WO2009133867A1 - 金属コロイド含有リポソーム - Google Patents

金属コロイド含有リポソーム Download PDF

Info

Publication number
WO2009133867A1
WO2009133867A1 PCT/JP2009/058310 JP2009058310W WO2009133867A1 WO 2009133867 A1 WO2009133867 A1 WO 2009133867A1 JP 2009058310 W JP2009058310 W JP 2009058310W WO 2009133867 A1 WO2009133867 A1 WO 2009133867A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
liposome
gold
lipid
solution
colloid
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/058310
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
貢一 五十嵐
一典 大家
政彦 平井
敬亨 大谷
Original Assignee
片山化学工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 片山化学工業株式会社 filed Critical 片山化学工業株式会社
Publication of WO2009133867A1 publication Critical patent/WO2009133867A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
    • A61K49/1806—Suspensions, emulsions, colloids, dispersions
    • A61K49/1812—Suspensions, emulsions, colloids, dispersions liposomes, polymersomes, e.g. immunoliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0065—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the luminescent/fluorescent agent having itself a special physical form, e.g. gold nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0076—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form dispersion, suspension, e.g. particles in a liquid, colloid, emulsion
    • A61K49/0084—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form dispersion, suspension, e.g. particles in a liquid, colloid, emulsion liposome, i.e. bilayered vesicular structure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes

