールで洗浄した後、減圧下で10時間、40℃で乾燥した。CDDP3の最終産生量は、1.0gであった。
図12(a)に示すように、25(F25)、50(F50)、100(F100)μg/mLの終濃度となるように、改変したコール酸透析法によって調製したリポソームに、DTSSPを介してアミノ化フコースを架橋した。さらに、リポソーム表面を親水性化するため、BS3およびTrisを結合した。リポソーム表面の親水性化は、肝臓および脾臓の細網内皮系、マクロファージおよび血管内皮細胞への取り込みを防止することができ、さらに血漿中のオプソニンタンパク質の吸着も防いで、リポソームが血流中で長く維持されるようになる。図12(b)に示す電子顕微鏡観察結果から、ほぼすべてのフコシル化リポソームが球状であり、Cy5.5を被包するリポソームは約80nmの大きさであった。
フコシル化リポソームの特異的送達を調べるため、Cy5.5を被包するフコシル化リポソームを、CA19−9産生または非産生の膵臓腺癌細胞にトランスフェクトした。AsPC−1細胞をCy5.5内包フコシル化リポソームとともに2時間インキュベートした後、リン酸緩衝食塩水で2回洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した(図14)。CA19−9を多く分泌するAsCP−1細胞において、フコシル化リポソーム(F0)ではなく、フコシル化リポソーム(F50)が、Cy5.5を効率よく導入した。
CDDPを被包するフコシル化リポソームの生理化学的特徴を、表4に示す。CDDPを被包するフコシル化リポソームの粒子サイズは、約200nmで、CDDPの終濃度は約2mg/mLと推定された。
式(1):脂質濃度(mg/mL)=コレステロール濃度(mg/mL)×4.5
式(2)において、Aは白金濃度を示し、300はCDDPの分子量、および195は白金の分子量を示す。
式(3):被包効率(%)=(リポソーム中のCDDP量/CDDP初期量)×100
式(4):CDDPと脂質との重量比=CDDP濃度(mg/mL)/脂質濃度(mg/mL)
WST−1アッセイによって、CDDPを被包するフコシル化リポソームの細胞毒性効果を調べた結果を図16に示す。2×104の各種細胞株(AsPC−1など)を24ウェルのプレートにそれぞれ移し、10%のウシ胎仔血清、5%のL−グルタミン、および1%の抗生物質を添加したRPMI−1640で1日培養した。その後、様々な投与量で、CDDPを被包するフコシル化リポソームまたはCDDPを被包するリポソームとともに、細胞をインキュベートした。2時間のインキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄し、最後に血清および抗生物質を含むRPMI−1640で懸濁した。72時間培養後、WST−1試薬を添加し、増殖アッセイをSato , Y. Nat Biotechnol. 2008;26(4):431-42の方法で行った。実験は3連で最低2回繰り返した。
皮下モデルの作製では、AsPC−1細胞(2×106個)をマウス(4週〜6週齢)の背側に播種した。注射後0〜4日目までバイオルミネセンスを測定し、処理を開始する前に、マウスを無作為に複数の集団に分けた。in vivo光学イメージングは、Xenogen-IVIS-cooled CCD optical system(Xenogen-IVIS)を用いて行った。結合(フコシル化リポソーム中のCDDPなど)または遊離のCDDPは、各投与につき2mg/kgの用量であった。注射は、第1週目に2回、そして2および3週目に2回行った。使用したマウスはすべて、最後に注射した日の翌日、バイオルミネセンスの最終測定の前に屠殺した。
膵癌モデルマウスにおけるフコシル化リポソームの送達を調べたところ、フコシル化リポソームに被包したCy5.5は、肝臓に蓄積し、Cy5.5の腫瘍病変部への蓄積が減少していることが観察された。本発明者らは、このフコシル化リポソームの肝臓への捕捉は、非実質細胞に存在するレクチンが原因であると予測した。
膵癌モデルマウス(AsPC−1)におけるCDDP、CDDPを被包するリポソーム(F0)、およびCDDPを被包するリポソーム(F50)による腫瘍増殖抑制効果を比較した(図11)。CDDP(2mg/kg)、CDDPを被包するリポソーム(F0)(2mg/kg CDDP)またはCDDPを被包するリポソーム(F50)(2mg/kg CDDP)の溶液を、マウスの尾静脈から1週間に2回注射した。マンノース処理はリポソームの投与1時間前、投与と同時および投与1日後に行った。移植から4、8、11、15、18および22日後、腫瘍の容積をそれぞれ測定した。その結果、CDDPを被包するフコシル化リポソームは、腫瘍の増殖をほぼ完全に阻害した(図20)。
