JPWO2007091661A1 - 分子イメージングに適した糖鎖修飾リポソームならびにその利用および製造 - Google Patents
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Abstract
Description
糖鎖修飾リポソームであって、該糖鎖修飾リポソームは、
リポソームと
糖鎖基と
リンカータンパク質基と
親水性化合物基とを含み、
該リンカータンパク質基は該リポソームの外表面に結合し、該リンカータンパク質基の少なくとも一部に該糖鎖基が結合し、該リポソームの外表面または該リンカータンパク質基の一部に該親水性化合物基が結合している、糖鎖修飾リポソーム。
(項目2)
前記糖鎖修飾リポソームは、構造Iと構造IIとを含み、
該構造Iは、
X−CH2−NH−R1−NH−C(=O)−R2−C(=O)−NH−R3で表され、
Xは、前記リポソームに含まれる前記リンカータンパク質とCH2−NH結合可能な官能基aを含む構成単位から、該官能基aがとれた基であり、
R1は、前記リンカータンパク質基であり、
R2は、リンカータンパク質架橋基であり、
R3は、前記糖鎖基であり;および
該構造IIは、
Y−NH−C(=O)−R4−C(=O)−NH−R5で表され、
Yは、前記リポソームに含まれる親水性化合物架橋基とペプチド結合可能な官能基bを含む構成単位から該官能基bがとれた基であり、
R4は、該親水性化合物架橋基であり、
R5は、前記親水性化合物基である、項目1に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目3)
前記リポソームが蛍光性を有する、項目1に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目4)
前記蛍光性が、前記リポソームと適合性の蛍光色素によって付与される、項目3に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目5)
前記蛍光色素が、
cy5、cy7、cy3B、cy3.5、Alexa Fluor350、Alexa Fluor488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor750およびフルオレセイン−4−イソチオシアネート(FITC)ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目4に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目6)
前記蛍光色素が、
である、項目5に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目7)
前記蛍光色素が、リポソームに内包されている、項目4に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目8)
前記R1が、哺乳動物由来タンパク質基である、項目2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目9)
前記R1が、ヒト由来タンパク質基である、項目8に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目10)
前記R1が、ヒト由来血清タンパク質基である、項目9に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目11)
前記R1が、血清アルブミン基である項目8に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目12)
前記R2が、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基、ビススルホスクシンイミジルスベレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスベレート基、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート基からなる群より選択される、項目2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目13)
前記R2が、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基である、項目12に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目14)
前記R3が、シアリルルイスX基、N−アセチルラクトサミン基、α1−6マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目15)
前記R3が、シアリルルイスX基であり、該シアリルルイスX基が、0.0001mg糖鎖/mg脂質〜500mg糖鎖/mg脂質の範囲の修飾結合密度で含まれる、項目14に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目16)
前記R3が、N−アセチルラクトサミン基であり、該N−アセチルラクトサミン基が、0.0001mg糖鎖/mg脂質〜500mg糖鎖/mg脂質の範囲の修飾結合密度で含まれる、項目14に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目17)
前記R3が、α1−6マンノビオース基であり、該α1−6マンノビオース基が、0.0001mg糖鎖/mg脂質〜500mg糖鎖/mg脂質の範囲の修飾結合密度で含まれる、項目14に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目18)
前記R4が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスベレート基、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート基から選択される、項目2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目19)
前記R4が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート基である、項目18に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目20)
前記R5が、トリス(ヒドロキシアルキル)アルキルアミノ基である、項目2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目21)
前記トリス(ヒドロキシアルキル)アルキルアミノ基が、ヒドロキシアルキルがC1〜C6ヒドロキシアルキルであり、アルキルアミノがC1〜C6アルキルアミノである、項目20に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目22)
前記トリス(ヒドロキシアルキル)アルキルアミノ基が、トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ基である、項目21に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目23)
前記官能基aが、−CH2−C(=O)−CH2−基を有する、項目2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目24)
前記Xが、ガングリオシドである、項目23に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目25)
前記官能基bが、アミノ基である、項目2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目26)
前記Yが、ホスファチジルエタノールアミンである、項目25に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目27)
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含む、項目1に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目28)
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、35:40:15:5:5:167のモル比で含む、項目27に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目29)
前記R2が、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基であり、かつ
前記R3が、シアリルルイスX基、N−アセチルラクトサミン基、α1−6マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目30)
前記R3が、シアリルルイスX基、N−アセチルラクトサミン基、α1−6マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
前記R4が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート基である、項目2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目31)
前記R2が、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基であり、
前記R3が、シアリルルイスX基、N−アセチルラクトサミン基、α1−6マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
前記R4が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート基である、項目2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目32)
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含み、
前記R2が、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基であり、
前記R3が、シアリルルイスX基、N−アセチルラクトサミン基、α1−6マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
前記R4が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート基である、項目2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目33)
前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含み、
前記R1が血清アルブミン基であり、
前記R2が、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基であり、
前記R3が、シアリルルイスX基、N−アセチルラクトサミン基、α1−6マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、
前記R4が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート基であり、かつ
前記R5が、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン基である、項目2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目34)
前記糖鎖修飾リポソームが、
によって標識されている、項目33に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目35)
前記リポソームにおいて、脂質に対するタンパク質の割合が、約0.1から約0.5である、項目1に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目36)
前記糖鎖修飾リポソームが、該リポソームの粒度分布の最大域において、約80nm〜約165nmの粒子径を有する、項目1に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目37)
前記糖鎖修飾リポソームが、約50nm〜約300nmの平均粒子径を有する、項目1に記載の糖鎖修飾リポソーム。
(項目38)
項目1〜37のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソームを含む、イメージング剤。
(項目39)
項目1〜37のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソームと送達が所望される物質とを含む、該物質を所望の部位に送達するための組成物。
(項目40)
前記所望される物質が、診断薬または研究試薬である、項目39に記載の組成物。
(項目41)
前記診断薬が、DNAプローブ診断薬、腫瘍診断薬、血液学的検査用試薬および微生物検査用試薬からなる群より選択される、項目40に記載の組成物。
(項目42)
分子イメージングまたはインビボイメージングにおいて使用するための、項目39に記載の組成物。
(項目43)
前記物質が該生物学的因子を含む、項目39に記載の組成物。
(項目44)
項目1〜37のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソームと医薬活性成分をさらに含む、薬学的組成物。
(項目45)
前記医薬活性成分が、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓もしくは心臓における疾患を処置するための薬剤、または炎症もしくは腫瘍を処置するための薬剤である、項目44に記載の薬学的組成物。
(項目46)
所望の部位を標識するための組成物の製造のための、項目1〜37のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソームの使用。
(項目47)
前記所望の部位が、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓、心臓、炎症部位および腫瘍部位からなる群より選択される、項目46に記載の使用。
(項目48)
所望の部位を標識するための方法であって、
該被験体に、該所望の部位を標識するための組成物を投与する工程を包含し、該組成物は項目1〜37のいずれか1項に記載の糖鎖修飾リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含み、該所望の部位が、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓、心臓、炎症部位および腫瘍部位からなる群より選択される、方法。
(項目49)
糖鎖修飾リポソームを製造する方法であって、該方法は、以下:
(a)脂質を、メタノール/クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程;
(b)該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理する工程;
(c)該超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合して、蛍光標識されたリポソームを提供する工程;
(d)該リポソームをトリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカンにより親水性化処理する工程;
(e)該親水性化処理されたリポソームにリンカータンパク質を結合させて、リンカータンパク質結合リポソームを生成する工程;および
(f)該リポソームに、糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する工程
を包含する、方法。
(項目50)
前記(c)工程の蛍光標識溶液が、
を含む、項目49に記載の糖鎖修飾リポソームを製造する方法。
(項目51)
前記(e)工程のリンカータンパク質が、ヒト血清アルブミンである、項目49に記載の方法。
(項目52)
目的の送達部位に薬物を送達するための糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、該方法は、以下:
(a)種々の糖鎖密度を有する、該目的の送達部位への送達を達成する蛍光標識された糖鎖修飾リポソームを提供する工程であって、以下:
(i)脂質を、メタノール/クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程;
(ii)該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理する工程;
(iii)該超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合する工程を包含する、工程;
(b)該糖鎖修飾リポソーム上の糖鎖密度について、該送達部位への最適な送達を達成する密度を決定する工程;および
(c)該薬物を決定された最適な糖鎖修飾リポソームに組み込んで薬物含有リポソームを生成する工程
を包含する、方法。
(項目53)
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、
A)蛍光色素をリポソームに内包したか、または結合させたリポソームを形成させる工程;
B)該リポソームを親水性化処理する工程;
C)該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程、および
D)該リポソームへ糖鎖を結合させる工程
を包含する、方法。
(項目54)
前記D)工程に引き続きフィルター濾過をする工程を包含する、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記A)工程が、
(A1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、35:40:15:5:5:167のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム(1:1)溶液に懸濁させる工程;
(A2)該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥させ、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程;
(A3)該再懸濁液を30℃〜40℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程;
(A4)(A3)工程において超音波処理した溶液に、前記蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量10,000で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程、
を包含する、項目53または54に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法。
(項目56)
前記(A4)工程における前記蛍光色素溶液が、蛍光色素で標識された蛍光色素標識タンパク質を含む溶液であり、以下:
(1)蛍光標識が結合し得るタンパク質/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液に蛍光色素/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を混合して、室温〜約37℃で撹拌する工程;および
(2)(1)工程の混合溶液を、分画分子量10,000で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程、
を包含する工程により調製される、項目55に記載の方法。
(項目57)
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、
前記B)工程が、以下:
(B1)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程;
(B2)該(B1)工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去する工程;
(B3)該(B2)工程において、該遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去した溶液に、330mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程;
を包含する、項目53〜56のいずれか1項に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法。
(項目58)
前記B)工程が、以下:
(B1’)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g、60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程;
(B2’)該(B1’)工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量100,000、2000×g、60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去する工程;
(B3’)該(B2’)工程において、該遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去した溶液に、330mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程;
を包含する、項目53〜57に記載の製造方法。
(項目59)
前記C)工程が、以下:
(C1)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2)(C1)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3)(C2)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;
(C4)さらに、該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該シアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程
を包含する、項目53〜58に記載の製造方法。
(項目60)
前記C)工程が、以下:
(C1)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2)(C1)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3)(C2)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;
(C4)さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程
を包含する、項目53〜59に記載の製造方法。
(項目61)
前記C)工程が、以下:
(C1’)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2’)(C1’)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3’)(C2’)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;
(C4’)さらに、該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程
を包含する、項目53〜59に記載の製造方法。
(項目62)
前記C)工程が、以下:
(C1’)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2’)(C1’)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3’)(C2’)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;
(C4’)さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程
を包含する、項目53〜59に記載の製造方法。
(項目63)
前記D)工程が、以下:
(D1)前記糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で室温〜約37℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程;
(D2)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去する工程;および
(D3)(D2)工程において、該遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)を添加し、冷蔵〜37℃で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去する工程;
(D4)(D3)工程において、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、HEPES緩衝液(pH7.2)に交換する工程、
を包含する、項目53〜62に記載の製造方法。
(項目64)
前記D)工程に引き続き前記糖鎖が結合したリポソームを親水性化する工程を包含する、項目53〜63に記載の製造方法。
(項目65)
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、該製造方法が、
A)蛍光色素をリポソームに内包させたリポソームを形成させる工程;
B)該リポソームを親水性化処理する工程;
C)該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程;
D)該リポソームへ糖鎖を結合させる工程;
E)該糖鎖が結合したリポソームを親水性化する工程;ならびに
F)該親水性化したリポソームを含む溶液をフィルター濾過する工程
を包含する、製造方法。
(項目66)
前記A)工程が、以下:
(A1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、35:40:15:5:5:167のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム(1:1)溶液に懸濁させる工程;
(A2)該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥させ、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程;
(A3)該再懸濁液を30〜40℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程;および
(A4)(A3)工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量10,000で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液に蛍光色素/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を混合して、37℃で撹拌し、分画分子量10,000で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記B)工程が、以下:
(B1)該蛍光色素を内包したか、または結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程;
(B2)該(B1)工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去する工程;および
(B3)該(B2)工程において、該遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去した溶液に、330mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記C)工程が、以下:
(C1)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵下で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2)(C1)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3)(C2)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;および
(C4)該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該シアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程を包含し、
前記D)工程が、以下:
(D1)該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約37℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程;
(D2)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去する工程;および
(D3)(D2)工程において、該遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)を添加し、冷蔵〜37℃で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去する工程;および
(D4)(D3)工程において、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、HEPES緩衝液(pH7.2)に交換する工程を包含する、
項目65に記載の製造方法。
(項目67)
前記A)工程が、以下:
(A1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、35:40:15:5:5:167のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム(1:1)溶液に懸濁させる工程;
(A2)該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥させ、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程;
(A3)該再懸濁液を30〜40℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程;および
(A4)(A3)工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量10,000で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液に蛍光色素/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を混合して、37℃で撹拌し、分画分子量10,000で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記B)工程が、以下:
(B1)該蛍光色素を内包したか、または結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程;
(B2)該(B1)工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去する工程;および
(B3)該(B2)工程において、該遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去した溶液に、330mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記C)工程が、以下:
(C1)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵下で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2)(C1)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3)(C2)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;および
(C4)さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程を包含し、
前記D)工程が、以下:
(D1)該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約37℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程;
(D2)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去する工程;および
(D3)(D2)工程において、該遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)を添加し、冷蔵〜37℃で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去する工程;および
(D4)(D3)工程において、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、HEPES緩衝液(pH7.2)に交換する工程を包含する、
項目65に記載の製造方法。
(項目68)
前記A)工程が、以下:
(A1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、35:40:15:5:5:167のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム(1:1)溶液に懸濁させる工程;
(A2)該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、減圧乾燥させ、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程;
(A3)該再懸濁液を30〜40℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程;および
(A4)(A3)工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量10,000で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液に蛍光色素/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を混合して、37℃で撹拌し、分画分子量10,000で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記B)工程が、以下:
(B1’)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程;
(B2’)該(B1’)工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去する工程;
(B3’)該(B2’)工程において、該遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去した溶液に、330mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記C)工程が、以下:
(C1’)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2’)(C1’)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3’)(C2’)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;
(C4’)さらに、該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程を包含し、
前記D)工程が、以下:
(D1)該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約37℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程;
(D2)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去する工程;および
(D3)(D2)工程において、該遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)を添加し、冷蔵〜37℃で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去する工程;および
(D4)(D3)工程において、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、HEPES緩衝液(pH7.2)に交換する工程を包含する、
項目65に記載の製造方法。
(項目69)
前記A)工程が、以下:
(A1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、35:40:15:5:5:167のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム(1:1)溶液に懸濁させる工程;
(A2)該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、減圧乾燥させ、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程;
(A3)該再懸濁液を30〜40℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程;および
(A4)(A3)工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量10,000で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液に蛍光色素/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を混合して、37℃で撹拌し、分画分子量10,000で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記B)工程が、以下:
(B1’)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程;
(B2’)該(B1’)工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去する工程;
(B3’)該(B2’)工程において、該遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去した溶液に、330mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記C)工程が、以下:
(C1’)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2’)(C1’)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3’)(C2’)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;
(C4’)さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程を包含し、
前記D)工程が、以下:
(D1)該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約37℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程;
(D2)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去する工程;および
(D3)(D2)工程において、該遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)を添加し、冷蔵〜37℃で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去する工程;および
(D4)(D3)工程において、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、HEPES緩衝液(pH7.2)に交換する工程を包含する、
項目65に記載の製造方法。
(項目70)
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、
A)リポソームを形成させる工程;
B)該リポソームを親水性化処理する工程;
C)該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程であって、該リンカータンパク質が蛍光色素により標識されている工程、および
D)該リポソームへ糖鎖を結合させる工程
を包含する、方法。
(項目71)
前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスX基であり、該シアリルルイスX基が、0.025mg糖鎖/mg脂質の修飾結合密度で含まれる、項目38に記載のイメージング剤。
(項目72)
炎症部位または癌組織をイメージングするための、項目71に記載のイメージング剤。
(項目73)
前記炎症部位または癌組織が実質を含む、項目72に記載のイメージング剤。
(項目74)
前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスX基であり、該シアリルルイスX基が、0.025mg糖鎖/mg脂質の修飾結合密度で含まれる、項目39に記載の組成物。
(項目75)
前記物質を、炎症部位または癌組織に送達するための、項目74に記載の組成物。
(項目76)
前記炎症部位または癌組織が実質を含む、項目75に記載の組成物。
(項目77)
分子イメージングまたはインビボイメージングにおいて使用するためのキャリアであって、該キャリアは、項目1〜37に記載の糖鎖修飾リポソームを含む、キャリア。
(項目78)
前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスX基であり、該シアリルルイスX基が、0.025mg糖鎖/mg脂質の修飾結合密度で含まれ、前記キャリアは炎症部位または癌組織に標識物質を送達するための、項目77に記載のキャリア。
(項目79)
前記炎症部位または癌組織が実質を含む、項目77に記載のキャリア。
(項目80)
前記標識物質が蛍光性である、項目79に記載のキャリア。
(項目81)
目的の部位を分子イメージングまたはインビボイメージングするためのシステムであって、該システムは:
A)該目的の部位に特異的な糖鎖修飾リポソーム;
B)標識;および
C)該標識の有無を調べる手段;
を備え、ここで、
該標識が目的の部位に集積するのに十分な時間たった後、該生体における該標識の有無を調べ、該標識により該生体の機能または構造を画像化することを特徴とする、
システム。
(項目82)
前記標識が蛍光物質である、項目81に記載のシステム。
(項目83)
前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスX基であり、該シアリルルイスX基が、0.025mg糖鎖/mg脂質の修飾結合密度で含まれる、項目82に記載のシステム。
(項目84)
炎症部位または癌組織をイメージングするための、項目81に記載のシステム。
(項目85)
前記炎症部位または癌組織が実質を含む、項目84に記載のシステム。
(項目86)
前記標識の有無を調べる手段が、走査型顕微鏡を含む、項目81に記載のシステム。
(項目87)
前記標識の有無を調べる手段が、さらにスティック対物レンズを備える、項目86に記載のシステム。
(項目88)
前記標識の有無を調べる手段が、蛍光を検出する手段である、項目81に記載のシステム。
(項目89)
項目53に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、以下:
a)リンカータンパク質が結合した蛍光を内包したリポソームを提供する工程;
b)該リポソームを親水性化処理する工程;
c)3,3’−ジチオビス(スルホスクシニミジルプロピオネート)を該リポソームに結合させる工程;および
d)該リポソームにおける該リンカータンパク質へ糖鎖を結合させて、該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程
を包含し、
該b)〜c)工程は任意の順で実施される、製造方法。
(項目90)
項目53に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、以下:
a)リンカータンパク質が結合した蛍光を内包したリポソームを提供する工程;
b)該リポソームを親水性化処理する工程;
c)3,3’−ジチオビス(スルホスクシニミジルプロピオネート)を該リポソームに結合させる工程;および
d)該リポソームにおける該リンカータンパク質へ糖鎖を結合させて、該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程
e)該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを親水性化する工程;および
f)該親水性化した該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液をフィルター濾過する工程
を包含し、
該b)〜c)工程は任意の順で実施される、製造方法。
(項目91)
前記a)工程の次に順に前記c)工程および前記b)工程を行い、
該c)工程が、以下:
(c1)3,3’−ジチオビス(スルホスクシニミジルプロピオネート)を含む粉体Aに、炭酸緩衝液を含む溶液Aを添加して溶解し、混合溶液を調製する工程;および
(c2)リポソームを含む溶液に、該混合溶液を添加し、室温で、16〜20時間攪拌し、分画分子量30,000で限外濾過し、脱塩して、3,3’−ジチオビス(スルホスクシニミジルプロピオネート)の結合した蛍光内包型リポソームを含む溶液を調製する工程を包含し、
該b)工程が、以下:
(b1)該蛍光内包型リポソームを含む溶液を濃縮し、濃縮された該蛍光内包型リポソームを含む溶液に、該溶液Aを添加する工程;および
(b2)該溶液Aが添加された該蛍光内包型リポソームを含む混合溶液を、分画分子量300,000で遠心分離にかけて限外濾過し、濃縮し、該濃縮させた混合溶液に該溶液Aを添加して、親水性化された該蛍光内包型リポソームを調製する工程を包含し、
前記d)工程が、以下:
(d1)所望の糖鎖を精製水に完全に溶解し、1〜10mM濃度の糖鎖溶液を調製する工程;
(d2)必要に応じて、該糖鎖水溶液に、炭酸水素アンモニウム(pH 7〜14)を約0.2〜1.0g/mL濃度で添加し、20〜40℃で3〜7日間攪拌させて、2〜8℃下で20〜60分間インキュベートし、濾過フィルターで濾過して、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程;
(d3)該親水性化された蛍光内包型リポソームを含む溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、混合した後、室温下で2〜6時間反応させて反応溶液工程;および
(d4)該(d3)工程によって得られた該反応溶液に、トリス緩衝液を含む溶液Bを添加し、室温下で2〜6時間攪拌し、さらに、冷蔵下で16〜48時間攪拌し、分画分子量30,000で限外濾過し、脱塩させて、前記蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程を包含し、
前記e)工程が、
(e1)該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液を濃縮し、2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を含む溶液Cを添加し、分画分子量30,000で限外濾過し、濃縮し、該濃縮させた蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液に該C溶液を添加して、該糖鎖が結合した蛍光内包型リポソームを親水性化する工程を包含する、
項目90に記載の製造方法。
(項目92)
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを製造するためのキットであって、
i)蛍光色素をリポソームに内包させるか、または結合させる手段;
ii)該リポソームの親水性化剤;
iii)該リポソームのリンカータンパク質、および
iv)糖鎖;
v)該糖鎖を該リポソームに結合させる手段
を備える、キット。
(項目93)
蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを製造するためのキットであって、以下:
A)リンカータンパク質を結合したリポソームを含む溶液;
B)3,3’−ジチオビス(スルホスクシニミジルプロピオネート)を含む粉体Aと
C)炭酸緩衝液を含む溶液Aと
D)トリス緩衝液を含む溶液Bと
E)2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を含む溶液Cとを備える、キット。
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。
ここで、n=2、3、4、5、6、7、8、9および10であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース,後者をケトースという。本発明では、いずれの形式のものでも使用され得る。
N−アセチル−α−D−ガラクトサミン
α−D−マンノース
β−D−グルコース
N−アセチル−β−D−グルコサミン
α−L−フコース
α−N−アセチルノイラミン酸
セラミド
は、Cer;
L−セリン
CH2(OH)CH(COOH)NH2
は、Serにより表す。なお、Cerは通常脂質に分類されるが、本明細書では、糖鎖を構成する糖の一種の定義にも入ることから特に言及しない限り、糖として扱う。また、Serは通常アミノ酸に分類されるが、本明細書では、糖鎖を構成する糖の一種の定義にも入ることから特に言及しない限り、糖として扱う。環状の2つのアノマーは、αおよびβにより表す。表示上の理由により、aまたはbと表すことがある。従って、本明細書において、αとa、βとbは、アノマー表記については交換可能に使用される。
本明細書において「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。リポソームは内部に水を含んだ閉鎖小胞であるため、水溶性の薬剤などを小胞内に保持させることも可能である。したがって、このようなリポソームによって、細胞膜を通過しえない薬物や遺伝子などを細胞内に送達するのに使われる。また、生体適合性も良いのでDDS用のナノ粒子性キャリアー材料としての期待が大きい。本発明において、リポソームは、修飾基を付するために、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位(例えば、糖脂質、ガングリオシド、ホスファチジルグリセロールなど)またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位(例えば、ホスファチジルエタノールアミン)を有し得る。
1つの局面において、本発明は、糖鎖修飾リポソームを提供する。従来、生体内では所望の標的細胞または組織に十分にターゲティングするものは提供されてこなかった。本発明は、生体内の所望の標的細胞または組織に指向性有する糖鎖修飾リポソームを提供することにより、従来DDS材料では不可能であったターゲティングが可能になるという効果を有する。具体的な実施形態では、このような糖鎖修飾リポソームは、シアリルルイスX、N−アセチルラクトサミン、α1−6マンノビオースおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つの構造を有する糖鎖が結合されている。
構造I X−R1−R2−R3
X:前記リポソームに含まれる前記リンカータンパク質とCH2−NH結合可能な官能基aを含む構成単位から、該官能基aがとれた基
R1:リンカータンパク質基
R2:リンカータンパク質架橋基
R3:糖鎖
であり、XとR1とはCH2−NH結合し、R1とR2とはペプチド結合し、R2とR3とはペプチド結合している。
従って、より詳細には、構造Iは、
X−CH2−NH−R1−NH−C(=O)−R2−C(=O)−NH−R3
という構造式で表すことができる。
構造II Y−R4−R5
Y:前記リポソームに含まれる親水性化合物架橋基とペプチド結合可能な官能基bを含む構成単位から該官能基bがとれた基
R4:親水性化合物架橋基
R5:親水性化合物基
YとR4はペプチド結合し、R4とR5はペプチド結合している。
従って、より詳細には、構造IIは、
Y−NH−C(=O)−R4−C(=O)−NH−R5
という構造式で表すことができる。
、1,1’−ビス(ε−カルボキシペンチル)−3,3,3’,3‘−テトラメチル−3H−ベンズインドジカルボシアニン−5,5’,7,7’−テトラスルホネート三カリウム塩−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど)、
cy3(例えば、
、1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン−5,5’−ジスルホネートカリウム塩−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(cy3)など)、cy5、cy7、cy3B、cy3.5、Alexa
Fluor350、Alexa Fluor488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、Alexa
Fluor647、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor750、FITCなどが挙げられるが、これらに限定されない。
H2N−R3−(R4OH)n 式(2)
H2N−R5(OH)n 式(3)
ここで、R1、R3およびR5は、C1からC40、好ましくはC1からC20、さらに好ましくはC1からC10の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R2、R4は存在しないかもしくはC1からC40、好ましくはC1からC20、さらに好ましくはC1からC10の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示す。Zはリポソーム脂質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、例えば、COOH、NH、NH2、CHO、SH、NHS−エステル、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、EDC、ピリジルジスルフィド、アジドフェニル、ヒドラジド等が挙げられる。nは自然数を示す。このような親水性化合物で親水性化を行ったリポソームの表面は、薄く親水性化合物で覆われている。但し、その親水性化合物の覆いの厚みは小さいので、リポソームに糖鎖を結合させた場合であっても、糖鎖等の反応性を抑制することはない。
他の局面において、本発明は、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿器・生殖器系、中枢神経系、または末梢神経系の障害を処置するための医薬の製造のための、糖鎖修飾リポソームの使用を提供する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の(糖鎖修飾リポソーム)に記載される任意の形態が使用され得る。
別の局面において、本発明は、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿器・生殖器系、中枢神経系、または末梢神経系を画像化するための方法を提供する。この方法は、被験体に、分子イメージング剤を投与する工程を包含し、該分子イメージング剤は糖鎖修飾リポソームおよび蛍光色素を含み、該糖鎖修飾リポソームは検出に十分な量の蛍光色素を含有する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の(糖鎖修飾リポソーム)に記載される任意の形態が使用され得る。
別の局面において、本発明は、目的の部位を分子イメージングまたはインビボイメージングするためのシステムを提供する。本明細書において、「分子イメージング」または「インビボイメージング」とは、生体の機能または構造を画像化するこという。本発明の分子イメージングまたはインビボイメージングするためのシステムは、
A)該目的の部位に特異的な糖鎖修飾リポソーム;
B)標識;および
C)該標識の有無を調べる手段;
を備え、ここで、
該標識が目的の部位に集積するのに十分な時間たった後、該生体における該標識の有無を調べ、該標識により該生体の機能または構造を画像化することができる。標識としては、蛍光物質、放射性物質、発色物質(例えば、βgal)、発行物質(例えば、ルシフェラーゼ)などが挙げられるが、これらに限定されない。
別の局面において、本発明は、呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿器・生殖器系、中枢神経系、または末梢神経系の障害を有する被験体を処置するための方法を提供する。この方法は、被験体に、障害を処置するための分子イメージング剤を投与する工程を包含し、該分子イメージング剤は糖鎖修飾リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含み、該糖鎖修飾リポソームは該障害を処置するのに有効な量の薬剤を含有する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の(糖鎖修飾リポソーム)に記載される任意の形態が使用され得る。
別の局面において、本発明は、生物学的因子を必要とする被験体において、標的部位に該生物学的因子を送達するための方法を提供する。この方法は、本発明の糖鎖修飾リポソームを投与する工程を包含し、該糖鎖修飾リポソームは該生物学的因子の有効量を含有する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の(糖鎖修飾リポソーム)に記載される任意の形態が使用され得る。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の(糖鎖修飾リポソーム)に記載される任意の形態が使用され得る。
一つの局面において、本発明は、蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法を提供する。この製造方法は、A)蛍光色素をリポソームに内包したか、または結合させたリポソームを形成させる工程;B)該リポソームを親水性化処理する工程;C)該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程、およびD)該リポソームへ糖鎖を結合させる工程を包含する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の(糖鎖修飾リポソーム)に記載される任意の形態が使用され得る。