Definitions

  • the present invention relates to a liposome containing a metal colloid and a method for producing the same.
  • the present invention also relates to an imaging agent comprising a metal colloid-containing liposome.
  • Imaging agents use metal colloids directly or in a mixture with other components, causing toxicity problems or directivity problems, so that they have not been widely used.
  • Non-Patent Documents 1 to 5 Non-Patent Documents 1 to 5
  • Patent Document 1 describes a method of producing an imaging agent containing a gold colloid and encapsulating the imaging agent in a liposome. However, neither the amount of metal actually encapsulated in the liposome nor the contrast effect is described. Patent Document 1 does not describe any liposome containing a metal colloid nor use it as an imaging agent.
  • Patent Document 2 describes a liposome encapsulating a gold colloid produced by a solid core liposome method.
  • the liposome described in Patent Document 2 cannot be used as an imaging agent because the amount of colloidal gold contained is very small.
  • Patent Document 3 discloses gold particles that form a complex with a nucleic acid and deliver the nucleic acid. However, Patent Document 3 does not describe any liposome containing a metal colloid, nor use it as an imaging agent.
  • Patent Document 4 describes a method for preparing a stable metal colloid. However, Patent Document 4 does not describe any liposome containing a metal colloid, nor use it as an imaging agent.
  • Patent Document 5 discloses a method of encapsulating metal colloid in erythrocytes. However, there is no description of the amount of metal actually taken up by red blood cells nor the contrast effect. Patent Document 5 does not describe any liposome containing a metal colloid nor use it as an imaging agent.
  • Non-Patent Document 1 describes liposomes encapsulating colloidal gold produced by the Bangham method. However, the liposome contains at most 1 to several gold colloids per liposome particle. The liposome described in Non-Patent Document 1 cannot be used as an imaging agent because the amount of colloidal gold contained is very small.
  • JP 2005-120033 A JP-A-64-063513 JP 2005-287507 A JP 2005-320615 A US Pat. No. 6,664,464
  • an object of the present invention is to provide a metal colloid-containing liposome that enables in vivo imaging.
  • the present invention also provides a method for producing a metal colloid-containing liposome useful for in vivo imaging and a method for using the same.
  • the present invention provides, for example, the following means.
  • (Item 1) A metal colloid-containing liposome containing a sufficient amount of metal colloid as an imaging agent.
  • (Item 2) The liposome according to the above item, wherein the metal colloid-containing liposome further comprises a target-directing substance.
  • (Item 3) The liposome according to the above item, wherein the target-directing substance is selected from the group consisting of sugar chain, antibody, lectin, complementary nucleic acid, receptor, ligand, aptamer and antigen.
  • (Item 4) The liposome according to the above item, wherein the metal colloid-containing liposome further comprises a desired substance.
  • the metal colloid is a gold colloid, and the gold colloid-containing liposome is 8.2 ⁇ g or more as gold amount per 1 mg lipid, 28.7 ⁇ g or more as gold amount per 1 ml of liposome solution, or 8.2 ⁇ as gold amount per one liposome.
  • a method for producing a metal colloid-containing liposome which comprises the following steps: A) a step of suspending a lipid membrane in a metal colloid solution to prepare a metal colloid lipid membrane suspension: B) the metal colloid lipid Subjecting the suspension to conditions for maintaining liposome formation. (Item 8) Step B) (B1) stirring the metal colloidal lipid suspension and replacing with nitrogen; (B2) sonicating the nitrogen-substituted metal colloidal lipid membrane suspension; and (B3) subjecting the sonicated metal colloidal lipid suspension to ultrafiltration. The method described.
  • Binding the target-directing substance comprises: i) a step of hydrophilizing the obtained liposome; ii) binding a targeting substance to the liposome; The method according to the above item, comprising the step of iii) hydrophilizing the liposome to which the target-directing substance is bound, and iv) ultrafiltration of a solution containing the hydrophilized liposome.
  • the targeting substance is selected from the group consisting of sugar chains, antibodies, lectins, complementary nucleic acids, receptors, ligands, aptamers and antigens.
  • the metal colloid is a metal colloid selected from the group consisting of iron (Fe), gadolinium (Gd), gold (Au), and europium (Eu).
  • the step A) comprises the steps of (A1) dispersing a gold colloid in a liquid to prepare a gold colloid solution; (A2) a step of suspending and stirring a lipid having liposome-forming ability in an organic solvent, evaporating the stirred organic solvent, and drying the precipitate in vacuum to obtain a lipid membrane; and (A3) The method according to the above item, which comprises a step of preparing a gold colloid lipid membrane suspension by suspending the gold colloid solution as a gold amount at a concentration of 0.001 to 10 mg / mg lipid.
  • (Item 15) A step of dispersing a gold colloid in a liquid to prepare a gold colloid solution; (A2-i) a step of preparing a lipid by mixing dipalmitoyl phosphatidylcholine, cholesterol, ganglioside, dicetyl phosphate, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine and sodium cholate; (A2-ii) suspending the lipid in an organic solvent and stirring, evaporating the stirred solution, and drying the precipitate in vacuo to obtain a lipid membrane; (A3) A step of preparing a gold colloid lipid membrane suspension by suspending the lipid membrane in a gold amount of 0.001 to 10 mg / mg of lipid in the gold colloid solution; (B1) a step of stirring the gold colloidal lipid suspension and replacing with nitrogen; (B2) sonicating the gold-cold lipid suspension with nitrogen substitution; and (B3) subjecting the sonicated gold colloidal lipid suspension to ultrafiltration.
  • the method described. (Item 16) The method according to the above item, wherein the gold colloid solution has a concentration in the range of 0.001 to 10 mg / mg of lipid as the amount of gold.
  • the liposome formation maintaining condition includes a step of encapsulating a desired substance in the liposome.
  • a method for producing a colloidal metal-containing liposome comprising the following steps: a) a step of suspending a lipid membrane in a lipid membrane suspension buffer to prepare a lipid membrane suspension; and b) a step of mixing the lipid suspension and a metal colloid solution and subjecting them to liposome formation maintaining conditions. Including the method.
  • Step b) (B1) a step of dispersing a metal colloid in a liquid to prepare a metal colloid solution; (B2) stirring the lipid suspension and replacing with nitrogen; (B3) sonicating the lipid membrane suspension substituted with nitrogen; and (b4) subjecting the sonicated lipid suspension to ultrafiltration using a metal colloid solution.
  • the method described in the above item. (Item 20) The method according to the above item, wherein in step b), the lipid suspension and the metal colloid solution are suspended at a mixing ratio of 1 to 9 to 9 to 1.
  • the step a) comprises the steps of: (a1) suspending and stirring a lipid having liposome-forming ability in an organic solvent, evaporating the stirred organic solvent, and vacuum drying the precipitate to obtain a lipid membrane; and (a2) The method according to the above item, comprising a step of suspending the lipid membrane in the lipid membrane suspension buffer to prepare a lipid membrane suspension.
  • (Item 22) (A1-i) a step of preparing a lipid by mixing dipalmitoyl phosphatidylcholine, cholesterol, ganglioside, dicetyl phosphate, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine and sodium cholate; (A1-ii) suspending the lipid in an organic solvent and stirring, evaporating the stirred solution, and drying the precipitate in vacuo to obtain a lipid membrane; (A2) suspending the lipid membrane in N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid buffered physiological saline to prepare a lipid membrane suspension; (B1) a step of dispersing a metal colloid in a liquid to prepare a metal colloid solution; (B2) stirring the lipid suspension and replacing with nitrogen; (B3) sonicating the lipid membrane suspension substituted with nitrogen; and (b4) subjecting the sonicated lipid suspension to ultrafiltration using a metal colloid solution.
  • Binding the target-directing substance comprises: i) a step of hydrophilizing the obtained liposome; ii) binding a targeting substance to the liposome; The method according to the above item, comprising the step of iii) hydrophilizing the liposome to which the target-directing substance is bound, and iv) ultrafiltration of a solution containing the hydrophilized liposome.
  • the targeting substance is selected from the group consisting of sugar chains, antibodies, lectins, complementary nucleic acids, receptors, ligands, aptamers and antigens.
  • the metal colloid is a metal colloid selected from the group consisting of iron (Fe), gadolinium (Gd), gold (Au), and europium (Eu).
  • the colloidal metal solution is a colloidal gold solution, and the colloidal gold solution has a gold concentration in a range of 0.001 to 10 mg / mg of lipid.
  • the liposome formation maintaining condition includes a step of encapsulating a desired substance in the liposome.
  • a method for producing a metal colloid-containing liposome the method comprising a step of mixing a freeze-dried liposome and a metal colloid solution.
  • the liposome comprises a targeting substance.
  • the metal colloid solution is a metal colloid solution selected from the group consisting of iron (Fe), gadolinium (Gd), gold (Au), and europium (Eu).
  • the metal colloid is a metal colloid selected from the group consisting of iron (Fe), gadolinium (Gd), gold (Au), and europium (Eu).
  • the metal colloid-containing liposome is a gold colloid-containing liposome, and contains 8.2 ⁇ g or more of gold per mg of lipid, or contains 28.7 ⁇ g or more of metal colloid as gold per ml of liposome solution. Imaging agent.
  • the composition comprises a metal colloid-containing liposome as described above and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a method for labeling a desired site comprising the step of administering to the subject a composition for labeling the desired site, wherein the composition comprises the metal colloid-containing liposome according to the above item. And a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides a metal colloid-containing liposome useful for imaging, a method for producing the same, and a method for using the same.
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention makes it possible to image a desired site with high sensitivity.
  • the metal colloid-containing liposome useful for such imaging is provided for the first time by the present invention.
  • FIG. 1 shows the particle distribution of gold colloid-containing liposomes prepared using a freeze-drying method.
  • the top shows a particle distribution of a colloidal gold-containing liposome prepared using a colloidal gold solution having a concentration of 0.1 mg / ml, and the bottom shows a colloidal gold-containing liposome prepared using a 10-fold concentration (1 mg / ml).
  • Vertical axis relative intensity of dynamic light scattering (%)
  • horizontal axis particle size (logarithm: diameter (nm))
  • FIG. 2 shows the particle distribution according to the strength of colloidal gold-containing liposomes prepared using the Bangham method (1).
  • the top shows a particle distribution of a colloidal gold-containing liposome prepared using a colloidal gold solution having a concentration of 0.1 mg / ml
  • the bottom shows a colloidal gold-containing liposome prepared using a 10-fold concentration (1 mg / ml).
  • Vertical axis relative intensity of dynamic light scattering (%)
  • horizontal axis particle size (logarithm: diameter (nm))
  • FIG. 3 shows the particle distribution according to the strength of the colloidal gold-containing liposome prepared using the Bangham method (2).
  • the colloidal gold-containing liposome was prepared using a colloidal gold solution having a concentration of 0.05 mg / ml.
  • FIG. 4 shows the particle distribution according to the strength of the colloidal gold-containing liposomes prepared using the improved cholate dialysis method (1).
  • the gold colloid-containing liposome was prepared using a gold colloid solution having a concentration of 1 mg / ml as the gold amount.
  • the solid line shows the particle distribution of unmodified gold colloid-containing liposomes, and the broken line shows the particle distribution of SLX-modified gold colloid-containing liposomes.
  • Vertical axis relative intensity of dynamic light scattering (%), horizontal axis: particle size (logarithm: diameter (nm))
  • FIG. 5 shows the particle distribution according to the strength of liposomes 10 times concentrated of colloidal gold-containing liposomes prepared using the improved cholate dialysis method (1).
  • the solid line shows the particle distribution of unmodified gold colloid-containing liposomes, and the broken line shows the particle distribution of SLX-modified gold colloid-containing liposomes.
  • Vertical axis relative intensity of dynamic light scattering (%), horizontal axis: particle size (logarithm: diameter (nm))
  • FIG. 6 is a colloidal gold-containing liposome photographed with a transmission electron microscope. Left: 100,000 times, right: In the left figure, the central gold colloid-containing liposome is magnified about twice.
  • FIG. 7 shows colloidal gold-containing liposomes taken with a scanning electron microscope.
  • FIG. 8 shows the tumor site 10 days after transplantation of Ehrlich ascite tumor (EAT) cells (5 ⁇ 10 6 cells / mouse) subcutaneously in the right thigh of a mouse (ddY mouse, male, 7 weeks old). (In the circle in the figure).
  • FIG. 9 shows the TEM results (20,000 times) in the liver 48 hours after administration. It was confirmed that the colloidal gold-containing liposome was taken up into cells in the liver.
  • FIG. 10 is an enlarged view of FIG.
  • FIG. 9 shows the result of TEM (2500 times) in the liver 48 hours after administration.
  • FIG. 11 shows the TEM results (10,000 times) in the liver 48 hours after administration. It was confirmed that the colloidal gold-containing liposome was taken up into cells in the liver.
  • FIG. 12 shows the TEM results (20,000 times) in the liver 48 hours after administration. It was confirmed that the colloidal gold-containing liposome was taken up into cells in the liver.
  • FIG. 13 is a transmission electron micrograph (2,000 times) in the tumor tissue 48 hours after administration of the liposome containing SLX-modified gold colloid in EAT cell transplanted mice. Colloidal gold was observed in the area surrounded by the broken line in the tumor tissue (arrow).
  • FIG. 14 is an enlarged photograph of FIG.
  • FIG. 15 is an enlarged photograph of the portion within the broken line indicated by the black arrow in FIG.
  • FIG. 16 is an enlarged photograph of FIG.
  • FIG. 17 is an enlarged photograph of the portion within the broken line indicated by the white arrow in FIG. It is a transmission electron micrograph (40,000 times) in a tumor tissue 48 hours after administration of a liposome containing SLX-modified gold colloid in an EAT cell transplanted mouse. Colloidal gold was observed at the arrow.
  • FIG. 18 is a diagram in which FIGS. 16 and 17 are enlarged by about 2 times and 3 times, respectively, by image software.
  • FIG. 19 shows colloidal gold-containing liposomes prepared by the same method (modified cholate dialysis method (2) conventional method) as in (2. improved cholate dialysis method (2)) of Examples 1 and 2.
  • the particle size distribution map by strength is shown.
  • the particle size of the gold colloid used is 10 nm.
  • Solid line unmodified gold colloid-containing liposome; broken line (thick line): SLX-modified gold colloid-containing liposome; broken line (thin line): anti-E selectin antibody-modified gold colloid-containing liposome.
  • Vertical axis relative intensity of dynamic light scattering (%), horizontal axis: particle size (logarithm: diameter (nm))
  • colloidal gold-containing liposomes prepared by the same method (modified cholate dialysis method (1) improved method) as in Examples 1 and 2 (1. improved cholate dialysis method (1)).
  • the particle size distribution map by strength is shown.
  • the particle size of the gold colloid used is 40 nm.
  • Solid line unmodified gold colloid-containing liposome; broken line (thick line): SLX-modified gold colloid-containing liposome.
  • Vertical axis relative intensity of dynamic light scattering (%), horizontal axis: particle size (logarithm: diameter (nm))
  • colloidal solution refers to a solution in which colloidal particles are dispersed in a liquid.
  • metal colloid refers to a substance in which a metal is dispersed in a liquid medium, or a dispersion state thereof. In the present specification, it should be understood that the metal colloid is used in the meaning normally used in the art.
  • the metal colloid examples include lithium (Li), beryllium (Be), sodium (Na), magnesium (Mg), aluminum (Al), potassium (K), calcium (Ca), scandium (Sc), and titanium (Ti ), Vanadium (V), chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe), cobalt (Co), nickel (Ni), copper (Cu), zinc (Zn), gallium (Ga), germanium (Ge) ), Rubidium (Rb), strontium (Sr), yttrium (Y), zirconium (Zr), niobium (Nb), molybdenum (Mo), technetium (Tc), ruthenium (Ru), rhodium (Rh), palladium (Pd) ), Silver (Ag), cadmium (Cd), indium (In), tin (Sn), antimony (Sb), cesi (Cs), barium (Ba), lanthanum (La), cerium (Ce), prase
  • it may be a colloid of a metal such as iron (Fe), gadolinium (Gd), gold (Au), and europium (Eu), but is not limited thereto.
  • colloidal gold include metals (eg, gold), distilled water, secondary distilled water, ultrapure water, N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid buffer (pH 8.4), carbonate buffer (PH 8.5), phosphate buffer (pH 8.0), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) buffer (pH 7.2), Tris (hydroxy) Aminomethane buffer, 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid buffer, N-tris (hydroxymethyl) 1-2-aminoethanesulfonic acid buffer, N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2 ethanesulfone Acid buffer, N-tris (hydroxymethyl) methyl-2
  • the metal colloid can be prepared by dispersing the metal in a hydrophobic solvent such as toluene, xylene, hexane, or tetradecane. Further, gold, silver, and the like can be dispersed in a polar solvent such as water. Preferably, the metal colloid can be gold dispersed in water.
  • the colloidal gold can also be prepared by dispersing a saccharide, a buffer containing amines, and the like.
  • the metal colloid to be contained in the liposome can be appropriately determined by those skilled in the art according to its use, and the concentration and the like can also be clearly determined.
  • metal colloid solution refers to a solution in which metal colloid particles are dispersed in a liquid.
  • the “liposome” usually means a closed vesicle composed of a lipid layer assembled in a membrane shape and an inner aqueous layer.
  • cholesterol, glycolipids and the like can also be incorporated. Since liposomes are closed vesicles containing water inside, it is possible to retain water-soluble drugs and the like in the vesicles. Therefore, such liposomes are used to deliver drugs and genes that cannot pass through the cell membrane into the cell. Moreover, since biocompatibility is good, the expectation as a nanoparticulate carrier material for DDS is great.
  • the liposome is a structural unit having a functional group that imparts an ester bond (eg, glycolipid, ganglioside, phosphatidylglycerol, etc.) or a structural unit that has a functional group that imparts a peptide bond in order to attach a modifying group.
  • a functional group that imparts an ester bond eg, glycolipid, ganglioside, phosphatidylglycerol, etc.
  • a structural unit that has a functional group that imparts a peptide bond in order to attach a modifying group eg, phosphatidylethanolamine.
  • lipid refers to a long-chain aliphatic hydrocarbon or a derivative thereof. “Lipid” is a general term for compounds composed of, for example, fatty acids, alcohols, amines, aminoalcohols, aldehydes and the like.
  • lipid membrane is a membrane-like lipid prepared from a lipid having a liposome-forming ability.
  • the “lipid having liposome forming ability” refers to a lipid having a property capable of forming a liposome.
  • composition of the lipid having liposome-forming ability can be appropriately determined by those skilled in the art according to the use of the liposome, and the range can be clearly determined.
  • Lipids commonly used in the production of liposomes can be used as the qualities having liposome-forming ability.
  • examples of lipids having liposome-forming ability include phosphatidylcholines, phosphatidylethanolamines, phosphatidic acids, long-chain alkyl phosphates, glycolipids (gangliosides, etc.), phosphatidylglycerols, sphingomyelins, cholesterols, etc. Can be mentioned.
  • phosphatidylcholines examples include dimyristoyl phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylcholine, distearoyl phosphatidylcholine, and the like.
  • phosphatidylethanolamines examples include dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, distearoyl phosphatidylethanolamine, and the like.
  • Examples of the phosphatidic acids include dimyristoyl phosphatidic acid, dipalmitoyl phosphatidic acid, and distearoyl phosphatidic acid.
  • Examples of long-chain alkyl phosphates include dicetyl phosphate.
  • glycolipids examples include galactosylceramide, glucosylceramide, lactosylceramide, phosphnatide, globoside, gangliosides and the like.
  • gangliosides include ganglioside GM1 (Gal ⁇ 1,3GalNAc ⁇ 1,4 (NeuA ⁇ 2,3) Gal ⁇ 1,4Glc ⁇ 1,1′Cer), ganglioside GDla, ganglioside GTlb, and the like.
  • phosphatidylglycerols dimyristoyl phosphatidylglycerol, dipalmitoyl phosphatidylglycerol, distearoyl phosphatidylglycerol and the like are preferable.
  • phosphatidic acids, long-chain alkyl phosphates, glycolipids, and cholesterols have the effect of increasing the stability of liposomes, so it is desirable to add them as constituent lipids.
  • the lipid constituting the liposome of the present invention is selected from the group consisting of phosphatidylcholines (molar ratio 0 to 70%), phosphatidylethanolamines (molar ratio 0 to 30%), phosphatidic acids, and long-chain alkyl phosphates.
  • One or more selected lipids (molar ratio 0-30%), one or more lipids selected from the group consisting of glycolipids, phosphatidylglycerols and sphingomyelin (molar ratio 0-40%), and Examples include those containing cholesterol (molar ratio of 0 to 70%).
  • metal colloid-containing liposome refers to a liposome containing a metal colloid.
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention includes, for example, lithium (Li), beryllium (Be), sodium (Na), magnesium (Mg), aluminum (Al), potassium (K), calcium (Ca), and scandium as metals.
  • the metal colloid can be prepared by dispersing the metal in a hydrophobic solvent such as toluene, xylene, hexane, or tetradecane. Further, gold, silver, and the like can be dispersed in a polar solvent such as water. Preferably, the metal colloid can be gold dispersed in water.
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention includes gadopentetate meglumine (for example, Magnevist (registered trademark) manufactured by Nihon Schering Co., Ltd.), gadoteridol (for example, Bristol Eisai Co., Prohans), felcarbotran (Nippon Schering Co., Ltd.). Manufactured by Rhizovist (registered trademark), ammonium iron citrate (for example, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Ferriselz), and the like.
  • gadopentetate meglumine for example, Magnevist (registered trademark) manufactured by Nihon Schering Co., Ltd.
  • gadoteridol for example, Bristol Eisai Co., Prohans
  • felcarbotran Neippon Schering Co., Ltd.
  • Rhizovist registered trademark
  • ammonium iron citrate for example, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Ferriselz
  • the “metal colloid lipid membrane suspension” refers to a liquid in which a metal colloid and a lipid membrane are suspended.
  • liposome formation and maintenance conditions refers to conditions under which liposomes are formed and / or liposomes are maintained. Liposome formation and maintenance conditions include, for example, substituting the metal colloidal lipid suspension with nitrogen, sonicating, and subjecting to ultrafiltration, substituting the lipid suspension with nitrogen, sonicating, and using a metal colloid solution. For ultrafiltration, etc.
  • the liposome formation maintaining condition is that the metal colloidal lipid suspension is purged with nitrogen, sonicated and subjected to ultrafiltration at a molecular weight cut-off of 500 to 300,000, preferably 10,000, or lipid suspension.
  • the suspension can be purged with nitrogen, sonicated, and subjected to ultrafiltration using a colloidal metal solution with a molecular weight cut-off of 500 to 300,000, preferably 10,000.
  • the liposome formation and maintenance conditions can include a step of encapsulating a desired substance in the liposome.
  • the conventionally used bangham method could not encapsulate metal colloids efficiently, but by using other methods (for example, improved cholate dialysis method, freeze-drying method, etc.) It should be noted that the inventors have found that the metal colloid can be efficiently encapsulated.
  • lipid membrane suspension buffer refers to a buffer for suspending a lipid membrane.
  • examples of the lipid membrane buffer include N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid buffer (pH 8.4), carbonate buffer (pH 8.5), and phosphate buffer (pH 8.0).
  • the solution containing the water-soluble statin includes, but is not limited to, N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid buffer (pH 8.4). This is because it is sufficient that the lipid membrane can be suspended and does not inhibit the formation of liposomes.
  • hydrophilization means binding of a hydrophilic compound to the liposome surface.
  • the compound used for hydrophilization include a low molecular weight hydrophilic compound, preferably a low molecular weight hydrophilic compound having at least one OH group, and more preferably a low molecular weight hydrophilic compound having at least two OH groups.
  • a low molecular weight hydrophilic compound having at least one amino group that is, a hydrophilic compound having at least one OH group and at least one amino group in the molecule can be mentioned.
  • hydrophilic compounds include amino alcohols such as tris (hydroxyalkyl) aminoalkanes including tris (hydroxymethyl) aminomethane, and more specifically, tris (hydroxymethyl) aminoethane, Tris (hydroxyethyl) aminoethane, Tris (hydroxypropyl) aminoethane, Tris (hydroxymethyl) aminomethane, Tris (hydroxyethyl) aminomethane, Tris (hydroxypropyl) aminomethane, Tris (hydroxymethyl) aminopropane, Tris (hydroxyethyl) ) Aminopropane, tris (hydroxypropyl) aminopropane and the like.
  • amino alcohols such as tris (hydroxyalkyl) aminoalkanes including tris (hydroxymethyl) aminomethane, and more specifically, tris (hydroxymethyl) aminoethane, Tris (hydroxyethyl) aminoethane, Tris (hydroxypropyl) aminoethane, Tris (hydroxymethyl) aminomethane, Tris (hydroxyethyl)
  • alkyl refers to a monovalent group formed by losing one hydrogen atom from an aliphatic hydrocarbon (referred to herein as “alkane”) such as methane, ethane, and propane. C n H 2n + 1 ⁇ (where n is a positive integer). Alkyl can be linear or branched. In the present specification, the “substituted alkyl” refers to an alkyl in which H of the alkyl is substituted with a substituent specified below.
  • C1-C2 alkyl C1-C3 alkyl, C1-C4 alkyl, C1-C5 alkyl, C1-C6 alkyl, C1-C7 alkyl, C1-C8 alkyl, C1-C9 alkyl, C1-C10 alkyl.
  • C1-C11 alkyl or C1-C12 alkyl C1-C2 substituted alkyl, C1-C3 substituted alkyl, C1-C4 substituted alkyl, C1-C5 substituted alkyl, C1-C6 substituted alkyl C1-C7 substituted alkyl, C1-C8 substituted alkyl, C1-C9 substituted alkyl, C1-C10 substituted alkyl, C1-C11 substituted alkyl or C1-C12 substituted alkyl obtain.
  • alkanes these specific examples include C1-C2 alkanes, C1-C3 alkanes, C1-C4 alkanes, C1-C5 alkanes, C1-C6 alkanes, C1-C7 alkanes, C1-C8 alkanes, C1-C9 alkanes, C1-C10 alkane, C1-C11 alkane or C1-C12 alkane, C1-C2-substituted alkane, C1-C3-substituted alkane, C1-C4-substituted alkane, C1-C5-substituted alkane, C1-C6 Substituted alkanes, C1-C7 substituted alkanes, C1-C8 substituted alkanes, C1-C9 substituted alkanes, C1-C10 substituted alkanes, C1-C11 substituted alkanes or C1-C
  • C1-C10 alkyl means linear or branched alkyl having 1 to 10 carbon atoms, such as methyl (CH 3- ), ethyl (C 2 H 5- ), n-propyl.
  • CH 3 CH 2 CH 2 — isopropyl ((CH 3 ) 2 CH—), n-butyl (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 —), n-pentyl (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -), N-hexyl (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2- ), n-heptyl (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2- ), n-octyl (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 —), n-nonyl (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 —), n-decyl (CH 3 CH 2 CH 2 C H 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2
  • C1-C10 substituted alkyl refers to C1-C10 alkyl, in which one or more hydrogen atoms are substituted with a substituent.
  • R is preferably C1-C6 alkyl, and particularly preferably C1-C6 alkyl.
  • substituent R When a substance of the invention or a functional group as defined above is substituted by a substituent R, such substituent R is present in one or more and each independently represents hydrogen, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, Cycloalkenyl, alkynyl, alkoxy, carbocyclic group, heterocyclic group, halogen, hydroxy, thiol, cyano, nitro, amino, carboxy, acyl, thiocarboxy, amide, substituted amide, substituted carbonyl, substituted Selected from the group consisting of thiocarbonyl, substituted sulfonyl, and substituted sulfinyl.
  • target-directed substance refers to a substance that specifically recognizes a specific site.
  • examples of the “targeting substance” used in the present invention include, but are not limited to, antibodies, sugar chains, lectins, complementary nucleic acids, receptors, ligands, aptamers, antibodies, and the like. . This is because the target directing substance may be any substance that imparts target directivity to the liposome without destroying the liposome. A person skilled in the art can appropriately determine the target-directing substance to be bound to the liposome according to the target.
  • antibody refers to an immunoglobulin molecule having a specific amino acid sequence elicited by an antigen that is an immunogen. Antibodies are produced by B cells and are present in blood and body fluids. An antibody has the characteristic of reacting specifically with an antigen. The antibody may be present naturally rather than as a result of stimulation by presentation of the antigen. Basically, the molecular structure of an antibody is formed by two light chains and a heavy chain, but can also exist as a dimer, trimer, or pentamer. Examples of these include, but are not limited to, IgA, IgE, IgM, IgG, and the like. Examples of the antibody include, but are not limited to, an anti-E selectin antibody, an anti-P selectin antibody, and an anti-EGFR antibody.
  • lectin refers to a substance capable of binding to sugar chains of cell membrane complex carbohydrates (glycoproteins and glycolipids), and induces cell aggregation and division according to the type of cell membrane complex carbohydrate to be bound. , Have the ability to exert effects such as functional activation and cell damage. If sugar chains are information molecules transmitted by cells, lectins can be said to be receiving molecules. Cells or tissues with certain properties have a corresponding lectin pattern. Lectins achieve infection, biological defense, immunity, fertilization, targeting to target cells, cell differentiation, cell-cell adhesion, quality control of nascent glycoproteins and intracellular sorting and transport.
  • Lectins have extensive sugar chain binding properties and are strictly controlled by their inherent physicochemical properties of rapid association and dissociation. Also called sugar chain recognition protein. Research on plant lectins is old, and about 300 kinds are already known. Recently, active research has been conducted on animal lectins, and the discovery of new lectins continues. Various sugar chain recognition functions based on lectins (about 100 types) of major lectin families present on animal cell membranes have been studied. In particular, the function as a receptor (information receiving protein or target molecule) for receiving structural information of sugar chain ligands having various structures has been attracting attention.
  • complementary nucleic acid is defined as the broadest meaning used in the art, and refers to nucleic acids that can form base pairs with each other by the base pairing rule of nucleic acids. Examples of these include, but are not limited to, DNA and RNA.
  • receptor is also referred to as “receptor” and refers to a substance that exists in a cell and has a structure for recognizing and transmitting an external stimulus. Examples of these include, but are not limited to, cell surface receptors and intracellular receptors.
  • ligand refers to a molecule that itself is very strongly adsorbed, and usually refers to a substance that specifically binds to a protein (for example, a receptor). Examples of these include, but are not limited to, proteins, nucleic acids, chemical substances, and the like.
  • aptamer refers to a nucleic acid having a relatively small molecular weight that can recognize and bind to the structures of various substances (proteins, chemical substances, etc.). Examples of these include, but are not limited to, RNA aptamers and DNA aptamers.
  • antigen refers to a substance that binds to an antibody, and preferably refers to a substance that has a function of promoting antibody production. Examples include, but are not limited to, macromolecular sugars, proteins, complexes thereof, viruses, cells, and the like.
  • the “sugar chain” refers to a compound in which one or more unit sugars (monosaccharides and / or derivatives thereof) are linked. When two or more unit sugars are connected, each unit sugar is bound by dehydration condensation by a glycosidic bond.
  • sugar chains include polysaccharides (glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid and complexes and derivatives thereof) contained in the living body.
  • sugar chains that are decomposed or derived from complex biomolecules such as degraded polysaccharides, glycoproteins, proteoglycans, glycosaminoglycans, glycolipids, and the like. Therefore, in the present specification, the sugar chain can be used interchangeably with “polysaccharide”, “sugar”, “saccharide”, and “carbohydrate”. Further, unless otherwise specified, the “sugar chain” in the present specification may include both sugar chains and sugar chain-containing substances.
  • monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, chitosan, dextran, and complexes and derivatives thereof
  • monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, chitosan, dextran, and complexes and derivatives thereof
  • monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, chitosan, dextran, and complexes and derivatives thereof
  • the functions differ depending on the sequence of monosaccharides, and they are usually branched in a complex manner
  • sugar chains examples include serial Lewis X (SLX: Neu5Ac ⁇ 2,3Gal ⁇ 1,4 (Fuc ⁇ 1,3) GlcNAc), N-acetyllactosamine (Gal ⁇ 1,4GlcNAc), ⁇ 1-6 mannobiose (Man ⁇ 1,6Man), A combination of two or more thereof is exemplified, but the invention is not limited thereto.
  • “monosaccharide” refers to polyhydroxyaldehyde or polyhydroxyketone containing at least one hydroxyl group and at least one aldehyde group or ketone group, and constitutes the basic unit of a sugar chain.
  • a sugar chain refers to a chain or a sequence of one or more monosaccharides, and when referred to as a monosaccharide, it refers to one unit constituting the sugar chain.
  • it corresponds to an aldehyde or ketone of a chain polyhydric alcohol.
  • the former is called aldose and the latter is called ketose.
  • the term “sugar” includes both “monosaccharide” and “sugar chain”.
  • “monosaccharide” and “sugar chain” are included. Any one of the complexes is shown. In the present invention, any type can be used.
  • imaging refers to imaging
  • molecular imaging refers to imaging at the molecular level.
  • In vivo imaging refers to imaging of the function or structure of a living body.
  • imaging agent refers to a drug or factor used to image a function or structure of a living body, and is also referred to as “contrast agent”.
  • imaging agent include those used for imaging tumor tissue, inflammatory tissue and the like in a living body.
  • the liposome can be prepared by any technique known in the art.
  • liposomes can be prepared by sonication, ethanol injection, French press method, ether injection method, cholic acid method, lyophilization method, reverse phase evaporation method (for example, “New Development of Liposome Application-Artificial Cells”).
  • sonication for example, “New Development of Liposome Application-Artificial Cells”.
  • ether injection method for example, “New Development of Liposome Application-Artificial Cells”.
  • cholic acid method for example, “New Development of Liposome Application-Artificial Cells”.
  • liposomes can be produced by a) preparation of mixed micelles of lipid and surfactant, and b) dialysis of mixed micelles.
  • Liposomes can also be produced by lyophilization.