また、表5に示すように、マンノースまたはCDDPを被包するフコシル化リポソームの投与は、悪影響を及ぼさないことが示された。
各種大腸癌細胞株の細胞5×106個を25cm2フラスコに播種し、無血清培地Opti−MEM(R)3mlで48時間培養した。培養上清中のCA19−9の濃度はELISA法で検討した。結果を図22および表6に示す。
フコシル化リポソームの特異的送達を調べるため、まず、蛍光顕微鏡法でCy5.5の細胞内導入を確認した。1×105個のCOLO205細胞をチャンバースライドに播種し、実施例8で得たCy5.5内包フコシル化リポソームとともに2時間インキュベートした後、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBSで洗浄し、DAPIで対比染色してから蛍光顕微鏡で可視化した(図23)。フコースを含まないリポソーム(F0)では、細胞内にCy5.5の赤い蛍光がほとんど見られないが、フコシル化リポソーム(F25、F50およびF100)により、Cy5.5が効率よく導入されたことが分かる。
WST−1アッセイによって、CDDPを被包するフコシル化リポソームの細胞毒性効果を調べた。2×104個の各種細胞を96ウェルカルチャーフラスコに播種し、CDDPを被包する、フコシル化されていない(F0)、または、種々の程度にフコシル化された(F50、F100)リポソームとともに、細胞をインキュベートした。2時間のインキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、培養液(COLO205は10%FBS添加RPMI1640培地、HT−29は10%FBS添加McCoy’s 5A培地)に置換後、さらに72時間培養してから実施例12と同様にWST−1試薬でのアッセイを行い、生細胞数を計測した。図25に示す結果から、CA19−9高産生株では低産生株に比し、CDDP内包フコシル化リポソームによる高い殺細胞効果を認めた。
また、別の実験では、同様の条件の下で、種々の濃度のCDDP内包フコシル化リポソーム(F100)またはCDDP内包非フコシル化リポソーム(F0)とともに細胞をインキュベートし、同様に生細胞数を計測した(図26)。この結果、CDDP内包フコシル化リポソームが用量依存的に殺細胞効果を示すことが明らかとなった。
ヌードマウス(5週齢、三共ラボサービス)の背部皮下2箇所にLS180細胞1×106個をそれぞれ移植した。腫瘍径が5mmに達した後(移植後約2週間)、Cy5.5内包フコシル化リポソーム(F100)50μlを尾静脈より注射した(Cy5.5:0.3μg、フコース1μg相当)。マンノース処理群(F100+M)では、PBSに溶解したD−マンノース(SIGMA)5mg/100μlを、リポソーム投与1時間前に腹腔内投与し、さらに、リポソーム投与時に尾静脈より投与した(合計10mg/200μl)。各投与におけるマンノースは、フコースの5000倍の過剰量であった。リポソーム投与後2日目、5日目および14日目に、Cy5.5の集積をIn vivo image analyzer(IVIS(R) Lumina、Caliper Life Sciences)で観察した。Cy5.5の肝臓への集積結果を図27に、腫瘍への集積結果を図28にそれぞれ示す。この結果、フコシル化リポソームとマンノースとを併用した場合に、肝臓におけるCy5.5の集積が少なく(図27)、逆に、腫瘍への集積が極めて多くなること(図28)が明らかとなった。
ヌードマウス(5週齢、三共ラボサービス)の背部皮下2箇所にLS180細胞1×106個をそれぞれ移植した。腫瘍径が5mmに達した後(移植後約2週間)、マウスを、未処理群(NT)、CDDP単独群(CDDP)、CDDP内包非フコシル化リポソーム群(F0−CDDP)、CDDP内包非フコシル化リポソーム群(F50−CDDPおよびF100−CDDP)の5群に分け(各群6匹)、未処理群を除き、CDDP2mg/kg相当の量の各処置剤を100μl、週2回尾静脈注射した。また、マンノース処理は、PBSに溶解したD−マンノース(SIGMA)5mg/100μlを、各処置剤の投与1時間前に腹腔内投与し、さらに、各処置剤の投与時に尾静脈より投与した(合計10mg/200μl)。処置開始後4、8、11、15、18および22日目の腫瘍径を計測した。図29に示す結果から、CDDP内包非フコシル化リポソームを投与したF100−CDDP群の腫瘍体積が、未処理群、CDDP単独群およびCDDP内包非フコシル化リポソーム群の腫瘍体積に比べ有意に減少したことが明らかとなった。