蛍光色素の結合または封入は、薬物をリポソーム中に結合または封入するために用いられる任意のものが使用される。例えば、(1)ジパルミトイルフォスファチジルコリン(DPPC)、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルフォスフェート(DCP)、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン(DPPE)、コール酸ナトリウムを秤量し、メタノール・クロロホルム溶液(1:1)に懸濁させ、37℃、1時間撹拌し;(2)クロロホルム・メタノールをロータリーエバポレーターで蒸発させ、真空乾燥させる。N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に再懸濁させ、37℃、1時間撹拌後、窒素置換し超音波処理をし、(3)超音波処理溶液と蛍光色素(例えば、cy5.5、cy3、cy7)標識ヒト血清アルブミン溶液(蛍光色素標識HSA溶液)を混合して、限外濾過(分画分子量:10,000)をすることによって、蛍光色素(例えば、cy5.5、cy3、cy7)標識HSAを内包したリポソーム粒子が得られる。
リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、これには、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等を挙げることができる。
一つの局面において、本発明は、蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを製造するためのキットを提供する。このキットは、i)蛍光色素(例えば、cy5.5、cy3、cy7等)をリポソームに内包させるか、または結合させる手段;ii)該リポソームの親水性化剤;iii)該リポソームのリンカータンパク質、およびiv)糖鎖;v)該糖鎖を該リポソームに結合させる手段を備える。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の(糖鎖修飾リポソーム)に記載される任意の形態が使用され得る。
本発明の糖鎖修飾リポソームに使用され得る糖鎖は、一般的な糖鎖合成方法によって合成され得る。これらの方法としては、(1)化学合成による方法、(2)遺伝子組換え細胞あるいは微生物による発酵法、(3)糖加水分解酵素(グリコシダーゼ)を用いて合成する方法、(4)糖転移酵素(グリコシルトランスフェラーゼ)を用いて合成する方法が挙げられる。(WO2002/081723、特開平9−31095公報、特開平11−42096公報、特開2004−180676公報、畑中研一、西村紳一郎、大内辰郎および小林一清(1997)糖質の科学と工業、講談社、東京などを参照のこと)。
本発明においては、上記のようにして作製したリポソームに、上記の糖鎖のいずれかを直接結合させてもよいし、さらに、リンカーを介して糖鎖を結合させてもよい。この際、リポソームに結合させる糖鎖の種類は1種類に限らず、複数の糖鎖を結合させてもよい。この場合の複数の糖鎖は同じ組織または器官の細胞表面に共通して存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する複数の糖鎖であってもよいし、異なる組織または器官の細胞表面に存在する異なるレクチンに対して結合活性を有する糖鎖であってもよい。前者のような複数の糖鎖を選択することにより、特定の標的組織または器官を確実に指向することができ、後者のような複数の糖鎖を選択することにより、1種類のリポソームに複数の標的を指向させることができ、マルチパーパスな標的指向性リポソームを得ることができる。
脂質量(μg/50μl)=コレステロール量(μg/50μl)×4.51(換算係数)
リポソーム中の脂質に対するタンパク質の割合は、例えば、上述のタンパク質定量および脂質定量の結果から導くことができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、好ましくは、脂質に対するタンパク質の割合が、約0.1から約0.5である。
本発明はまた、保健・食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品・健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。好ましくは、本発明の糖鎖修飾リポソームに機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品を封入または結合させたものを食品組成物として用いることができる。本発明で用い得る機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品に限定はなく、摂取されて食品機能を有効に発現するように設計され、加工変換された食品ならばいずれのものも含まれる。
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール(1:1)溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH 8.4)3mlに再懸濁し、37℃で1時間攪拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH 8.4)を用いた限外濾過(分画分子量:10,000)にかけ均一リポソーム(平均粒子径100nm)10mlを調製した。
実施例1で調製したリポソーム溶液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)と炭酸緩衝液(pH 8.5)を用いた限外濾過(分画分子量:300,000)にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3;Pierce Co.,USA)10mgを加え、室温で2時間攪拌した。その後、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜と炭酸緩衝液(pH 8.5)で限外濾過(分画分子量:300,000)にかけた。次に、炭酸緩衝液(pH 8.5)1mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン40mgをリポソーム液10mlに加えた。次いで、この溶液を、室温で2時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換し、リポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合は、既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)MethodsEnzymol.242,56−65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、はじめに、実施例2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1mlのN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH 8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加え、冷蔵下で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化した。XM300膜とPBS緩衝液(pH 8.0)で限外濾過(分画分子量:300,000)することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換して、酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)/PBS緩衝液(pH 8.0)を加えて室温で2時間反応させ、次に2M NaBH3CN/PBS緩衝液(pH 8.0)100μlを加えて室温で2時間、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。次いで、限外濾過(分画分子量:300,000)し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換して、HSA結合リポソーム液10mlを得た。
以下の表2Bに示される糖鎖を使用した。
実施例4において調製した各糖鎖2mgを精製水に溶解し、0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルアミン化合物4mg/ml(アミノ化糖鎖溶液)を得た。次に、実施例3で得たリポソーム液の一部分10mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP;Pierce Co.,USA)10mgを加えて室温で2時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、XM300膜と炭酸緩衝液(pH 8.5)で限外濾過(分画分子量:300,000)して、遊離のDTSSPを除去し、DTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム10mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物(アミノ化糖鎖溶液)12.5、37.5、125、250、500、1250、2500μlを加えて、室温で2時間反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH 8.5)を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。XM300膜とHEPES緩衝液(pH 7.2)で限外濾過(分画分子量:300,000)して、遊離の糖鎖およびトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した。その結果、表2Bに示される糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各10ml(総脂質量26mg、総蛋白量1.5mg、平均粒子径100nm)が得られた。
(調製例1.リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの結合)
比較試料としてのリポソームを調製するために、実施例3で得たリポソーム液の一部分10mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)10mgを加えて室温で2時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、XM300膜と炭酸緩衝液(pH 8.5)で限外濾過(分画分子量:300,000)して、遊離のDTSSPを除去し、DTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム10mlを得た。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)26.4mgを加えて、室温で2時間攪拌し、その後冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの結合を行った。XM300膜とHEPES緩衝液(pH 7.2)で限外濾過(分画分子量:300,000)した。この工程で既に大過剰である26.4mgのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが存在するのでリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理も同時に完結した。0.45μmのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理されたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム(略称:TRIS)10ml(総脂質量26mg、総蛋白量1.5mg、平均粒子径100nm)が得られた。
実施例5の手段により調製された糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のHSAタンパク質表面の親水性化処理を行った。糖鎖修飾リポソーム10mlに、別々に、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン26.4mgを加えて、室温で2時間、その後冷蔵下で一晩攪拌した後、XM300膜とHEPES緩衝液(pH 7.2)で限外濾過(分画分子量:300,000)し未反応物を除去した。0.45μmのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理された糖鎖修飾リポソーム複合体各10ml(総脂質量26mg、総蛋白量1.5μg、平均粒子径100nm)を得た。
(cy5.5標識ヒト血清アルブミン溶液の調製)
ヒト血清アルブミン/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液(10mg/ml)、(2ml)にcy5.5/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液(2mg/ml)、(2.5ml)を混合して、37℃で3時間撹拌した。この混合溶液を、分画分子量10,000、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液で限外濾過し、遊離のcy5.5を除去し、cy5.5標識ヒト血清アルブミン溶液を調製した。
実施例7で調製した蛍光色素を内包するリポソーム溶液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)と炭酸緩衝液(pH 8.5)を用いた限外濾過(分画分子量:300,000)にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3;Pierce Co.,USA)10mgを加え、室温で2時間攪拌した。その後、さらに7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜と炭酸緩衝液(pH 8.5)で限外濾過(分画分子量:300,000)にかけた。次に、炭酸緩衝液(pH 8.5)1mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン40mgをリポソーム液10mlに加えた。次いで、この溶液を、室温で2時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換し、リポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合は、既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)MethodsEnzymol.242,56−65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、はじめに、実施例2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1mlのN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH 8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム10.8mgを加え、7℃で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化した。XM300膜とPBS緩衝液(pH 8.0)で限外濾過(分画分子量:300,000)することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換して、酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)/PBS緩衝液(pH 8.0)を加えて室温で2時間反応させ、次に2M NaBH3CN/PBS緩衝液(pH 8.0)100μlを加えて室温で2時間、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。次いで、限外濾過(分画分子量:300,000)し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換して、HSA結合リポソーム液10mlを得た。
実施例4と同様の手順により糖鎖を調製した。
実施例10において調製した各糖鎖2mgを精製水に溶解し、0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルアミン化合物4mg/ml(アミノ化糖鎖溶液)を得た。次に、実施例9で得たリポソーム液の一部分10mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP;Pierce Co.,USA)10mgを加えて室温で2時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、XM300膜と炭酸緩衝液(pH 8.5)で限外濾過(分画分子量:300,000)して、遊離のDTSSPを除去し、DTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム10mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物(アミノ化糖鎖溶液)12.5、37.5、125、250、500、1250、2500μlを加えて、室温で2時間反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH 8.5)を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。XM300膜とHEPES緩衝液(pH 7.2)で限外濾過(分画分子量:300,000)して、遊離の糖鎖およびトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した。その結果、表2Bに示される糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各10ml(総脂質量38mg、総蛋白量15mg、平均粒子径100nm)が得られた。
実施例11の手段により調製された糖鎖が結合したリポソームについて、以下の手順によりリポソーム上のHSAタンパク質表面の親水性化処理を行った。糖鎖修飾リポソーム10mlに、別々に、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン26.4mgを加えて、室温で2時間、その後冷蔵下で一晩攪拌した後、XM300膜とHEPES緩衝液(pH 7.2)で限外濾過(分画分子量:300,000)し、未反応物を除去した。0.45μmのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理された糖鎖修飾リポソーム複合体各10ml(総脂質量38mg、総蛋白量15mg、平均粒子径100nm)を得た。
(担癌マウスの作製)
マウス(ddyY、雄性、7週齢)の右大腿部皮下に、Ehrlich ascite
tumor(EAT)細胞を5×106細胞移植し、7〜10日後に実験に使用した。
1/10 ネンブタール溶液を担癌マウスの腹腔内に300μl投与して麻酔をかけた。蛍光イメージング装置 eXplore Optix(GE Healthcare)により投与前の画像データを取った。尾静脈より、cy5.5内包糖鎖修飾リポソーム(K1)(200μl:脂質量750μg相当)を投与して、投与直後の画像データを取った。
図1に示されるように、リポソーム投与直後では糖鎖のあるなしの差は見られないが、1日後には糖鎖修飾リポソーム(K1)が糖鎖なしよりも強く腫瘍部位に集積した。2日後では、糖鎖修飾リポソーム(K1)は有意に腫瘍部位に集積することが確認できた。この結果から、K1−3リポソームによる腫瘍部位のイメージングが可能であることがわかった。リポソーム投与量を200μlから50μlと1/4にすると、バックグラウンドが下がり8時間後でも糖鎖結合リポソ−ムは腫瘍部位に集積しているのが確認できた。1日後ではさらに明確に腫瘍部位での糖鎖なしとの差が見られた。この結果から、K1−3リポソームによる腫瘍部位のイメージングが少量で、しかも短時間に可能であることがわかった(図2)。リポソーム投与量200μlの場合、糖鎖修飾リポソーム(K1)の集積は投与2日後が最大となり、その後徐々にシグナルが弱くなっていくのが確認できた。一方、糖鎖なしリポソームでは大きな変化は見られなかった。この結果から、K1−3リポソームが腫瘍部位において代謝されている様子をイメージングによりリアルタイムで見ることができることがわかった(図3)。