  • the lyophilization method is described in, for example, H.H. Kikuchi, N .; Suzuki et al, Biopharm. Drug Dispos. 17, 589-605 (1999).
  • the particle size can be adjusted by a French press method or a membrane filter method.
  • a liposome having a molar ratio of dipalmitoyl phosphatidylcholine, cholesterol, dicetyl phosphate, and ganglioside of 35: 45: 5: 15 can be produced.
  • the liposome of the present invention preferably contains a lipid containing a group that can be a functional group such as ganglioside, glycolipid, or phosphatidylglycerol. This is because a linker such as albumin is easily bonded.
  • the liposome of the present invention preferably contains phosphatidylethanolamine. This is because inclusion of phosphatidylethanolamine facilitates bonding with a hydrophilicity-imparting group (such as tris (hydroxyalkyl) aminoalkane).
  • a sugar chain contained in the glycolipid is used as a constituent by combining lipids containing a group that can be a functional group such as ganglioside, glycolipid, or phosphatidylglycerol when preparing a liposome. Liposomes can be made.
  • the liposome of the present invention may comprise dipalmitoyl phosphatidylcholine, cholesterol, ganglioside, dicetyl phosphate, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, sodium cholate.
  • the liposome is stable even when stored at 4 ° C. for several months.
  • the stability of liposomes in vivo can be examined using a mouse. Liposomes are intravenously injected into mice, blood is collected after 3 hours to prepare serum, and ultrafiltration is performed using a membrane having a pore size of 0.03 ⁇ m to purify and collect the liposomes. As a result of the SEM observation, it can be confirmed that the form of the liposome is not changed before and after the treatment and recovery for 3 hours in vivo.
  • the protein amount of the liposome can be measured, for example, by the BCA method by measuring the amount of HSA encapsulated in the liposome and the total protein amount of HSA coupled to the liposome surface.
  • Micro BCA TM Protein Assay Reagent kit (catalog number 23235BN) (PIERCE Co. LTD) can be used for the measurement of the amount of protein.
  • 2 mg / ml albumin (BSA) may be used.
  • a standard solution a standard substance (2 mg / ml: albumin) is diluted with a PBS buffer solution to prepare solutions of 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 ⁇ g / 50 ⁇ l.
  • the liposome is diluted 20 times with PBS buffer to prepare a sample solution.
  • the protein amount of the liposome of the present invention can be, for example, in the range of 0 to 1 mg / ml.
  • the protein amount of the metal colloid-containing liposome can be, for example, 0.01 mg / ml or more.
  • the amount of the constituent lipid of the liposome or metal colloid-containing liposome can be calculated, for example, by quantifying the amount of cholesterol.
  • Determinator TC555 kit (catalog number UCC / EAN128) (KYOWA Co. LTD) can be used for lipid quantification.
  • As a standard substance use 50 mg / ml cholesterol attached to the kit.
  • a standard solution a standard substance (50 mg / ml: cholesterol) is diluted with a PBS buffer solution, and 0, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 5, 10 ⁇ g / 20 ⁇ l solution To prepare.
  • the liposome is diluted 5-fold with PBS buffer to prepare a sample solution.
  • the conversion formula for obtaining the lipid content from the cholesterol content is expressed, for example, as follows.
  • Lipid amount ( ⁇ g / 50 ⁇ l) cholesterol amount ( ⁇ g / 50 ⁇ l) ⁇ 4.51 (conversion factor)
  • the amount of lipid contained in the liposome can also be measured using a phospholipid C-test (Wako).
  • the phospholipid standard solution of the kit is mixed with the color developing solution to prepare 5961 ⁇ g / mL, 3000 ⁇ g / mL, and 1500 ⁇ g / mL solutions.
  • (1) Mix all of the color former and buffer of the kit to obtain a color developing solution.
  • (2) Add 5 ⁇ l of sample solution to 0.75 mL of coloring reagent.
  • the conversion formula for obtaining the lipid amount from the phospholipid concentration is expressed as follows, for example.
  • a 595 ⁇ 0.964 ⁇ 45.6 / 16.8 lipid amount 0.964—error from the conversion value on the kit display. Conversion factor. 45.6 ... total amount of lipid 16.8 ... amount of dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC)
  • the ratio of protein to lipid in the liposome can be derived, for example, from the results of protein quantification and lipid quantification described above.
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention preferably has a protein to lipid ratio of about 0 to 0.5.
  • the amount of lipid in the metal colloid-containing liposome of the present invention can be in the range of 0 to 5 mg / ml, for example.
  • the particle size distribution and particle size of the liposome of the present invention and the metal colloid-containing liposome are measured, for example, by diluting the liposome particles 50 times with purified water and using Zetasizer Nano (Nan-ZS: MALVERN Co. LTD). can do.
  • the liposome can include a targeting agent.
  • a protein is preferably used as a linker, and the coupling of a protein to which a target-directing substance (eg, sugar chain or antibody) is bound to the liposome can be performed by the following two-step reaction. a) Periodate oxidation of gangliosides or other equivalents (eg, lipids containing functional groups such as glycolipids or phosphatidylglycerols) on the liposome membrane, and b) oxidation to oxidized liposomes by reductive amination reaction. Coupling of proteins bound by targeting substances.
  • a protein containing a desired targeting substance can be bound to a liposome, and a wide variety of liposomes having a desired targeting property can be obtained.
  • the present invention provides a metal colloid-containing liposome.
  • One important feature of the present invention is that it contains a sufficient amount of metal colloid as an imaging agent.
  • the metal colloid contained in the metal colloid-containing liposome of the present invention include lithium (Li), beryllium (Be), sodium (Na), magnesium (Mg), aluminum (Al), potassium (K), and calcium (Ca ), Scandium (Sc), titanium (Ti), vanadium (V), chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe), cobalt (Co), nickel (Ni), copper (Cu), zinc (Zn ), Gallium (Ga), germanium (Ge), rubidium (Rb), strontium (Sr), yttrium (Y), zirconium (Zr), niobium (Nb), molybdenum (Mo), technetium (Tc), ruthenium (Ru) ), Rhodium (Rh
  • Preferable examples include metals such as iron (Fe), gadolinium (Gd), gold (Au), and europium (Eu), but are not limited thereto.
  • the metal colloid can be prepared by dispersing the metal in a hydrophobic solvent such as toluene, xylene, hexane, or tetradecane. Further, gold, silver, and the like can be dispersed in a polar solvent such as water. Preferably, the metal colloid can be gold dispersed in water. If the amount of metal colloid sufficient as an imaging agent is, for example, gold, the amount described below in this specification, for example, 8.2 ⁇ g or more as the amount of gold per 1 mg lipid can be exemplified. For other metals, an amount equivalent to the amount of gold can be calculated in consideration of common technical knowledge in the field.
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention includes gadopentetate meglumine (for example, Magnevist (registered trademark) manufactured by Nihon Schering Co., Ltd.), gadoteridol (for example, Bristol Eisai Co., Prohans), felcarbotran (Nippon Schering Co., Ltd.). Manufactured by Rhizovist (registered trademark), ammonium iron citrate (for example, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Ferriselz), and the like.
  • gadopentetate meglumine for example, Magnevist (registered trademark) manufactured by Nihon Schering Co., Ltd.
  • gadoteridol for example, Bristol Eisai Co., Prohans
  • felcarbotran Neippon Schering Co., Ltd.
  • Rhizovist registered trademark
  • ammonium iron citrate for example, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Ferriselz
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention may contain a gold colloid as the metal colloid.
  • the colloidal gold-containing liposome has a gold amount of 8.2 ⁇ g or more per 1 mg lipid, a gold amount of 28.7 ⁇ g or more per ml of liposome solution, and a gold amount of 8.2 ⁇ 10 ⁇ 15 mg per liposome.
  • the above metal colloid can be included, it is not limited to these.
  • the colloidal gold-containing liposome of the present invention may contain a gold amount of 3 ⁇ 10 ⁇ 15 mg to 3 ⁇ 10 ⁇ 11 mg per liposome.
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention may further contain a targeting substance (eg, antibody, sugar chain, lectin, complementary nucleic acid, receptor, ligand, aptamer, antibody, etc.).
  • a targeting substance eg, antibody, sugar chain, lectin, complementary nucleic acid, receptor, ligand, aptamer, antibody, etc.
  • the target-directing substance can be bound by including a lipid containing a functional group such as ganglioside, glycolipid, or phosphatidylglycerol in a liposome and binding a linker such as a peptide thereto.
  • the sugar chain that can be used in the present invention includes, for example, serial Lewis X (SLX: Neu5Ac ⁇ 2,3Gal ⁇ 1,4 (Fuc ⁇ 1,3) GlcNAc), N-acetyllactosamine (Gal ⁇ 1, 4GlcNAc), ⁇ 1-6 mannobiose (Man ⁇ 1,6Man), combinations of two or more thereof, and the like, but are not limited thereto.
  • serial Lewis X SLX: Neu5Ac ⁇ 2,3Gal ⁇ 1,4 (Fuc ⁇ 1,3) GlcNAc
  • N-acetyllactosamine Gal ⁇ 1, 4GlcNAc
  • ⁇ 1-6 mannobiose Man ⁇ 1,6Man
  • examples of antibodies that can be used as the target-directing substance of the present invention include, but are not limited to, an anti-E selectin antibody, an anti-P selectin antibody, and an anti-EGFR antibody.
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention may further contain a desired substance.
  • a desired substance include, but are not limited to, fluorescent dyes, fluorescent proteins (eg, GFP, CFP, YFP, etc.), and luminescent enzymes (eg, luciferase).
  • Fluorescent dyes include, for example,
  • Cy7 (registered trademark), Cy3B (registered trademark), Cy3.5 (registered trademark), Alexa Fluoro (registered trademark) 350, Alexa Fluoro (registered trademark) 488, Alexa Fluoro (registered trademark) 532, Alexa Fluoro (registered trademark) 546, Alexa Fluoro (registered trademark) 594, Alexa Fluoro (registered trademark) 633, Alexa Fluoro (registered trademark) 647, Alexa Fluoro (registered trademark) 680, Alexa Fluoro (registered trademark) 700, Alexa Fluoro (registered trademark) 750, Examples include, but are not limited to, fluorescein-4-isothiocyanate (FITC), rhodamine, calcein, and combinations thereof.
  • FITC fluorescein-4-isothiocyanate
  • rhodamine rhodamine
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention comprises, for example, A) a step of suspending a lipid membrane in a metal colloid solution and preparing a metal colloid lipid membrane suspension: and B) the metal colloid lipid suspension.
  • B) the metal colloid lipid suspension can be produced by a method comprising a step of subjecting to a condition for maintaining liposome formation.
  • the colloidal metal solution that can be used in the method includes, for example, the desired metal in distilled water, secondary distilled water, ultrapure water, N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid.
  • Buffer pH 8.4
  • carbonate buffer pH 8.5
  • phosphate buffer pH 8.0
  • 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) buffer Agent (pH 7.2), tris (hydroxy) aminomethane buffer, 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid buffer, N-tris (hydroxymethyl) 1-2-aminoethanesulfonic acid buffer, N-2 -Hydroxyethylpiperazine-N'-2 ethanesulfonic acid buffer, N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfone Acid buffer, piperazine-N, N′-bis (2-hydroxypropa
  • the metal colloid can be prepared by dissolving a metal in ultrapure water.
  • the metal colloid can also be used by adjusting a commercially available metal colloid, for example, manufacturer: Wine Red Chemical Co., Ltd., product name: gold colloid (for immunochromatography), production code: WRGM3, etc. to a desired concentration. .
  • the lipid membrane that can be used in the present method is prepared by, for example, suspending and stirring a lipid capable of forming liposomes in an organic solvent, evaporating the stirred organic solvent, and drying the precipitate in vacuum.
  • suspending and stirring a lipid capable of forming liposomes in an organic solvent evaporating the stirred organic solvent, and drying the precipitate in vacuum.
  • examples of the lipid having liposome-forming ability include, but are not limited to, dipalmitoyl phosphatidylcholine, cholesterol, ganglioside, dicetyl phosphate, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, and sodium cholate. This is because it is only necessary to prepare a lipid membrane. Those skilled in the art can appropriately select such lipids according to the purpose.
  • the organic solvent used in the method may be any one that dissolves lipids and is volatile. These include, but are not limited to, alcohol, ether, acetone, and the like.
  • the organic solvent can be diethyl ether, methanol, acetonitrile, acetone, ethanol, methylene chloride, chloroform, isopropanol, toluene, xylene, more preferably a mixture of methanol and chloroform.
  • Those skilled in the art can appropriately select such an organic solvent in accordance with the lipid to be used.
  • metal colloids that can be used in the method include, for example, lithium (Li), beryllium (Be), sodium (Na), magnesium (Mg), aluminum (Al), potassium (K), calcium.
  • Ca scandium (Sc), titanium (Ti), vanadium (V), chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe), cobalt (Co), nickel (Ni), copper (Cu), zinc (Zn), gallium (Ga), germanium (Ge), rubidium (Rb), strontium (Sr), yttrium (Y), zirconium (Zr), niobium (Nb), molybdenum (Mo), technetium (Tc), ruthenium (Ru), rhodium (Rh), palladium (Pd), silver (Ag), cadmium (Cd), indium (In), tin (Sn), antimony (Sb), cesium (Cs), barium (Ba), lanthanum (La), cerium
  • Preferable examples include metals such as iron (Fe), gadolinium (Gd), gold (Au), and europium (Eu), but are not limited thereto.
  • the metal colloid can be prepared by dispersing the metal in a hydrophobic solvent such as toluene, xylene, hexane, or tetradecane. Further, gold, silver, and the like can be dispersed in a polar solvent such as water. Preferably, the metal colloid can be gold dispersed in water.
  • the colloidal gold can also be prepared by dispersing a saccharide, a buffer containing amines, and the like.
  • the metal colloid solution is a gold colloid
  • the lipid membrane that can be used in the present method is a concentration of 0.001 to 10 mg / mg lipid, preferably as a gold amount with respect to the gold colloid solution, preferably
  • the concentration of gold can be suspended at a concentration of 0.01-1 mg / mg of lipid, and more preferably at a concentration of about 0.22 mg / mg of lipid as a gold amount, but is not limited to this concentration.
  • the step A) of the production method comprises (A1) gold colloid in a gold amount of 0.1 to 10 mg / ml, preferably a gold amount of 0.25 to 8 mg / ml, A step of preparing a colloidal gold solution by dispersing in a liquid to a concentration of 0.5 to 5 mg / ml, 0.75 to 3 mg / ml, more preferably 1 mg / ml; (A2) liposome formation Active lipids (for example, dipalmitoyl phosphatidylcholine, cholesterol, ganglioside, dicetyl phosphate, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, sodium cholate, etc.) are suspended in an organic solvent (for example, methanol / chloroform solution) and stirred.
  • an organic solvent for example, methanol / chloroform solution
  • the lipid membrane is applied to the colloidal gold solution at a concentration of 0.001 to 10 mg / mg of lipid, preferably 0.01 to 1 mg / mg of lipid as a gold amount, more preferably about gold as a gold amount. Suspending at a concentration of 0.22 mg / mg lipid and preparing a gold colloidal lipid membrane suspension may be included.
  • the gold colloid is converted into, for example, distilled water, secondary distilled water, ultrapure water, N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid buffer (pH 8.4), carbonate buffer.
  • the liposome formation maintaining condition in the present method can be, for example, replacing the metal colloidal lipid suspension with nitrogen, sonicating, and subjecting to ultrafiltration.
  • the liposome formation and maintenance conditions can be that the metal colloidal lipid suspension is purged with nitrogen, sonicated, and subjected to ultrafiltration at a molecular weight cut-off of 500 to 300,000, preferably 10,000.
  • the liposome formation maintaining condition may include a step of encapsulating a desired substance in the liposome.
  • a desired substance include, but are not limited to, a fluorescent dye, a fluorescent protein (for example, GFP, CFP, YFP, and the like), and a luminescent enzyme (for example, luciferase and the like).
  • Fluorescent dyes include, for example,
  • Cy7 (registered trademark), Cy3B (registered trademark), Cy3.5 (registered trademark), Alexa Fluoro (registered trademark) 350, Alexa Fluoro (registered trademark) 488, Alexa Fluoro (registered trademark) 532, Alexa Fluoro (registered trademark) 546, Alexa Fluoro (registered trademark) 594, Alexa Fluoro (registered trademark) 633, Alexa Fluoro (registered trademark) 647, Alexa Fluoro (registered trademark) 680, Alexa Fluoro (registered trademark) 700, Alexa Fluoro (registered trademark) 750, Examples include, but are not limited to, fluorescein-4-isothiocyanate (FITC), rhodamine, calcein, and combinations thereof.
  • FITC fluorescein-4-isothiocyanate
  • rhodamine rhodamine
  • the step B) of the present production method includes the step (B1) of stirring the metal colloidal lipid suspension at 10 to 60 ° C., preferably 30 to 40 ° C., and replacing with nitrogen; (B2) Sonicating the nitrogen-substituted metal colloidal lipid membrane suspension; and (B3) sonicating the metal colloidal lipid suspension with a molecular weight cut-off of 500 to 300,000, preferably 10,000.
  • a step of subjecting to ultrafiltration may be included.
  • the step of binding the target-directing substance includes: i) a step of hydrophilizing the obtained liposome; ii) a step of binding the target-directing substance to the liposome; iii) the target-directivity A step of hydrophilizing the liposome to which the substance is bound, and iv) a step of ultrafiltration of the solution containing the hydrophilized liposome can be included.
  • target-directing substances include sugar chains (eg, serial Lewis X, N-acetyllactosamine, ⁇ 1-6 mannobiose), antibodies (eg, anti-E selectin antibody), lectins, complementary nucleic acids, receptors, ligands, aptamers, Examples include, but are not limited to, antigens. This is because the target directing substance may be any substance that imparts target directivity to the liposome without destroying the liposome. A person skilled in the art can appropriately determine the target-directing substance to be bound to the liposome according to the target.
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention comprises: a) a step of suspending a lipid membrane in a lipid membrane suspension buffer to prepare a lipid membrane suspension; and b) the lipid suspension and a metal. It can also be produced by a method including a step of mixing with a colloidal solution and subjecting it to liposome formation maintaining conditions.
  • the lipid membrane that can be used in the present method is prepared by, for example, suspending and stirring a lipid capable of forming liposomes in an organic solvent, evaporating the stirred organic solvent, and drying the precipitate in vacuum.
  • suspending and stirring a lipid capable of forming liposomes in an organic solvent evaporating the stirred organic solvent, and drying the precipitate in vacuum.
  • examples of the lipid having liposome-forming ability include, but are not limited to, dipalmitoyl phosphatidylcholine, cholesterol, ganglioside, dicetyl phosphate, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, and sodium cholate. This is because it is only necessary to prepare a lipid membrane. Those skilled in the art can appropriately select such lipids according to the purpose.
  • the organic solvent used in the method may be any one that dissolves lipids and is volatile. These include, but are not limited to, alcohol, ether, acetone, and the like.
  • the organic solvent can be diethyl ether, methanol, acetonitrile, acetone, ethanol, methylene chloride, chloroform, isopropanol, toluene, xylene, more preferably a mixture of methanol and chloroform.
  • Those skilled in the art can appropriately select such an organic solvent in accordance with the lipid to be used.
  • the lipid membrane that can be used in the present method has a lipid concentration of 4 to 50 mg / ml, preferably a lipid concentration of 10 to 20 mg / ml, with respect to the lipid membrane suspension buffer, More preferably, it can be suspended at a lipid concentration of 15.2 mg / ml, but is not limited to this concentration.
  • the lipid membrane suspension buffer used in the production method includes, for example, N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid buffer (pH 8.4), carbonate buffer (PH 8.5), phosphate buffer (pH 8.0), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) buffer (pH 7.2), Tris (hydroxy) Aminomethane buffer, 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid buffer, N-tris (hydroxymethyl) 1-2-aminoethanesulfonic acid buffer, N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2 ethanesulfone Acid buffer, N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid buffer, piperazine-N, N ′ Bis (2-hydroxypropanesulfonic acid) buffer, N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-hydroxypropan
  • the metal colloid that can be used in the method includes, for example, the desired metal in distilled water, secondary distilled water, ultrapure water, N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropane sulfonate buffer.
  • Agent pH 8.4
  • carbonate buffer pH 8.5
  • phosphate buffer pH 8.0
  • 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) buffer PH 7.2
  • tris (hydroxy) aminomethane buffer 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid buffer
  • N-tris (hydroxymethyl) 1-2-aminoethanesulfonic acid buffer N-2- Hydroxyethylpiperazine-N'-2 ethanesulfonic acid buffer
  • N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid Impactant piperazine-N, N′-bis (2-hydroxypropanesulfonic
  • the metal colloid can be prepared by dissolving a metal in ultrapure water.
  • the metal colloid can also be used by adjusting a commercially available metal colloid, for example, manufacturer: Wine Red Chemical Co., Ltd., product name: gold colloid (for immunochromatography), production code: WRGM3, etc. to a desired concentration. .
  • the step a) of the production method comprises (a1) a lipid having a liposome-forming ability (for example, dipalmitoyl phosphatidylcholine, cholesterol, ganglioside, dicetyl phosphate, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, sodium cholate, etc.) Is suspended in an organic solvent (for example, methanol / chloroform solution), stirred, the stirred organic solvent is evaporated, and the precipitate is vacuum-dried to obtain a lipid membrane; and (a2) the lipid membrane is A step of suspending in the lipid membrane suspension buffer (for example, N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid buffered physiological saline) to prepare a lipid membrane suspension may be included.
  • the lipid concentration of the lipid membrane suspension is 4 to 50 mg / ml, preferably 10 to 20 mg / ml, more preferably 15.2 mg /
  • the liposome formation maintaining condition can be, for example, replacing the lipid suspension with nitrogen, sonicating, and subjecting the suspension to ultrafiltration using a metal colloid solution.
  • the liposome formation maintaining condition is that the lipid suspension is purged with nitrogen, sonicated, and subjected to ultrafiltration using a metal colloid solution with a molecular weight cut-off of 500 to 300,000, preferably 10,000. It can be.
  • the liposome formation maintaining condition may include a step of encapsulating a desired substance in the liposome.
  • a desired substance include, but are not limited to, a fluorescent dye, a fluorescent protein (for example, GFP, CFP, YFP, and the like), and a luminescent enzyme (for example, luciferase and the like).
  • Fluorescent dyes include, for example,
  • Cy7 (registered trademark), Cy3B (registered trademark), Cy3.5 (registered trademark), Alexa Fluoro (registered trademark) 350, Alexa Fluoro (registered trademark) 488, Alexa Fluoro (registered trademark) 532, Alexa Fluoro (registered trademark) 546, Alexa Fluoro (registered trademark) 594, Alexa Fluoro (registered trademark) 633, Alexa Fluoro (registered trademark) 647, Alexa Fluoro (registered trademark) 680, Alexa Fluoro (registered trademark) 700, Alexa Fluoro (registered trademark) 750, Examples include, but are not limited to, fluorescein-4-isothiocyanate (FITC), rhodamine, calcein, and combinations thereof.
  • FITC fluorescein-4-isothiocyanate
  • rhodamine rhodamine
  • metal colloids that can be used in the method include, for example, lithium (Li), beryllium (Be), sodium (Na), magnesium (Mg), aluminum (Al), potassium (K), calcium.
  • Ca scandium (Sc), titanium (Ti), vanadium (V), chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe), cobalt (Co), nickel (Ni), copper (Cu), zinc (Zn), gallium (Ga), germanium (Ge), rubidium (Rb), strontium (Sr), yttrium (Y), zirconium (Zr), niobium (Nb), molybdenum (Mo), technetium (Tc), ruthenium (Ru), rhodium (Rh), palladium (Pd), silver (Ag), cadmium (Cd), indium (In), tin (Sn), antimony (Sb), cesium (Cs), barium (Ba), lanthanum (La), cerium
  • Preferable examples include metals such as iron (Fe), gadolinium (Gd), gold (Au), and europium (Eu), but are not limited thereto.
  • the metal colloid can be prepared by dispersing the metal in a hydrophobic solvent such as toluene, xylene, hexane, or tetradecane. Further, gold, silver, and the like can be dispersed in a polar solvent such as water. Preferably, the metal colloid can be gold dispersed in water.
  • the colloidal gold can also be prepared by dispersing a saccharide, a buffer containing amines, and the like.
  • the metal colloid is a gold colloid
  • the step b) of the present production method comprises (b1) 0.1 to 10 mg / ml of the gold colloid as a gold amount, and preferably 0.
  • Prepare a colloidal gold solution by dispersing in a liquid to a concentration of 25-8 mg / ml, 0.5-5 mg / ml, 0.75-3 mg / ml, more preferably 1 mg / ml.
  • the colloidal gold is, for example, distilled water, secondary distilled water, ultrapure water, N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid buffer (pH 8.4), carbonate Buffer (pH 8.5), phosphate buffer (pH 8.0), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) buffer (pH 7.2), Tris ( Hydroxy) aminomethane buffer, 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid buffer, N-tris (hydroxymethyl) 1-2-aminoethanesulfonic acid buffer, N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2 Ethanesulfonic acid buffer, N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid buffer, piperazine-N, N′-bis (2- Roxypropanesulfonic acid) buffer, N-2-hydroxye
  • the lipid suspension and the metal colloid solution may be suspended in a mixing ratio of 1 to 9 to 9 to 1, preferably 3 to 7, but not limited to this range.
  • the step of binding the target-directing substance includes: i) a step of hydrophilizing the obtained liposome; ii) a step of binding the target-directing substance to the liposome; iii) the target-directivity A step of hydrophilizing the liposome to which the substance is bound, and iv) a step of ultrafiltration of the solution containing the hydrophilized liposome can be included.
  • target-directing substances include sugar chains (eg, serial Lewis X, N-acetyllactosamine, ⁇ 1-6 mannobiose), antibodies (eg, anti-E selectin antibody), lectins, complementary nucleic acids, receptors, ligands, aptamers, Examples include, but are not limited to, antigens. This is because the target directing substance may be any substance that imparts target directivity to the liposome without destroying the liposome. A person skilled in the art can appropriately determine the target-directing substance to be bound to the liposome according to the target.
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention can also be produced by a method including a step of mixing a freeze-dried liposome and a metal colloid solution.
  • metal colloids that can be used in the method include, for example, lithium (Li), beryllium (Be), sodium (Na), magnesium (Mg), aluminum (Al), potassium (K), calcium.
  • Ca scandium (Sc), titanium (Ti), vanadium (V), chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe), cobalt (Co), nickel (Ni), copper (Cu), zinc (Zn), gallium (Ga), germanium (Ge), rubidium (Rb), strontium (Sr), yttrium (Y), zirconium (Zr), niobium (Nb), molybdenum (Mo), technetium (Tc), ruthenium (Ru), rhodium (Rh), palladium (Pd), silver (Ag), cadmium (Cd), indium (In), tin (Sn), antimony (Sb), cesium (Cs), barium (Ba), lanthanum (La), cerium
  • Preferable examples include metals such as iron (Fe), gadolinium (Gd), gold (Au), and europium (Eu), but are not limited thereto.
  • the metal colloid can be prepared by dispersing the metal in a hydrophobic solvent such as toluene, xylene, hexane, or tetradecane. Further, gold, silver, and the like can be dispersed in a polar solvent such as water. Preferably, the metal colloid can be gold dispersed in water.
  • the colloidal gold can also be prepared by dispersing a saccharide, a buffer containing amines, and the like.
  • the metal colloid that can be used in the present method is a gold colloid
  • the lyophilized liposome is in an amount of 0.001 to 10 mg / mg lipid, preferably as a gold amount with respect to the gold colloid solution, As gold amount, 0.05 to 0.1 mg / mg lipid, 0.01 to 0.75 mg / mg lipid, 0.025 to 0.5 mg / mg lipid, 0.5 to 1 mg / mg lipid, more preferably, As gold amount it can be suspended at a concentration of 0.05 mg / mg lipid.
  • the freeze-dried liposome that can be used in this production method may be prepared by any method.
  • H.M. Kikuchi, N .; Suzuki et al, Biopharm. Drug Dispos. , 17, 589-605 (1999), etc. can be used lyophilized liposomes prepared by the method reported.
  • the metal colloid includes, for example, a desired metal such as distilled water, secondary distilled water, ultrapure water, N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid buffer (pH 8.4), Carbonate buffer (pH 8.5), phosphate buffer (pH 8.0), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) buffer (pH 7.2), Tris (Hydroxy) aminomethane buffer, 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid buffer, N-tris (hydroxymethyl) 1-2-aminoethanesulfonic acid buffer, N-2-hydroxyethylpiperazine-N'- 2-ethanesulfonic acid buffer, N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid buffer, piperazine-N, N'- (2-hydroxypropanesulfonic acid) buffer, N-2
  • the metal colloid can be prepared by suspending. Preferably, it can be prepared by dissolving a metal in ultrapure water.
  • the metal colloid can also be used by adjusting a commercially available metal colloid, for example, manufacturer: Wine Red Chemical Co., Ltd., product name: gold colloid (for immunochromatography), production code: WRGM3, etc. to a desired concentration. .
  • the metal colloid is a gold colloid
  • the gold amount is 0.001 to 10 mg / mg lipid, preferably 0.05 to 0.1 mg / mg lipid, 0.01 to 0.75 mg / mg lipid, 0.025 to 0.5 mg / mg lipid, 0.5 to 1 mg / mg lipid, more preferably 0.05 mg / mg lipid concentration as gold amount It can be prepared by dissolving.
  • the liposome may contain a target-directing substance.
  • a person skilled in the art can appropriately determine the target-directing substance to be bound to the liposome according to the target.
  • the present invention provides an imaging agent comprising a metal colloid-containing liposome.
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention has at least about 180 ng, about 190 ng, about 200 ng, about 250 ng, about 300 ng, about 350 ng, about 400 ng, about 450 ng, about 500 ng, about 550 ng, about 600 ng, about 650 ng, about 650 ng, 700 ng, about 750 ng, about 800 ng, about 850 ng, about 900 ng, about 950 ng, 1000 ng, about 1100 ng, about 1200 ng, about 1300 ng, about 1400 ng, about 1500 ng, about 1600 ng, about 1700 ng, about 1800 ng, about 1900 ng, about 2000 ng or more Once the metal colloid has accumulated, it can be detected in in vivo imaging.
  • colloidal metal-containing liposome that can be used in the imaging agent of the present invention may further contain a targeting substance (eg, sugar chain, antibody), but is not limited thereto.
  • a targeting substance eg, sugar chain, antibody
  • the metal colloid-containing liposome that can be used in the imaging agent of the present invention may contain iron (Fe), gadolinium (Gd), gold (Au), europium (Eu), etc. as the metal colloid.
  • Fe iron
  • Gd gadolinium
  • Au gold
  • Eu europium
  • Et etc.
  • the metal colloid-containing liposome is a gold colloid-containing liposome, and the gold colloid-containing liposome contains 8.2 ⁇ g or more of metal colloid as a gold amount per 1 mg lipid, or a liposome. It may contain 28.7 ⁇ g or more of metal colloid as the amount of gold per ml of solution.
  • the metal colloid-containing liposome that can be used in the imaging agent of the present invention may contain a desired substance such as a fluorescent dye.
  • the imaging agent of the present invention is used for administering a biological factor to a subject in need of the biological factor, and for the respiratory system, circulatory system, digestive system, urinary / genital system, central nervous system or peripheral. It can also be used to treat mammals with nervous system disorders.
  • the imaging agent of the present invention can be easily performed by those skilled in the art by considering pH, isotonicity, stability, and the like.
  • the molecular imaging agent of the present invention is blended with a pharmaceutically acceptable carrier, solid preparations such as tablets, capsules, granules, powders, powders, siroc, and the imaging agent of the present invention is physiologically Acceptable carriers, excipients or stabilizers (see Japanese Pharmacopoeia 15th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, AR Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, etc.) )
  • a sugar chain composition having a desired degree of purity can be prepared and stored in the form of a lyophilized cake or an aqueous solution.
  • the metal colloid-containing liposome of the present invention enables imaging with higher sensitivity than conventional imaging agents. This is because, in the present invention, by incorporating a sufficient amount of metal colloid as an imaging agent in the liposome, it is possible to accumulate it in the tissue several to several hundred times the conventional amount.
  • the imaging agent of the present invention can be used by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, sex, medical history, cell morphology or type, etc. Can be easily determined.
  • the frequency with which imaging / imaging using the imaging agent of the present invention is performed on a subject (or patient) also depends on the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, sex, and history.
  • a person skilled in the art can easily determine the history and the course of treatment. Examples of the frequency include imaging every day—once every several months (for example, once a week—once a month).
  • Imaging agents can be formulated using pharmaceutically acceptable carriers well known in the art in dosage forms suitable for administration. Such carriers allow drug delivery vehicles to be formulated into liquids, gels, syrups, slurries, suspensions, etc. suitable for ingestion by patients.
  • any form described in the above (liposome), (metal-containing liposome), and (manufacturing method) can be used.
  • composition provides a composition for labeling a desired site.
  • the composition may comprise a metal colloid-containing liposome provided in the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition of the present invention may contain an appropriate formulation material or a pharmaceutically acceptable carrier as required.
  • suitable formulation materials or pharmaceutically acceptable carriers include antioxidants, preservatives, colorants, fluorescent dyes, flavoring agents, diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, buffering agents. , Delivery vehicles and / or pharmaceutical adjuvants.
  • the composition of the present invention is administered in the form of a composition comprising a metal colloid and optionally other active ingredients together with at least one physiologically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • suitable vehicles can be micelles, injection solutions, physiological solutions, or artificial cerebrospinal fluid, which are supplemented with other substances commonly used in compositions for parenteral delivery. It is possible.
  • Acceptable carriers, excipients or stabilizers used herein are preferably non-toxic to recipients and preferably inert at the dosages and concentrations used.
  • phosphate, citrate, or other organic acids e.g., phosphate, citrate, or other organic acids; ascorbic acid, ⁇ -tocopherol; low molecular weight polypeptides; proteins (eg, serum albumin, gelatin, or immunoglobulin); amines (eg, , Diethylenetriaminepentaacetic acid); hydrophilic polymers (eg polyvinylpyrrolidone); amino acids (eg glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (glucose, mannose or dextrin); (Eg EDTA) Sugar alcohols (eg, mannitol or sorbitol); salt-forming counterions (eg, sodium); and / or non-ionic surfactants (eg
  • Exemplary suitable carriers include neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin.
  • the product is formulated as a lyophilizer using a suitable excipient (eg, sucrose).
  • suitable excipient eg, sucrose
  • Other standard carriers, diluents and excipients may be included as desired.