各種胆道癌細胞株の細胞5×106個を25cm2フラスコに播種し、無血清培地Opti−MEM(R)3mlで48時間培養した。培養上清中のCA19−9の濃度はELISA法で検討した。結果を図30に示す。これに基づいて、以下の検討には高産生株であるHuCCT1を用いた。
フコシル化リポソームの特異的送達を調べるため、フローサイトメトリー法でCy5.5の細胞内導入を確認した。1×106個のHuCCT1細胞を6ウェルカルチャーフラスコに播種し、実施例8で得たCy5.5内包フコシル化リポソームを添加し2時間培養した。培養後、細胞をPBSで洗浄し、細胞懸濁液を作製、FACSCaliburTMフローサイトメーター(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)にてCy5.5陽性細胞を検出した(図31)。この結果、フコシル化リポソーム(F50)により、非フコシル化リポソーム(F0)よりも、Cy5.5が効率よく導入されたことが分かる。また、過剰のフコースが効率的導入を阻害したことは(図中、F50+Fuc)、フコシル化リポソームによるCy5.5の導入が、フコース受容体依存的であることを示すものである。
各種胃癌細胞株の細胞5×106個を25cm2フラスコに播種し、無血清培地Opti−MEM(R)3mlで48時間培養した。培養上清中のCA19−9の濃度はELISA法で検討した。結果を表7に示す。
フコシル化リポソームの特異的送達を調べるため、フローサイトメトリー法および蛍光顕微鏡法でCy5.5の細胞内導入を確認した。
フローサイトメトリー法においては、1×106個の各種細胞を6ウェルカルチャーフラスコに播種し、実施例8で得たCy5.5内包フコシル化リポソームを添加し1時間インキュベートした。インキュベート後、細胞をPBSで洗浄し、細胞懸濁液を作製、FACSCaliburTMフローサイトメーター(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)にてCy5.5陽性細胞を検出した。図32および33の左側のチャートに示す結果から、高産生株のJR−St細胞では、非フコシル化リポソーム(F0)に比べ、フコシル化リポソーム(F50およびF100)によってCy5.5が効率よく導入されたが、低産生株のMKN45細胞では、フコシル化リポソーム(F50およびF100)によっても、Cy5.5の導入は、非フコシル化リポソーム(F0)と同程度の低いレベルに止まることが分かる。また、過剰のフコースがJR−St細胞におけるフコシル化リポソームによるCy5.5の効率的導入を阻害したことは(図中、F100+Fuc)、フコシル化リポソームによるCy5.5の導入が、フコース受容体依存的であることを示すものである。
WST−1アッセイによって、CDDPを被包するフコシル化リポソームの細胞毒性効果を調べた。2×104個の各種細胞を96ウェルカルチャーフラスコに播種し、CDDPを被包する、フコシル化されていない(F0)、または、種々の程度にフコシル化されたリポソーム(F25、F50またはF100)とともに、細胞をインキュベートした。1時間のインキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、培養液(10%FBS添加RPMI1640培地)に置換後、さらに72時間培養してから実施例12と同様にWST−1試薬でのアッセイを行い、生細胞数を計測した。図34および35の左側のグラフに示す結果が示すとおり、CA19−9高産生株(JR−St)では低産生株(MKN45)に比し、CDDP内包フコシル化リポソームによる高い殺細胞効果を認めた。
また、別の実験では、同様の条件の下で、種々の濃度(0、0.1、1、10または100μM)のCDDP内包フコシル化リポソーム(F100)またはCDDP内包非フコシル化リポソーム(F0)とともに細胞をインキュベートし、同様に生細胞数を計測した(図34および35の右側のグラフ)。この結果、CA19−9高産生株において、CDDP内包フコシル化リポソームが用量依存的に殺細胞効果を示すことが明らかとなった。
各種白血病細胞株の細胞1×106個を0.1%BSA/PBSで洗浄後、1mlのPBS中の10μlの抗体(PE結合CD33抗体(R&D)およびFITC結合Notch−1抗体(R&D))で10分間反応させて標識し、PBSで細胞を洗浄して細胞懸濁液を作製した。これをFACSCaliburTMフローサイトメーター(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)に供して陽性細胞を検出し、CellQuest Pro software(BD Biosciences)で解析した。図36に示す結果から明らかなとおり、HL−60、KG−1およびRPMI8226の各細胞においてCD33およびNotch−1がともに発現しており、HL−60細胞においてNotch−1の発現率が特に高かったが、MOLT−4ではCD33もNotch−1も殆ど発現していなかった。