(ヒト慢性関節リウマチモデルマウスの作製)
マウス(Balb/c,雌性、8週齢)に関節炎惹起用モノクロナール抗体(Chondrex社)を200μl(2mg)、尾静脈投与した。投与2〜5日後、LPS(リポポリサッカリド(Lipopolysaccharide))を100μl(50μl)をマウス腹腔内に投与した。マウスは、投与3〜4日後に関節炎を発症した。
1/10 ネンブタール溶液を関節炎マウスの腹腔内に200μl投与して麻酔をかけた。蛍光イメージング装置 eXplore Optix(GE Healthcare)により投与前の画像データを取った。尾静脈より、cy5.5内包糖鎖修飾リポソーム(K1,K2)(50μl:脂質量190μg)を投与して、投与直後の画像データを取った。コントロールとして、糖鎖を結合させていないリポソームを同量投与した。経時的に画像データをとった。画像データは、すべて背中側より後ろ足を撮影した。
図5に示すように、糖鎖修飾リポソーム(K1)投与1日後に炎症部位に集積していることが確認できた。その後、2日後、3日後と徐々にシグナルは弱くなっていった。この結果から、K1−3リポソームによる炎症部位のイメージングが可能であることがわかった。また、炎症部位に集積したK1−3リポソームの代謝される様子が、イメージングによりリアルタイムで見ることができることがわかった。 図6に示すように、糖鎖修飾リポソーム(K1)投与1日後に炎症部位に集積していることが確認できた。その後、図5と同様に、2日後とシグナルは弱くなっていった。この結果は、K1−3リポソームによる炎症部位のイメージングと特異性の再現性を示した。
(cy5.5内包糖鎖修飾リポソームの正常マウスにおける体内動態の確認)
正常マウスとして、Balb/c,雌性、7〜8週齢を用いた。
1/10 ネンブタール溶液を正常マウスの腹腔内に100μl投与して麻酔をかけた。蛍光イメージング装置 eXplore Optix(GE Healthcare)により投与前の画像データを取った。尾静脈より、cy5.5内包糖鎖修飾リポソーム(200μl:脂質量750μg)を投与して、投与直後の画像データを取った。経時的に画像データをとった。画像データは、すべて腹側より撮影した。
図14は、脳のデータを示す。投与後1時間でK1−3、K2−3が脳に集積しているのが確認できた。また、投与後1日ではK1−3は脳にかなりの量残っているが、K2−3では明らかに減少していた。この結果から、糖鎖修飾リポソーム(K1)は血液脳関門(Blood−Brain Barrier; BBB)を通過し組織へ浸透していることがわかった。また、糖鎖修飾リポソーム(K2)は、1日後で減少していたことより、脳の血管には入るが、BBBを通過できず、組織へは浸透しないことがわかった。このことより、糖鎖の種類による脳での特異的な動態があることがわかった。
(I.タンパク質定量)
リポソームに内包されたHSA量とリポソーム表面にカップリングしたHSAの総タンパク質量をBCA法により測定した。
リポソームの構成脂質量を、コレステロール量を定量することにより算出した。脂質の定量にはデタミナーTC555キット(カタログ番号UCC/EAN128)(KYOWA Co.LTD)を用いた。標準物質として、キットに添付されている50mg/ml
コレステロールを使用した。
コレステロール量から脂質量を求める換算式
脂質量(μg/50μl)=コレステロール量(μg/50μl)×4.51(換算係数)
脂質量の定量結果を以下に示す。
リポソーム粒子を精製水で50倍に希釈して、ゼータサイザーナノ(Nan−ZS:MALVERN Co.LTD)を用いて測定した。
(cy5.5標識ヒト血清アルブミン溶液の調製)
ヒト血清アルブミン/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液(10mg/ml)、(2ml)にcy5.5/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液(2mg/ml)、(2.5ml)を混合して、37℃で3時間撹拌した。この混合溶液を、分画分子量10,000で限外濾過し、遊離のcy5.5を除去し、cy5.5標識ヒト血清アルブミン溶液を調製する。
実施例4と同様の方法にて糖鎖を調製する。
実施例4において調製した各糖鎖2mgを精製水に溶解し、0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルアミン化合物4mg/ml(アミノ化糖鎖溶液)を得る。次に、実施例3で得たリポソーム液の一部分10mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP;Pierce Co.,USA)10mgを加えて室温で2時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、XM300膜と炭酸緩衝液(pH 8.5)で限外濾過(分画分子量:300,000)して、遊離のDTSSPを除去し、DTSSPがリポソーム上のcy5.5標識HSAに結合したリポソーム10mlを得る。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物(アミノ化糖鎖溶液)12.5、37.5、125、250、500、1250、2500μlを加えて、室温で2時間反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH 8.5)を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合cy5.5標識ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行う。XM300膜とHEPES緩衝液(pH 7.2)で限外濾過(分画分子量:300,000)して、遊離の糖鎖およびトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去する。その結果、糖鎖とcy5.5標識ヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソームが得られる。
上記の糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のcy5.5標識HSAタンパク質表面の親水性化処理を行う。糖鎖修飾リポソーム10mlに、別々に、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン26.4mgを加えて、室温で2時間、その後冷蔵下で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過(分画分子量:300,000)し、未反応物を除去する。0.45μmのフィルターで濾過して、最終産物である親水性化処理された糖鎖修飾リポソーム複合体各10mlを得る。
実施例6で得られたリポソーム表面のHSA中のS―S基に対して、蛍光色素cy3またはcy5を添加して反応させ、標識させる。
(Cy5.5内包糖鎖修飾リポソーム(K1)の調製)
糖鎖としてSLXを用いてCy5.5内包糖鎖修飾リポソーム(K1)を調製した(図40を参照のこと。)。リポソームを、Yamazaki,N.J.Membrance
Sci.1989,41,249−267、Yamazaki,N.,Komada,M.,Gabius,H−J.Methods.Enzymol.1994,242,56−65に記載される改良されたコール酸塩透析法を用いて調製した。
CO.,LTD)(架橋剤)を、このリポソーム溶液(10ml)に加え、20〜25℃にて2時間撹拌し、さらに、4℃にて一晩撹拌した。BS3を、リポソーム表面に結合させた。次いで、40mgのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを加え、20〜25℃にて2時間撹拌し、さらに、4℃にて一晩撹拌して、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンをBS3に結合させた。これを、XM300(Amicon CO.,LTD)により限外濾過して、残ったトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した。HSAをリポソーム表面に結合させるために、カップリング法を用いた。リポソーム表面を酸化するために、10.8mgの過ヨウ素酸ナトリウムを、リポソーム溶液(10ml)に加え、4℃にて一晩撹拌した。これを、XM300(Amicon CO.,LTD)により限外濾過し、残った過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。20mgのHSAをこれに加え、20〜25℃にて2時間撹拌した。次いで、3.125mgのシアノホウ化水素ナトリウムを加え、20〜25℃にて2時間撹拌し、さらに、4℃にて一晩撹拌した。残ったシアノホウ化水素ナトリウムを除去するために、この溶液を、XM300(Amicon CO.,LTD)により限外濾過した。
糖鎖なしのリポソームの調製を、糖鎖を結合させるプロセスを除いて、糖鎖修飾リポソームの場合と同様に行った。リポソーム表面上へのN−アセチルラクトサミン(G4GN: Calbiochem CO.,LTD)の結合もまた、糖鎖修飾リポソームの場合と同様に行なった。
(リポソームの脂質含量の測定)
得られた糖鎖修飾リポソーム(K1)および糖鎖なしリポソームの脂質含量を、Determiner TC555キット(KYOWA CO.,LTD)を用いて、0.5%
TritonX−100の存在下での総コレステロールとして測定した。次いで、脂肪酸の総量を各脂質のモル比から計算した。タンパク質含量を、Yamazaki,N.J.Membrance Sci.1989,41,249−267、Yamazaki,N.,Komada,M.,Gabius,H−J.Methods.Enzymol.1994,242,56−65に記載されるように、Micro BCATM Protein Assay Reagent(PIERCE CO.,LTD)を用いて、1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の存在下で測定した。
Zetasizer Nano−S90(Malvern CO.,LTD)を用いて、粒子サイズおよびζ電位を25℃にて測定した。このリポソーム溶液を、測定のために、蒸留水で50倍に希釈した。糖鎖修飾リポソーム(K1)および糖鎖なしリポソームの両方の粒子サイズは、ほぼ均一な分布を示した。平均粒子サイズは、約100nmであった(図41)。リポソーム膜表面の電荷を示すζ電位は、負に帯電しており、両方のリポソームについて、−40mVであった。4℃にて6ヶ月間保存した後、粒子サイズの分布は、調製直後のものとほぼ同じであり、これらのリポソームの安定特性を示した(図42)。
(ヒト慢性関節リウマチモデルマウスの作製およびリポソームの投与)
ヒト慢性関節リウマチモデルマウスを、以下の方法により作製した。ヒト慢性関節リウマチの誘導のために、200μl(2mg)のモノクローナル抗体(Chondrex CO.,LTD)を、Balb/cマウス(雌性、8週齢)の尾静脈から投与した。4日後、100μl(50μg)のリポ多糖(LPS)を、腹腔内に投与した。このマウスを、3〜4日後に実験に使用した。生理食塩水で10倍希釈した150μlのネンブタール溶液(Dainippon Pharmaceutical CO.,LTD)を、腹腔内に投与し、モデルマウスを麻酔をかけた。次いで、糖鎖修飾リポソーム(K1)または糖鎖なしリポソームを、尾静脈から投与した(マウス1匹あたり50μl)。
eXplore Optix(GE Healthcare CO.,LTD)を用いて、Cy5.5の蛍光シグナルを、注射前、注射後の0時間および24時間において、同じマウスの炎症領域(後脚の裏面)においてモニターした(励起:680nm、発光:700nm)。
この集積がSLX特異的であることを確認するために、G4GNがリポソーム表面に結合した糖鎖修飾リポソーム(K2)を、本実施例の糖鎖修飾リポソーム(K1)と同様の方法を用いて、D2の糖鎖密度(K2−3)で調製する。糖鎖修飾リポソーム(K1およびK2)を、尾静脈から投与し(50μl/マウス)、注射の24時間後に、リポソームの集積を調べた。図44に示すように、糖鎖修飾リポソーム(K2)の集積は、糖鎖なしリポソームの場合とほぼ同じレベルであり、糖鎖修飾リポソーム(K1)のみが、炎症領域に特異的に集積した。
糖鎖修飾リポソーム(K1)の炎症領域への特異的な集積と、その表面上の糖鎖密度との関係を明らかにするために、種々の密度の糖鎖を有する糖鎖修飾リポソーム(K1)(D1〜5)を投与し(50μl/マウス)、リポソームの集積の程度を比較した(図45)。
(オリンパスIV100による観察)
(方法)
炎症部位へ集積したSLX−Lipo−Cy5.5が血管内にとどまっているのか、或いは血管から周辺の組織へ移行しているのかの確認を走査型蛍光顕微鏡IV−100(OLYMPUS.,Co.LTD)を用いて行った。観察は、IV−100の直径1.3mmの極細径スティック対物レンズ(IV−OB35F22W20)を観察部位に近づけて行った。1/10ネンブタール溶液を関節炎マウスの腹腔内に200μl投与して麻酔をかけ、尾静脈より、cy5.5内包糖鎖修飾リポソーム(K1−3)(100μl:脂質量380μg)を投与した。また、コントロールとして、糖鎖を結合させていないリポソームを同量投与した。経時的に画像データをとった。画像データは、すべて後ろ足の裏側を観察した。
炎症部位へ集積したK1−3リポソームが血管内にとどまっているのか、或いは血管から周辺の組織へ移行しているのかの確認を行った。図46に示すとおり、投与後10分および30分では、リポソームの血管壁への付着や凝集物は認められず、血管内を流れるリポソームが確認できた。投与6h後では、K1−3リポソームのみ、部分的に血管壁に添った付着が認められた。一方、糖鎖なしリポソームではそのような付着は確認されなかった。投与24h後では、K1−3リポソームは、血管周辺組織へ移行しており、血管内壁に6h後に認められた血管に添った付着は認められなかった。48h後において、K1−3リポソームの血管周辺組織での集積は、24h後よりも増加した。
以前より、LPSにより誘導されたヒト臍静脈(HUVEC)上のE−セレクチンの発現パターンは均一ではなく、細胞上で部分的かつ高密度の凝集を形成することが報告されている(Joseph.K.Welply.,S.Zaheer Abbas.,Peter Scudder.Glycobiology.1994,4,259−265、Muligan,M.S.,Polley,M.J.,Bayer,R.J.J.Clin.Invest.1992,90(4),1600−1607、Pober,J.S.,Bevilacqua,D.L.,Mendrick,L.A.,Lapierre,L.A.J.Immunol.1986,136(5),1680−1687)。本実施例において、血管内に存在した糖鎖修飾リポソーム(K1−3)リポソームは、血管から血管内壁をローリングし、血管周辺組織へ移行することが確認された。これは、糖鎖修飾リポソーム(K1)が、血管内皮上に不均一に発現するE−セレクチンを認識し、部分的に結合しながら移動したことを示している。
(担癌マウスモデルの作製およびリポソームの投与)
糖鎖修飾リポソーム(K1)および糖鎖なしリポソームの腫瘍領域への集積を、以下の方法により作製した腫瘍を有するマウスを用いて試験した。EAT細胞(5×106 細胞/マウス)を、ddYマウス(雄性、7週齢)の右大腿領域に移植し、そして、このマウスを、7〜10日後に実験に使用した。麻酔をかけるために、生理食塩水で10倍希釈した300μlのネンブタール溶液を、腹腔内に投与した。次いで、糖鎖修飾リポソーム(K1)または糖鎖なしリポソームを、尾静脈から投与した(200μl/マウス)。
eXplore Optix(励起:680nm、発光:700nm)を用いて、同じマウスの腫瘍領域(後脚の裏面)を、投与前、投与の0時間後、24時間後、48時間後、72時間後および96時間後に観察した。図47に示されるように、糖鎖修飾リポソーム(K1)は、腫瘍領域に有意に集積した。この集積は、48時間まで次第に増加した。一方で、糖鎖なしリポソームの集積は、糖鎖修飾リポソーム(K1)の集積よりも低く、96時間以降まで一定であった。
(オリンパスIV100による観察)
(方法)
マウス(Balb/c、雌性、8週齢)の右大腿部皮下にEhrlich ascite tumor (EAT)細胞を2×106細胞移植し、7〜10日後に実験に使用した。
担癌部位へ集積したK1−3リポソームが血管内にとどまっているのか、或いは血管から周辺の組織へ移行しているのかの確認を行った。図49に示すとおり、K1−3リポソームは、投与48時間後、血管から血管外組織へ移行して血管外組織の細胞内に集積していた。糖鎖なしリポソームの場合も、投与48時間でK1−3リポソームに比べ集積量は少ないが、血管外組織で蛍光が確認された。このことは、糖鎖なしリポソームの場合も、癌周辺の血管内皮の間隙から受動的に組織へ移行したことによると考えられた。
血管内のリポソームの保持は、炎症領域および腫瘍領域における集積に有意に影響を与え、この集積は、血管内の保持を延長することによって増加することが報告された(Drummond,D.C.,Meyer,O.,Hong,K.,Kirpotin,D.B.Pharmacological.Rev.1999,51,691−743、Kawakita,Y.,Yamazaki,N.,Kojima,S.Radioisotopes.2000,49,339−345、Yamazaki,N.US patent.2003−0143267)。
(蛍光標識物質外付型リポソームの調製)
糖鎖としてSLXを用いて、実施例17と同様の方法を使用して蛍光標識外付型リポソームを調製する。
糖鎖なしのリポソームの調製を、実施例19と同様の方法を使用して調製する。
(リポソームの脂質含量の測定)
得られた糖鎖修飾リポソーム(K1)および糖鎖なしリポソームの脂質含量を、実施例19と同様の方法を用いて測定する。次いで、脂肪酸の総量を各脂質のモル比から計算する。タンパク質含量を、1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の存在下で測定する。
実施例19と同様の方法を用いて、粒子サイズおよびζ電位を測定する。糖鎖修飾リポソーム(K1)および糖鎖なしリポソームの両方の粒子サイズは、ほぼ均一な分布を示す。リポソーム膜表面の電荷を示すζ電位は、負に帯電しており、両方のリポソームについて、−40mVである。4℃にて6ヶ月間保存した後、粒子サイズの分布は、調製直後のものとほぼ同じであり、これらのリポソームの安定特性を示す。
(ヒト慢性関節リウマチモデルマウスの作製およびリポソームの投与)
実施例20と同様の方法によりヒト慢性関節リウマチモデルを作製する。麻酔をかけるために、生理食塩水で10倍希釈した150μlのネンブタール溶液(Dainippon Pharmaceutical CO.,LTD)を、腹腔内に投与する。次いで、糖鎖修飾リポソーム(K1)または糖鎖なしリポソームを、尾静脈から投与する(マウス1匹あたり50μl)。
実施例21と同様の方法を用いて、Cy5.5の蛍光シグナルを、注射前、注射後の0時間および24時間において、同じマウスの炎症領域(後脚の裏面)においてモニターする(励起:680nm、発光:700nm)。
この集積がSLX特異的であることを確認するために、実施例21と同様の方法によりG4GNがリポソーム表面に結合した糖鎖修飾リポソーム(K2)を、D2の糖鎖密度(K2−3)で調製する。これらのリポソーム(K1およびK2)を尾静脈から投与し(マウス1匹あたり50μl)、注射の24時間後にリポソームの集積を調べる。糖鎖修飾リポソーム(K2)の集積は、糖鎖なしリポソームの場合とほぼ同じレベルであり、糖鎖修飾リポソーム(K1)のみが炎症領域に特異的に集積することが確認される。