  • Other exemplary compositions include a Tris buffer with a pH of about 7.0-8.5 or an acetate buffer with a pH of about 4.0-5.5, which further includes sorbitol or a suitable replacement thereof. Can contain things.
  • composition of the present invention may be blended with a pharmaceutically acceptable carrier as necessary, and administered parenterally, for example, as a liquid preparation such as an injection, suspension, solution, spray or the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include excipients, lubricants, binders, disintegrants, disintegration inhibitors, absorption enhancers, absorbents, wetting agents, solvents, solubilizers, suspending agents, Examples include isotonic agents, buffering agents, soothing agents and the like.
  • formulation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be used as necessary.
  • compositions used in the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable aqueous solution that is pyrogen free. It is within the skill of the artisan to consider pH, isotonicity, stability, etc. for the preparation of such pharmaceutically acceptable compositions.
  • Suitable examples of the solvent in the liquid preparation include injection solutions, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil and the like.
  • solubilizing agent in the liquid preparation include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate and sodium citrate. It is not limited to them.
  • Suitable examples of the suspending agent in the liquid preparation include, for example, surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate, Examples thereof include hydrophilic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, and hydroxypropyl cellulose.
  • surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate
  • hydrophilic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose
  • Suitable examples of isotonic agents in liquid preparations include, but are not limited to, sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.
  • Suitable examples of the buffer in the liquid preparation include, but are not limited to, phosphate, acetate, carbonate and citrate.
  • soothing agents in liquid preparations include, but are not limited to, benzyl alcohol, benzalkonium chloride and procaine hydrochloride.
  • Preferred examples of the preservative in the liquid preparation include, but are not limited to, p-hydroxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, 2-phenylethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • Suitable examples of the antioxidant in the liquid preparation include, but are not limited to, sulfite, ascorbic acid, ⁇ -tocopherol, cysteine and the like.
  • the solutions and suspensions are preferably sterilized and isotonic with the solvent at the injection site for blood or other purposes.
  • these are sterilized by filtration using a bacteria retention filter or the like, blending with a bactericide, or irradiation.
  • composition of the present invention may contain a coloring agent, a preservative, a fragrance, a flavoring agent, a sweetener, and other substances.
  • the amount of the substance, composition, etc. used in the present invention takes into consideration the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the age, weight, sex, past history, cell morphology or type of the subject. Thus, it can be easily determined by those skilled in the art.
  • the frequency with which the method of the present invention is applied to a subject also takes into account the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the subject's age, weight, gender, medical history, treatment course, etc. A person skilled in the art can easily determine. Examples of the frequency include administration every day—once every several months (for example, once a week—once a month). It is preferable to administer once a week to once a month while observing the course.
  • the amount to be administered can be determined by estimating the amount required by the site to be treated.
  • composition containing the metal-containing liposome of the present invention any form described in (Liposome), (Metal-containing liposome), and (Manufacturing method) can be used.
  • the present invention provides the use of a metal colloid-containing liposome of the present invention for the manufacture of a composition for labeling a desired site.
  • any form described in the above-mentioned (liposome), (metal-containing liposome), and (manufacturing method) can be used.
  • the present invention provides a method for labeling a desired site.
  • the method includes administering to the subject a composition for labeling the desired site, the composition comprising a metal colloid-containing liposome of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier. .
  • subject refers to a living organism to which imaging / imaging using the imaging agent of the present invention is applied, and is also referred to as a “patient”.
  • the patient or subject may be, for example, a bird, a mammal, and the like.
  • animals are mammals (eg, single pores, marsupials, rodents, wings, wings, carnivorous, carnivorous, long-nosed, odd-hoofed, cloven-hoofed) , Rodents, scales, sea cattle, cetaceans, primates, rodents, rabbits, etc.).
  • Exemplary subjects include, but are not limited to, animals such as humans, cows, pigs, horses, chickens, cats, dogs and the like. More preferably, it may be a human.
  • the amount actually administered of the composition of the invention will depend on the individual at which the desired site is to be labeled and is preferably optimized so that the desired labeling is achieved without significant side effects. Amount. Dosage determination is well within the ability of those skilled in the art. The dose will vary within this range depending upon the mode of administration used, patient sensitivity, and route of administration. As an example, the dose is appropriately selected depending on the age and other patient conditions, the type of disease, the type of cells used, and the like.
  • any form described in the above can be used.
  • the total lipid content was 45.6 mg in a molar ratio.
  • 46.9 mg of sodium cholate was added and dissolved in 3 ml of a chloroform / methanol (1: 1) solution. The solution was evaporated and the precipitate was dried in vacuo to obtain a lipid membrane.
  • the colloidal gold solution is a commercially available colloidal gold solution (manufacturer: Wine Red Chemical Co., Ltd., product name: colloidal gold (for immunochromatography), production code: WRGM3) in ultrapure water to a concentration of 1 mg / ml. Prepared by suspending.
  • the obtained lipid membrane was resuspended in a 10 mL colloidal gold solution and stirred at 37 ° C. for 1 hour. The solution was then purged with nitrogen and sonicated, yielding 10 ml of a clear micelle suspension.
  • This micelle suspension was subjected to ultrafiltration using a PM10 membrane (Amicon Co., USA) and N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid buffered physiological saline (TAPS: pH 8.4). Fractionated molecular weight: 10,000) to prepare 10 ml of a liposome particle suspension containing uniform gold colloid.
  • the SLX-modified gold colloid-containing liposome prepared in Example 1 was concentrated 10 times by ultrafiltration (fractionated molecular weight: 300,000).
  • the particle size and zeta potential in physiological saline suspension are measured using a zeta potential / particle size / molecular weight measuring device (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd, UK). It was measured by.
  • the liposome had a particle size of about 50 nm to about 300 nm and a zeta potential of ⁇ 30 to ⁇ 120 mV.
  • the total lipid content was 45.6 mg in a molar ratio.
  • 46.9 mg of sodium cholate was added and dissolved in 3 ml of a chloroform / methanol (1: 1) solution. The solution was evaporated and the precipitate was dried in vacuo to obtain a lipid membrane.
  • the colloidal gold solution is a commercially available colloidal gold solution (manufacturer: Wine Red Chemical Co., Ltd., product name: colloidal gold (for immunochromatography), production code: WRGM3) in ultrapure water to a concentration of 1 mg / ml. Prepared by suspending.
  • the obtained lipid membrane was resuspended in 3 ml of N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid buffer (pH 8.4) and stirred at 37 ° C. for 1 hour. The solution was then purged with nitrogen and sonicated to give 3 ml of a clear micelle suspension. A colloidal gold solution (7 ml) was slowly added dropwise to the sonicated micelle suspension with stirring and mixed uniformly. The colloidal gold micelle suspension was then mixed with a PM10 membrane (Amicon Co., USA).
  • Liposome particle suspension containing uniform gold colloid by ultrafiltration (fraction molecular weight: 10,000) using N-tris (hydroxymethyl) -3-aminomethane (TAPS) buffered saline (pH 8.4) 10 ml of turbid liquid was prepared.
  • TAPS N-tris (hydroxymethyl) -3-aminomethane
  • the particle size and zeta potential in physiological saline suspension are measured using a zeta potential / particle size / molecular weight measuring device (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd, UK). It was measured by. As a result, the particle diameter was about 50 nm to about 300 nm, and the zeta potential was ⁇ 30 to ⁇ 120 mV.
  • the colloidal gold solution was prepared by the same method as the above-described improved cholate dialysis method.
  • the COASTOME EL series (EL-01-PA, NOF) was used as the lyophilized liposome.
  • the colloidal gold solution is a commercially available colloidal gold solution (manufacturer: Wine Red Chemical Co., Ltd., product name: colloidal gold (for immunochromatography), production code: WRGM3) at concentrations of 1 mg / ml and 0.1 mg / mL. In this way, it was prepared by suspending in ultrapure water. 3 mL of each gold colloid solution was dropped into a vial of freeze-dried liposomes.
  • the vial was mixed by inversion 4-5 times, and ultrafiltration using a PM10 (AMICON) and tris (hydroxymethyl) methylaminopropanesulfonate buffer solution (TAPS buffer solution: pH 8.4) 1 (fractionated molecular weight: 10, 000) to prepare 10 mL of each liposome.
  • PM10 AMICON
  • TAPS buffer solution pH 8.4
  • the particle size and zeta potential of the colloidal gold-containing liposome particles in the obtained physiological saline suspension (37 ° C.) were measured with a zeta potential / particle size / molecular weight measuring device (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd, UK). .
  • the colloidal gold-containing liposome has a particle size of about 68.1 nm to about 396 nm with a gold colloid solution encapsulated in a 0.1 mg / mL range, and a zeta potential of ⁇ 81.7 to ⁇ 15.3 mV.
  • the one containing 1 mg / mL colloidal gold solution was about 68.1 nm to about 342 nm, and the zeta potential was -95.9 to 3.57 mV.
  • the particle distribution is shown in FIG.
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • the colloidal gold solution has a concentration of 1 mg / ml and 0.1 mg / ml of a commercially available colloidal gold solution (manufacturer: Wine Red Chemical Co., Ltd., product name: gold colloid (for immunochromatography), production code: WRGM3). In this way, it was prepared by suspending in ultrapure water.
  • the particle size and zeta potential of the colloidal gold-containing liposome particles in the obtained physiological saline suspension (37 ° C.) were measured with a zeta potential / particle size / molecular weight measuring device (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd, UK). .
  • the above liposomes have a particle size of 58.8 nm to about 6440 nm using a 1 mg gold colloid solution, a zeta potential of ⁇ 6.9 to 26.3 mV, and those using 0.1 mg gold colloid. It was 43.8 nm to about 6440 nm, and the zeta potential was ⁇ 44.5 to 10.9 mV.
  • the particle distribution is shown in FIG.
  • the particle size and zeta potential of the colloidal gold-containing liposome particles in the obtained physiological saline suspension (37 ° C.) were measured with a zeta potential / particle size / molecular weight measuring device (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd, UK). .
  • the liposome had a particle size of 68 nm to about 6440 nm and a zeta potential of 30 to 93 mV.
  • the particle distribution is shown in FIG.
  • DTSSP 3,3′-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate)
  • the SLX-modified gold colloid-containing liposome prepared in Example 2 was concentrated 10 times by ultrafiltration (fractionated molecular weight: 300,000).
  • the particle size and zeta potential of the colloidal gold-containing liposome particles in the obtained physiological saline suspension (37 ° C.) were measured with a zeta potential / particle size / molecular weight measuring device (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd, UK). .
  • the sugar chain-modified gold colloid-containing liposome had a particle size of about 50 nm to about 300 nm and a zeta potential of ⁇ 30 to ⁇ 120 mV.
  • the particle size was about 50 nm to about 300 nm, and the zeta potential was ⁇ 30 to ⁇ 120 mV.
  • the particle distribution is shown in FIGS. 4 and 5, respectively.
  • Anti-E-selectin antibody is an anti-E-selectin antibody-producing hybridoma (CL-3) ATCC No. Purified from CRL-2515.
  • Mouse Balb / c (6 weeks old female) was administered pristane 0.5 mL / mouse.
  • the hybridoma was cultured in RPMI (10% FBS, Pc + St) medium at 5% CO 2 and 37 ° C. Cells were suspended in PBS and administered intraperitoneally at 5 ⁇ 10 6 cells / mouse. Ascites was collected about 2 weeks later. Ammonium sulfate was precipitated, the precipitate was dissolved in PBS, and dialyzed against PBS buffer. The solution after dialysis was passed through a protein G column (HiTrap ProteinG column 1 mL). After washing the column, the monoclonal antibody bound to protein G was eluted with 0.1 M glycine buffer (pH 2.7), and the eluate was neutralized with 1 M Tris solution (pH 9.0).
  • DTSSP 3,3′-dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate (DTSSP, Pierce Co., USA: No. 21578) was weighed and dissolved in 400 ⁇ L of CBS buffer (pH 8.5). A DTSSP solution was added, reacted at room temperature for 2 hours, and then allowed to react overnight under refrigeration, and then subjected to ultrafiltration (300K) under CBS buffer (pH 8.5).
  • DTSSP 3,3′-dithiobis
  • Anti-E-selectin antibodies (25 ⁇ g / mL, 50 ⁇ g / mL, 75 ⁇ g / mL, 100 ⁇ g / mL) purified by the above method were added, respectively. Then, after reacting at room temperature for 2 hours, trishydroxyaminomethane (Tris) (132 mg / mL) was added, and the mixture was further reacted at room temperature overnight.
  • Tris trishydroxyaminomethane
  • the particle size and zeta potential of colloidal gold-containing liposome particles in the obtained physiological saline suspension (37 ° C.) were measured with a zeta potential / particle size / molecular weight measuring device (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., UK). .
  • the sugar chain-modified gold colloid-containing liposome had a particle size of about 50 nm to about 300 nm and a zeta potential of ⁇ 30 to ⁇ 120 mV.
  • Liposomes prepared in Example 1 (1. Improved cholate dialysis method (1)) can be modified with an antibody in the same manner as in this example.
  • a liposome (abbreviation: TRIS) is obtained as a comparative sample in which tris (hydroxymethyl) aminomethane subjected to hydrophilization treatment, human serum albumin, and liposome are bound.
  • Example 3 Quantitative analysis of liposome
  • the protein amount was measured using Micro BCA TM Protein Assay Reagent kit (Cat. No. 23235BN) (PIERCE Co. Ltd.). As a standard substance, 2 mg / ml albumin (BSA) attached to the kit was used.
  • BSA Protein Assay Reagent kit
  • a standard substance (2 mg / ml: albumin) was diluted with a PBS buffer solution to prepare solutions of 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 ⁇ g / 50 ⁇ l.
  • the colloidal gold-containing liposome was diluted 20 times with PBS buffer to prepare a sample solution.
  • 50 ⁇ l of each of the standard solution and the sample solution was dispensed into a test tube.
  • 100 ⁇ l of 3% sodium lauryl sulfate solution (SDS solution) was added to each test tube.
  • the test tube was allowed to stand at 60 ° C. for 1 hour. After returning to room temperature, the absorbance at 540 nm was measured, a calibration curve was prepared with the standard solution, and the amount of protein in the liposome was measured.
  • the amount of lipid contained in the liposome was measured using a phospholipid C-test (Wako).
  • the phospholipid standard solution of the kit was mixed with the color developing solution to prepare 5961 ⁇ g / mL, 3000 ⁇ g / mL, and 1500 ⁇ g / mL solutions.
  • a total amount of the color former and the buffering agent of the kit were mixed to obtain a color development reagent.
  • 5 ⁇ l of the sample solution was added to 0.75 mL of the color developing solution.
  • Sample solution and standard solution were dispensed in 250 ⁇ L aliquots into a 96-well plate and incubated in a 37 ° C. incubator for 10 minutes.
  • A595 was measured with a microplate reader, and the phospholipid concentration was calculated.
  • Conversion formula A 595 ⁇ 0.964 ⁇ 45.6 / 16.8 total lipid amount 0.964 for calculating the lipid amount from the phospholipid concentration.
  • DPPC dipalmitoyl phosphatidylcholine
  • FAS flameless atomic absorption spectrophotometry
  • AA-6700 Atomic Absorption Flame Emission Spectrophotometer Shimadzu was used. Under the conditions of a wavelength of 242.8 nm, a slit width of 0.5, and a lamp current of 12 mV, 120 ° C. for 30 seconds, 250 ° C. for 10 seconds, 500 ° C. for 20 seconds, 500 ° C. for 5 seconds, 1700 ° C. for 3 seconds Processed sequentially.
  • a gold standard solution (1 mg Au / ml, 1000 ppm) was diluted with purified water to prepare solutions of 1 ng / ml, 2.5 ng / ml, 5 ng / ml, 10 ng / ml, and a calibration curve was prepared.
  • the liposome solution was multiplied by 1000 to 100,000 times with purified water to obtain a test sample.
  • the gold amount, lipid concentration, gold colloid concentration, etc. of the obtained liposome are summarized in the following table.
  • Gold Gold colloid used for inclusion in liposome
  • Stock solution 1 mg / mL colloidal gold solution 1/20: Gold colloid solution diluted 20-fold of the stock solution 1/10: Gold colloid solution lipid diluted 10-fold of the stock solution
  • Concentration ( ⁇ g / mL): Lipid amount Gold colloid concentration per mL of liposome solution ( ⁇ g / mL): Gold colloid weight per mL of liposome solution ( ⁇ g) Gold colloid amount per microgram of lipid ( ⁇ g): Gold colloid weight per microgram of lipid in the liposome ( ⁇ g) Bangham Method (2): Liposome Bangham Method Prepared by Comparative Example 2 (1): Liposome COATSOME (Registered Trademark) Prepared by Comparative Example 1: Liposome Modified Cholic Acid Method Prepared by Lyophilization Method of Example 1 K1 ( 1): Example 1 (1.
  • Improved cholate dialysis method (1) Improved method) Gold colloid-containing liposome modified cholic acid method modified by sugar chain prepared by K1 (2): Example 1 (2. Improved cholate dialysis method (2) Conventional method) Colloidal gold-containing liposomes prepared by the method and modified with sugar chains. From the above results, the liposome prepared by the Bangham method (1) has a gold amount of 28.7 ⁇ g per ml of the liposome solution and 8.2 ⁇ g per mg of the lipid, whereas the improved cholate dialysis method (1) Liposomes prepared by the improved method had a gold content of 522 ⁇ g / ml of liposome solution and 131 ⁇ g / mg of lipid. Therefore, in the improved cholate dialysis method (1), the gold content was about 15 times higher than that in the Bangham method.
  • the amount of gold contained per liposome is 6.5 ⁇ 10 ⁇ 15 mg in the improved cholate dialysis method (1) and the improved cholate dialysis method (2) and 4. in the conventional method. It was 5 ⁇ 10 ⁇ 15 mg and 1.5 ⁇ 10 ⁇ 14 mg in the lyophilization method.
  • the amount of gold is 8.2 ⁇ 10 ⁇ 15 mg per liposome, all of the gold colloid-containing liposomes of the present invention contain significantly more gold colloid than the Bangham method. It can be said that it was possible.
  • Gold colloid Particle size of gold colloid used for inclusion in liposome K0: Unmodified gold colloid-containing liposome K1: SLX modified gold colloid-containing liposome Au amount ( ⁇ g / mL): Gold colloid weight per 1 mL of liposome solution ( ⁇ g ) Lipid amount ( ⁇ g / mL): Lipid amount per mL of liposome solution.
  • the physical properties of colloidal gold-containing liposomes prepared in Examples 1 and 2 (10-fold concentrated) are shown in the following table.
  • Gold colloid Particle size of gold colloid used for inclusion in liposome K0: Unmodified gold colloid-containing liposome K1: SLX modified gold colloid-containing liposome Au amount ( ⁇ g / mL): Gold colloid weight per 1 mL of liposome solution ( ⁇ g ) Lipid amount ( ⁇ g / mL): Lipid amount per mL of liposome solution
  • Example 4. Confirmation of colloidal gold-containing liposome
  • the SLX-modified colloidal gold-containing liposome produced in Example 2 was used.
  • SLX-modified colloidal gold-containing liposomes were pre-fixed overnight at room temperature using a mixture of 2% glutaraldehyde and 2% formaldehyde. It is then washed with 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) buffer (pH 7.2) and 1.5% OsO 4 with 1.5% OsO 4 at room temperature. After time, fixed. Then, it was washed with 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) buffer (pH 7.2).
  • HEPES 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid
  • the washed sample was dehydrated with 50% ethanol (10 minutes), 70% ethanol (10 minutes), 90% ethanol (30 minutes), 100% ethanol (30 minutes ⁇ twice).
  • This dehydrated sample was continuously immersed in Spurr 1 (30 minutes), Spurr 2 (30 minutes), Spurr 3 (60 minutes, under reduced pressure), Spurr 4 (overnight, under reduced pressure).
  • the embedded sample was heat treated at 45 ° C. for 60 minutes, 60 ° C. for 30 minutes, and 70 ° C. for 14 hours to thermally polymerize Spurr. Subsequently, an ultrathin section having a thickness of 60 to 90 nm was prepared according to a conventional method.
  • Double staining of uranium and lead was carried out as follows.
  • the cover glass was divided according to the size of the sample table. Carbon was deposited on the cracked cover glass. The deposited glass was immersed in a 0.1% poly-L-lysine aqueous solution for 1 minute and gently stirred. Next, this glass was washed with distilled water five times or more and dried in a 37 ° C. incubator. After drying, the liposome solution containing SLX-modified gold colloid was dropped onto the glass and allowed to stand for 1 minute. Excess sample solution was removed so as not to dry the sample.
  • the glass was put in 50% ethanol for 10 minutes, 70% ethanol in 10 minutes, 90% ethanol in 10 minutes, 95% ethanol in 10 minutes, 99% ethanol in 10 minutes, 99.5% ethanol was added for 10 minutes, absolute ethanol was added for 20 minutes, and absolute ethanol was further added and left for 20 minutes.
  • t-butyl alcohol was added and left for 20 minutes, and t-butyl alcohol was replaced again for dehydration.
  • the glass was frozen in a freezer. The frozen sample was dried with a t-butyl alcohol dryer. Then, the sample after drying was adhere
  • the prepared sample was observed using a high-resolution scanning electron microscope S-900 (HITACHI). Specifically, first, it was confirmed that the microscope was ready for use. Next, it was confirmed that the sample exchange chamber was evacuated, and the sample holder was removed. The sample was set in the sample holder, loaded into the sample exchange chamber, and evacuated. The acceleration voltage was confirmed, the observation field of view and the magnification were changed as necessary, and the sample image was observed. The observation image was photographed. The result is shown in FIG.
  • Example 5 In vivo experiment In this example, colloidal gold-containing liposomes were administered to EAT cell transplanted tumor-bearing mice, and the amount of gold in each organ was quantified and the colloidal gold in tissue sections was observed with an electron microscope.
  • the gold colloid-containing liposomes produced in Example 2 were used.
  • mice (Production of tumor-bearing mice) Mice (ddY mice, male, 7 weeks old) were subcutaneously transplanted with Ehrlich ascite tumor (EAT) cells (5 ⁇ 10 6 cells / mouse) in the right thigh and used for experiments 10 days later (FIG. 8). .
  • EAT Ehrlich ascite tumor
  • the SLX-modified colloidal gold-containing liposome solution prepared in Example 2 (500 ⁇ g of gold per ml of liposome solution) and the liposome solution (200 ⁇ l of each) in which the SLX-modified colloidal gold-containing liposome solution was concentrated 10 times were administered to the tumor-bearing mice via the tail vein. did. The tumor, liver and spleen were removed 48 hours after administration.
  • Gold amount was quantified by flameless atomic absorption spectrophotometry (FAAS).
  • FAS flameless atomic absorption spectrophotometry
  • AA-6700 Atomic Absorption Flame Emission Spectrophotometer Shimadzu
  • a gold standard solution (1 mg Au / ml, 1000 ppm) was diluted with purified water to prepare solutions of 1 ng / ml, 2.5 ng / ml, 5 ng / ml, 10 ng / ml, and a calibration curve was prepared.
  • the aqua regia treatment solution was diluted with purified water to obtain a test sample.
  • liver and tumor sites were observed using a transmission electron microscope H-7100 (HITACHI) (hereinafter referred to as TEM observation. Specifically, the following was performed.
  • HITACHI transmission electron microscope H-7100
  • a microscope sample was prepared using an embedding method using a low viscosity resin Spurr (distributor: Cosmo Bio, catalog number: 24300-1).
  • the removed tissue sections were prefixed overnight at room temperature using a mixture of 2% glutaraldehyde and 2% formaldehyde. Subsequently, it was washed with physiological saline and post-fixed with 1.5% OsO 4 at room temperature for 1.5 hours. Then, it was washed with physiological saline.
  • the washed sample was dehydrated with 50% ethanol (10 minutes), 70% ethanol (10 minutes), 90% ethanol (30 minutes), 100% ethanol (30 minutes ⁇ twice).
  • This dehydrated sample was continuously immersed in Spurr 1 (30 minutes), Spurr 2 (30 minutes), Spurr 3 (60 minutes, under reduced pressure), Spurr 4 (overnight, under reduced pressure).
  • the embedded sample was heat treated at 45 ° C. for 60 minutes, 60 ° C. for 30 minutes, and 70 ° C. for 14 hours to thermally polymerize Spurr. Subsequently, an ultrathin section having a thickness of 60 to 90 nm was prepared according to a conventional method.
  • Double staining of uranium and lead was carried out as follows.
  • Liposomes prepared by using the Bangham method in Comparative Examples 1 and 2 can be used for in vivo imaging can be confirmed by using the same method as in this example. Liposomes prepared using the Bangham method are considered to be difficult to use as imaging agents in in vivo imaging because the amount of gold contained in the liposomes is very small.
  • fluorescent dye solution As fluorescent dyes, cy5.5 (registered trademark), cy3 (registered trademark), Cy7 (registered trademark), Cy3B (registered trademark), Cy3.5 (registered trademark), Alexa Fluoro350, Alexa Fluoro (registered trademark) 488, Alexa Fluoro (R) 532, Alexa Fluoro (R) 546, Alexa Fluoro (R) 594, Alexa Fluoro (R) 633, Alexa Fluoro (R) 647, Alexa Fluoro (R) 680, Alexa Fluoro (R) (Registered trademark) 700, Alexa Fluoro (registered trademark) 750, fluorescein-4-isothiocyanate (FITC), rhodamine, calcein, and combinations thereof are used.
  • FITC fluorescein-4-isothiocyanate
  • the human serum albumin / N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid buffer solution was mixed with the fluorescent dye / N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid buffer solution and stirred. This mixed solution is ultrafiltered to remove free fluorescent dye, and a fluorescent dye-labeled human serum albumin solution is prepared.
  • the resulting lipid membrane is resuspended in gold colloid and fluorescent dye solution and stirred.
  • the solution is then purged with nitrogen and sonicated to give 10 ml of a clear micelle suspension.
  • This micelle suspension is subjected to ultrafiltration to obtain a liposome particle suspension containing a gold colloid encapsulating a fluorescent dye.
  • the particle diameter and zeta potential of the obtained gold colloid-containing liposome particles can be measured by a zeta potential / particle diameter / molecular weight measuring device (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd, UK).
  • the obtained lipid membrane is resuspended in N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid buffer and stirred.
  • the solution is then purged with nitrogen and sonicated to obtain a clear micelle suspension.
  • the colloidal gold solution and the fluorescent dye solution are slowly added dropwise to the sonicated micelle suspension with stirring and mixed uniformly, and then the micelle suspension is subjected to ultrafiltration to colloidal gold containing the fluorescent dye.
  • a liposome particle suspension containing is obtained.
  • the particle diameter and zeta potential of the obtained gold colloid-containing liposome particles can be measured by a zeta potential / particle diameter / molecular weight measuring device (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd, UK).
  • Example 2 Hydrophilic treatment on colloidal gold-containing liposome lipid membrane surface
  • the same method as in Example 1 is used, except that the colloidal gold-containing liposome solution containing the fluorescent dye prepared in this example is used.
  • the liposome solution is subjected to ultrafiltration to adjust the pH.
  • the cross-linking reagent bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS 3 ; Pierce Co., USA) was added and stirred. Thereafter, the liposome solution is subjected to ultrafiltration.
  • tris (hydroxymethyl) aminomethane dissolved in carbonate buffer is added to the liposome solution.
  • the solution is stirred and then ultrafiltered to remove free tris (hydroxymethyl) aminomethane.
  • the buffer is exchanged to complete the chemical binding reaction between BS 3 bound to the lipid on the liposome membrane and tris (hydroxymethyl) aminomethane.
  • the particle diameter and zeta potential of the obtained gold colloid-containing liposome particles can be measured by a zeta potential / particle diameter / molecular weight measuring device (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd, UK).
  • the particle diameter and zeta potential of the obtained gold colloid-containing liposome particles can be measured by a zeta potential / particle diameter / molecular weight measuring device (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd, UK).
  • the anti-E-selectin antibody prepared in Example 2 is used as the monoclonal antibody.
  • the dissolved NaBH 3 CN solution was added to the buffer and allowed to react, subjected to ultrafiltration.
  • the crosslinking agent is dissolved in a buffer solution to prepare a crosslinking agent solution. This crosslinker solution is added and allowed to react. Thereafter, it is subjected to ultrafiltration.
  • Tris trishydroxyaminomethane
  • the particle diameter and zeta potential of the obtained gold colloid-containing liposome particles can be measured by a zeta potential / particle diameter / molecular weight measuring device (Model Nano ZS, Malvern Instruments Ltd, UK).
  • Example 7 Preparation of metal colloid-containing liposome
  • the same methods as (1. improved cholate dialysis method (1) improved method) and (2. improved cholate dialysis method (2) conventional method) of Examples 1 and 2 were used.
  • unmodified gold colloid-containing liposomes, SLX-modified gold colloid-containing liposomes and anti-E selectin antibody-modified gold colloid-containing liposomes were prepared.
  • the particle size of the gold colloid used was 10 nm (manufacturer: Wine Red Chemical Co., Ltd., product name: gold colloid (for immunochromatography, production code: WRGM3)) and 40 nm (manufacturer: Wine Red Chemical Co., Ltd., product name: gold colloid ( For immunochromatography), production code: WRGH).
  • the gold colloid solution was prepared in the same manner as in Example 1.
  • Improved cholate dialysis method (1) Improved method) Dipalmitoyl phosphatidylcholine, cholesterol, dicetyl phosphate, ganglioside (total ganglioside extract (brain, butammonium salt) vendor: Avanti, catalog number: 10000232 (860053P)) and dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, respectively 35: 40: 5 The mixture was mixed so that the total lipid amount was 45.6 mg at a molar ratio of 15: 5. To the mixed lipid, 46.9 mg of sodium cholate was added and dissolved in 3 ml of a chloroform / methanol (1: 1) solution. The solution was evaporated and the precipitate was dried in vacuo to obtain a lipid membrane.
  • ganglioside total ganglioside extract (brain, butammonium salt) vendor: Avanti, catalog number: 10000232 (860053P)
  • dipalmitoyl phosphatidylethanolamine respectively 35: 40: 5
  • the obtained lipid membrane was resuspended in a 10 mL colloidal gold solution and stirred at 37 ° C. for 1 hour. The solution was then purged with nitrogen and sonicated, yielding 10 ml of a clear micelle suspension.
  • This micelle suspension was subjected to ultrafiltration using a PM10 membrane (Amicon Co., USA) and N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid buffered physiological saline (TAPS: pH 8.4). Fractionated molecular weight: 10,000) to prepare 10 ml of a liposome particle suspension containing uniform gold colloid.
  • the obtained lipid membrane was resuspended in 3 ml of N-tris (hydroxymethyl) -3-aminopropanesulfonic acid buffer (pH 8.4) and stirred at 37 ° C. for 1 hour. The solution was then purged with nitrogen and sonicated to give 3 ml of a clear micelle suspension. A colloidal gold solution (7 ml) was slowly added dropwise to the sonicated micelle suspension with stirring and mixed uniformly. The colloidal gold micelle suspension was then mixed with a PM10 membrane (Amicon Co., USA).
  • Liposome particle suspension containing uniform gold colloid by ultrafiltration (fraction molecular weight: 10,000) using N-tris (hydroxymethyl) -3-aminomethane (TAPS) buffered saline (pH 8.4) 10 ml of turbid liquid was prepared.
  • TAPS N-tris (hydroxymethyl) -3-aminomethane
  • this liposome solution was subjected to ultrafiltration (fractionated molecular weight: 300,000) with an XM300 membrane and a carbonate buffer (pH 8.5). Next, 40 mg of tris (hydroxymethyl) aminomethane dissolved in 1 ml of carbonate buffer (pH 8.5) was added to 10 ml of liposome solution.
  • the propanesulfonic acid buffer was exchanged with PBS buffer (pH 8.0) to obtain 10 ml of oxidized liposomes.
  • PBS buffer pH 8.0
  • 20 mg of human serum albumin (HSA) / PBS buffer (pH 8.0) was added and allowed to react at room temperature for 2 hours, and then 100 ⁇ l of 2M NaBH 3 CN / PBS buffer (pH 8.0).
  • HSA human serum albumin
  • the mixture was stirred overnight, ultrafiltered (fractionated molecular weight: 300,000) with XM300 membrane and carbonate buffer (pH 8.5) to remove free DTSSP, and DTSSP bound to HSA on the liposome. 10 ml was obtained. Next, 37.5 ⁇ l of the aminated sugar chain solution is added to the liposome solution and reacted at room temperature for 2 hours. Tris (hydroxymethyl) aminomethane / carbonate buffer (pH 8.5) is added, and then The mixture was stirred overnight under refrigeration, and the glycosylated amine compound was bound to DTSSP on liposome membrane surface-bound human serum albumin.
  • DTSSP 3,3′-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate (DTSSP, manufactured by PIERCE: No. 21578) was weighed, and the DTSSP solution dissolved in 400 ⁇ L of CBS buffer (pH 8.5) was used. The mixture was added, reacted at room temperature for 2 hours, and allowed to react overnight under refrigeration, and then subjected to ultrafiltration (300K) under CBS buffer (pH 8.5).
  • DTSSP 3,3′-dithiobis
  • Tris trishydroxyaminomethane
  • the amount of protein contained in the liposome was measured in the same manner as in Example 3 using the Micro BCA TM Protein Assay Reagent kit (Catalog No. 23235BN) (PIERCE Co. LTD).
  • the amount of lipid contained in the liposome was measured by the same method as in Example 3 using a phospholipid C-test (Wako).
  • improved cholate dialysis method (2) colloidal gold-containing liposome prepared by conventional method: improved cholate dialysis method (1) colloidal gold-containing liposome prepared by improved method 10 nm: gold colloid used Particle size of K0: Unmodified gold colloid-containing liposome K1: SLX modified gold colloid-containing liposome
  • Anti-E-selectin antibody Anti-E-selectin antibody-containing liposome initial concentration ( ⁇ g / mL): Gold per mL of liposome solution before hydrophilization
  • improved cholate dialysis method (2) colloidal gold-containing liposome prepared by conventional method: improved cholate dialysis method (1) colloidal gold-containing liposome prepared by improved method 10 nm: gold colloid used Particle size of K0: Unmodified gold colloid-containing liposome K1: SLX modified gold colloid-containing liposome
  • Anti-E-selectin antibody Anti-E selectin antibody-containing liposome protein amount (mg / mL): Protein amount per 1 mL of liposome solution (mg) Lipid amount (mg / mL): Lipid amount per 1 mL of liposome solution (mg) P / L value: Protein amount relative to lipid amount
  • the present invention has the usefulness that a metal colloid that cannot be contained in the liposome or has a low content efficiency can be efficiently contained in the liposome. Therefore, the usefulness of using a metal colloid-containing liposome that could not be used in in vivo imaging as an imaging agent is provided.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本発明は、金属コロイドを大量に含有させたリポソームを提供することを課題とする。本発明は、金属コロイド含有リポソームを提供する。本発明はまた、金属コロイド含有リポソームを製造する方法を提供する。さらに、本発明はまた、金属コロイド含有リポソームを含むイメージング剤、組成物を提供する。本発明の金属含有リポソームは、金属として、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、ユーロピウム（Ｅｕ）などを含み得る。また、金属コロイド含有リポソームは標的指向性物質をさらに含み得る。