各白血病細胞株につき、1×106個の細胞から全RNAを抽出し、RT−PCRを行った。ランダムヘキサマー(100pM)およびMMLV(GIBCO)を用いて、製造者の説明書に従って全RNA(1μg)を逆転写した。各フコシルトランスフェラーゼのプライマーを下表に示す。
PCR産物を1.2%アガロースゲルで泳動後、発現をUV下で観察した。図37に示す結果から、Notch−1のフコシル化に関与するとされるPOFUT1が、Notch−1陽性のHL−60、KG−1およびRPMI8226の各細胞において発現している一方、Notch−1陰性のMOLT−4ではほとんど発現していないことが分かる。これに基づいて、以下の検討では、Notch−1発現株としてHL−60を、Notch−1非発現株としてMOLT−4をそれぞれ用いた。
フコシル化リポソームの特異的送達を調べるため、フローサイトメトリー法および蛍光顕微鏡法で蛍光標識の細胞内導入を確認した。
フローサイトメトリー法においては、1×106個の各種細胞を6ウェルカルチャーフラスコに播種し、実施例8で得たCy5.5内包フコシル化リポソーム(HL−60細胞)または実施例8と同様にして得たFAM内包フコシル化リポソーム(MOLT−4細胞)を添加し2時間インキュベートした。インキュベート後、細胞をPBSで洗浄し、細胞懸濁液を作製、FACSCaliburTMフローサイトメーター(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)にて蛍光標識陽性細胞を検出した。図38に示す結果から、Notch−1発現株のHL−60細胞では、非フコシル化リポソーム(F0)に比べ、フコシル化リポソーム(F25およびF50)によって蛍光標識が効率よく導入されたが、Notch−1非発現株のMOLT−4細胞では、フコシル化リポソームによっても、蛍光標識の導入は、非フコシル化リポソームと同程度の低いレベルに止まることが分かる。
WST−1アッセイによって、ドキソルビシンを被包するフコシル化リポソームの細胞毒性効果を調べた。ドキソルビシン内包フコシル化リポソームは、実施例8と同様の手法で作製した。2×104個の各種細胞を96ウェルカルチャーフラスコに播種し、種々の濃度のドキソルビシン内包フコシル化リポソーム(F−DOX)またはドキソルビシン単独(DOX)とともに、細胞をインキュベートした。2時間のインキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、培養液(10%FBS添加RPMI1640培地)に置換後、さらに72時間培養してから実施例12と同様にWST−1試薬でのアッセイを行い、生細胞数を計測した。図40に示すとおり、Notch−1発現株(HL−60)では、ドキソルビシン内包フコシル化リポソーム(F−DOX)が、ドキソルビシン単独(DOX)に比べ顕著な用量依存的な殺細胞効果を示した。これに対し、Notch−1非発現株(MOLT−4)では、このような用量依存的な殺細胞効果は認められなかった。
白血病患者検体は患者本人の同意のもと末梢血を採取し、Ficoll-Hypaqueにて単核球を分離し使用前まで液体窒素内で保存した。検体を採取した患者の内訳は下表9に示すとおりである。
WST−1アッセイによって、ドキソルビシンを被包するフコシル化リポソームの細胞毒性効果を調べた。2×104個の各種細胞を96ウェルカルチャーフラスコに播種し、0.1μMまたは1.0μMのドキソルビシン単独(DOX)、ドキソルビシン内包フコシル化(F25)または非フコシル化リポソーム(F0)とともに、細胞をインキュベートした。2時間のインキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、培養液(10%FBS添加RPMI1640培地)に置換後、さらに72時間培養してから実施例12と同様にWST−1試薬でのアッセイを行い、生細胞数を計測した。図42に示すとおり、Notch−1発現検体(Case1および2)では、ドキソルビシン内包フコシル化リポソームが、ドキソルビシン単独およびドキソルビシン内包非フコシル化リポソームに比べ顕著な殺細胞効果を示した。これに対し、Notch−1非発現検体(Case4)では、このような顕著な殺細胞効果は認められなかった。
Claims (14)