糖鎖修飾リポソーム(K1)の炎症領域への特異的な集積と、その表面上の糖鎖密度との関係を明らかにするために、種々の密度の糖鎖を有する糖鎖修飾リポソーム(K1:D1〜5)を投与し(マウス1匹あたり50μl)、リポソームの集積の程度を比較する。
実施例22と同様の方法を用いて、炎症部位へ集積したK1−3リポソームが血管内にとどまっているのか、或いは血管から周辺の組織へ移行しているのかの確認する。走査型顕微鏡は、IV−OB 35F22W20、1.3mm直径レンズ(OLYMPUS CO.,LTD)を用いる。
(方法)
白血球および血管内皮細胞を染色するために、150μlのアクリジンオレンジ(AO)(0.5%、w/v%)を、観察の直前にマウスの尾静脈から投与する。糖鎖修飾リポソーム(K1)または糖鎖なしリポソームを、尾静脈から投与する(100μl/マウス)。測定条件は以下を使用する:Cy5.5およびAOに対する励起は、それぞれ、HeNe−Rレーザ(633nm)およびアルゴンレーザ(488nm)により提供する。発光は、Cy5.5については、Cy5.5チャネル(660〜730nm バンドパスフィルタ)で補足し、AOについては、緑色蛍光タンパク質(GFP)チャネル(505〜525nm バンドパスフィルタ)で捕捉する。
(担癌マウスモデルの作製およびリポソームの投与)
実施例23と同様の方法により、腫瘍を有するマウスを作製する。糖鎖修飾リポソーム(K1)または糖鎖なしリポソームを、尾静脈から投与する(マウス1匹あたり200μl)。
実施例24と同様の方法を用いて、eXplore Optix(励起:680nm、発光:700nm)を用いて、同じマウスの腫瘍領域(後脚の裏面)を、投与前、投与の0時間後、24時間後、48時間後、72時間後および96時間後に観察する。糖鎖修飾リポソーム(K1)は、腫瘍領域に有意に集積し、この集積は、48時間まで次第に増加する。一方で、糖鎖なしリポソームの集積は、糖鎖修飾リポソーム(K1)の集積よりも低く、96時間以降まで一定である。
(オリンパスIV100による観察)
(方法)
実施例25と同様の方法を使用する。糖鎖修飾リポソームが血管内にとどまっているのか、或いは血管から腫瘍組織へ移行しているのかの確認する。
蛍光標識物質外付型リポソームにおいても、蛍光内包糖鎖修飾リポソームと同様に、SLXで修飾した糖鎖修飾リポソーム(K1)は、E−セレクチンに対する親和性および血管内での優れた保持を示し、炎症領域および腫瘍組織に特異的かつ効率的に集積すると考えられる。それゆえ、蛍光標識物質外付型の糖鎖修飾リポソーム(K1)も、蛍光内包糖鎖修飾リポソームと同様にインビボ蛍光イメージング試薬として有用である。
(Cy7内包型糖鎖修飾リポソームの調製)
蛍光色素としてCy5.5のかわりにCy7を用いること以外、実施例1〜12と同様の方法を用いてCy7内包型糖鎖修飾リポソームを調製した。糖鎖としては、SLX(K−1)を用いた。
実施例23と同様の方法を用いて6週齢の雌性Balb/cマウスの右大腿部皮下にEhrlich ascite tumor(EAT)細胞を1×106個移植した。7〜10日後にこれらの担癌マウスを実験に使用した。
1/10 ネンブタール溶液を担癌マウスの腹腔内に200μl投与して麻酔をかけた。次いで、尾静脈より、cy7内包型糖鎖修飾リポソーム(K1−3(50μg/mL)50μl)を投与した。蛍光イメージング装置 eXplore Optix(GE Healthcare)を用いて、投与直後から経時的に画像データをとった。画像データはすべて腹側より撮影した。コントロールとして、糖鎖を結合させていないリポソームを同量投与した担癌マウスを用いた。
投与6時間後、Cy7内包型糖鎖修飾リポソーム(K−1)を投与した担癌マウスは、コントロールに比べて腫瘍部位において蛍光強度が高かった。投与24時間後においては、ほとんどシグナルが検出されなかった(図50を参照のこと。)。
蛍光色素としてCy5.5のかわりにCy3を用いること以外、実施例1〜12と同様の方法を用いてCy3内包型糖鎖修飾リポソームを調製した。糖鎖としては、SLX(K−1)を用いた。
実施例23と同様の方法を用いて6週齢の雌性Balb/cマウスの右大腿部皮下にEhrlich ascite tumor(EAT)細胞を1×106個移植した。7〜10日後にこれらの担癌マウスを実験に使用した。
1/10 ネンブタール溶液を担癌マウスの腹腔内に200μl投与して麻酔をかけた。次いで、尾静脈より、cy3内包型糖鎖修飾リポソーム(K−1)(K1−3(50μg/mL)100μl)を投与した。投与48時間後に腫瘍部位を取り出し、ホルマリン溶液で12時間以上固定した後、常法によりパラフィン切片を作製し、蛍光顕微鏡CKX41(OLYMPUS)により画像データを得た。コントロールとして、糖鎖を結合させていないリポソームを同量投与した担癌マウスを用いた。
投与6時間後、Cy3内包型糖鎖修飾リポソーム(K−1)を投与した担癌マウスは、コントロールに比べて腫瘍組織における蛍光強度が高いことが判明した(図51を参照のこと。)。
本実施例では、標識物質として、蛍光色素であるCy3.Cy5.5およびCy7をそれぞれ用いた。
3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP;Pierce Co.,USA)を含む粉体Aに、炭酸緩衝液を含む溶液Aを500μL添加して溶解した。この溶液50μLを、リポソームを含む溶液1mLに添加して、室温で2時間撹拌した。遠心限外濾過フィルター(NMWL,:30,000)を用いて脱塩を行った。100〜200μlに濃縮し、溶液Aを加え1mlとした。この操作をもう一度繰り返した。
糖鎖SLX、N-アセチルラクトサミン、α-マンノビオースをそれぞれ密栓のできるガラス製バイアルに秤量し、精製水500μLに完全に溶解した。糖鎖水溶液の終濃度が5mMとなるように調製した。
これらのリポソームを含む溶液1mLに糖鎖溶液12.5μLを添加し、ボルテックスで混合後、室温で2時間反応させた。トリス緩衝液を含む溶液Bを40μL添加し、室温で2時間撹拌し、さらに、冷蔵(2〜10℃)で16〜20時間撹拌した。遠心限外濾過フィルター(NMWL,:30,000)を用いて、脱塩を行った。脱塩を行った溶液を100〜200μlに濃縮し、HEPES緩衝液を含む溶液Cを加え1m1にした。この操作をもう一度繰り返した。0.45μm 濾過フィルター(マイレクス−HV(ミリポア))で濾過し、遮光下で、冷蔵保管した。
これらのリポソームについて、タンパク質濃度、脂質濃度、平均粒子径、ゼータ電位を測定した。本実施例により調製されたリポソームの脂質濃度、平均粒子径、Z電位、吸光度、安定性は、実施例7〜12において調製された糖鎖修飾リポソームの脂質濃度、平均粒子径、Z電位、吸光度、安定性と変わらなかった。本実施例により調製されたリポソームは、表面に結合させる糖鎖の影響も受けなかった。
実施例16と同様の方法により、これらの糖鎖修飾リポソームについて、タンパク質濃度を測定した。その結果、タンパク質濃度は、Cy3では0.24mg/mL以上、Cy5.5では0.45mg/mL以上、Cy7では0.20mg/mL以上であった(表8を参照のこと。)。
実施例16と同様の方法により、これらの糖鎖修飾リポソームについて、脂質濃度を測定した。その結果、脂質濃度は、Cy3では1.2mg/mL以上、Cy5.5では1.4mg/mL以上、Cy7では2.1mg/mL以上であった(表8を参照のこと。)。
実施例16と同様の方法により、これらの糖鎖修飾リポソームについて、平均粒子径を測定した。その結果、平均粒子径は、いずれの蛍光を用いた場合も50nm〜300nmであった(表8を参照のこと。)。
実施例16と同様の方法により、これらの糖鎖修飾リポソームについて、ゼータ電位を測定した。その結果、ゼータ電位は、いずれの蛍光を用いた場合も−30未満であった(表8を参照のこと。)。
製造した各リポソームを、冷蔵保存した後、安定性を確認した。その結果、Cy3では少なくとも1年間、Cy5.5では少なくとも1年間、Cy7では少なくとも3ケ月間にわたって、粒子サイズの分布は、調製直後のものとほぼ同じであり、これらのリポソームの安定特性を示した。
実施例1と同様の方法を使用して、リポソーム(平均粒子径100nm)10mlを調製した。
実施例1と同様の方法で調製したリポソーム溶液12.5mlをAmicon Ultra−4(分画分子量:100,000)(Millipore)4本それぞれに4等分して入れ、2000×gで60分間、室温で遠心分離機にかけることで限外濾過濃縮した。このリポソーム濃縮液に炭酸緩衝液(CBS緩衝液:50mM NaHCO3、157mM NaCl(pH8.5))を2mlずつ加え、同条件で遠心機にかけて限外濾過した。濃縮されたリポソーム溶液を回収してまとめ、同緩衝液を加え元の体積にメスアップした。次に、架橋試薬ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3;Pierce Co.,USA)12.5mgを加え、室温で2時間攪拌した。その後、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。リポソーム溶液12.5mlをAmicon Ultra−4(分画分子量:100,000)4本それぞれに4等分して入れ、2000×gで60分間、室温で遠心分離機にかけることで限外濾過濃縮した。このリポソーム濃縮液にCBS緩衝液(pH 8.5)を2mlずつ加え、同条件で遠心機にかけて限外濾過した。濃縮されたリポソーム溶液を回収してまとめ、同緩衝液を加え元の体積にメスアップした。次に、CBS緩衝液(pH 8.5)1.25mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン50mgをリポソーム液12.5mlに加えた。次いで、この溶液を、室温で2時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌しリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結した。このリポソーム溶液をAmicon Ultra−4(分画分子量:100,000)4本それぞれに4等分して入れ、2000×gで60分間、室温で遠心分離機にかけることで限外濾過濃縮した。このリポソーム濃縮液にN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)を2mlずつ加え、同条件で遠心機にかけて限外濾過した。濃縮されたリポソーム溶液を回収してまとめ、同緩衝液を加え元の体積にメスアップした。
上記1.で得られた12.5mlのリポソーム溶液に、0.3mlのN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH 8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム13.45mgを加え、冷蔵下で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化した。Amicon Ultra−4(分画分子量:100,000)4本それぞれに4等分して入れ、2000×gで60分間、室温で遠心分離機にかけることで限外濾過濃縮した。このリポソーム濃縮液にPBS緩衝液(pH 8.0)を2mlずつ加え、同条件で遠心機にかけて限外濾過した。濃縮されたリポソーム溶液を回収してまとめ、同緩衝液を加え元の体積にメスアップした。
Claims (93)
- 糖鎖修飾リポソームであって、該糖鎖修飾リポソームは、
リポソームと
糖鎖基と
リンカータンパク質基と
親水性化合物基とを含み、
該リンカータンパク質基は該リポソームの外表面に結合し、該リンカータンパク質基の少なくとも一部に該糖鎖基が結合し、該リポソームの外表面または該リンカータンパク質基の一部に該親水性化合物基が結合している、糖鎖修飾リポソーム。 - 前記糖鎖修飾リポソームは、構造Iと構造IIとを含み、
該構造Iは、
X−CH2−NH−R1−NH−C(=O)−R2−C(=O)−NH−R3で表され、
Xは、前記リポソームに含まれる前記リンカータンパク質とCH2−NH結合可能な官能基aを含む構成単位から、該官能基aがとれた基であり、
R1は、前記リンカータンパク質基であり、
R2は、リンカータンパク質架橋基であり、
R3は、前記糖鎖基であり;および
該構造IIは、
Y−NH−C(=O)−R4−C(=O)−NH−R5で表され、
Yは、前記リポソームに含まれる親水性化合物架橋基とペプチド結合可能な官能基bを含む構成単位から該官能基bがとれた基であり、
R4は、該親水性化合物架橋基であり、
R5は、前記親水性化合物基である、請求項1に記載の糖鎖修飾リポソーム。 - 前記リポソームが蛍光性を有する、請求項1に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記蛍光性が、前記リポソームと適合性の蛍光色素によって付与される、請求項3に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記蛍光色素が、
cy5、cy7、cy3B、cy3.5、Alexa Fluor350、Alexa Fluor488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor750およびフルオレセイン−4−イソチオシアネート(FITC)ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項4に記載の糖鎖修飾リポソーム。 - 前記蛍光色素が、
である、請求項5に記載の糖鎖修飾リポソーム。 - 前記蛍光色素が、リポソームに内包されている、請求項4に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R1が、哺乳動物由来タンパク質基である、請求項2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R1が、ヒト由来タンパク質基である、請求項8に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R1が、ヒト由来血清タンパク質基である、請求項9に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R1が、血清アルブミン基である請求項8に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R2が、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基、ビススルホスクシンイミジルスベレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスベレート基、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート基からなる群より選択される、請求項2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R2が、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基である、請求項12に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R3が、シアリルルイスX基、N−アセチルラクトサミン基、α1−6マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R3が、シアリルルイスX基であり、該シアリルルイスX基が、0.0001mg糖鎖/mg脂質〜500mg糖鎖/mg脂質の範囲の修飾結合密度で含まれる、請求項14に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R3が、N−アセチルラクトサミン基であり、該N−アセチルラクトサミン基が、0.0001mg糖鎖/mg脂質〜500mg糖鎖/mg脂質の範囲の修飾結合密度で含まれる、請求項14に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R3が、α1−6マンノビオース基であり、該α1−6マンノビオース基が、0.0001mg糖鎖/mg脂質〜500mg糖鎖/mg脂質の範囲の修飾結合密度で含まれる、請求項14に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R4が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート基、ジスクシンイミジルグルタレート基、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート基、ジスクシンイミジルスベレート基、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基、エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート基およびエチレングリコールビススルホスクシンイミジルスクシネート基から選択される、請求項2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R4が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート基である、請求項18に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R5が、トリス(ヒドロキシアルキル)アルキルアミノ基である、請求項2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記トリス(ヒドロキシアルキル)アルキルアミノ基が、ヒドロキシアルキルがC1〜C6ヒドロキシアルキルであり、アルキルアミノがC1〜C6アルキルアミノである、請求項20に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記トリス(ヒドロキシアルキル)アルキルアミノ基が、トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ基である、請求項21に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記官能基aが、−CH2−C(=O)−CH2−基を有する、請求項2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記Xが、ガングリオシドである、請求項23に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記官能基bが、アミノ基である、請求項2に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記Yが、ホスファチジルエタノールアミンである、請求項25に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含む、請求項1に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、35:40:15:5:5:167のモル比で含む、請求項27に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記R2が、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基であり、かつ
前記R3が、シアリルルイスX基、N−アセチルラクトサミン基、α1−6マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項2に記載の糖鎖修飾リポソーム。 - 前記R3が、シアリルルイスX基、N−アセチルラクトサミン基、α1−6マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
前記R4が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート基である、請求項2に記載の糖鎖修飾リポソーム。 - 前記R2が、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基であり、
前記R3が、シアリルルイスX基、N−アセチルラクトサミン基、α1−6マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