Description

金属コロイド含有リポソーム
　本発明は、金属コロイドを含有するリポソームおよびその製造方法に関する。本発明はまた、金属コロイド含有リポソームを含むイメージング剤に関する。
　金属コロイドは、イメージング剤として利用されている。しかし、現在、イメージング剤は金属コロイドを直接使用するかまたは他の成分との混合物が多く、毒性が問題となったり、指向性の問題があり、汎用されるに至っていない。
　他方、リポソームを用いた標的化剤が注目されている。リポソームに金属コロイドを含ませる試みはなされているが、イメージング剤として十分な量を内包させることができず（非特許文献１～５）、積極的に開発されていないのが現状である。
　特許文献１には，金コロイドを含むイメージング剤を作製し、そのイメージング剤をリポソームに内包させる方法が記載されている。しかし、実際にリポソームに内包された金属量についても、その造影効果についても何ら記載されていない。特許文献１には、金属コロイドを含有したリポソームも、それをイメージング剤として使用することも何ら記載されていない。
　特許文献２には、ソリッドコアリポソーム法により製造された金コロイドが内包されたリポソームが記載されている。しかし、特許文献２に記載のリポソームは、含まれる金コロイドの量が非常に少ないので、イメージング剤として使用することはできない。
　特許文献３には、核酸との複合体を形成し、該核酸をデリバリーする金粒子を開示されている。しかし、特許文献３には、金属コロイドを含有したリポソームも、それをイメージング剤として使用することも何ら記載されていない。
　特許文献４には、安定した金属コロイドの調製方法が記載されている。しかし、特許文献４には、金属コロイドを含有したリポソームも、それをイメージング剤として使用することも何ら記載されていない。
　特許文献５には、赤血球に金属コロイドを内包させる方法が開示されている。しかし、赤血球に実際に取り込まれた金属量についても、その造影効果についても何ら記載されていない。特許文献５には、金属コロイドを含有したリポソームも、それをイメージング剤として使用することも何ら記載されていない。
　非特許文献１には、バンガム法により製造された金コロイドが内包されたリポソームが記載されている。しかし、そのリポソームには、リポソーム１粒子あたり、せいぜい１～数個の金コロイドしか内包されていない。非特許文献１に記載のリポソームは、含まれる金コロイドの量が非常に少ないので、イメージング剤として使用することはできない。
特開２００５－１２００３３号公報 特開昭６４－０６３５１３号公報 特開２００５－２８７５０７号公報 特開２００５－３２０６１５号公報 米国特許第０６６４５４６４号明細書
Ｍ．Ｓｉｎｇｈ　ｅｔ．ａｌ．，Ｊ　Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ，１９９３．１０（１）：３５－４４ Ｋｕｉｘｏｎｇ　Ｇａｏ　ａｎｄ　Ｌｅａｆ　Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，１９８７．８９７：３７７－８３． Ｔｏｏｓ　Ｄａｅｍｅｎ　ｅｔ．ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９７．２６（２）：４１６－２３ Ｓ．Ｋ．Ｈｕａｎｇ　ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３．５２（１９）：５１３５－４３． Ａｒｎｏｌｄ　Ｊ．Ｍ．Ｄｒｉｅｓｓｅｎ　ｅｔ．ａｌ．，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９８５．２６０：１０８８０－７．
　そこで、本発明の課題は、インビボイメージングを可能にする金属コロイド含有リポソームを提供することにある。
　上記の課題を解決するために、本発明者等は鋭意研究の結果、金属コロイドをリポソームに大量に含有させる方法を見いだし、本発明を完成させるに至ったものである。
　本発明はまた、インビボイメージングに有用な金属コロイド含有リポソームの製造法およびその利用法を提供する。
　上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１Ａ）
金属コロイド含有リポソーム。
（項目１）
イメージング剤として十分量の金属コロイドを含む金属コロイド含有リポソーム。
（項目２）
前記金属コロイド含有リポソームが標的指向性物質をさらに含む、上記項目に記載のリポソーム。
（項目３）
前記標的指向性物質が、糖鎖、抗体、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、上記項目に記載のリポソーム。
（項目４）
前記金属コロイド含有リポソームが所望の物質をさらに含む、上記項目に記載のリポソーム。
（項目５）
前記金属コロイドが、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、およびユーロピウム（Ｅｕ）からなる群より選択される金属のコロイドである、上記項目に記載のリポソーム。
（項目６）
前記金属コロイドが金コロイドであり、金コロイド含有リポソームが、１ｍｇ脂質あたり金量として８．２μｇ以上、リポソーム溶液１ｍｌあたり金量として２８．７μｇ以上、またはリポソーム１個あたり金量として８．２×１０－１５ｍｇ以上の金コロイドを含む、上記項目に記載のリポソーム。
（項目７）
金属コロイド含有リポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：Ａ）金属コロイド溶液に脂質膜を懸濁し、金属コロイド脂質膜懸濁液を調製する工程：Ｂ）該金属コロイド脂質懸濁液を、リポソーム形成維持条件に供する工程
を包含する、方法。
（項目８）
前記Ｂ）工程が、
　（Ｂ１）前記金属コロイド脂質懸濁液を攪拌させ、窒素置換する工程；
　（Ｂ２）窒素置換した該金属コロイド脂質膜懸濁液を超音波処理する工程；および
　（Ｂ３）超音波処理した該金属コロイド脂質懸濁液を限外濾過に供する工程
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目９）
前記Ａ）工程において、前記脂質膜が、前記金属コロイド溶液に対して０．００１～１０ｍｇ/脂質の濃度で懸濁される、上記項目に記載の方法。
（項目１０）
得られたリポソームに標的指向性物質を結合させる工程をさらに包含する、上記項目に記載の方法。
（項目１１）
前記標的指向性物質を結合させる工程が、
　ｉ）得られたリポソームを親水性化処理する工程；
　ｉｉ）該リポソームへ標的指向性物質を結合させる工程；
　ｉｉｉ）該標的指向性物質が結合したリポソームを親水性化する工程ならびに
　ｉｖ）該親水性化したリポソームを含む溶液を限外濾過をする工程
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目１２）
前記標的指向性物質が、糖鎖、抗体、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目１３）
前記金属コロイドが、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、およびユーロピウム（Ｅｕ）からなる群より選択される金属のコロイドである、上記項目に記載の方法。
（項目１４）
前記Ａ）工程が
　（Ａ１）金コロイドを液体に分散させ、金コロイド溶液を調製する工程；
　（Ａ２）リポソーム形成能を有する脂質を、有機溶媒に懸濁して攪拌し、該攪拌した有機溶媒を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させて脂質膜を得る工程；および
　（Ａ３）該脂質膜を、該金コロイド溶液に対して、金量として、０．００１～１０ｍｇ／脂質ｍｇの濃度で懸濁し、金コロイド脂質膜懸濁液を調製する工程
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目１５）
　（Ａ１）金コロイドを液体に分散させ、金コロイド溶液を調製する工程；
　（Ａ２－ｉ）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを混合して脂質を調製する工程；
　（Ａ２－ｉｉ）該脂質を、有機溶媒に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させて脂質膜を得る工程；
　（Ａ３）該脂質膜を、該金コロイド溶液に対して金量として、０．００１～１０ｍｇ／脂質ｍｇで懸濁し、金コロイド脂質膜懸濁液を調製する工程；
　（Ｂ１）該金コロイド脂質懸濁液を攪拌させ、窒素置換する工程；
　（Ｂ２）窒素置換した該金コロイド脂質膜懸濁液を超音波処理する工程；および
　（Ｂ３）超音波処理した該金コロイド脂質懸濁液を限外濾過に供する工程
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目１６）
前記金コロイド溶液が、金量として、０．００１～１０ｍｇ／脂質ｍｇの範囲の濃度である、上記項目に記載の方法。
（項目１７）
前記リポソーム形成維持条件が、所望の物質をリポソームに内包させる工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目１８）
金属コロイド含有リポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）脂質膜懸濁用緩衝液に脂質膜を懸濁し、脂質膜懸濁液を調製する工程：および
ｂ）該脂質懸濁液と金属コロイド溶液とを混合し、リポソーム形成維持条件に供する工程
を包含する、方法。
（項目１９）
前記ｂ）工程が、
　（ｂ１）金属コロイドを液体に分散させ、金属コロイド溶液を調製する工程；
　（ｂ２）前記脂質懸濁液を攪拌させ、窒素置換する工程；
　（ｂ３）窒素置換した該脂質膜懸濁液を超音波処理する工程；および
　（ｂ４）超音波処理した該脂質懸濁液を、金属コロイド溶液を用いて限外濾過に供する工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２０）
前記ｂ）工程において、前記脂質懸濁液と前記金属コロイド溶液とが、１対９～９対１の混合比で懸濁される、上記項目に記載の方法。
（項目２１）
前記ａ）工程が
　（ａ１）リポソーム形成能を有する脂質を有機溶媒に懸濁して攪拌し、該攪拌した有機溶媒を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させて脂質膜を得る工程；および
　（ａ２）該脂質膜を、前記脂質膜懸濁用緩衝液に懸濁し、脂質膜懸濁液を調製する工程
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２２）
　（ａ１－ｉ）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを混合して脂質を調製する工程；
　（ａ１－ｉｉ）該脂質を、有機溶媒に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させて脂質膜を得る工程；
　（ａ２）該脂質膜を、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝生理食塩液に懸濁し、脂質膜懸濁液を調製する工程；
　（ｂ１）金属コロイドを液体に分散させ、金属コロイド溶液を調製する工程；
　（ｂ２）前記脂質懸濁液を攪拌させ、窒素置換する工程；
　（ｂ３）窒素置換した該脂質膜懸濁液を超音波処理する工程；および
　（ｂ４）超音波処理した該脂質懸濁液を、金属コロイド溶液を用いて限外濾過に供する工程
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２３）
得られたリポソームに標的指向性物質を結合させる工程をさらに包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２４）
前記標的指向性物質を結合させる工程が、
　ｉ）得られたリポソームを親水性化処理する工程；
　ｉｉ）該リポソームへ標的指向性物質を結合させる工程；
　ｉｉｉ）該標的指向性物質が結合したリポソームを親水性化する工程ならびに
　ｉｖ）該親水性化したリポソームを含む溶液を限外濾過をする工程
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２５）
前記標的指向性物質が、糖鎖、抗体、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目２６）
前記金属コロイドが、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、およびユーロピウム（Ｅｕ）からなる群より選択される金属のコロイドである、上記項目に記載の方法。
（項目２７）
前記金属コロイド溶液が金コロイド溶液であり、該金コロイド溶液が、金量として、０．００１～１０ｍｇ／脂質ｍｇの範囲の濃度である、上記項目に記載の方法。
（項目２８）
前記リポソーム形成維持条件が、所望の物質をリポソームに内包させる工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目２９）
金属コロイド含有リポソームを製造する方法であって、該方法は、凍結乾燥したリポソームと金属コロイド溶液とを混合する工程を包含する、方法。
（項目３０）
前記リポソームが標的指向性物質を含む、上記項目に記載の方法。
（項目３１）
前記金属コロイド溶液が、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、およびユーロピウム（Ｅｕ）からなる群より選択される金属のコロイド溶液である、上記項目に記載の方法。
（項目３２）
前記金属コロイド溶液が金コロイド溶液であり、前記凍結乾燥したリポソームが、該金コロイド溶液に対して金量として、０．００１～１０ｍｇ／脂質ｍｇの濃度で懸濁される、上記項目に記載の方法。
（項目３３）
前記リポソーム形成維持条件が、所望の物質をリポソームに内包させる工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目３４）
項目１に記載の金属コロイド含有リポソームを含む、イメージング剤。
（項目３５）
前記金属コロイド含有リポソームが標的指向性物質をさらに含む、上記項目に記載のイメージング剤。
（項目３６）前記標的指向性物質が、糖鎖、抗体、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、上記項目に記載のイメージング剤。
（項目３７）
前記金属コロイドが、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、およびユーロピウム（Ｅｕ）からなる群より選択される金属のコロイドである、上記項目に記載のイメージング剤。
（項目３８）
前記金属コロイド含有リポソームは金コロイド含有リポソームであり、１ｍｇ脂質あたり金量として８．２μｇ以上を含むか、またはリポソーム溶液１ｍｌあたり金量として２８．７μｇ以上の金属コロイドを含む、上記項目に記載のイメージング剤。
（項目３９）
前記金属コロイド含有リポソームが所望の物質をさらに含む、上記項目に記載のイメージング剤。
（項目４０）
所望の部位を標識するための組成物であって、該組成物は上記項目に記載の金属コロイド含有リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目４１）
所望の部位を標識するための組成物の製造のための、上記項目に記載の金属コロイド含有リポソームの使用。
（項目４２）
所望の部位を標識するための方法であって、該被験体に、該所望の部位を標識するための組成物を投与する工程を包含し、該組成物は上記項目に記載の金属コロイド含有リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含む、方法。
　本発明によって、イメージングに有用な金属コロイド含有リポソームならびにその製造法およびその利用法が提供される。本発明の金属コロイド含有リポソームは、所望の部位を高感度にイメージングすることを可能にした。このようなイメージングに有用な金属コロイド含有リポソームは、本発明によって初めて提供されるものである。
図１は、凍結乾燥法を用いて調製した金コロイド含有リポソームの粒子分布を示す。上は、０．１ｍｇ／ｍｌ濃度の金コロイド溶液を用いて調製したものであり、下は、その１０倍濃度（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて調製した金コロイド含有リポソームの粒子分布を示す。縦軸：動的光散乱の相対強度（％）、横軸：粒子サイズ（対数：直径（ｎｍ）） 図２は、バンガム法（１）を用いて調製した金コロイド含有リポソームの強度による粒子分布を示す。上は、０．１ｍｇ／ｍｌ濃度の金コロイド溶液を用いて調製したものであり、下は、その１０倍濃度（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて調製した金コロイド含有リポソームの粒子分布を示す。縦軸：動的光散乱の相対強度（％）、横軸：粒子サイズ（対数：直径（ｎｍ）） 図３は、バンガム法（２）を用いて調製した金コロイド含有リポソームの強度による粒子分布を示す。この金コロイド含有リポソームは、０．０５ｍｇ／ｍｌ濃度の金コロイド溶液を用いて調製した。縦軸：動的光散乱の相対強度（％）、横軸：粒子サイズ（対数：直径（ｎｍ）） 図４は、改良型コール酸塩透析法（１）を用いて調製した、金コロイド含有リポソームの強度による粒子分布を示す。この金コロイド含有リポソームは、金量として１ｍｇ／ｍｌ濃度の金コロイド溶液を用いて調製した。実線は、未修飾金コロイド含有リポソームの粒子分布を示し、破線は、ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソームの粒子分布を示す。縦軸：動的光散乱の相対強度（％）、横軸：粒子サイズ（対数：直径（ｎｍ）） 図５は、改良型コール酸塩透析法（１）を用いて調製した、金コロイド含有リポソームの１０倍濃縮したリポソームの強度による粒子分布を示す。実線は、未修飾金コロイド含有リポソームの粒子分布を示し、破線は、ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソームの粒子分布を示す。縦軸：動的光散乱の相対強度（％）、横軸：粒子サイズ（対数：直径（ｎｍ）） 図６は、透過型電子顕微鏡で撮影した金コロイド含有リポソームである。左：１０万倍、右：左図中、中央の金コロイド含有リポソームを約２倍に拡大したもの。 図７は、走査型電子顕微鏡で撮影した金コロイド含有リポソームである。左：１５万倍で観察した金コロイド含有リポソームの２次電子像である。上図はイオンエッチング未処理であり、下図はイオンエッチング処理したものである。右：左図の反射電子像である。 図８は、マウス（ｄｄＹマウス、雄性、７週齢）の右大腿部皮下に、Ｅｈｒｌｉｃｈ　ａｓｃｉｔｅ　ｔｕｍｏｒ（ＥＡＴ）細胞（５×１０６　細胞／マウス）を移植し、１０日後の腫瘍部位を示す（図中の丸枠内）。 図９は、投与４８時間後の肝臓におけるＴＥＭの結果（２万倍）を示す。肝臓中の細胞に、金コロイド含有リポソームが取り込まれていることが確認された。 図１０は、図９を拡大した図であり、投与４８時間後の肝臓におけるＴＥＭの結果（２５００倍）を示す。 図１１は、投与４８時間後の肝臓におけるＴＥＭの結果（１万倍）を示す。肝臓中の細胞に、金コロイド含有リポソームが取り込まれていることが確認された。 図１２は、投与４８時間後の肝臓におけるＴＥＭの結果（２万倍）を示す。肝臓中の細胞に、金コロイド含有リポソームが取り込まれていることが確認された。 図１３は、ＥＡＴ細胞移植マウスにおける、ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソームの投与４８時間後、腫瘍組織中の透過型電子顕微鏡写真（２千倍）である。腫瘍組織中の破線で囲まれた箇所に金コロイドが確認された（矢印）。 図１４は、図１３を拡大した写真である。ＥＡＴ細胞移植マウスにおける、ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソームの投与４８時間後、腫瘍組織中の透過型電子顕微鏡写真（７千倍）である。図中、Ａは血管内皮細胞の領域を、Ｂは赤血球の領域を示す。 図１５は、図１４の黒矢印で示した破線内の部分を拡大した写真である。ＥＡＴ細胞移植マウスにおける、ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソームの投与４８時間後、腫瘍組織中の透過型電子顕微鏡写真（３万倍）である。矢印部分に金コロイドが確認された。 図１６は、図１５をさらに拡大した写真である。ＥＡＴ細胞移植マウスにおける、ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソームの投与４８時間後、腫瘍組織中の透過型電子顕微鏡写真（８万倍）である。金コロイドが、さらに明確に確認された。 図１７は、図１４の白抜き矢印で示した破線内の部分を拡大した写真である。ＥＡＴ細胞移植マウスにおける、ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソームの投与４８時間後、腫瘍組織中の透過型電子顕微鏡写真（４万倍）である。矢印部分に金コロイドが確認された。 図１８は、図１６および１７を画像ソフトにより、それぞれ約２倍および３倍に拡大した図である。 図１９は、実施例１および２の（２．改良型コール酸塩透析法（２））と同様の方法（改良型コール酸塩透析法（２）従来法）により調製した金コロイド含有リポソームの強度による粒子径分布図を示す。用いた金コロイドの粒径は１０ｎｍである。実線：未修飾金コロイド含有リポソーム；破線（太線）：ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソーム；破線（細線）：抗Ｅセレクチン抗体修飾金コロイド含有リポソーム。縦軸：動的光散乱の相対強度（％）、横軸：粒子サイズ（対数：直径（ｎｍ）） 図２０は、実施例１および２の（１．改良型コール酸塩透析法（１））と同様の方法（改良型コール酸塩透析法（１）改良法）により調製した金コロイド含有リポソームの強度による粒子径分布図を示す。用いた金コロイドの粒径は４０ｎｍである。実線：未修飾金コロイド含有リポソーム；破線（太線）：ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソーム。縦軸：動的光散乱の相対強度（％）、横軸：粒子サイズ（対数：直径（ｎｍ））
　以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義を適宜説明する。
　本明細書において「コロイド溶液」とは、コロイド粒子が液体に分散したものをいう。
　本明細書において「金属コロイド」とは、金属が液体の媒質中に分散している物質、またはその分散状態をいう。本明細書において、金属コロイドは、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
　金属コロイドとしては、例えば、リチウム（Ｌｉ）、ベリリウム（Ｂｅ）、ナトリウム（Ｎａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ガリウム（Ｇａ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、ルビジウム（Ｒｂ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、イットリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、カドミウム（Ｃｄ）、インジウム（Ｉｎ）、スズ（Ｓｎ）、アンチモン（Ｓｂ）、セシウム（Ｃｓ）、バリウム（Ｂａ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロジウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、タリウム（Ｔｌ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、ポロニウム（Ｐｏ）、フランシウム（Ｆｒ）、ラジウム（Ｒａ）、それらの組み合わせの金属のコロイドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、ユーロピウム（Ｅｕ）のような金属のコロイドであり得るが、これらに限定されない。金コロイドとしては、金属（例えば、金）を、蒸留水、２次蒸留水、超純水、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）１－２－アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパン－３－プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２－（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３－Ｎ－シクロヘキシルアミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３－シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等に分散させたものが挙げられる。金属コロイドは、金属をトルエン、キシレン、ヘキサン、テトラデカンなどの疎水性溶媒に分散することにより調製することができる。また、金、銀などは水などの極性溶媒に分散することも可能である。好ましくは、金属コロイドは、金を水に分散させたものであり得る。金コロイドは、糖類、アミン類を含む緩衝液などを分散させて調製することもできる。
　リポソームに含有させる金属コロイドは、当業者が、その用途にあわせて適宜決めることができ、その濃度等も明確に決定することができる。
　本明細書において「金属コロイド溶液」とは、金属コロイド粒子が液体に分散したものをいう。
　本明細書において「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。リポソームは内部に水を含んだ閉鎖小胞であるため、水溶性の薬剤などを小胞内に保持させることも可能である。したがって、このようなリポソームによって、細胞膜を通過しえない薬物や遺伝子などを細胞内に送達するのに使われる。また、生体適合性も良いのでＤＤＳ用のナノ粒子性キャリアー材料としての期待が大きい。本発明において、リポソームは、修飾基を付するために、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、糖脂質、ガングリオシド、ホスファチジルグリセロールなど）またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）を有し得る。
　本明細書において使用される場合、用語「脂質」とは、長鎖の脂肪族炭化水素またはその誘導体をいう。「脂質」は、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドなどからなる化合物の総称である。
　本明細書において「脂質膜」とは、リポソーム形成能を有する脂質から調製された膜状の脂質である。
　本明細書において「リポソーム形成能を有する脂質」とは、リポソームを形成することができる性質を有する脂質をいう。
　リポソーム形成能を有する脂質は、当業者が、リポソームの用途にあわせてその組成を適宜決めることができ、その範囲を明確に決定することができる。リポソーム形成能を有する資質は、リポソームの作製に一般的に用いられる脂質が使用され得る。リポソーム形成能を有する脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類（ガングリオシド類など）、ホスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類、コレステロール類等が挙げられる。
　ホスファチジルコリン類としては、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられる。
　ホスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
　ホスファチジン酸類としては、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸が挙げられる。長鎖アルキルリン酸塩類としてはジセチルホスフェート等が挙げられる。
　糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボシド、ガングリオシド類等が挙げられる。ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（ＮｅｕＡα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）、ガングリオシドＧＤｌａ、ガングリオシドＧＴｌｂ等が挙げられる。
　ホスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロ－ル、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等が好ましい。
　このうち、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類、およびコレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。例えば、本発明のリポソームを構成する脂質として、ホスファチジルコリン類（モル比０～７０％）、ホスファチジルエタノールアミン類（モル比０～３０％）、ホスファチジン酸類、および長鎖アルキルリン酸塩からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０～３０％）、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される１種以上の脂質（モル比０～４０％）、ならびにコレステロール類（モル比０～７０％）を含むものが挙げられる。
　本明細書において「金属コロイド含有リポソーム」とは、金属コロイドを含むリポソームをいう。本発明の金属コロイド含有リポソームは、金属として、例えば、リチウム（Ｌｉ）、ベリリウム（Ｂｅ）、ナトリウム（Ｎａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ガリウム（Ｇａ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、ルビジウム（Ｒｂ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、イットリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、カドミウム（Ｃｄ）、インジウム（Ｉｎ）、スズ（Ｓｎ）、アンチモン（Ｓｂ）、セシウム（Ｃｓ）、バリウム（Ｂａ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロジウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、タリウム（Ｔｌ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、ポロニウム（Ｐｏ）、フランシウム（Ｆｒ）、ラジウム（Ｒａ）、それらの組み合わせの金属のコロイドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、ユーロピウム（Ｅｕ）などが挙げられるが、これらに限定されない。金属コロイドは、金属をトルエン、キシレン、ヘキサン、テトラデカンなどの疎水性溶媒に分散することにより調製することができる。また、金、銀などは水などの極性溶媒に分散することも可能である。好ましくは、金属コロイドは、金を水に分散させたものであり得る。
　また、本発明の金属コロイド含有リポソームは、ガドペンテト酸メグルミン（例えば、日本シエーリング株式会社製、マグネビスト（登録商標））、ガドテリドール（例えば、ブリストルエーザイ社製、プロハンス）、フェルカルボトラン（日本シエーリング株式会社製、リゾビスト（登録商標））、クエン酸鉄アンモニウム（例えば、大塚製薬社製、フェリセルツ）などを含ませることも可能である。
　本明細書において「金属コロイド脂質膜懸濁液」とは、金属コロイドと脂質膜とが懸濁した液体をいう。
　本明細書において「リポソーム形成維持条件」とは、リポソームが形成するか、および／またはリポソームが維持されるための条件をいう。リポソーム形成維持条件は、例えば、金属コロイド脂質懸濁液を窒素置換し、超音波処理し、限外濾過に供すること、脂質懸濁液を窒素置換し、超音波処理し、金属コロイド溶液を用いて限外濾過に供すること、等であり得る。好ましくは、リポソーム形成維持条件は、金属コロイド脂質懸濁液を窒素置換し、超音波処理し、分画分子量５００～３００，０００、好ましくは１０，０００で限外濾過に供すること、または脂質懸濁液を窒素置換し、超音波処理し、金属コロイド溶液を用いて分画分子量５００～３００，０００、好ましくは１０，０００で限外濾過に供することであり得る。リポソーム形成維持条件は、所望の物質をリポソームに内包させる工程を包含することもできる。本発明では、従来汎用されているバンガム法では効率よく金属コロイドを内包させることができなかったが、それ以外の方法（たとえば、改良型コール酸塩透析法、凍結乾燥法など）を用いることによって、効率よく金属コロイドを内包させることを見出した点に留意すべきである。
　本明細書において「脂質膜懸濁用緩衝液」とは、脂質膜を懸濁するための緩衝液をいう。脂質膜用緩衝液としては、例えば、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）１－２－アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパン－３－プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２－（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３－Ｎ－シクロヘキシルアミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３－シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等を含み得る。好ましくは、水溶性のスタチンを含む溶液は、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、脂質膜を懸濁することができ、リポソームの形成を阻害しないものであればよいからである。
　本明細書において「親水性化」とは、リポソーム表面に親水性化合物を結合させることをいう。親水性化に用いる化合物としては、低分子の親水性化合物、好ましくは少なくとも１つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物、さらに好ましくは、少なくとも２つのＯＨ基を有する低分子の親水性化合物が挙げられる。また、さらに少なくとも１つのアミノ基を有する低分子の親水性化合物、すなわち分子中に少なくとも１つのＯＨ基と少なくとも１つのアミノ基を有する親水性化合物が挙げられる。このような親水性化合物として、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどを含むトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカン等のアミノアルコール類等が挙げられ、さらに具体的には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノエタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシエチル）アミノプロパン、トリス（ヒドロキシプロピル）アミノプロパン等が挙げられる。
　本明細書において「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（本明細書において「アルカン」という）から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１－で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルのＨが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、Ｃ１～Ｃ２アルキル、Ｃ１～Ｃ３アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ５アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ７アルキル、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ１～Ｃ９アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１１アルキルまたはＣ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ１～Ｃ２置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ３置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ４置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ５置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ６置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ７置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ８置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ９置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ１０置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ１１置換されたアルキルまたはＣ１～Ｃ１２置換されたアルキルであり得る。アルカンについては、これらの具体例は、Ｃ１～Ｃ２アルカン、Ｃ１～Ｃ３アルカン、Ｃ１～Ｃ４アルカン、Ｃ１～Ｃ５アルカン、Ｃ１～Ｃ６アルカン、Ｃ１～Ｃ７アルカン、Ｃ１～Ｃ８アルカン、Ｃ１～Ｃ９アルカン、Ｃ１～Ｃ１０アルカン、Ｃ１～Ｃ１１アルカンまたはＣ１～Ｃ１２アルカン、Ｃ１～Ｃ２置換されたアルカン、Ｃ１～Ｃ３置換されたアルカン、Ｃ１～Ｃ４置換されたアルカン、Ｃ１～Ｃ５置換されたアルカン、Ｃ１～Ｃ６置換されたアルカン、Ｃ１～Ｃ７置換されたアルカン、Ｃ１～Ｃ８置換されたアルカン、Ｃ１～Ｃ９置換されたアルカン、Ｃ１～Ｃ１０置換されたアルカン、Ｃ１～Ｃ１１置換されたアルカンまたはＣ１～Ｃ１２置換されたアルカンであり得る。ここで、例えばＣ１～Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を１～１０個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル（ＣＨ３－）、エチル（Ｃ２Ｈ５－）、ｎ－プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２－）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ－）、ｎ－ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、ｎ－ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、ｎ－ヘキシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、ｎ－ヘプチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、ｎ－オクチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、ｎ－ノニル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、ｎ－デシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２などが例示される。また、例えば、Ｃ１～Ｃ１０置換されたアルキルとは、Ｃ１～Ｃ１０アルキルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。Ｒとしては、Ｃ１～Ｃ６アルキルが好ましく、特にＣ１～Ｃ６アルキルが好ましい。
　本発明の物質または上で定義した官能基が置換基Ｒによって置換されている場合、そのような置換基Ｒは、単数または複数存在し、それぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオ－ル、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、アシル、チオカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィニルからなる群より選択される。
　本明細書において「標的指向性物質」とは、特定の部位を特異的に認識するものをいう。本発明において使用される「標的指向性物質」としては、例えば、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマー、抗体等が挙げられ得るが、これらに限定されるものではない。なぜなら、標的指向性物質は、リポソームを破壊することなく、リポソームに標的指向性を付与するようなものであれば、よいからである。当業者は、標的にあわせて、リポソームに結合させる標的指向性物質を適宜、決定することができる。
　本明細書において「抗体」とは、免疫原である抗原によって惹起された特異的なアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子をいう。抗体は、Ｂ細胞により生産され、血液、体液中に存在する。抗体は、抗原と特異的に反応するという特徴を有する。抗体は、抗原の呈示による刺激の結果としてではなく自然に存在する場合もあり得る。基本的には、抗体の分子構造は各２本の軽鎖と重鎖とから形成されるが、二量体、三量体、五量体としても存在し得る。これらとしては、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ等が挙げられるが、これらに限定されない。抗体としては、例えば、抗Ｅセレクチン抗体、抗Ｐセレクチン抗体、抗ＥＧＦＲ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において「レクチン」とは、細胞膜複合糖質（糖タンパク質および糖脂質）の糖鎖と結合能を有する物質をいい、結合される細胞膜複合糖質の種類に応じて細胞凝集，分裂誘発，機能活性化，細胞障害などの効果をおよぼす能力を有しうる。糖鎖を細胞が発信する情報分子とすれば、レクチンは受信分子であるといえる。一定の性質を有する細胞または組織は、それに相応したレクチンのパターンを有する。レクチンは、感染、生体防御、免疫、受精、標的細胞へのターゲティング、細胞分化、細胞間接着、新生糖タンパク質の品質管理および細胞内選別輸送などを実現する。レクチンは、多用な糖鎖結合性を有し、速やかな結合および解離という固有の物理化学的性質を有することにより厳格に制御されている。糖鎖認識蛋白質とも呼ばれる。植物レクチンについての研究は古く、既に約３００種類が知られている。最近、動物レクチンについても活発に研究が行われており、新規レクチンの発見が続いている。動物細胞膜上に在る主要なレクチンファミリーのレクチン群（約１００種類）に基づく多彩な糖鎖認識機能が研究されている。とりわけ、多様な構造をもつ糖鎖リガンドの構造情報を受け取るレセプター（情報受容蛋白質、または、標的分子）としての機能が注目されている。
　本明細書において「相補的核酸」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味として定義され、核酸の塩基対合律により、互いに塩基対を形成し得る核酸をいう。これらとしては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において「レセプター」とは、「受容体」とも称され、細胞に存在して外部からの刺激を認識し、伝達するための構造を有するものをいう。これらとしては、例えば、細胞表面受容体、細胞内受容体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において「リガンド」とは、物質にとって、それ自体が非常に強固に吸着される分子をいい、通常は、タンパク質（たとえば、受容体）に特異的に結合する物質をいう。これらとしては、例えば、タンパク質、核酸、化学物質等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において「アプタマー」とは、種々の物質（タンパク質、化学物質など）の構造を認識し、結合し得る比較的分子量の小さい核酸をいう。これらとしては、例えば、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において「抗原」とは、抗体と結合する物質をいい、好ましくは、抗体の産生を促す働きを有する物質をいう。例えば、高分子の糖、タンパク質、それらの複合体、ウイルス、細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「糖類」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。代表的には、約２０種類の単糖（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸、キトサン、デキストランならびにそれらの複合体および誘導体など）が鎖状につながった物質で、生体の細胞内外のタンパク質や脂質に付いている。単糖の配列によって機能が異なり、通常は複雑に枝分かれしていて、人体には数百種類以上の多様な構造の糖鎖があると予想されており、さらに、人体において有用な構造は数万種類以上あると考えられている。細胞間での分子・細胞認識機能などタンパク質や脂質が生体内で果たす高次機能に関係していると見られているが、そのメカニズムは未解明の部分が多い。核酸、タンパク質に次ぐ第３の生命鎖として現在のライフサイエンスで注目されている。とりわけ、細胞認識におけるリガンド（情報分子）としての糖鎖の機能が期待され、その高機能材料開発への応用が研究されている。このような糖鎖としては、例えば、シリアルルイスＸ（ＳＬＸ：Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ-アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）、α１－６マンノビオース（Ｍａｎα１，６Ｍａｎ）、それらの２つ以上の組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において「単糖」とは、少なくとも１つの水酸基および少なくとも１つのアルデヒド基またはケトン基を含む、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンをいい、糖鎖の基本単位を構成する。本明細書において、特に言及するときは、糖鎖は、１つ以上単糖が連なった鎖または配列をいい、単糖というときは、糖鎖を構成する１つの単位をいう。ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９および１０であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。本明細書において「糖」というときは、「単糖」および「糖鎖」の両方を包含し、たとえば、接頭語として「糖・・・」というときは、「単糖」および「糖鎖」のいずれかの複合体を示す。本発明では、いずれの形式のものでも使用され得る。
　本明細書において、「イメージング」とは、画像化することをいい、「分子イメージング」とは分子レベルでの画像化をいう。また「インビボイメージング」とは、生体の機能または構造の画像化をいう。
　本明細書において「イメージング剤」とは、生体の機能または構造を画像化するために用いられる薬剤または因子をいい、「造影剤」ともいわれる。イメージング剤としては、例えば、生体内の腫瘍組織、炎症組織などを画像化するために用いられるものが挙げられる。
　（好ましい実施形態の説明）
　以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
　（リポソーム）
　リポソームの調製は、当該分野において公知の任意の手法により製造することができる。例えば、リポソームは、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、凍結乾燥法、逆相蒸発法により調製され得る（例えば、「リポソーム応用の新展開～人工細胞の開発に向けて～　監修　秋吉一成/辻井薫　ＮＴＳ　ｐ３３～４５（２００５）」、「リポソーム　野島庄七　ｐ２１－４０　南江堂（１９８８）」を参照のこと。）。
　例えば、コール酸透析法では、ａ）脂質と界面活性剤の混合ミセルの調製、およびｂ）混合ミセルの透析によりリポソームが製造され得る。
　リポソームは、凍結乾燥法によっても作製することができる。凍結乾燥法は、例えば、Ｈ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｎ．Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｐｏｓ．，１７，５８９－６０５（１９９９）等により報告されている。目的に応じて、フレンチプレス法、メンブランフィルター法により粒子サイズを調整することができる。
　一例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドのモル比　３５：４５：５：１５のタイプのリポソームを製造することができる。
　好ましい実施形態において、本発明のリポソームは、ガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロール等官能基となりうる基を含む脂質を含むことが好ましい。なぜなら、アルブミンのようなリンカーの結合が容易になるからである。
　別の好ましい実施形態では、本発明のリポソームは、ホスファチジルエタノールアミンを含むことが好ましい。ホスファチジルエタノールアミンを含むことによって、親水性付与基（トリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンなど）との結合が容易になるからである。
　別の好ましい実施形態では、リポソームを作製するときにガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロール等官能基となりうる基を含む脂質を合わせる（ｃｏｍｂｉｎｅ）ことによって、この糖脂質中に含まれる糖鎖を構成成分として含むリポソームを作製することができる。
　別の好ましい実施形態として、本発明のリポソームは、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウムを含み得る。
　リポソームの純度および安定性を確認するために粒子径サイズ分布を調べることが重要である。その方法として、ゲル濾過クロマトグラフィー法（ＧＰＣ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）などを使うことができる。なお、このリポソームは４℃で数ヶ月保存しても安定である。リポソームのｉｎ　ｖｉｖｏでの安定性は、マウスを使って調べることができる。リポソームをマウスに静注し、３時間後に採血して血清を調製し、孔径０．０３μｍの膜を用いて限外濾過を行いリポソームを精製し回収する。そのＳＥＭ観察の結果、このリポソームの形態はｉｎ　ｖｉｖｏでの３時間処理・回収前後においても変化がないことを確認することができる。
　本発明においてリポソームのタンパク質量は、例えば、リポソームに内包されたＨＳＡ量とリポソーム表面にカップリングしたＨＳＡの総タンパク質量をＢＣＡ法により測定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　タンパク質量の測定は、例えば、Ｍｉｃｒｏ　ＢＣＡＴＭ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔキット（カタログ番号２３２３５ＢＮ）（ＰＩＥＲＣＥ　Ｃｏ．ＬＴＤ）などを用いることができる。標準物質として、２ｍｇ／ｍｌアルブミン（ＢＳＡ）を使用し得る。（１）スタンダード溶液として、標準物質（２ｍｇ／ｍｌ：アルブミン）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、０、０．２５、０．５、１、２、３、４、５μｇ／５０μｌ溶液を調製する。（２）リポソームをＰＢＳ緩衝液で２０倍希釈し、検体溶液を調製する。（３）スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に５０μｌ分注する。（４）各試験管に３％ラウリル硫酸ナトリウム溶液（ＳＤＳ溶液）を１００μｌ添加する。（５）キットに添付された試薬Ａ、Ｂ、Ｃを、試薬Ａ：試薬Ｂ：試薬Ｃ＝４８：２：５０となるように混合し、各試験管に１５０μｌ添加する。（６）この試験管を、６０℃で１時間、静置する。（７）室温に戻ってから、吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リポソームのタンパク質量を測定する。
　本発明のリポソームのタンパク質量は、例えば、０～１ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。金属コロイド含有リポソームのタンパク質量は、例えば、０．０１ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。
　本発明において、リポソーム、金属コロイド含有リポソームの構成脂質量は、例えば、コレステロール量を定量することにより算出することができる。
　＜脂質定量の原理＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　脂質の定量には、デタミナーＴＣ５５５キット（カタログ番号ＵＣＣ／ＥＡＮ１２８）（ＫＹＯＷＡ　Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いることができる。標準物質として、キットに添付されている５０ｍｇ／ｍｌ　コレステロールを使用する。（１）スタンダード溶液として、標準物質（５０ｍｇ／ｍｌ：コレステロール）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、０、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０μｇ／２０μｌ溶液を調製する。（２）リポソームをＰＢＳ緩衝液で５倍希釈し、検体溶液を調製する。（３）スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に２０μｌ分注する。（４）各試験管に、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（１０％溶液）を１７μｌ添加して撹拌し、その後、３７℃、４０分間、静置する。（５）デタミナーＴＣ５５５キットの酵素試薬を３００μｌ添加して撹拌し、その後、３７℃、２０分間、静置する。（６）吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リポソームのコレステロール量を測定し、脂質量を求める。
　コレステロール量から脂質量を求める換算式は、例えば、以下のように表される。
脂質量（μｇ／５０μｌ）＝コレステロール量（μｇ／５０μｌ）×４．５１（換算係数）
　リポソームに含まれる脂質量は、リン脂質Ｃ－テスト（ワコー）を用いても測定することができる。スタンダードとして、キットのリン脂質標準液を、発色試液と混合し、５９６１μｇ／ｍＬ、３０００μｇ／ｍＬ、１５００μｇ／ｍＬ溶液を調製する。（１）キットの発色剤と緩衝剤を全量混合し発色試液とする。（２）発色試液０．７５ｍＬに対しサンプル溶液を５μｌ加える。（３）サンプル溶液・スタンダード溶液を、２５０μＬずつ９６穴プレートに分注し、３７℃インキュベーターで１０分間インキュベートする。（４）マイクロプレートリーダーでＡ５９５を測定し、リン脂質濃度を算出する。
　リン脂質濃度から脂質量を求める換算式は、例えば、以下のように表される。
　Ａ５９５×０．９６４×４５．６／１６.８＝脂質量
０．９６４…キット表示の換算値との誤差。換算係数。
４５．６…脂質総量
１６.８…ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）量
　リポソーム中の脂質に対するタンパク質の割合は、例えば、上述のタンパク質定量および脂質定量の結果から導くことができる。本発明の金属コロイド含有リポソームは、好ましくは、脂質に対するタンパク質の割合が、約０～０．５である。
　本発明の金属コロイド含有リポソームの脂質量は、例えば、０～５ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。