- マンノースまたは末端にマンノースを有する化合物を含む、細網内皮系細胞における多特異性レクチンをブロックするための第1の成分と、フコースまたはこれを末端に含む分子で標的化された抗腫瘍剤を含む第2の成分とを含む、フコシル化分子を正常細胞の2倍以上産生する腫瘍細胞に起因する腫瘍性疾患を処置するための組合わせ医薬製剤。
- 第1の成分と第2の成分とが、同時投与および/または逐次投与される、請求項1に記載の医薬製剤。
- 腫瘍性疾患が、フコシル化腫瘍マーカー陽性である、請求項1または2に記載の医薬製剤。
- 腫瘍性疾患が、固形腫瘍および白血病からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の医薬製剤。
- マンノースまたは末端にマンノースを有する化合物を含む、細網内皮系細胞における多特異性レクチンをブロックするための第1の成分と、フコースまたはこれを末端に含む分子で標的化された担体を含む第2の成分とを含む、標的細胞特異的に物質を送達するための組合わせ医薬組成物であって、標的細胞がフコシル化分子を正常細胞の2倍以上産生する腫瘍細胞である、前記医薬組成物。
- 物質が、標識または抗腫瘍剤である、請求項5に記載の医薬組成物。
- 標識が、気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、放射性同位体、磁性体、核磁気共鳴する元素、核磁気共鳴する元素の緩和時間に影響を与える物質、標識化物質に結合する物質、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、酵素、ビオチンもしくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体、または、これらの1または2以上を含む物質からなる群から選択される、請求項6に記載の医薬組成物。
- マンノースまたは末端にマンノースを有する化合物を含む、細網内皮系細胞における多特異性レクチンをブロックするための第1の成分と、フコースまたはこれを末端に含む分子で標的化された標識剤を含む第2の成分とを含む、フコシル化分子を正常細胞の2倍以上産生する腫瘍細胞またはこれを含む組織を標識するための組合わせ医薬組成物。
- 標識剤が、気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、放射性同位体、磁性体、核磁気共鳴する元素、核磁気共鳴する元素の緩和時間に影響を与える物質、標識化物質に結合する物質、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、酵素、ビオチンもしくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体、または、これらの1または2以上を含む物質からなる群から選択される標識を含む、請求項8に記載の医薬組成物。
- フコシル化分子を正常細胞の2倍以上産生する腫瘍細胞の存在部位を決定するための、請求項8または9に記載の医薬組成物。
- マンノースまたは末端にマンノースを有する化合物と、フコースまたはこれを末端に含む分子で標的化された抗腫瘍剤とを、単独でまたは組み合わせて含む1または2以上の容器を含む、フコシル化分子を正常細胞の2倍以上産生する腫瘍細胞に起因する腫瘍性疾患を処置するためのキット。
- 腫瘍性疾患が、フコシル化腫瘍マーカー陽性である、請求項11に記載のキット。
- 腫瘍性疾患が、固形腫瘍および白血病からなる群から選択される、請求項11または12に記載のキット。
- マンノースまたは末端にマンノースを有する化合物を含む、フコースまたはこれを末端に含む分子で標的化された担体、薬剤または標識剤の、フコシル化分子を正常細胞の2倍以上産生する腫瘍細胞に対する、標的特異性強化剤。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61158932A (ja) * | 1984-10-22 | 1986-07-18 | ネクスター・フアーマシユーテイカルズ・インコーポレイテツド | 体内腫瘍の目標攻撃、診断または治療用ミセル粒子組成物 |
JPS6366123A (ja) * | 1986-08-21 | 1988-03-24 | ベスタ−・インコ−ポレイテツド | 微小単層小胞に封入されたポリエン抗真菌抗生物質を含む組成物及びその製造方法 |
JPH01221400A (ja) * | 1987-09-14 | 1989-09-04 | Center For Molecular Medicine & Immunolog | クリアランスを向上させた修飾抗体 |