前記R4が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート基である、請求項2に記載の糖鎖修飾リポソーム。 - 前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含み、
前記R2が、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基であり、
前記R3が、シアリルルイスX基、N−アセチルラクトサミン基、α1−6マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
前記R4が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート基である、請求項2に記載の糖鎖修飾リポソーム。 - 前記リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを含み、
前記R1が血清アルブミン基であり、
前記R2が、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)基であり、前記R3が、シアリルルイスX基、N−アセチルラクトサミン基、α1−6マンノビオース基およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、
前記R4が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート基であり、かつ
前記R5が、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン基である、請求項2に記載の糖鎖修飾リポソーム。 - 前記糖鎖修飾リポソームが、
によって標識されている、請求項33に記載の糖鎖修飾リポソーム。 - 前記リポソームにおいて、脂質に対するタンパク質の割合が、約0.1から約0.5である、請求項1に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記糖鎖修飾リポソームが、該リポソームの粒度分布の最大域において、約80nm〜約165nmの粒子径を有する、請求項1に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 前記糖鎖修飾リポソームが、約50nm〜約300nmの平均粒子径を有する、請求項1に記載の糖鎖修飾リポソーム。
- 請求項1に記載の糖鎖修飾リポソームを含む、イメージング剤。
- 請求項1に記載の糖鎖修飾リポソームと送達が所望される物質とを含む、該物質を所望の部位に送達するための組成物。
- 前記所望される物質が、診断薬または研究試薬である、請求項39に記載の組成物。
- 前記診断薬が、DNAプローブ診断薬、腫瘍診断薬、血液学的検査用試薬および微生物検査用試薬からなる群より選択される、請求項40に記載の組成物。
- 分子イメージングまたはインビボイメージングにおいて使用するための、請求項39に記載の組成物。
- 前記物質が該生物学的因子を含む、請求項39に記載の組成物。
- 請求項1に記載の糖鎖修飾リポソームと医薬活性成分をさらに含む、薬学的組成物。
- 前記医薬活性成分が、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓もしくは心臓における疾患を処置するための薬剤、または炎症もしくは腫瘍を処置するための薬剤である、請求項44に記載の薬学的組成物。
- 所望の部位を標識するための組成物の製造のための、請求項1に記載の糖鎖修飾リポソームの使用。
- 前記所望の部位が、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓、心臓、炎症部位および腫瘍部位からなる群より選択される、請求項46に記載の使用。
- 所望の部位を標識するための方法であって、
該被験体に、該所望の部位を標識するための組成物を投与する工程を包含し、該組成物は請求項1に記載の糖鎖修飾リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含み、該所望の部位が、脳、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓、心臓、炎症部位および腫瘍部位からなる群より選択される、方法。 - 糖鎖修飾リポソームを製造する方法であって、該方法は、以下:
(a)脂質を、メタノール/クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程;
(b)該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理する工程;
(c)該超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合して、蛍光標識されたリポソームを提供する工程;
(d)該リポソームをトリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカンにより親水性化処理する工程;
(e)該親水性化処理されたリポソームにリンカータンパク質を結合させて、リンカータンパク質結合リポソームを生成する工程;および
(f)該リポソームに、糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する工程
を包含する、方法。 - 前記(c)工程の蛍光標識溶液が、
を含む、請求項49に記載の糖鎖修飾リポソームを製造する方法。 - 前記(e)工程のリンカータンパク質が、ヒト血清アルブミンである、請求項49に記載の製造方法。
- 目的の送達部位に薬物を送達するための糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、該製造方法は、以下:
(a)種々の糖鎖密度を有する、該目的の送達部位への送達を達成する蛍光標識された糖鎖修飾リポソームを提供する工程であって、以下:
(i)脂質を、メタノール/クロロホルム溶液に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させることにより脂質膜を得る工程;
(ii)該脂質膜を、懸濁緩衝液に懸濁し、超音波処理する工程;
(iii)該超音波処理した溶液と蛍光標識溶液とを混合する工程を包含する、工程;
(b)該糖鎖修飾リポソーム上の糖鎖密度について、該送達部位への最適な送達を達成する密度を決定する工程;および
(c)該薬物を決定された最適な糖鎖修飾リポソームに組み込んで薬物含有リポソームを生成する工程
を包含する、製造方法。 - 蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、
A)蛍光色素をリポソームに内包したか、または結合させたリポソームを形成させる工程;
B)該リポソームを親水性化処理する工程;
C)該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程、および
D)該リポソームへ糖鎖を結合させる工程
を包含する、製造方法。 - 前記D)工程に引き続きフィルター濾過をする工程を包含する、請求項53に記載の製造方法。
- 前記A)工程が、以下:
(A1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、35:40:15:5:5:167のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム(1:1)溶液に懸濁させる工程;
(A2)該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥させ、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程;
(A3)該再懸濁液を30℃〜40℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程;
(A4)(A3)工程において超音波処理した溶液に、前記蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量10,000で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程、
を包含する、請求項53に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法。 - 前記(A4)工程における前記蛍光色素溶液が、蛍光色素で標識された蛍光色素標識タンパク質を含む溶液であり、以下:
(1)蛍光標識が結合し得るタンパク質/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液に蛍光色素/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を混合して、室温〜約37℃で撹拌する工程;および
(2)(1)工程の混合溶液を、分画分子量10,000で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程、
を包含する工程により調製される、請求項55に記載の製造方法。 - 前記B)工程が、以下:
(B1)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程;
(B2)該(B1)工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去する工程;
(B3)該(B2)工程において、該遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去した溶液に、330mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程;
を包含する、請求項53に記載の製造方法。 - 前記B)工程が、以下:
(B1’)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g、60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程;
(B2’)該(B1’)工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量100,000、2000×g、60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去する工程;
(B3’)該(B2’)工程において、該遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去した溶液に、330mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程;
を包含する、請求項53に記載の製造方法。 - 前記C)工程が、以下:
(C1)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2)(C1)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3)(C2)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;
(C4)さらに、該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該シアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程
を包含する、請求項53に記載の製造方法。 - 前記C)工程が、以下:
(C1)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2)(C1)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3)(C2)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;
(C4)さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程
を包含する、請求項53に記載の製造方法。 - 前記C)工程が、以下:
(C1’)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2’)(C1’)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3’)(C2’)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;
(C4’)さらに、該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程
を包含する、請求項53に記載の製造方法。 - 前記C)工程が、以下:
(C1’)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2’)(C1’)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3’)(C2’)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;
(C4’)さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程
を包含する、請求項53に記載の製造方法。 - 前記D)工程が、以下:
(D1)前記糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で室温〜約37℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程;
(D2)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去する工程;および
(D3)(D2)工程において、該遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)を添加し、冷蔵〜37℃で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去する工程;
(D4)(D3)工程において、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、HEPES緩衝液(pH7.2)に交換する工程、
を包含する、請求項53に記載の製造方法。 - 前記D)工程に引き続き前記糖鎖が結合したリポソームを親水性化する工程を包含する、請求項53に記載の製造方法。
- 蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、該製造方法が、
A)蛍光色素をリポソームに内包させたリポソームを形成させる工程;
B)該リポソームを親水性化処理する工程;
C)該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程;
D)該リポソームへ糖鎖を結合させる工程;
E)該糖鎖が結合したリポソームを親水性化する工程;ならびに
F)該親水性化したリポソームを含む溶液をフィルター濾過する工程
を包含する、製造方法。 - 前記A)工程が、以下:
(A1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、35:40:15:5:5:167のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム(1:1)溶液に懸濁させる工程;
(A2)該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥させ、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程;
(A3)該再懸濁液を30〜40℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程;および
(A4)(A3)工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量10,000で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液に蛍光色素/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を混合して、37℃で撹拌し、分画分子量10,000で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記B)工程が、以下:
(B1)該蛍光色素を内包したか、または結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程;
(B2)該(B1)工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去する工程;および
(B3)該(B2)工程において、該遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去した溶液に、330mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記C)工程が、以下:
(C1)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵下で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2)(C1)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3)(C2)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;および
(C4)該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該シアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程を包含し、
前記D)工程が、以下:
(D1)該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約37℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程;
(D2)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去する工程;および
(D3)(D2)工程において、該遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)を添加し、冷蔵〜37℃で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去する工程;および
(D4)(D3)工程において、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、HEPES緩衝液(pH7.2)に交換する工程を包含する、
請求項65に記載の製造方法。 - 前記A)工程が、以下:
(A1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、35:40:15:5:5:167のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム(1:1)溶液に懸濁させる工程;
(A2)該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、真空乾燥させ、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程;
(A3)該再懸濁液を30〜40℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程;および
(A4)(A3)工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量10,000で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液に蛍光色素/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を混合して、37℃で撹拌し、分画分子量10,000で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記B)工程が、以下:
(B1)該蛍光色素を内包したか、または結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程;
(B2)該(B1)工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去する工程;および
(B3)該(B2)工程において、該遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去した溶液に、330mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記C)工程が、以下:
(C1)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵下で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2)(C1)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3)(C2)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;および
(C4)さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程を包含し、
前記D)工程が、以下:
(D1)該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約37℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程;
(D2)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去する工程;および
(D3)(D2)工程において、該遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)を添加し、冷蔵〜37℃で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去する工程;および
(D4)(D3)工程において、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、HEPES緩衝液(pH7.2)に交換する工程を包含する、
請求項65に記載の製造方法。 - 前記A)工程が、以下:
(A1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、35:40:15:5:5:167のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム(1:1)溶液に懸濁させる工程;
(A2)該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、減圧乾燥させ、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程;
(A3)該再懸濁液を30〜40℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程;および
(A4)(A3)工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量10,000で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液に蛍光色素/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を混合して、37℃で撹拌し、分画分子量10,000で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記B)工程が、以下:
(B1’)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程;
(B2’)該(B1’)工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去する工程;
(B3’)該(B2’)工程において、該遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去した溶液に、330mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記C)工程が、以下:
(C1’)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2’)(C1’)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3’)(C2’)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;
(C4’)さらに、該反応溶液に、シアノホウ素酸ナトリウム/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよび該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程を包含し、
前記D)工程が、以下:
(D1)該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約37℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程;
(D2)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去する工程;および
(D3)(D2)工程において、該遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)を添加し、冷蔵〜37℃で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去する工程;および
(D4)(D3)工程において、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、HEPES緩衝液(pH7.2)に交換する工程を包含する、
請求項65に記載の製造方法。 - 前記A)工程が、以下:
(A1)ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを、35:40:15:5:5:167のモル比で混合させ、メタノール・クロロホルム(1:1)溶液に懸濁させる工程;
(A2)該クロロホルム・メタノール溶液を蒸発させ、減圧乾燥させ、N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に再懸濁させて再懸濁液を生成する工程;
(A3)該再懸濁液を30〜40℃で攪拌させ、窒素置換し、超音波処理する工程;および
(A4)(A3)工程において超音波処理した溶液に、該蛍光色素を含む蛍光色素溶液を混合し、混合した溶液を分画分子量10,000で限外濾過し、該蛍光色素を内包するリポソームを調製する工程であって、該蛍光色素溶液は、ヒト血清アルブミン/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液に蛍光色素/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を混合して、37℃で撹拌し、分画分子量10,000で限外濾過し、遊離の該蛍光色素を除去する工程によって調製される工程を包含し、
前記B)工程が、以下:
(B1’)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該溶液中に含まれる緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程;
(B2’)該(B1’)工程において該緩衝液が該炭酸緩衝液に変換された溶液にビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去する工程;
(B3’)該(B2’)工程において、該遊離の該ビス(スルホスクシンイミジル)スベレートを除去した溶液に、330mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、さらに冷蔵〜室温で一晩撹拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をN−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)に交換して親水性化処理されたリポソームを含む溶液を生成させる工程を包含し、
前記C)工程が、以下:
(C1’)前記蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、メタ過ヨウ素酸ナトリウム/N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液(pH8.4)溶液を添加し、冷蔵〜室温で一晩撹拌して、リポソーム粒子表面を酸化する工程;
(C2’)(C1’)工程において、粒子表面が酸化されたリポソームを含む溶液を、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、遊離の該メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、該N−トリス(ヒドロキシメチル)−3−アミノプロパンスルホン酸緩衝液をPBS緩衝液(pH8.0)に交換する工程;
(C3’)(C2’)工程において、該緩衝液が該PBS緩衝液に交換された溶液に、ヒト血清アルブミン/PBS緩衝液(pH8.0)を添加して冷蔵〜室温で反応させて反応溶液を生成する工程;
(C4’)さらに、該反応溶液を、冷蔵〜室温で攪拌し、分画分子量100,000、2000×g 60分間の条件で2回、遠心分離にかけることにより限外濾過し、該ヒト血清アルブミンを除去し、該溶液の緩衝液を炭酸緩衝液(pH8.5)に交換する工程を包含し、
前記D)工程が、以下:
(D1)該糖鎖を精製水に溶解して、炭酸水素アンモニウム飽和下で、室温〜約37℃で反応させて、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程;
(D2)該蛍光色素を内包したかまたは結合したリポソームを含む溶液に、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を添加して、冷蔵〜約37℃で攪拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去する工程;および
(D3)(D2)工程において、該遊離の該3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)を除去した溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、冷蔵〜約37℃で反応させ、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/炭酸緩衝液(pH8.5)を添加し、冷蔵〜37℃で一晩撹拌し、分画分子量300,000で限外濾過し、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去する工程;および
(D4)(D3)工程において、遊離の該糖鎖と該トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを除去した溶液の緩衝液を、HEPES緩衝液(pH7.2)に交換する工程を包含する、
請求項65に記載の製造方法。 - 蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、
A)リポソームを形成させる工程;
B)該リポソームを親水性化処理する工程;
C)該リポソームとリンカータンパク質を結合させる工程であって、該リンカータンパク質が蛍光色素により標識されている工程、および
D)該リポソームへ糖鎖を結合させる工程
を包含する、方法。 - 前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスX基であり、該シアリルルイスX基が、0.025mg糖鎖/mg脂質の修飾結合密度で含まれる、請求項38に記載のイメージング剤。
- 炎症部位または癌組織をイメージングするための、請求項71に記載のイメージング剤。
- 前記炎症部位または癌組織が実質を含む、請求項72に記載のイメージング剤。
- 前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスX基であり、該シアリルルイスX基が、0.025mg糖鎖/mg脂質の修飾結合密度で含まれる、請求項39に記載の組成物。
- 前記物質を、炎症部位または癌組織に送達するための、請求項74に記載の組成物。
- 前記炎症部位または癌組織が実質を含む、請求項75に記載の組成物。
- 分子イメージングまたはインビボイメージングにおいて使用するためのキャリアであって、該キャリアは、請求項1に記載の糖鎖修飾リポソームを含む、キャリア。
- 前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスX基であり、該シアリルルイスX基が、0.025mg糖鎖/mg脂質の修飾結合密度で含まれ、前記キャリアは炎症部位または癌組織に標識物質を送達するための、請求項77に記載のキャリア。
- 前記炎症部位または癌組織が実質を含む、請求項77に記載のキャリア。
- 前記標識物質が蛍光性である、請求項79に記載のキャリア。
- 目的の部位を分子イメージングまたはインビボイメージングするためのシステムであって、該システムは:
A)該目的の部位に特異的な糖鎖修飾リポソーム;
B)標識;および
C)該標識の有無を調べる手段;
を備え、ここで、
該標識が目的の部位に集積するのに十分な時間たった後、該生体における該標識の有無を調べ、該標識により該生体の機能または構造を画像化することを特徴とする、
システム。 - 前記標識が蛍光物質である、請求項81に記載のシステム。
- 前記糖鎖修飾リポソームの糖鎖が、シアリルルイスX基であり、該シアリルルイスX基が、0.025mg糖鎖/mg脂質の修飾結合密度で含まれる、請求項82に記載のシステム。
- 炎症部位または癌組織をイメージングするための、請求項81に記載のシステム。
- 前記炎症部位または癌組織が実質を含む、請求項84に記載のシステム。
- 前記標識の有無を調べる手段が、走査型顕微鏡を含む、請求項81に記載のシステム。
- 前記標識の有無を調べる手段が、さらにスティック対物レンズを備える、請求項86に記載のシステム。
- 前記標識の有無を調べる手段が、蛍光を検出する手段である、請求項81に記載のシステム。
- 請求項53に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、以下:
a)リンカータンパク質が結合した蛍光を内包したリポソームを提供する工程;
b)該リポソームを親水性化処理する工程;
c)3,3’−ジチオビス(スルホスクシニミジルプロピオネート)を該リポソームに結合させる工程;および
d)該リポソームにおける該リンカータンパク質へ糖鎖を結合させて、該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程
を包含し、
該b)〜c)工程は任意の順で実施される、製造方法。 - 請求項53に記載の蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームの製造方法であって、以下:
a)リンカータンパク質が結合した蛍光を内包したリポソームを提供する工程;
b)該リポソームを親水性化処理する工程;
c)3,3’−ジチオビス(スルホスクシニミジルプロピオネート)を該リポソームに結合させる工程;および
d)該リポソームにおける該リンカータンパク質へ糖鎖を結合させて、該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程
e)該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを親水性化する工程;および
f)該親水性化した該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液をフィルター濾過する工程
を包含し、
該b)〜c)工程は任意の順で実施される、製造方法。 - 前記a)工程の次に順に前記c)工程および前記b)工程を行い、
該c)工程が、以下:
(c1)3,3’−ジチオビス(スルホスクシニミジルプロピオネート)を含む粉体Aに、炭酸緩衝液を含む溶液Aを添加して溶解し、混合溶液を調製する工程;および
(c2)リポソームを含む溶液に、該混合溶液を添加し、室温で、16〜20時間攪拌し、分画分子量30,000で限外濾過し、脱塩して、3,3’−ジチオビス(スルホスクシニミジルプロピオネート)の結合した蛍光内包型リポソームを含む溶液を調製する工程を包含し、
該b)工程が、以下:
(b1)該蛍光内包型リポソームを含む溶液を濃縮し、濃縮された該蛍光内包型リポソームを含む溶液に、該溶液Aを添加する工程;および
(b2)該溶液Aが添加された該蛍光内包型リポソームを含む混合溶液を、分画分子量300,000で遠心分離にかけて限外濾過し、濃縮し、該濃縮させた混合溶液に該溶液Aを添加して、親水性化された該蛍光内包型リポソームを調製する工程を包含し、
前記d)工程が、以下:
(d1)所望の糖鎖を精製水に完全に溶解し、1〜10mM濃度の糖鎖溶液を調製する工程;
(d2)必要に応じて、該糖鎖水溶液に、炭酸水素アンモニウム(pH 7〜14)を約0.2〜1.0g/mL濃度で添加し、20〜40℃で3〜7日間攪拌させて、2〜8℃下で20〜60分間インキュベートし、濾過フィルターで濾過して、アミノ化糖鎖溶液を調製する工程;
(d3)該親水性化された蛍光内包型リポソームを含む溶液に、該アミノ化糖鎖溶液を添加して、混合した後、室温下で2〜6時間反応させて反応溶液工程;および
(d4)該(d3)工程によって得られた該反応溶液に、トリス緩衝液を含む溶液Bを添加し、室温下で2〜6時間攪拌し、さらに、冷蔵下で16〜48時間攪拌し、分画分子量30,000で限外濾過し、脱塩させて、前記蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを生じさせる工程を包含し、
前記e)工程が、
(e1)該蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液を濃縮し、2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を含む溶液Cを添加し、分画分子量30,000で限外濾過し、濃縮し、該濃縮させた蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを含む溶液に該C溶液を添加して、該糖鎖が結合した蛍光内包型リポソームを親水性化する工程を包含する、
請求項90に記載の製造方法。 - 蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを製造するためのキットであって、
i)蛍光色素をリポソームに内包させるか、または結合させる手段;
ii)該リポソームの親水性化剤;
iii)該リポソームのリンカータンパク質、および
iv)糖鎖;
v)該糖鎖を該リポソームに結合させる手段
を備える、キット。 - 蛍光色素含有糖鎖修飾リポソームを製造するためのキットであって、以下:
A)リンカータンパク質を結合した蛍光を内包したリポソームを含む溶液;
B)3,3’−ジチオビス(スルホスクシニミジルプロピオネート)を含む粉体Aと
C)炭酸緩衝液を含む溶液Aと
D)トリス緩衝液を含む溶液Bと
E)2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を含む溶液Cとを備える、キット。
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