　本発明のリポソーム、金属コロイド含有リポソームの粒子径分布および粒子径は、例えば、リポソーム粒子を精製水で５０倍に希釈して、ゼータサイザーナノ（Ｎａｎ－ＺＳ：ＭＡＬＶＥＲＮ　Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いて測定することができる。
　１つの実施形態において、リポソームは標的指向性物質を含み得る。このリポソームは、リンカーとしてタンパク質を使用することが好ましく、標的指向性物質（例えば、糖鎖、抗体）が結合したタンパク質のリポソームへのカップリングは、以下の２段階反応によって行うことができる。ａ）リポソーム膜上のガングリオシドまたは他の等価物（例えば、糖脂質またはホスファチジルグリセロール等官能基となりうる基を含む脂質）部分の過ヨウ素酸酸化、およびｂ）還元的アミノ化反応による酸化リポソームへの、標的指向性物質が結合したタンパク質のカップリングである。このような手法によって望ましい標的指向性物質を含むタンパク質をリポソームに結合することができ、所望の標的指向性を有する多種多様なリポソームを得ることができる。
　（金属コロイド含有リポソーム）
　１つの局面において、本発明は、金属コロイド含有リポソームを提供する。本発明の重要な特徴の一つは、イメージング剤として十分量の金属コロイドを含むことにある。本発明の金属コロイド含有リポソームが含有する金属コロイドとしては、例えば、リチウム（Ｌｉ）、ベリリウム（Ｂｅ）、ナトリウム（Ｎａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ガリウム（Ｇａ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、ルビジウム（Ｒｂ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、イットリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、カドミウム（Ｃｄ）、インジウム（Ｉｎ）、スズ（Ｓｎ）、アンチモン（Ｓｂ）、セシウム（Ｃｓ）、バリウム（Ｂａ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロジウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、タリウム（Ｔｌ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、ポロニウム（Ｐｏ）、フランシウム（Ｆｒ）、ラジウム（Ｒａ）、それらの組み合わせの金属のコロイドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、ユーロピウム（Ｅｕ）などの金属が挙げられるが、これらに限定されない。金属コロイドは、金属をトルエン、キシレン、ヘキサン、テトラデカンなどの疎水性溶媒に分散することにより調製することができる。また、金、銀などは水などの極性溶媒に分散することも可能である。好ましくは、金属コロイドは、金を水に分散させたものであり得る。イメージング剤として十分量の金属コロイドは、例えば、金であれば、本明細書に以下に記載される量、たとえば、１ｍｇ脂質あたり金量として８．２μｇ以上などを挙げることができる。他の金属であれば、当該分野における技術常識を考慮して、金の量に匹敵する量を算出することができる。
　また、本発明の金属コロイド含有リポソームは、ガドペンテト酸メグルミン（例えば、日本シエーリング株式会社製、マグネビスト（登録商標））、ガドテリドール（例えば、ブリストルエーザイ社製、プロハンス）、フェルカルボトラン（日本シエーリング株式会社製、リゾビスト（登録商標））、クエン酸鉄アンモニウム（例えば、大塚製薬社製、フェリセルツ）などを含ませることも可能である。
　１つの実施形態において、本発明の金属コロイド含有リポソームは、金属コロイドとして、金コロイドを含有し得る。１つの実施形態において、金コロイド含有リポソームは、１ｍｇ脂質あたり金量として８．２μｇ以上、リポソーム溶液１ｍｌあたり金量として２８．７μｇ以上、リポソーム１個あたり金量として８．２×１０－１５ｍｇ以上の金属コロイドを含み得るが、これらに限定されない。このましくは、本発明の金コロイド含有リポソームは、リポソーム１個あたり３×１０－１５ｍｇ～３×１０－１１ｍｇの金量を含み得る。
　別の実施形態において、本発明の金属コロイド含有リポソームは、標的指向性物質（例えば、抗体、糖鎖、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマー、抗体など）をさらに含み得る。標的指向性物質は、リポソームにガングリオシド、糖脂質またはホスファチジルグリセロール等官能基となりうる基を含む脂質を含ませてそれにペプチドなどのリンカーを結合させることにより結合させることが可能である。
　好ましい実施形態において、本発明において使用され得る糖鎖としては、糖鎖としては、例えば、シリアルルイスＸ（ＳＬＸ：Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ-アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）、α１－６マンノビオース（Ｍａｎα１，６Ｍａｎ）、それらの２つ以上の組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。２つ以上の組み合わせが使用可能な理由としては、理論に束縛されないが、上記糖鎖の各々が目的の送達部位の組織または細胞に局在するレクチンに対して特異性を有しており、混在してもその特異性を発揮すると考えられるからである。
　好ましい実施形態において、本発明の標的指向性物質として使用され得る抗体としては、例えば、抗Ｅセレクチン抗体、抗Ｐセレクチン抗体、抗ＥＧＦＲ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
　１つの実施形態において、本発明の金属コロイド含有リポソームは、所望の物質をさらに含み得る。これらとしては、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰなど）、発光酵素（例えば、ルシフェラーゼなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
　蛍光色素としては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ３Ｂ（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）７５０、フルオレセイン－４－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、カルセイン、それらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
　（製造方法）
　１つの局面において、本発明の金属コロイド含有リポソームは、例えば、Ａ）金属コロイド溶液に脂質膜を懸濁し、金属コロイド脂質膜懸濁液を調製する工程：およびＢ）該金属コロイド脂質懸濁液を、リポソーム形成維持条件に供する工程を包含する方法によって製造され得る。
　１つの実施形態において、本方法において使用され得る金属コロイド溶液は、例えば、所望の金属を、蒸留水、２次蒸留水、超純水、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）１－２－アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパン－３－プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２－（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３－Ｎ－シクロヘキシルアミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３－シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等に懸濁することによって調製することができる。好ましくは、金属を超純水に溶解することにより調製することができる。また、金属コロイドは、市販されている金属コロイド、例えば、メーカー：ワインレッドケミカル株式会社、製品名：金コロイド（イムノクロマト用）、製造コード:ＷＲＧＭ３などを所望の濃度に調整し、用いることもできる。
　１つの実施形態において、本方法において使用され得る脂質膜は、例えば、リポソーム形成能を有する脂質を、有機溶媒に懸濁して攪拌し、該攪拌した有機溶媒を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させること等により得ることができるが、これらに限定されない。
　１つの実施形態において、リポソーム形成能を有する脂質としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、脂質膜を調製できるものでありさえすればよいからである。当業者は、このような脂質を、目的にあわせて適宜選択することができる。
　１つの実施形態において、本方法において使用される有機溶媒は、脂質が溶解し、揮発性があるものであればよい。これらとしては、アルコール、エーテル、アセトンなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、有機溶媒は、ジエチルエーテル、メタノール、アセトニトリル、アセトン、エタノール、塩化メチレン、クロロホルム、イソプロパノール、トルエン、キシレン、より好ましくは、メタノールとクロロホルムの混合液であり得る。当業者は、このような有機溶媒を、用いる脂質にあわせて適宜選択することができる。
　１つの実施形態において、本方法において使用され得る金属コロイドとしては、例えば、リチウム（Ｌｉ）、ベリリウム（Ｂｅ）、ナトリウム（Ｎａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ガリウム（Ｇａ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、ルビジウム（Ｒｂ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、イットリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、カドミウム（Ｃｄ）、インジウム（Ｉｎ）、スズ（Ｓｎ）、アンチモン（Ｓｂ）、セシウム（Ｃｓ）、バリウム（Ｂａ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロジウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、タリウム（Ｔｌ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、ポロニウム（Ｐｏ）、フランシウム（Ｆｒ）、ラジウム（Ｒａ）、それらの組み合わせの金属のコロイドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、ユーロピウム（Ｅｕ）などの金属が挙げられるが、これらに限定されない。金属コロイドは、金属をトルエン、キシレン、ヘキサン、テトラデカンなどの疎水性溶媒に分散することにより調製することができる。また、金、銀などは水などの極性溶媒に分散することも可能である。好ましくは、金属コロイドは、金を水に分散させたものであり得る。金コロイドは、糖類、アミン類を含む緩衝液などを分散させて調製することもできる。
　１つの実施形態において、前記金属コロイド溶液は金コロイドであり、本方法において使用され得る脂質膜は、前記金コロイド溶液に対して金量として、０．００１～１０ｍｇ／脂質ｍｇの濃度、好ましくは、金量として０．０１～１ｍｇ／脂質ｍｇ、の濃度の濃度、より好ましくは、金量として約０．２２ｍｇ／脂質ｍｇの濃度で懸濁され得るが、この濃度に限定されない。
　好ましい実施形態において、本製造方法の前記Ａ）工程は、（Ａ１）金コロイドを、金量として、０．１～１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、金量として０．２５～８ｍｇ／ｍｌの濃度、０．５～５ｍｇ／ｍｌの濃度、０．７５～３ｍｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように液体に分散させ、金コロイド溶液を調製する工程；（Ａ２）リポソーム形成能を有する脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウムなど）を、有機溶媒（例えば、メタノール・クロロホルム溶液）に懸濁して攪拌し、該攪拌した有機溶媒を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させて脂質膜を得る工程；および（Ａ３）該脂質膜を、該金コロイド溶液に対して０．００１～１０ｍｇ／脂質ｍｇの濃度、好ましくは、金量として０．０１～１ｍｇ／脂質ｍｇの濃度、より好ましくは、金量として約０．２２ｍｇ／脂質ｍｇの濃度で懸濁し、金コロイド脂質膜懸濁液を調製する工程を包含し得る。ここで、Ａ１）工程では、金コロイドを、例えば、蒸留水、２次蒸留水、超純水、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）１－２－アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパン－３－プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２－（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３－Ｎ－シクロヘキシルアミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３－シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等に分散させることができるが、これらに限定されない。
　１つの実施形態において、本方法におけるリポソーム形成維持条件は、例えば、金属コロイド脂質懸濁液を窒素置換し、超音波処理し、限外濾過に供することであり得る。好ましくは、リポソーム形成維持条件は、金属コロイド脂質懸濁液を窒素置換し、超音波処理し、分画分子量５００～３００，０００、好ましくは１０，０００で限外濾過に供することであり得る。
　別の実施形態において、本発明の方法において、リポソーム形成維持条件は、所望の物質をリポソームに内包させる工程を包含し得る。所望の物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰなど）、発光酵素（例えば、ルシフェラーゼなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
　蛍光色素としては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ３Ｂ（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）７５０、フルオレセイン－４－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、カルセイン、それらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
　好ましい実施形態において、本製造方法の前記Ｂ）工程は、（Ｂ１）該金属コロイド脂質懸濁液を１０～６０℃、好ましくは、３０～４０℃で攪拌させ、窒素置換する工程；（Ｂ２）窒素置換した該金属コロイド脂質膜懸濁液を超音波処理する工程；および（Ｂ３）超音波処理した該金属コロイド脂質懸濁液を、分画分子量５００～３００，０００、好ましくは１０，０００で限外濾過に供する工程を包含し得る。
　好ましい実施形態において、前記標的指向性物質を結合させる工程は、ｉ）得られたリポソームを親水性化処理する工程；ｉｉ）該リポソームへ標的指向性物質を結合させる工程；ｉｉｉ）該標的指向性物質が結合したリポソームを親水性化する工程ならびにｉｖ）該親水性化したリポソームを含む溶液を限外濾過をする工程を包含し得る。
　標的指向性物質としては、糖鎖（例えば、シリアルルイスＸ、Ｎ-アセチルラクトサミン、α１－６マンノビオース）、抗体（例えば、抗Ｅセレクチン抗体）、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマー、抗原などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、標的指向性物質は、リポソームを破壊することなく、リポソームに標的指向性を付与するようなものであれば、よいからである。当業者は、標的にあわせて、リポソームに結合させる標的指向性物質を適宜、決定することができる。
　別の局面において、本発明の金属コロイド含有リポソームは、ａ）脂質膜懸濁用緩衝液に脂質膜を懸濁し、脂質膜懸濁液を調製する工程：およびｂ）該脂質懸濁液と金属コロイド溶液とを混合し、リポソーム形成維持条件に供する工程を包含する方法によっても製造することができる。
　１つの実施形態において、本方法において使用され得る脂質膜は、例えば、リポソーム形成能を有する脂質を、有機溶媒に懸濁して攪拌し、該攪拌した有機溶媒を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させること等により得ることができるが、これらに限定されない。
　１つの実施形態において、リポソーム形成能を有する脂質としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、脂質膜を調製できるものでありさえすればよいからである。当業者は、このような脂質を、目的にあわせて適宜選択することができる。
　１つの実施形態において、本方法において使用される有機溶媒は、脂質が溶解し、揮発性があるものであればよい。これらとしては、アルコール、エーテル、アセトンなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、有機溶媒は、ジエチルエーテル、メタノール、アセトニトリル、アセトン、エタノール、塩化メチレン、クロロホルム、イソプロパノール、トルエン、キシレン、より好ましくは、メタノールとクロロホルムの混合液であり得る。当業者は、このような有機溶媒を、用いる脂質にあわせて適宜選択することができる。
　１つの実施形態において、本方法において使用され得る脂質膜は、前記脂質膜懸濁用緩衝液に対して脂質濃度４～５０ｍｇ／ｍｌの濃度、好ましくは、脂質濃度１０～２０ｍｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは、脂質濃度１５．２ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁され得るが、この濃度に限定されない。
　１つの実施形態において、本製造方法において使用される脂質膜懸濁用緩衝液としては、例えば、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）１－２－アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパン－３－プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２－（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３－Ｎ－シクロヘキシルアミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３－シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等を含み得る。
　１つの実施形態において、本方法において使用され得る金属コロイドは、例えば、所望の金属を、蒸留水、２次蒸留水、超純水、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）１－２－アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパン－３－プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２－（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３－Ｎ－シクロヘキシルアミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３－シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等に懸濁することによって調製することができる。好ましくは、金属を超純水に溶解することにより調製することができる。また、金属コロイドは、市販されている金属コロイド、例えば、メーカー：ワインレッドケミカル株式会社、製品名：金コロイド（イムノクロマト用）、製造コード:ＷＲＧＭ３などを所望の濃度に調整し、用いることもできる。
　好ましい実施形態において、本製造方法の前記ａ）工程は、（ａ１）リポソーム形成能を有する脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、コール酸ナトリウムなど）を、有機溶媒（例えば、メタノール・クロロホルム溶液）に懸濁して攪拌し、該攪拌した有機溶媒を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させて脂質膜を得る工程；および（ａ２）該脂質膜を、前記脂質膜懸濁用緩衝液（例えば、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝生理食塩液）に懸濁し、脂質膜懸濁液を調製する工程を包含し得る。ここで、好ましくは、脂質膜懸濁液の脂質濃度は、４～５０ｍｇ／ｍｌの濃度、好ましくは、脂質濃度１０～２０ｍｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは、脂質濃度１５．２ｍｇ／ｍｌの濃度であり得る。
　本製造方法において、リポソーム形成維持条件は、例えば、脂質懸濁液を窒素置換し、超音波処理し、金属コロイド溶液を用いて限外濾過に供することであり得る。好ましくは、リポソーム形成維持条件は、脂質懸濁液を窒素置換し、超音波処理し、金属コロイド溶液を用いて分画分子量５００～３００，０００、好ましくは１０，０００で限外濾過に供することであり得る。
　別の実施形態において、本発明の方法において、リポソーム形成維持条件は、所望の物質をリポソームに内包させる工程を包含し得る。所望の物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰなど）、発光酵素（例えば、ルシフェラーゼなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
　蛍光色素としては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ３Ｂ（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）７５０、フルオレセイン－４－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、カルセイン、それらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
　１つの実施形態において、本方法において使用され得る金属コロイドとしては、例えば、リチウム（Ｌｉ）、ベリリウム（Ｂｅ）、ナトリウム（Ｎａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ガリウム（Ｇａ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、ルビジウム（Ｒｂ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、イットリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、カドミウム（Ｃｄ）、インジウム（Ｉｎ）、スズ（Ｓｎ）、アンチモン（Ｓｂ）、セシウム（Ｃｓ）、バリウム（Ｂａ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロジウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、タリウム（Ｔｌ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、ポロニウム（Ｐｏ）、フランシウム（Ｆｒ）、ラジウム（Ｒａ）、それらの組み合わせの金属のコロイドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、ユーロピウム（Ｅｕ）などの金属が挙げられるが、これらに限定されない。金属コロイドは、金属をトルエン、キシレン、ヘキサン、テトラデカンなどの疎水性溶媒に分散することにより調製することができる。また、金、銀などは水などの極性溶媒に分散することも可能である。好ましくは、金属コロイドは、金を水に分散させたものであり得る。金コロイドは、糖類、アミン類を含む緩衝液などを分散させて調製することもできる。
　好ましい実施形態において、金属コロイドは金コロイドであり、本製造方法の前記ｂ）工程は、（ｂ１）金コロイドを、金量として、０．１～１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、金量として０．２５～８ｍｇ／ｍｌの濃度、０．５～５ｍｇ／ｍｌの濃度、０．７５～３ｍｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように液体に分散させ、金コロイド溶液を調製する工程；（ｂ２）前記脂質懸濁液を１０～６０℃、好ましくは、３０～４０℃で攪拌させ、窒素置換する工程；（ｂ３）窒素置換した該脂質膜懸濁液を超音波処理する工程；および（ｂ４）超音波処理した該脂質懸濁液を、金コロイド溶液を用いて、分画分子量５００～３００，０００、好ましくは１０，０００で限外濾過に供する工程を包含し得る。ここで、（ｂ１）工程では、金コロイドを、例えば、蒸留水、２次蒸留水、超純水、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）１－２－アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパン－３－プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２－（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３－Ｎ－シクロヘキシルアミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３－シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等に分散させることができるが、これらに限定されない。
　好ましい実施形態において、前記脂質懸濁液と前記金属コロイド溶液とは、１対９～９対１、好ましくは、３対７の混合比で懸濁され得るが、この範囲に限定されない。
　好ましい実施形態において、前記標的指向性物質を結合させる工程は、ｉ）得られたリポソームを親水性化処理する工程；ｉｉ）該リポソームへ標的指向性物質を結合させる工程；ｉｉｉ）該標的指向性物質が結合したリポソームを親水性化する工程ならびにｉｖ）該親水性化したリポソームを含む溶液を限外濾過をする工程を包含し得る。
　標的指向性物質としては、糖鎖（例えば、シリアルルイスＸ、Ｎ-アセチルラクトサミン、α１－６マンノビオース）、抗体（例えば、抗Ｅセレクチン抗体）、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマー、抗原などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、標的指向性物質は、リポソームを破壊することなく、リポソームに標的指向性を付与するようなものであれば、よいからである。当業者は、標的にあわせて、リポソームに結合させる標的指向性物質を適宜、決定することができる。
　別の局面において、本発明の金属コロイド含有リポソームは、凍結乾燥したリポソームと金属コロイド溶液とを混合する工程を包含する方法によっても製造することができる。
　１つの実施形態において、本方法において使用され得る金属コロイドとしては、例えば、リチウム（Ｌｉ）、ベリリウム（Ｂｅ）、ナトリウム（Ｎａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ガリウム（Ｇａ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、ルビジウム（Ｒｂ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、イットリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、カドミウム（Ｃｄ）、インジウム（Ｉｎ）、スズ（Ｓｎ）、アンチモン（Ｓｂ）、セシウム（Ｃｓ）、バリウム（Ｂａ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロジウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、タリウム（Ｔｌ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、ポロニウム（Ｐｏ）、フランシウム（Ｆｒ）、ラジウム（Ｒａ）、それらの組み合わせの金属のコロイドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、ユーロピウム（Ｅｕ）などの金属が挙げられるが、これらに限定されない。金属コロイドは、金属をトルエン、キシレン、ヘキサン、テトラデカンなどの疎水性溶媒に分散することにより調製することができる。また、金、銀などは水などの極性溶媒に分散することも可能である。好ましくは、金属コロイドは、金を水に分散させたものであり得る。金コロイドは、糖類、アミン類を含む緩衝液などを分散させて調製することもできる。
　１つの実施形態において、本方法において使用され得る金属コロイドは金コロイドであり、前記凍結乾燥したリポソームは、該金コロイド溶液に対して金量として、０．００１～１０ｍｇ／ｍｇ脂質、好ましくは、金量として、０．０５～０．１ｍｇ／ｍｇ脂質、０．０１～０．７５ｍｇ／ｍｇ脂質、０．０２５～０．５ｍｇ／ｍｇ脂質、０．５～１ｍｇ／ｍｇ脂質、より好ましくは、金量として、０．０５ｍｇ／ｍｇ脂質の濃度で懸濁され得る。
　本製造方法において使用され得る凍結乾燥リポソームは、どのような方法により調製されたものであってもよい。例えば、Ｈ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｎ．Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｐｏｓ．，１７，５８９－６０５（１９９９）等により報告されている方法により調製された凍結乾燥リポソームが使用され得る。
　本製造方法において、金属コロイドは、例えば、所望の金属を、蒸留水、２次蒸留水、超純水、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ８．４）、炭酸緩衝剤（ｐＨ８．５）、リン酸緩衝剤（ｐＨ８．０）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）、トリス（ヒドロキシ）アミノメタン緩衝剤、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）１－２－アミノエタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２エタンスルホン酸緩衝剤、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパン－３－プロパンスルホン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチルメチルグリシン）緩衝剤、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤、２－（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸緩衝剤、３－Ｎ－シクロヘキシルアミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝剤、３－シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸緩衝剤等に懸濁することによって調製することができる。好ましくは、金属を超純水に溶解することにより調製することができる。また、金属コロイドは、市販されている金属コロイド、例えば、メーカー：ワインレッドケミカル株式会社、製品名：金コロイド（イムノクロマト用）、製造コード:ＷＲＧＭ３などを所望の濃度に調整し、用いることもできる。好ましくは、金属コロイドは金コロイドであり、該金コロイド溶液に対して金量として、０．００１～１０ｍｇ／ｍｇ脂質、好ましくは、金量として、０．０５～０．１ｍｇ／ｍｇ脂質、０．０１～０．７５ｍｇ／ｍｇ脂質、０．０２５～０．５ｍｇ／ｍｇ脂質、０．５～１ｍｇ／ｍｇ脂質、より好ましくは、金量として、０．０５ｍｇ／ｍｇ脂質の濃度になるように溶解して調製することができる。
　１つの実施形態において、本発明の製造方法において、前記リポソームは、標的指向性物質を含み得る。当業者は、標的にあわせて、リポソームに結合させる標的指向性物質を適宜、決定することができる。
　（イメージング剤）
　１つの局面において、本発明は、金属コロイド含有リポソームを含むイメージング剤を提供する。
　本発明の金属コロイド含有リポソームは、少なくとも組織１ｇあたり約１８０ｎｇ、約１９０ｎｇ、約２００ｎｇ、約２５０ｎｇ、約３００ｎｇ、約３５０ｎｇ、約４００ｎｇ、約４５０ｎｇ、約５００ｎｇ、約５５０ｎｇ、約６００ｎｇ、約６５０ｎｇ、約７００ｎｇ、約７５０ｎｇ、約８００ｎｇ、約８５０ｎｇ、約９００ｎｇ、約９５０ｎｇ、１０００ｎｇ、約１１００ｎｇ、約１２００ｎｇ、約１３００ｎｇ、約１４００ｎｇ、約１５００ｎｇ、約１６００ｎｇ、約１７００ｎｇ、約１８００ｎｇ、約１９００ｎｇ、約２０００ｎｇ以上の金属コロイドが集積すれば、インビボイメージングにおいて検出することができる。
　別の実施形態において、本発明のイメージング剤において使用され得る金属コロイド含有リポソームは、標的指向性物質（例えば、糖鎖、抗体）をさらに含み得るが、これらに限定されない。
　別の実施形態において、本発明のイメージング剤において使用され得る金属コロイド含属有リポソームは、金属コロイドとして、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、ユーロピウム（Ｅｕ）等を含み得るが、これらに限定されない。
　１つの実施形態において、本発明のイメージング剤では、金属コロイド含有リポソームは金コロイド含有リポソームであり、該金コロイド含有リポソームは、１ｍｇ脂質あたり金量として８．２μｇ以上の金属コロイドを含むか、リポソーム溶液１ｍｌあたり金量として２８．７μｇ以上の金属コロイドを含み得る。
　別の実施形態において、本発明のイメージング剤において使用され得る金属コロイド含属有リポソームは、例えば、蛍光色素のような所望の物質を含んでいてもよい。
　本発明のイメージング剤は、生物学的因子を必要とする被験体へ生物学的因子を投与するため、および呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿器・生殖器系、中枢神経系または末梢神経系の障害を有する哺乳動物を処置するためにも使用され得る。
　本発明のイメージング剤の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本発明の分子イメージング剤は、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤等の固形製剤、シロッ　本発明のイメージング剤は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１５版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
　本発明の金属コロイド含有リポソームは、従来のイメージング剤よりも高感度なイメージングを可能にする。なぜなら、本発明では、イメージング剤として十分な量の金属コロイドをリポソームに含有させることにより、従来の数倍から数１００倍も組織に集積させることを可能としたからである。
　本発明のイメージング剤は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、その使用量を当業者が容易に決定することができる。本発明のイメージング剤を用いた画像化・イメージングを被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日－数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回－１ヶ月に１回）のイメージングが挙げられる。
　イメージング剤は、投与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、薬物送達媒体が患者による摂取に適した液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。
　ここで、本発明の金属含有リポソームを含むイメージング剤には、上述の（リポソーム）、（金属含有リポソーム）、（製造方法）に記載される任意の形態が使用され得る。
　（組成物）
　１つの局面において、本発明は、所望の部位を標識するための組成物を提供する。この組成物は、本発明において提供される金属コロイド含有リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含み得る。
　本発明の組成物は、必要に応じて、適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、蛍光色素、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよび／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の組成物は、金属コロイドおよび必要に応じて他の有効成分を、少なくとも１つの生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、ミセル、注射溶液、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的に使用される他の物質を補充することが可能である。
　本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくは、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、好ましくは、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α－トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；アミン類（例えば、ジエチレントリアミン５酢酸）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられる。
　例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ約７．０－８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ約４．０－５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
　以下に本発明の組成物の一般的な調製法を示す。本発明の組成物などは、薬学的に受容可能なキャリアと必要に応じて配合し、例えば、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸収剤、湿潤剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には、シアリルルイスＸ、脂質など以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、皮膚投与など等が挙げられるがそれらに限定されない。全身投与されるとき、本発明において使用される組成物は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製について、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することは、当業者の技術範囲内である。
　液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。
　液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
　液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
　液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。
　液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等が挙げられるがそれらに限定されない。
　液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
　液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２－フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
　液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α－トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
　注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液または他の目的のための注射部位における溶媒と等張であることが好ましい。通常、これらは、細菌保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射などによって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。
　さらに、本発明の組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の物質を含んでいてもよい。
　本発明において使用される物質、組成物等の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の方法を被験体に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日－数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回－１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間－１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。投与する量は、処置されるべき部位が必要とする量を見積もることによって確定することができる。
　ここで、本発明の金属含有リポソームを含む組成物には、上述の（リポソーム）、（金属含有リポソーム）、（製造方法）に記載される任意の形態が使用され得る。
　（使用）
　１つの局面において、本発明は、所望の部位を標識するための組成物の製造のための、本発明の金属コロイド含有リポソームの使用を提供する。
　ここで、本発明の金属含有リポソームを含む使用には、上述の（リポソーム）、（金属含有リポソーム）、（製造方法）に記載される任意の形態が使用され得る。
　（標識方法）
　１つの局面において、本発明は、所望の部位を標識するための方法を提供する。この方法は、該被験体に、該所望の部位を標識するための組成物を投与する工程を包含し、該組成物は、本発明の金属コロイド含有リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含み得る。
　本明細書において「被験体」とは、本発明のイメージング剤を用いた画像化／イメージングが適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は、例えば、鳥類、哺乳動物などであってもよい。好ましくは、そのような動物は、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、ヒトであり得る。
　本発明の組成物が実際に投与される量は、所望の部位が標識されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の標識が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。用量の決定は十分に当業者の能力内にある。用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用する細胞の種類等により適宜選択される。
　ここで、本発明の金属含有リポソームを含む使用には、上述の（リポソーム）、（金属含有リポソーム）、（製造方法）、（組成物）に記載される任意の形態が使用され得る。
　以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
　以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、市販されているものを使用した。
　（実施例１．金コロイド内包リポソームの調製）
　（１．改良型コール酸塩透析法（１））
　リポソームは既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ　Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．－Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６－６５）により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシド（Ｔｏｔａｌ　Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ　Ｅｘｔｒａｃｔ（脳、ブタ－アンモニウム塩）販売元：Ａｖａｎｔｉ、カタログ番号：１００２３２（８６００５３Ｐ））およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを、それぞれ３５：４０：５：１５：５のモル比で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合した。混合した脂質に、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加し、クロロホルム／メタノール（１：１）溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。金コロイド溶液は、市販の金コロイドの溶液（メーカー：ワインレッドケミカル株式会社、製品名：金コロイド（イムノクロマト用）、製造コード:ＷＲＧＭ３）を、１ｍｇ/ｍｌの濃度になるように超純水に懸濁することにより調製した。
　得られた脂質膜を、１０ｍＬ金コロイド溶液に再懸濁し、３７℃で１時間攪拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理し、透明なミセル懸濁液１０ｍｌを得た。このミセル懸濁液を、ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）およびＮ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝生理食塩液（ＴＡＰＳ：ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）にかけ、均一な金コロイドを含有するリポソーム粒子懸濁液１０ｍｌを調製した。
　また、実施例１において調製したＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソームを、限外濾過（分画分子量：３００，０００）により、１０倍に濃縮した。
　得られた金コロイド含有リポソーム粒子について、生理食塩懸濁液中（３７℃）での粒子径およびゼータ電位を、ゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定した。その結果、リポソームでは、粒子径は約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、ゼータ電位は－３０～－１２０ｍＶであった。
　（２．改良型コール酸塩透析法（２））
　リポソームは既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ　Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．－Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６－６５）により、改良型コール酸透析法をさらに改良した方法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシド（Ｔｏｔａｌ　Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ　Ｅｘｔｒａｃｔ（脳、ブタ－アンモニウム塩）販売元：Ａｖａｎｔｉ、カタログ番号：１００２３２（８６００５３Ｐ））およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを、それぞれ３５：４０：５：１５：５のモル比で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合した。混合した脂質に、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加し、クロロホルム／メタノール（１：１）溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。金コロイド溶液は、市販の金コロイドの溶液（メーカー：ワインレッドケミカル株式会社、製品名：金コロイド（イムノクロマト用）、製造コード:ＷＲＧＭ３）を、１ｍｇ/ｍｌの濃度になるように超純水に懸濁することにより調製した。
　得られた脂質膜をＮ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ　８．４）３ｍｌに再懸濁し、３７℃で１時間攪拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理し、透明なミセル懸濁液３ｍｌを得た。この超音波処理したミセル懸濁液に金コロイド溶液（７ｍｌ）を撹拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、この金コロイド入りミセル懸濁液をＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＮ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノメタン（ＴＡＰＳ）緩衝生理食塩液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）にかけ均一な金コロイドを含有するリポソーム粒子懸濁液１０ｍｌを調製した。
　得られた金コロイド含有リポソーム粒子について、生理食塩懸濁液中（３７℃）での粒子径およびゼータ電位を、ゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定した。その結果、粒子径は約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、ゼータ電位は－３０～－１２０ｍＶであった。
　（金コロイド含有リポソーム脂質膜面上の親水性化処理）
　上記の（１．改良型コール酸塩透析法（１））および（２．改良型コール酸塩透析法（２））で調製した金コロイド含有リポソーム溶液各１０ｍｌを、ＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）および炭酸緩衝液（ｐＨ　８．５）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけ、溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加え、室温で２時間攪拌した。その後、さらに７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜および炭酸緩衝液（ｐＨ　８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけた。次に、炭酸緩衝液（ｐＨ　８．５）１ｍｌに溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えた。次いで、この溶液を、室温で２時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換し、リポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン上にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
　（金コロイド含有リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合）
　リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合は、既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ　Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．－Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６－６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行った。はじめに、本実施例で得られた各１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＮ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ　８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム１０．８ｍｇを加え、７℃で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化した。ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ　８．０）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換して、酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ　８．０）を加えて室温で２時間反応させ、次に２Ｍ　ＮａＢＨ３ＣＮ／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ　８．０）１００μｌを加えて室温で２時間、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。次いで、限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換して、ＨＳＡ結合リポソーム液各１０ｍｌを得た。
　（３．凍結乾燥法による金コロイド含有リポソームの調製）
　金コロイド溶液は、上記の改良型コール酸塩透析法と同様の方法により調製した。凍結乾燥リポソームは、ＣＯＡＳＴＯＭＥ　ＥＬシリーズ（ＥＬ－０１－ＰＡ、日油）を使用した。このＣＯＡＳＴＯＭＥ　ＥＬ－０１－ＰＡ（負電荷リポソーム）の組成は、ジセチルホスファチジルエタノールアミン－ポリグリセリン８Ｇ：ジパルミトイルホスファチジルコリン：コレステロール：ジパルミトイルホスファチジルグリセロール＝４．２：１１．４：１５．２：１１．４（μＭｏｌ／バイアル）である。金コロイド溶液は、市販の金コロイドの溶液（メーカー：ワインレッドケミカル株式会社、製品名：金コロイド（イムノクロマト用）、製造コード:ＷＲＧＭ３）を、１ｍｇ/ｍｌおよび０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように超純水に懸濁することにより調製した。各金コロイド溶液を凍結乾燥リポソームのバイヤル内に３ｍＬ滴下した。バイヤルを４～５回転倒混和し、ＰＭ１０（ＡＭＩＣＯＮ）とトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパンスルホン酸緩衝液（ＴＡＰＳ緩衝液：ｐＨ８．４)１を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）によりリポソーム各１０ｍＬを調製した。