JP2010235564A (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Junji Kato | フコシル化糖鎖産生細胞用物質送達担体 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5435989A (en) | 1982-03-30 | 1995-07-25 | Vestar, Inc. | Method of targeting a specific location in a body |
US5043107A (en) | 1986-08-21 | 1991-08-27 | Vestar Research, Inc. | Preparation small unilamellar vesicles including polyene antifungal antibiotics |
US5196183A (en) | 1991-12-04 | 1993-03-23 | Sterling Winthrop Inc. | Contrast agents for ultrasound imaging |
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US20060193906A1 (en) * | 2002-01-30 | 2006-08-31 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Sugar-modified liposome and products comprising the liposome |
KR101076053B1 (ko) | 2003-02-04 | 2011-10-21 | 브라코 인터내셔날 비.브이. | 초음파 조영제 및 그것의 제조방법 |
JPWO2005011633A1 (ja) * | 2003-08-01 | 2006-09-14 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 標的指向性リポソームを含む炎症性疾患治療薬または診断薬 |
US20070292494A1 (en) * | 2004-03-19 | 2007-12-20 | Let There Be Hope Medical Research Institute | Carbohydrate-Derivatized Liposomes for Targeting Cellular Carbohydrate Recognition Domains of Ctl/Ctld Lectins, and Intracellular Delivery of Therapeutically Active Compounds |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61158932A (ja) * | 1984-10-22 | 1986-07-18 | ネクスター・フアーマシユーテイカルズ・インコーポレイテツド | 体内腫瘍の目標攻撃、診断または治療用ミセル粒子組成物 |
JPS6366123A (ja) * | 1986-08-21 | 1988-03-24 | ベスタ−・インコ−ポレイテツド | 微小単層小胞に封入されたポリエン抗真菌抗生物質を含む組成物及びその製造方法 |
JPH01221400A (ja) * | 1987-09-14 | 1989-09-04 | Center For Molecular Medicine & Immunolog | クリアランスを向上させた修飾抗体 |
JP2010235564A (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Junji Kato | フコシル化糖鎖産生細胞用物質送達担体 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6015037618; Advanced Drug Delivery Reviews, 1994, Vol.14, pp.89-111 * |
JPN6015037619; Journal of Controlled Release, 1991, Vol.16, pp.91-100 * |
JPN6015037620; Annals of the New York Academy of Sciences, 1987, Vol.507 , No.1,pp.337-338 * |
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