　得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）の金コロイド含有リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定した。その結果、上記金コロイド含有リポソームは、粒子径は、０．１ｍｇ／ｍLの金コロイド溶液内包のものが約６８．１ｎｍ～約３９６ｎｍ、ゼータ電位は－８１．７～－１５．３ｍＶであり、１ｍｇ／ｍLの金コロイド溶液内包のものが約６８．１ｎｍ～約３４２ｎｍ、ゼータ電位は－９５．９～３．５７ｍＶであった。粒子分布は、図１に示す。
　（比較例１．バンガム法（１））
　本比較例では、リポソーム作製法として古典的な方法であり、数多くの文献（例えば、（秋吉一成，辻井薫，リポソーム応用の新展開人工細胞の開発に向けて．２００５：ＮＴＳ）；Ｂａｎｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３，２３８－２５２（１９６５））で使用されているバンガム法を用いて金属コロイドをリポソームに含有させる実験を行った。
　脂質として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）４５．６ｍｇをクロロホルム３ｍＬに溶解した。この脂質を５０℃で加熱し、窒素ガスを吹き付け、溶媒を揮散させた。次いで、真空ポンプで減圧し、低圧状態で一晩静置した。金コロイド溶液は、市販の金コロイドの溶液（メーカー：ワインレッドケミカル株式会社、製品名：金コロイド（イムノクロマト用）、製造コード:ＷＲＧＭ３）を、１ｍｇ/ｍｌおよび０．１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように超純水に懸濁することにより調製した。金コロイド溶液各１０ｍＬを加え、６５℃で１時間撹拌して脂質を再分散させた。超音波洗浄器（Ａｔｔｏ）で１時間処理した後、６５℃に加熱した。次いで、エクストルーダー（Ａｖａｎｔｉ）を用いて、φ１００ｎｍフィルターでエクストルージョンした。最後に、３００ｋユニット（Ｓａｌｔｏｒｉｕｓ社製、Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０）で限外濾過し、リポソームを得た。
　得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）の金コロイド含有リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定した。その結果、上記リポソームは、粒子径は１ｍｇ金コロイド溶液を用いたものが５８．８ｎｍ～約６４４０ｎｍ、ゼータ電位は－６．９９～２６．３ｍＶであり、０．１ｍｇ金コロイドを用いたものが４３．８ｎｍ～約６４４０ｎｍ、ゼータ電位は－４４．５～１０．９ｍＶでありであった。粒子分布は、図２に示す。
　（比較例２．バンガム法（２））
　金コロイド溶液３．５ｍＬ（０．０５ｍｇ／ｍＬ）、トルエン３．５ｍＬ、およびステアリルアミン（Ｆｌｕｋａ：５ｍｇ）を加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、この混合液を７０℃に加熱し、金コロイドをトルエン層に移行させた。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）４５．６ｍｇをクロロホルム３ｍＬに溶解した。ついで、金コロイド／トルエン溶液３ｍＬをＤＰＰＣ溶液に加え、混合した。この混合物を５０℃で加熱し、窒素ガスを吹き付けて溶媒を揮散させた。真空ポンプで減圧し、低圧状態で一晩静置した。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ（－））１０ｍＬを加え、６５℃で１時間撹拌し、脂質を再分散させた。次いで、超音波洗浄器で１時間処理した。次に、６５℃に加熱した。次いで、エクストルーダー（Ａｖａｎｔｉ）を用いて、φ１００ｎｍフィルターでエクストルージョンした。最後に、３００ｋユニット（Ｓａｌｔｏｒｉｕｓ社製、Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０）で限外濾過し、リポソームを得た。
　得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）の金コロイド含有リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定した。その結果、上記リポソームは、粒子径は６８ｎｍ～約６４４０ｎｍ、ゼータ電位は３０～９３ｍＶであった。粒子分布は、図３に示す。
　（実施例２．標的指向性物質により修飾したリポソームの調製）
　（Ｉ．糖鎖による修飾）
　（糖鎖の調製）
　糖鎖としてシアリルルイスＸ（ＳＬＸ）（メーカー：ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ、カタログ番号：５６５９５０）を使用した。
　（金コロイド含有リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への糖鎖の結合とリンカータンパク質（ＨＳＡ）の親水性化処理）
　本実施例において調製した糖鎖（ＳＬＸ）２ｍｇを精製水（０．５ｍｌ）に溶解した。この溶液を、０．２５ｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶かした０．５ｍｌ糖鎖溶解液に加え、３７℃で３日間攪拌した。その後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、糖鎖のグリコシルアミン化合物４ｍｇ／ｍｌ（アミノ化糖鎖溶液）を得た。次に、実施例１で得たリポソーム液の一部分１０ｍｌに架橋試薬３，３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加えて室温で２時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ　８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離のＤＴＳＳＰを除去し、ＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１０ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物（アミノ化糖鎖溶液）３７．５μｌを加えて、室温で２時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ　８．５）を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ　７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離の糖鎖およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、０．４５μｍのフィルター、０．２２μｍのフィルターで順に濾過した。その結果、糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各１０ｍｌが得られた。修飾結合密度０．００７５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質で糖鎖修飾リポソームを調製した。
　また、実施例２において調製したＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソームを、限外濾過（分画分子量：３００，０００）により、１０倍に濃縮した。
　得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）の金コロイド含有リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定した。その結果、上記糖鎖修飾金コロイド含有リポソームは、粒子径は約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、ゼータ電位は－３０～－１２０ｍＶであった。１０濃縮したリポソームでは、粒子径は約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、ゼータ電位は－３０～－１２０ｍＶであった。粒子分布を、それぞれ図４および図５に示す。
　（ＩＩ．抗体による修飾）
　（モノクローナル抗体の精製方法）
　抗Ｅ－セレクチン抗体は、抗Ｅ－セレクチン抗体産生ハイブリドーマ（ＣＬ－３）ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－２５１５から精製した。
　マウスＢａｌｂ／ｃ（雌性６週齢）に、プリスタン０．５ｍＬ／マウスを投与した。ハイブリドーマをＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ，Ｐｃ＋Ｓｔ）培地で、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ＰＢＳに細胞を懸濁して、５×１０６細胞／マウスでマウスの腹腔内に投与した。約２週間後に腹水を採取した。硫酸アンモニウム沈殿し、沈殿物をＰＢＳに溶解させ、ＰＢＳ緩衝液で透析を行った。プロテインＧカラム（ＨｉＴｒａｐ　ＰｒｏｔｅｉｎＧ　ｃｏｌｕｍ　１ｍＬ）カラムに透析後の溶液を通した。カラムを洗浄後、プロテインＧに結合したモノクローナル抗体を、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．７）にて溶出し、溶出液を１ＭＴｒｉｓ溶液（ｐＨ９．０）で中和した。
　（リポソーム膜面上への抗Ｅ－セレクチン抗体の結合）
　過ヨウ素酸ナトリウムを約０．０１５ｇを秤量し、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパンスルホン酸緩衝液（ＴＡＰＳ緩衝液：ｐＨ８．４)１ｍＬで溶解した。この過ヨウ素酸ナトリウム溶液を実施例１の（２．改良型コール酸塩透析法（２））において調製したリポソームに添加し、酸化反応をさせ、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ緩衝液：ｐＨ８．０)下で限外濾過（３００Ｋ）した。次いで、ＨＳＡ溶液(１０ｍｇ／ｍＬ)を添加し、ゆるやかに転倒混和後、室温で２時間攪拌した。
　ＮａＢＨ３ＣＮを０．００３ｇ秤量し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５)１００μＬで溶解したＮａＢＨ３ＣＮ溶液を添加して、冷蔵下で一晩、還元反応により結合させた。炭酸緩衝液（ＣＢＳ緩衝液：ｐＨ８．５）下で限外濾過（３００Ｋ）に供した。
　次いで、３，３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（ＤＴＳＳＰ、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ．，ＵＳＡ製：Ｎｏ．２１５７８）を０．０１ｇ秤量し、ＣＢＳ緩衝液(ｐＨ８．５)４００μＬで溶解したＤＴＳＳＰ溶液を添加し、室温で２時間反応後、冷蔵下で一晩反応させる。その後、ＣＢＳ緩衝液(ｐＨ８．５)下で限外濾過（３００Ｋ）に供した。
　上記方法にて精製した抗Ｅ－セレクチン抗体（２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）をそれぞれ添加した。その後、室温で２時間反応させたのち、トリスヒドロキシアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を(１３２ｍｇ／ｍＬ)加え、さらに室温で一晩、反応させた。
　２－［４－（２－ヒドロキシルエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液(ｐＨ７．２)下で限外濾過（３００Ｋ）を行い、０．４５μｍフィルターで濾過を行った。
　得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）の金コロイド含有リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．，ＵＫ）により測定した。その結果、上記糖鎖修飾金コロイド含有リポソームは、粒子径は約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、ゼータ電位は－３０～－１２０ｍＶであった。
　実施例１の（１．改良型コール酸塩透析法（１））において調製したリポソームについても本実施例と同様の方法により抗体で修飾することが可能である。
　（調製例１．糖鎖／抗体の結合していない金コロイド含有リポソームの調製）
　（リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの結合）
　本調製例では、比較試料としての糖鎖／抗体の結合していない金コロイド含有リポソームを調製する。実施例１の（金コロイド含有リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合）で得たリポソーム液の一部分（１０ｍｌ）に架橋試薬３，３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加えて室温で２時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ　８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離のＤＴＳＳＰを除去し、ＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１０ｍｌを得る。次に、このリポソーム液にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｗａｋｏ　Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）２６．４ｍｇを加えて、室温で２時間攪拌し、その後冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの結合を行う。ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ　７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）する。この工程で既に大過剰である２６．４ｍｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが存在するのでリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理も同時に完結させる。０．４５μｍのフィルター、０．２２μｍのフィルターで順に濾過させ、最終産物である親水性化処理されたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム（略称：ＴＲＩＳ）を得る。
　（実施例３．リポソームの定量分析）
　実施例１で調製した金属含有リポソームおよび比較例のリポソームについて定量分析を行った。
　（Ｉ．タンパク質定量）
　リポソームに内包されたＨＳＡ量とリポソーム表面にカップリングしたＨＳＡの総タンパク質量をＢＣＡ法により測定した。
　タンパク質量の測定は、Ｍｉｃｒｏ　ＢＣＡＴＭ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔキット（カタログ番号２３２３５ＢＮ）（ＰＩＥＲＣＥ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いた。標準物質として、キットに添付された２ｍｇ／ｍｌアルブミン（ＢＳＡ）を使用した。
　スタンダード溶液として、標準物質（２ｍｇ／ｍｌ：アルブミン）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、０、０．２５、０．５、１、２、３、４、５μｇ／５０μｌ溶液を調製した。金コロイド含有リポソームをＰＢＳ緩衝液で２０倍希釈し、検体溶液を調製した。スタンダード溶液、検体溶液をそれぞれ試験管に５０μｌ分注した。各試験管に３％ラウリル硫酸ナトリウム溶液（ＳＤＳ溶液）を１００μｌ添加した。キットに添付された試薬Ａ、Ｂ、Ｃを、試薬Ａ：試薬Ｂ：試薬Ｃ＝４８：２：５０となるように混合し、各試験管に１５０μｌ添加した。この試験管を、６０℃で１時間、静置した。室温に戻ってから、吸光度５４０ｎｍを測定し、スタンダード溶液により検量線を作成して、リポソームのタンパク質量を測定した。
　（ＩＩ．脂質定量）
　リポソームに含まれる脂質量を、リン脂質Ｃ－テスト（ワコー）を用いて測定した。スタンダードとして、キットのリン脂質標準液を、発色試液と混合し、５９６１μｇ／ｍＬ、３０００μｇ／ｍＬ、１５００μｇ／ｍＬ溶液を調製した。
　キットの発色剤と緩衝剤とを全量混合し発色試液とした。発色試液０．７５ｍＬに対しサンプル溶液を５μｌ加えた。サンプル溶液・スタンダード溶液を、２５０μＬずつ９６穴プレートに分注し、３７℃インキュベーターで１０分間インキュベートした。次いで、マイクロプレートリーダーでＡ５９５を測定し、リン脂質濃度を算出した。
リン脂質濃度から脂質量を求める換算式
Ａ５９５×０．９６４×４５．６／１６.８＝総脂質量
０．９６４…キット表示の換算値との誤差。換算係数。
４５．６…脂質総量
１６.８…ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）量。
　（金コロイド濃度の測定）
　フレームレス原子吸光光度法（ＦＡＡＳ）により金量を定量した。フレームレス原子吸光光度法（ＦＡＡＳ）には、ＡＡ－６７００　Ａｔｏｍｉｃ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｆｌａｍｅ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（島津）を用いた。波長２４２．８ｎｍ、スリット幅０．５、ランプ電流１２ｍＶの条件下にて、１２０℃で３０秒間、２５０℃で１０秒間、５００℃で２０秒間、５００℃で５秒間、１７００℃で３秒間にわたって順次処理した。金標準液（１ｍｇ　Ａｕ／　ｍｌ、１０００ｐｐｍ）を精製水で希釈して、１ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌの溶液を調製し、検量線を作成した。リポソーム溶液を精製水で１０００～１０００００倍して、披検試料とした。
　得られたリポソームの金量、脂質濃度、金コロイド濃度等について、以下の表にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
金：リポソームに含有させるために用いた金コロイド
　原液：１ｍｇ／ｍＬの金コロイド溶液
　１／２０：上記原液を２０倍希釈した金コロイド溶液
　１／１０：上記原液を１０倍希釈した金コロイド溶液
脂質濃度（μｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりの脂質量
金コロイド濃度（μｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりの金コロイド重量（μｇ）
脂質１μｇあたりの金コロイド量（μｇ）：リポソーム中の脂質１μｇあたりの金コロイ
ド重量（μｇ）
バンガム法（２）：比較例２により調製したリポソーム
バンガム法（１）：比較例１により調製したリポソーム
ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）：実施例１の凍結乾燥法により調製したリポソーム
改良コール酸法　Ｋ１（１）：実施例１の（１．改良型コール酸塩透析法（１）改良法）
により調製し、糖鎖で修飾した金コロイド含有リポソーム
改良コール酸法　Ｋ１（２）：実施例１の（２．改良型コール酸塩透析法（２）従来法）
により調製し、糖鎖で修飾した金コロイド含有リポソーム。
　以上の結果より、バンガム法（１）で調製したリポソームは、金量が、リポソーム溶液１ｍｌあたり２８．７μｇ、脂質１ｍｇあたり８．２μｇであるのに対し、改良型コール酸塩透析法（１）改良法により調製したリポソームは、金量が、リポソーム溶液１ｍｌあたり５２２μｇ、脂質１ｍｇあたり１３１μｇであった。したがって、改良型コール酸塩透析法（１）改良法では、金の含有量がバンガム法に比べて１５倍程度高かった。
　また、リポソーム１個あたりに含まれる金量は、改良型コール酸塩透析法（１）改良法では６．５×１０－１５ｍｇ、改良型コール酸塩透析法（２）従来法では４．５×１０－１５ｍｇ、凍結乾燥法では１．５×１０－１４ｍｇであった。これに対し、バンガム法では、リポソーム１個あたり８．２×１０－１５ｍｇの金量であるので、本発明の金コロイド含有リポソームはいずれも、バンガム法よりも顕著に多くの金コロイドを含有することができたといえる。
　実施例１および実施例２において調製した金コロイド含有リポソームの物性を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
金コロイド：リポソームに含有させるために用いた金コロイドの粒径
Ｋ０：未修飾金コロイド含有リポソーム
Ｋ１：ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソーム
Ａｕ量（μｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりの金コロイド重量（μｇ）
脂質量（μｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりの脂質量。
　実施例１および２において調製した金コロイド含有リポソーム（１０倍濃縮）の物性を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
金コロイド：リポソームに含有させるために用いた金コロイドの粒径
Ｋ０：未修飾金コロイド含有リポソーム
Ｋ１：ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソーム
Ａｕ量（μｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりの金コロイド重量（μｇ）
脂質量（μｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりの脂質量
　（実施例４．金コロイド含有リポソームの確認）
　本実施例では、実施例２において製造したＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソームを用いた。
　（１．透過型電子顕微鏡試料作製法）
　低粘性樹脂Ｓｐｕｒｒ（コスモ・バイオ、カタログ番号：２４３００－１）による包埋法を用いて、顕微鏡試料を作製した。
　ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソームを、２％　グルタルアルデヒドと２％　ホルムアルデヒドとの混合液を用いて、室温で一晩、前固定した。次いで、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄し、１．５％　ＯｓＯ４を用いて、室温で１．５時間、後固定した。次いで、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した。
　洗浄した試料を、５０％エタノール（１０分）、７０％エタノール（１０分）、９０％エタノール（３０分）、１００％エタノール（３０分×２回）により、脱水した。この脱水した試料を、Ｓｐｕｒｒ　１（３０分）、Ｓｐｕｒｒ　２（３０分）、Ｓｐｕｒｒ　３（６０分、減圧下）、Ｓｐｕｒｒ　４（一晩、減圧下）に連続して浸漬した。翌朝、新しいＳｐｕｒｒで試料を包埋した。包埋した試料を、４５℃で６０分、６０℃で３０分、そして７０℃で１４時間にわたり熱処理して、Ｓｐｕｒｒを熱重合させた。次いで、定法に従い、厚さ６０～９０ｎｍの超薄切片を作製した。
　（ウランと鉛との二重染色）
　ウランと鉛との二重染色を以下のように実施した。
　超薄切片をグリット上に載せた。このグリッドをパラフィルムの上で滴下した酢酸ウラン溶液につけ、蒸留水で洗浄したのち、クエン酸鉛溶液でも同様につけ、蒸留水で洗浄し、乾燥させた。
　ウランと鉛との二重染色に供した試料を、日立Ｈ７１００透過型電子顕微鏡で観察した（図６）。
　（２．走査型電子顕微鏡試料作製法）
　走査型電子顕微鏡試料は、以下のように調製した。
　カバーガラスを試料台の大きさにあわせて割った。この割ったカバーガラスにカーボン蒸着をした。この蒸着したガラスを、０．１％のポリ－Ｌ－リジン水溶液に１分間浸漬し、軽く撹拌した。ついで、このガラスを蒸留水で５回以上洗浄し、３７℃恒温器内で乾燥させた。乾燥後、ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソーム溶液をガラスに滴下し、１分間放置した。試料を乾燥させないように余分な試料液を取り除いた。その後、ガラスを、５０％エタノールを入れて１０分間、７０％エタノールを入れて１０分間、９０％エタノールを入れて１０分間、９５％エタノールを入れて１０分間、９９％エタノールを入れて１０分間、９９．５％エタノールを入れて１０分間、無水エタノールを入れて２０分間、そしてさらに無水エタノールを入れて２０分間放置した。次に、ｔ－ブチルアルコールを入れて２０分間放置し、再度、ｔ－ブチルアルコールを入れ換えて脱水した。脱水後、ガラスを冷凍庫で凍結した。凍結できたサンプルをｔ－ブチルアルコール乾燥機で乾燥した。その後、乾燥後のサンプルを試料台に接着し、オスミウム蒸着した（１０秒）。なお、固定はガラスに付着させる前にした。具体的には、２％　グルタルアルデヒドと２％　ホルムアルデヒドとの混合液をリポソーム溶液に対して等量添加し、一晩、室温でインキュベートすることにより固定した。
　調製した試料を、高分解能走査型電子顕微鏡Ｓ－９００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて観察した。具体的には、まず、顕微鏡が使用可能状態であることを確認した。次いで、試料交換室が真空排気されていることを確認し、試料ホルダーを取りした。試料ホルダーに試料をセットし、試料交換室へ装填し、真空させた。加速電圧を確認し、必要に応じて観察視野、倍率の変更を行い、試料像の観察を行った。観察像の写真撮影を行った。その結果を、図７に示す。
　（実施例５．インビボ実験）
　本実施例では、金コロイド含有リポソームをＥＡＴ細胞移植担癌マウスに投与し、各臓器の金量の定量および電子顕微鏡による組織切片中の金コロイドの観察を行った。
　本実施例では、実施例２において製造した金コロイド含有リポソーム（ＳＬＸ修飾した金コロイド含有リポソーム（Ｋ１）、および未修飾金コロイド含有リポソーム（Ｋ０））を用いた。
　（担癌マウスの作製）
　マウス（ｄｄＹマウス、雄性、７週齢）の右大腿部皮下に、Ｅｈｒｌｉｃｈ　ａｓｃｉｔｅ　ｔｕｍｏｒ（ＥＡＴ）細胞（５×１０６　細胞／マウス）を移植し、１０日後に実験に使用した（図８）。
　（投与方法）
　麻酔をかけるために、生理食塩水で１０倍希釈した３００μｌのネンブタール溶液を、腹腔内に投与した。
　実施例２において調製したＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソーム溶液（リポソーム溶液１ｍｌあたり５００μｇの金量）およびＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソーム溶液を１０倍濃縮したリポソーム溶液（各２００μｌ）を担癌マウスに尾静脈投与した。投与の４８時間後に腫瘍、肝臓、脾臓を摘出した。
　（評価方法）
　摘出した各サンプルを、０．１ｇずつ量り、王水（濃塩酸：濃硝酸＝３：１）２ｍＬ添加し、６０℃で１時間放置した。その後、原子吸光法により金量を測定した。具体的には、以下のとおり行った。
　フレームレス原子吸光光度法（ＦＡＡＳ）により金量を定量した。フレームレス原子吸光光度法（ＦＡＡＳ）には、ＡＡ－６７００　Ａｔｏｍｉｃ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｆｌａｍｅ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（島津）を用いた。波長２４２．８ｎｍ、スリット幅０．５、ランプ電流１２ｍＶの条件下にて、１２０℃で３０秒間、２５０℃で１０秒間、５００℃で２０秒間、５００℃で５秒間、１７００℃で３秒間にわたって順次処理した。金標準液（１ｍｇ　Ａｕ／　ｍｌ、１０００ｐｐｍ）を精製水で希釈して、１ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌの溶液を調製し、検量線を作成した。王水処理溶液を精製水で希釈して、披検試料とした。
　次いで、肝臓、腫瘍部位を透過型電子顕微鏡　Ｈ－７１００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて観察した（以下、ＴＥＭ観察と称する。具体的には以下のとおり行った。
　低粘性樹脂Ｓｐｕｒｒ（販売元：コスモ・バイオ、カタログ番号：２４３００－１）による包埋法を用いて、顕微鏡試料を作製した。
　取り出した組織切片を、２％　グルタルアルデヒドと２％　ホルムアルデヒドとの混合液を用いて室温で一晩、前固定した。次いで、生理食塩水で洗浄し、１．５％　ＯｓＯ４を用いて、室温で１．５時間、後固定した。次いで、生理食塩水で洗浄した。
　洗浄した試料を、５０％エタノール（１０分）、７０％エタノール（１０分）、９０％エタノール（３０分）、１００％エタノール（３０分×２回）により、脱水した。この脱水した試料を、Ｓｐｕｒｒ　１（３０分）、Ｓｐｕｒｒ　２（３０分）、Ｓｐｕｒｒ　３（６０分、減圧下）、Ｓｐｕｒｒ　４（一晩、減圧下）に連続して浸漬した。翌朝、新しいＳｐｕｒｒで試料を包埋した。包埋した試料を、４５℃で６０分、６０℃で３０分、そして７０℃で１４時間にわたり熱処理して、Ｓｐｕｒｒを熱重合させた。次いで、定法に従い、厚さ６０～９０ｎｍの超薄切片を作製した。
　（ウランと鉛との二重染色）
　ウランと鉛との二重染色を以下のように実施した。
　超薄切片をグリット上に載せた。このグリッドをパラフィルムの上で滴下した酢酸ウラン溶液につけ、蒸留水で洗浄したのち、クエン酸鉛溶液でも同様につけ、蒸留水で洗浄し、乾燥させた。
　その結果、実施例１および２において調製した金コロイド含有リポソームは、肝臓、腫瘍において集積することが確認された（図９～１８）。つまり、実施例１および２において調製した金コロイド含有リポソームは、インビボイメージングに使用できることが確認された。
　比較例１および２においてバンガム法を用いて調製したリポソームについても、本実施例と同様の方法を使用することにより、インビボイメージングに使用できるか否かを確認することができる。バンガム法を用いて調製したリポソームでは、リポソームに含有された金量が非常に少ないことから、インビボイメージングにおいてイメージング剤として使用することは困難と考えられる。
　（実施例６．蛍光色素を内包する金コロイド含有リポソームの調製）
　（蛍光色素溶液の調製）
　蛍光色素として、ｃｙ５．５（登録商標）、ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ３Ｂ（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ３５０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）７５０、フルオレセイン－４－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、カルセイン、それらの組み合わせを用いる。
　ヒト血清アルブミン／Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝液溶液に、蛍光色素／Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝液溶液を混合して撹拌した。この混合溶液を、限外濾過し、遊離の蛍光色素を除去し、蛍光色素標識ヒト血清アルブミン溶液を調製する。
　（１．改良型コール酸塩透析法（１）改良法）
　本実施例は、蛍光色素を内包する金コロイド含有リポソームを調製する。
　ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを混合する。混合した脂質に、コール酸ナトリウムを添加し、クロロホルム／メタノール溶液に溶解する。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得る。
　得られた脂質膜を金コロイドおよび蛍光色素溶液に再懸濁し、攪拌する。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理し、透明なミセル懸濁液１０ｍｌを得る。このミセル懸濁液を、限外濾過にかけ、蛍光色素が内包された金コロイドを含有するリポソーム粒子懸濁液を得る。
　得られた金コロイド含有リポソーム粒子の粒子径およびゼータ電位は、ゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定することができる。
　（２．改良型コール酸塩透析法（２）従来法）
　本実施例は、蛍光色素を内包する金コロイド含有リポソームを調製する。
　ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを混合する。混合した脂質に、コール酸ナトリウムを添加し、クロロホルム／メタノール溶液に溶解する。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得る。
　得られた脂質膜をＮ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝液に再懸濁し、攪拌する。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理し、透明なミセル懸濁液を得る。この超音波処理したミセル懸濁液に金コロイド溶液および蛍光色素溶液を撹拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このミセル懸濁液を限外濾過にかけ蛍光色素が内包された金コロイドを含有するリポソーム粒子懸濁液を得る。
　得られた金コロイド含有リポソーム粒子の粒子径およびゼータ電位は、ゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定することができる。
　（金コロイド含有リポソーム脂質膜面上の親水性化処理）
　本実施例で調製した、蛍光色素が内容された金コロイド含有リポソーム溶液を用いること以外、実施例１と同様の方法を使用する。リポソーム溶液を限外濾過にかけ、ｐＨを調製する。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）を加え攪拌した。その後、このリポソーム液を限外濾過にかける。次いで、炭酸緩衝液に溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンをリポソーム液に加える。この溶液を攪拌後、限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去する。緩衝液を交換し、リポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの化学結合反応を完結させる。
　（金コロイド含有リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合）
　リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合は、実施例２と同様の方法を用いる。リポソーム膜面上に存在するガングリオシドを、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝液に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウムを加え攪拌することにより過ヨウ素酸酸化する。限外濾過をすることにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、緩衝液を交換して、酸化されたリポソームを得る。このリポソーム液に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＰＢＳ緩衝液を加えて反応させ、次にＮａＢＨ３ＣＮ／ＰＢＳ緩衝液を加えて攪拌する。次いで、限外濾過し、緩衝液を交換して、ＨＳＡ結合リポソーム液を得る。
　（３．凍結乾燥法による金コロイド含有リポソームの調製）
　凍結乾燥リポソームは、ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）　ＥＬシリーズ（ＥＬ－０１－ＰＡ、日油）を使用する。金コロイド溶液および蛍光色素溶液を凍結乾燥リポソームのバイヤル内に滴下し、バイヤルを数回回転倒混和し、限外濾過によりリポソームを調製する。
　得られた金コロイド含有リポソーム粒子の粒子径およびゼータ電位は、ゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定することができる。
　（標的指向性物質により修飾したリポソームの調製）
　（Ｉ．糖鎖による修飾）
　糖鎖としてシアリルルイスＸ（ＳＬＸ）、Ｎ-アセチルラクトサミン、α１-6マンノビオースを使用する。
　（金コロイド含有リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への糖鎖の結合とリンカータンパク質（ＨＳＡ）の親水性化処理）
　実施例２と同様の方法を用いて、アミノ化糖鎖溶液を調製する。次に、リポソーム液の一部分に架橋試薬を加えて攪拌し、限外濾過にかける。次に、このリポソーム液に上記のアミノ化糖鎖溶液を加えて反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液を添加し攪拌する。限外濾過にかけ、遊離の糖鎖およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、フィルター濾過する。
　得られた金コロイド含有リポソーム粒子の粒子径およびゼータ電位は、ゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定することができる。
　（ＩＩ．抗体による修飾）
　モノクローナル抗体として実施例２において調製した抗Ｅ－セレクチン抗体を用いる。
　（リポソーム膜面上への抗Ｅ－セレクチン抗体の結合）
　過ヨウ素酸ナトリウムを緩衝液に溶解する。この過ヨウ素酸ナトリウム溶液をリポソームに添加し、酸化反応をさせ、リン酸緩衝化生理食塩水下で限外濾過にかける。次いで、ＨＳＡ溶液を添加し、攪拌する。
　ＮａＢＨ３ＣＮを緩衝液に溶解したＮａＢＨ３ＣＮ溶液を添加して、反応させた後、限外濾過に供する。次いで、架橋剤を緩衝液で溶解し、架橋剤溶液調製する。この架橋剤溶液を添加し、反応させる。その後、限外濾過に供する。
　抗Ｅ－セレクチン抗体をそれぞれ添加し反応させたのち、トリスヒドロキシアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を加え、反応させる。次いで、限外濾過を行い、フィルター濾過を行う。
　得られた金コロイド含有リポソーム粒子の粒子径およびゼータ電位は、ゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定することができる。
　（実施例７．金属コロイド含有リポソームの調製）
　本実施例では、実施例１および２の（１．改良型コール酸塩透析法（１）改良法）および（２．改良型コール酸塩透析法（２）従来法）と同様の方法を用いて、未修飾金コロイド含有リポソーム、ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソームおよび抗Ｅセレクチン抗体修飾金コロイド含有リポソームを調製した。用いた金コロイドの粒径は１０ｎｍ（メーカー：ワインレッドケミカル株式会社、製品名：金コロイド（イムノクロマト用）、製造コード:ＷＲＧＭ３）および４０ｎｍ（メーカー：ワインレッドケミカル株式会社、製品名：金コロイド（イムノクロマト用）、製造コード:ＷＲＧＨ）である。
　金コロイド溶液は、実施例１と同様の方法により調製した。
　（１．改良型コール酸塩透析法（１）改良法）
　ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシド（Ｔｏｔａｌ　Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ　Ｅｘｔｒａｃｔ（脳、ブタ－アンモニウム塩）販売元：Ａｖａｎｔｉ、カタログ番号：１００２３２（８６００５３Ｐ））およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを、それぞれ３５：４０：５：１５：５のモル比で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合した。混合した脂質に、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加し、クロロホルム／メタノール（１：１）溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。
　得られた脂質膜を、１０ｍＬ金コロイド溶液に再懸濁し、３７℃で１時間攪拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理し、透明なミセル懸濁液１０ｍｌを得た。このミセル懸濁液を、ＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）およびＮ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝生理食塩液（ＴＡＰＳ：ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）にかけ、均一な金コロイドを含有するリポソーム粒子懸濁液１０ｍｌを調製した。
　（２．改良型コール酸塩透析法（２）従来法）
　ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシド（Ｔｏｔａｌ　Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ　Ｅｘｔｒａｃｔ（脳、ブタ－アンモニウム塩）販売元：Ａｖａｎｔｉ、カタログ番号：１００２３２（８６００５３Ｐ））およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを、それぞれ３５：４０：５：１５：５のモル比で合計脂質量４５．６ｍｇになるように混合した。混合した脂質に、コール酸ナトリウム４６．９ｍｇを添加し、クロロホルム／メタノール（１：１）溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。
　得られた脂質膜をＮ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ　８．４）３ｍｌに再懸濁し、３７℃で１時間攪拌した。次いで、この溶液を窒素置換し、超音波処理し、透明なミセル懸濁液３ｍｌを得た。この超音波処理したミセル懸濁液に金コロイド溶液（７ｍｌ）を撹拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、この金コロイド入りミセル懸濁液をＰＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＮ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノメタン（ＴＡＰＳ）緩衝生理食塩液（ｐＨ８．４）を用いた限外濾過（分画分子量：１０，０００）にかけ均一な金コロイドを含有するリポソーム粒子懸濁液１０ｍｌを調製した。
　（金コロイド含有リポソーム脂質膜面上の親水性化処理）
　本実施例で得られた金コロイド含有リポソーム溶液各１０ｍｌを、ＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）および炭酸緩衝液（ｐＨ　８．５）を用いた限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけ、溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加え、室温で２時間攪拌した。その後、さらに７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜および炭酸緩衝液（ｐＨ　８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）にかけた。次に、炭酸緩衝液（ｐＨ　８．５）１ｍｌに溶かしたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン４０ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えた。次いで、この溶液を、室温で２時間攪拌後、冷蔵下で一晩攪拌し、分画分子量３００，０００で限外濾過し、遊離のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、該炭酸緩衝液をＮ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ８．４）に交換し、リポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン上にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
　（金コロイド含有リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合）
　本実施例で得られた各１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＮ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ　８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム１０．８ｍｇを加え、７℃で一晩攪拌して過ヨウ素酸酸化した。ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ　８．０）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）することにより、遊離の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換して、酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ　８．０）を加えて室温で２時間反応させ、次に２Ｍ　ＮａＢＨ３ＣＮ／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ　８．０）１００μｌを加えて室温で２時間、さらに冷蔵下で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。次いで、限外濾過（分画分子量：３００，０００）し、遊離のシアノホウ素酸ナトリウムおよびヒト血清アルブミンを除去し、この溶液の緩衝液を炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に交換して、ＨＳＡ結合リポソーム液各１０ｍｌを得た。
　（表面修飾）
　（Ｉ．糖鎖による修飾）
　（金コロイド含有リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への糖鎖の結合とリンカータンパク質（ＨＳＡ）の親水性化処理）
　実施例２と同様の方法により、グリコシルアミン化合物（アミノ化糖鎖溶液）を調製した。次に、リポソーム溶液の一部分１０ｍｌに架橋試薬３，３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｇを加えて室温で２時間、続いて冷蔵下で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜と炭酸緩衝液（ｐＨ　８．５）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離のＤＴＳＳＰを除去し、ＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１０ｍｌを得た。次に、このリポソーム溶液に上記アミノ化糖鎖溶液３７．５μｌを加えて、室温で２時間反応させ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／炭酸緩衝液（ｐＨ　８．５）を添加し、その後、冷蔵下で一晩攪拌し、リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。ＸＭ３００膜とＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ　７．２）で限外濾過（分画分子量：３００，０００）して、遊離の糖鎖およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを除去し、０．４５μｍのフィルター、０．２２μｍのフィルターで順に濾過した。その結果、糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各１０ｍｌが得られた。修飾結合密度０．００７５ｍｇ糖鎖／ｍｇ脂質で糖鎖修飾リポソームを調製した。
　（ＩＩ．抗体による修飾）
　本実施例では、実施例２と同様の方法により調製した抗Ｅセレクチン抗体を用いた。
　（リポソーム膜面上への抗Ｅ－セレクチン抗体の結合）
　過ヨウ素酸ナトリウムを約０．０１５ｇ秤量し、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパンスルホン酸緩衝液（ＴＡＰＳ緩衝液：ｐＨ８．４)１ｍＬで溶解した。この過ヨウ素酸ナトリウム溶液を、本実施例において調製したリポソームに添加し、酸化反応をさせ、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ緩衝液：ｐＨ８．０)下で限外濾過（３００Ｋ）した。次いで、ＨＳＡ溶液(１０ｍｇ／ｍＬ)を添加し、ゆるやかに転倒混和後、室温で２時間攪拌した。
　ＮａＢＨ３ＣＮを０．００３ｇ秤量し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５)１００μＬで溶解したＮａＢＨ３ＣＮ溶液を添加して、冷蔵下で一晩、還元反応により結合させた。炭酸緩衝液（ＣＢＳ緩衝液：ｐＨ８．５）下で限外濾過（３００Ｋ）に供した。
　次いで、３，３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（ＤＴＳＳＰ、ＰＩＥＲＣＥ社製：Ｎｏ．２１５７８）を０．０１ｇ秤量し、ＣＢＳ緩衝液(ｐＨ８．５)４００μＬで溶解したＤＴＳＳＰ溶液を添加し、室温で２時間反応後、冷蔵下で一晩反応させる。その後、ＣＢＳ緩衝液(ｐＨ８．５)下で限外濾過（３００Ｋ）に供した。
　リポソーム溶液中に終濃度が１００μg／ｍＬとなるように添加した。その後、室温で２時間反応させたのち、トリスヒドロキシアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を(１３２ｍｇ／ｍＬ)加え、さらに室温で一晩、反応させた。
　２－［４－（２－ヒドロキシルエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液(ｐＨ７．２)下で限外濾過（３００Ｋ）を行い、０．４５μｍフィルターで濾過を行った。
　（リポソームの物性の確認）
　得られた生理食塩懸濁液中（３７℃）の金コロイド含有リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置（Ｍｏｄｅｌ　Ｎａｎｏ　ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ，，ＵＫ）により測定した。
　リポソームに含まれるタンパク質量を、Ｍｉｃｒｏ　ＢＣＡＴＭ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔキット（カタログ番号２３２３５ＢＮ）（ＰＩＥＲＣＥ　Ｃｏ．ＬＴＤ）を用いて実施例３と同様の方法により測定した。
　リポソームに含まれる脂質量を、リン脂質Ｃ－テスト（ワコー）を用いて、実施例３と同様の方法により測定した。
　これらの結果を、以下の表ならびに図１９および２０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
従来法：改良型コール酸塩透析法（２）従来法により調製した金コロイド含有リポソーム
改良法：改良型コール酸塩透析法（１）改良法により調製した金コロイド含有リポソーム
　１０ｎｍ：使用した金コロイドの粒径
　Ｋ０：未修飾金コロイド含有リポソーム
　Ｋ１：ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソーム
　抗Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体：抗Ｅセレクチン抗体含有リポソーム
初期濃度（μｇ／ｍＬ）：親水性化前のリポソーム溶液１ｍＬあたりの金コロイド重量（
μｇ）
親水性化後Ａｕ（μｇ／ｍＬ）：親水性化後のリポソーム溶液１ｍＬあたりの金コロイド
重量（μｇ）
リンカータンパク質結合後Ａｕ（μｇ／ｍＬ）：リンカータンパク質結合後のリポソーム
溶液１ｍＬあたりの金コロイド重量（μｇ）
表面修飾後：糖鎖または抗体による表面修飾後
　Ａｕ量（μｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりの金コロイド重量（μｇ）
　脂質量（ｍｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりの脂質量
　内包量／脂質量（μｇ／ｍｇ）：脂質１ｍｇあたりの金コロイド重量（μｇ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
従来法：改良型コール酸塩透析法（２）従来法により調製した金コロイド含有リポソーム
改良法：改良型コール酸塩透析法（１）改良法により調製した金コロイド含有リポソーム
　１０ｎｍ：使用した金コロイドの粒径
　Ｋ０：未修飾金コロイド含有リポソーム
　Ｋ１：ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソーム
　抗Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体：抗Ｅセレクチン抗体含有リポソーム
タンパク質量（ｍｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりのタンパク質量（ｍｇ）
脂質量（ｍｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりの脂質量（ｍｇ）
Ｐ／Ｌ値：脂質量に対するタンパク質量
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
従来法：改良型コール酸塩透析法（２）従来法により調製した金コロイド含有リポソーム
改良法：改良型コール酸塩透析法（１）改良法により調製した金コロイド含有リポソーム
　４０ｎｍ：使用した金コロイドの粒径
　Ｋ０：未修飾金コロイド含有リポソーム
　Ｋ１：ＳＬＸ修飾金コロイド含有リポソーム
初期濃度（μｇ／ｍＬ）：親水性化前のリポソーム溶液１ｍＬあたりの金コロイド重量（
μｇ）
親水性化後Ａｕ（μｇ／ｍＬ）：親水性化後のリポソーム溶液１ｍＬあたりの金コロイド
重量（μｇ）
リンカータンパク質結合後Ａｕ（μｇ／ｍＬ）：リンカータンパク質結合後のリポソーム
溶液１ｍＬあたりの金コロイド重量（μｇ）
表面修飾後：糖鎖または抗体による表面修飾後
　Ａｕ量（μｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりの金コロイド重量（μｇ）
　脂質量（ｍｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりの脂質量
　内包量／脂質量（μｇ／ｍｇ）：脂質１ｍｇあたりの金コロイド重量（μｇ）
タンパク質量（ｍｇ／ｍＬ）：リポソーム溶液１ｍＬあたりのタンパク質量（ｍｇ）
　以上の結果より、粒径１０ｎｍの金コロイドも粒径４０ｎｍの金コロイドも、イメージング剤として充分に利用できる程度にリポソームに含有させることができたことが確認された。
　以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
　本発明は、リポソームに含有できないか、含有効率の低かった金属コロイドをリポソームに効率よく含有させることができるという有用性を有する。従って、インビボイメージングで利用することができなかった金属コロイド含有リポソームを、イメージング剤として利用するという有用性を提供する。
 

Claims (42)

  1. イメージング剤として十分量の金属コロイドを含む金属コロイド含有リポソーム。
  2. 前記金属コロイド含有リポソームが標的指向性物質をさらに含む、請求項１に記載のリポソーム。
  3. 前記標的指向性物質が、糖鎖、抗体、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、請求項２に記載のリポソーム。
  4. 前記金属コロイド含有リポソームが所望の物質をさらに含む、請求項１に記載のリポソーム。
  5. 前記金属コロイドが、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、およびユーロピウム（Ｅｕ）からなる群より選択される金属のコロイドである、請求項１に記載のリポソーム。
  6. 前記金属コロイドが金コロイドであり、金コロイド含有リポソームが、１ｍｇ脂質あたり金量として８．２μｇ以上、リポソーム溶液１ｍｌあたり金量として２８．７μｇ以上、またはリポソーム１個あたり金量として８．２×１０－１５ｍｇ以上の金コロイドを含む、請求項５に記載のリポソーム。
  7. 金属コロイド含有リポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
    Ａ）金属コロイド溶液に脂質膜を懸濁し、金属コロイド脂質膜懸濁液を調製する工程：
    Ｂ）該金属コロイド脂質懸濁液を、リポソーム形成維持条件に供する工程
    を包含する、方法。
  8. 前記Ｂ）工程が、
    　（Ｂ１）前記金属コロイド脂質懸濁液を攪拌させ、窒素置換する工程；
    　（Ｂ２）窒素置換した該金属コロイド脂質膜懸濁液を超音波処理する工程；および
    　（Ｂ３）超音波処理した該金属コロイド脂質懸濁液を限外濾過に供する工程
    を包含する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記Ａ）工程において、前記脂質膜が、前記金属コロイド溶液に対して０．００１～１０ｍｇ/脂質の濃度で懸濁される、請求項７に記載の方法。
  10. 得られたリポソームに標的指向性物質を結合させる工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
  11. 前記標的指向性物質を結合させる工程が、
    　ｉ）得られたリポソームを親水性化処理する工程；
    　ｉｉ）該リポソームへ標的指向性物質を結合させる工程；
    　ｉｉｉ）該標的指向性物質が結合したリポソームを親水性化する工程ならびに
    　ｉｖ）該親水性化したリポソームを含む溶液を限外濾過をする工程
    を包含する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記標的指向性物質が、糖鎖、抗体、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記金属コロイドが、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、およびユーロピウム（Ｅｕ）からなる群より選択される金属のコロイドである、請求項７に記載の方法。
  14. 前記Ａ）工程が
    　（Ａ１）金コロイドを液体に分散させ、金コロイド溶液を調製する工程；
    　（Ａ２）リポソーム形成能を有する脂質を、有機溶媒に懸濁して攪拌し、該攪拌した有機溶媒を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させて脂質膜を得る工程；および
    　（Ａ３）該脂質膜を、該金コロイド溶液に対して、金量として、０．００１～１０ｍｇ／脂質ｍｇの濃度で懸濁し、金コロイド脂質膜懸濁液を調製する工程
    を包含する、請求項１３に記載の方法。
  15. 　（Ａ１）金コロイドを液体に分散させ、金コロイド溶液を調製する工程；
    　（Ａ２－ｉ）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを混合して脂質を調製する工程；
    　（Ａ２－ｉｉ）該脂質を、有機溶媒に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させて脂質膜を得る工程；
    　（Ａ３）該脂質膜を、該金コロイド溶液に対して金量として、０．００１～１０ｍｇ／脂質ｍｇで懸濁し、金コロイド脂質膜懸濁液を調製する工程；
    　（Ｂ１）該金コロイド脂質懸濁液を攪拌させ、窒素置換する工程；
    　（Ｂ２）窒素置換した該金コロイド脂質膜懸濁液を超音波処理する工程；および
    　（Ｂ３）超音波処理した該金コロイド脂質懸濁液を限外濾過に供する工程
    を包含する、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記金コロイド溶液が、金量として、０．００１～１０ｍｇ／脂質ｍｇの範囲の濃度である、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記リポソーム形成維持条件が、所望の物質をリポソームに内包させる工程を包含する、請求項７に記載の方法。
  18. 金属コロイド含有リポソームを製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
    ａ）脂質膜懸濁用緩衝液に脂質膜を懸濁し、脂質膜懸濁液を調製する工程：および
    ｂ）該脂質懸濁液と金属コロイド溶液とを混合し、リポソーム形成維持条件に供する工程
    を包含する、方法。
  19. 前記ｂ）工程が、
    　（ｂ１）金属コロイドを液体に分散させ、金属コロイド溶液を調製する工程；
    　（ｂ２）前記脂質懸濁液を攪拌させ、窒素置換する工程；
    　（ｂ３）窒素置換した該脂質膜懸濁液を超音波処理する工程；および
    　（ｂ４）超音波処理した該脂質懸濁液を、金属コロイド溶液を用いて限外濾過に供する工程
    を包含する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ｂ）工程において、前記脂質懸濁液と前記金属コロイド溶液とが、１対９～９対１の混合比で懸濁される、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記ａ）工程が
    　（ａ１）リポソーム形成能を有する脂質を有機溶媒に懸濁して攪拌し、該攪拌した有機溶媒を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させて脂質膜を得る工程；および
    　（ａ２）該脂質膜を、前記脂質膜懸濁用緩衝液に懸濁し、脂質膜懸濁液を調製する工程
    を包含する、請求項１８に記載の方法。
  22. 　（ａ１－ｉ）ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ガングリオシド、ジセチルホスフェート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびコール酸ナトリウムを混合して脂質を調製する工程；
    　（ａ１－ｉｉ）該脂質を、有機溶媒に懸濁して攪拌し、該攪拌した溶液を蒸発させ、沈殿物を真空乾燥させて脂質膜を得る工程；
    　（ａ２）該脂質膜を、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸緩衝生理食塩液に懸濁し、脂質膜懸濁液を調製する工程；
    　（ｂ１）金属コロイドを液体に分散させ、金属コロイド溶液を調製する工程；
    　（ｂ２）前記脂質懸濁液を攪拌させ、窒素置換する工程；
    　（ｂ３）窒素置換した該脂質膜懸濁液を超音波処理する工程；および
    　（ｂ４）超音波処理した該脂質懸濁液を、金属コロイド溶液を用いて限外濾過に供する工程
    を包含する、請求項１８に記載の方法。
  23. 得られたリポソームに標的指向性物質を結合させる工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
  24. 前記標的指向性物質を結合させる工程が、
    　ｉ）得られたリポソームを親水性化処理する工程；
    　ｉｉ）該リポソームへ標的指向性物質を結合させる工程；
    　ｉｉｉ）該標的指向性物質が結合したリポソームを親水性化する工程ならびに
    　ｉｖ）該親水性化したリポソームを含む溶液を限外濾過をする工程
    を包含する、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記標的指向性物質が、糖鎖、抗体、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記金属コロイドが、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、およびユーロピウム（Ｅｕ）からなる群より選択される金属のコロイドである、請求項１８に記載の方法。
  27. 前記金属コロイド溶液が金コロイド溶液であり、該金コロイド溶液が、金量として、０．００１～１０ｍｇ／脂質ｍｇの範囲の濃度である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記リポソーム形成維持条件が、所望の物質をリポソームに内包させる工程を包含する、請求項１８に記載の方法。
  29. 金属コロイド含有リポソームを製造する方法であって、該方法は、凍結乾燥したリポソームと金属コロイド溶液とを混合する工程を包含する、方法。
  30. 前記リポソームが標的指向性物質を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記金属コロイド溶液が、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、およびユーロピウム（Ｅｕ）からなる群より選択される金属のコロイド溶液である、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記金属コロイド溶液が金コロイド溶液であり、前記凍結乾燥したリポソームが、該金コロイド溶液に対して金量として、０．００１～１０ｍｇ／脂質ｍｇの濃度で懸濁される、請求項２９に記載の方法。
  33. 前記リポソーム形成維持条件が、所望の物質をリポソームに内包させる工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
  34. 請求項１に記載の金属コロイド含有リポソームを含む、イメージング剤。
  35. 前記金属コロイド含有リポソームが標的指向性物質をさらに含む、請求項３４に記載のイメージング剤。
  36. 前記標的指向性物質が、糖鎖、抗体、レクチン、相補的核酸、レセプター、リガンド、アプタマーおよび抗原からなる群より選択される、請求項３５に記載のイメージング剤。
  37. 前記金属コロイドが、鉄（Ｆｅ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、金（Ａｕ）、およびユーロピウム（Ｅｕ）からなる群より選択される金属のコロイドである、請求項３４に記載のイメージング剤。
  38. 前記金属コロイド含有リポソームは金コロイド含有リポソームであり、１ｍｇ脂質あたり金量として８．２μｇ以上を含むか、またはリポソーム溶液１ｍｌあたり金量として２８．７μｇ以上の金属コロイドを含む、請求項３７に記載のイメージング剤。
  39. 前記金属コロイド含有リポソームが所望の物質をさらに含む、請求項３４に記載のイメージング剤。
  40. 所望の部位を標識するための組成物であって、該組成物は請求項１に記載の金属コロイド含有リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含む、組成物。
  41. 所望の部位を標識するための組成物の製造のための、請求項１に記載の金属コロイド含有リポソームの使用。
  42. 所望の部位を標識するための方法であって、該被験体に、該所望の部位を標識するための組成物を投与する工程を包含し、該組成物は請求項１に記載の金属コロイド含有リポソームおよび薬学的受容可能なキャリアを含む、方法。
     
PCT/JP2009/058310 2008-05-01 2009-04-27 金属コロイド含有リポソーム WO2009133867A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-120046 2008-05-01
JP2008120046 2008-05-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009133867A1 true WO2009133867A1 (ja) 2009-11-05

Family

ID=41255083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/058310 WO2009133867A1 (ja) 2008-05-01 2009-04-27 金属コロイド含有リポソーム

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2009133867A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014058079A1 (ja) * 2012-10-12 2014-04-17 帝人株式会社 金属微粒子を含む静電結合型ベシクル

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6463513A (en) * 1987-02-02 1989-03-09 Univ Teneshii Res Corp Solid core liposome and formation
JPH11507628A (ja) * 1995-06-07 1999-07-06 ジェナー・テクノロジーズ 改良されたリポソーム製剤
JP2005120033A (ja) * 2003-10-17 2005-05-12 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 金属微粒子を含むリポソーム複合体及びこれを利用した造影剤並びにこれを利用した発熱方法及び破壊方法
WO2007091661A1 (ja) * 2006-02-08 2007-08-16 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 分子イメージングに適した糖鎖修飾リポソームならびにその利用および製造
WO2009008489A1 (ja) * 2007-07-10 2009-01-15 Katayama Chemical Industries Co., Ltd. 抗体リポソーム

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6463513A (en) * 1987-02-02 1989-03-09 Univ Teneshii Res Corp Solid core liposome and formation
JPH11507628A (ja) * 1995-06-07 1999-07-06 ジェナー・テクノロジーズ 改良されたリポソーム製剤
JP2005120033A (ja) * 2003-10-17 2005-05-12 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 金属微粒子を含むリポソーム複合体及びこれを利用した造影剤並びにこれを利用した発熱方法及び破壊方法
WO2007091661A1 (ja) * 2006-02-08 2007-08-16 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 分子イメージングに適した糖鎖修飾リポソームならびにその利用および製造
WO2009008489A1 (ja) * 2007-07-10 2009-01-15 Katayama Chemical Industries Co., Ltd. 抗体リポソーム

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Ban'yu Seimei Kagaku Shinko Kokusai Koryu Zaidan Soyaku Kogaku Symposium, 2005", vol. 5TH, article HIROYUKI HONDA: "Jiki Liposomes Ryushi o Mochiita Gan no Onnetsu Ryoho no Kenkyu", pages: 29 - 34 *
HONG, K. ET AL.: "Liposomes containing colloidal gold are a useful probe of liposome-cell interactions", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, BIOMEMBRANES, vol. 732, no. L, 1983, pages 320 - 323 *
TAKAYUKI OTANI ET AL.: "Komitsudo Kin-colloid Naiho Hyoteki Shikosei Liposome no Kaihatsu", DRUG DELIVERY SYSTEM, vol. 23, no. 3, June 2008 (2008-06-01), pages 427 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014058079A1 (ja) * 2012-10-12 2014-04-17 帝人株式会社 金属微粒子を含む静電結合型ベシクル
JP5912186B2 (ja) * 2012-10-12 2016-05-11 帝人株式会社 金属微粒子を含む静電結合型ベシクル
JPWO2014058079A1 (ja) * 2012-10-12 2016-09-05 帝人株式会社 金属微粒子を含む静電結合型ベシクル

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5364381B2 (ja) アンミン白金錯体を高濃度で内包するリポソームおよびその製造方法
JPWO2007091661A1 (ja) 分子イメージングに適した糖鎖修飾リポソームならびにその利用および製造
ES2608857T3 (es) Partículas Salipro
AU2016291224A1 (en) Fusogenic liposome-coated porous silicon nanoparticles
JP2007112768A (ja) 肝指向性リポソーム組成物
CA2983358A1 (en) Targeted liposomal delivery of cgmp analogues
JPWO2007018272A1 (ja) 糖鎖修飾リポソーム及び該リポソームを含有する薬剤送達組成物
JP5465542B2 (ja) 合成糖脂質含有リポソーム
JP2011020923A (ja) 動脈硬化の診断及び治療
WO2009133867A1 (ja) 金属コロイド含有リポソーム
JPWO2007018275A1 (ja) ローリングモデルに基づく、送達媒体の設計
US9018156B2 (en) Organic nanotube having hydrophobized inner surface, and encapsulated medicinal agent prepared using the nanotube
WO2009148169A1 (ja) アンミン白金錯体を高濃度に内包するリポソームを用いた腫瘍治療技術
Dovydenko et al. Interaction of hydrophobic tungsten cluster complexes with a phospholipid bilayer
JP2010215509A (ja) 抗体リポソーム
Vodovozova et al. Saccharide‐assisted delivery of cytotoxic liposomes to human malignant cells
JP5721130B2 (ja) 非対称ナノチューブ形成性非対称双頭型脂質分子、同脂質分子により形成された非対称ナノチューブ、および同非対称ナノチューブを用いた薬剤カプセル化物
US20220257514A1 (en) Monosaccharide-tagged nano-liposome drug delivery system, the manufacture and use for drug targeting delivery thereof
Kim et al. Nanoparticle platform comprising lipid-tailed pH-sensitive carbon dots with minimal drug loss
US20170209605A1 (en) Carbohydrate functionalized catanionic surfactant vesicles for drug delivery
US11859201B2 (en) Nanoparticle compositions containing sugar functionalized nucleic acid carriers
US10925831B2 (en) Liposomal formulations of platinum-acridine anticancer agents and methods thereof
US11492327B2 (en) Aminooxylipids for the construction of self-assembling liposomal systems enabling their subsequent modification by biologically functional molecules
Clergeaud Veiga Liposomes as versatile tools: nanoreactors, membrane models and drug delivery carriers.
JP2023165564A (ja) ベシクル及びその薬物送達のための使用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09738804

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09738804

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1