JPWO2007018275A1 - ローリングモデルに基づく、送達媒体の設計 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、簡便な実験・アッセイにより最適な送達製剤を設計するための方法およびそれによって製造された送達媒体を探索することを課題とする。【解決手段】本発明は、所望の物質の所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、該製造方法は:A)該送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンなどの細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;およびB)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、を包含する、方法を提供する。
Description
本発明は、医薬品、化粧品をはじめ医学・薬学分野において応用し得る、癌などの標的細胞・組織を認識し局所的に薬剤や遺伝子を患部に送り込むための治療用のドラッグデリバリーシステムや診断用の細胞・組織センシングプローブとして利用できるもののなかから、最適なものをインビトロ実験により選択し、それに基づき、最適なプローブを有する医薬を設計すること、およびそれによって製造された糖鎖修飾リポソーム、およびこれに薬剤あるいは遺伝子等を封入したリポソーム製剤に関する。
米国の国家ナノテク戦略(NNI)によって実現を目指す具体的目標の一例として、「癌細胞や標的組織を狙い撃ちする薬物や遺伝子送達システム(DDS:ドラッグデリバリーシステム)」を掲げた。日本の総合科学技術会議のナノテクノロジー・材料分野推進戦略でも、重点領域として「医療用極小システム・材料、生物のメカニズムを活用し制御するナノバイオロジー」があり、その5年間の研究開発目標の1つとして「健康寿命延伸のための生体機能材料・ピンポイント治療等技術の基本シーズ確立」が掲げられている。一方、高齢化社会となるに伴い癌の発症率・死亡率は年々増えており、新規な治療材料である標的指向DDSの開発が待望されている。その他の病気においても副作用のない標的指向DDSナノ材料の重要性が注目されており、その市場規模は近い将来に10兆円を超えると予測されている。また、これらの材料は治療とともに診断への利用においても期待されている。
医薬品の治療効果は、薬物が特定の標的部位に到達し、そこで作用することにより発現される。その一方で、医薬品による副作用とは、薬物が不必要な部位に作用してしまうことである。従って、薬物を有効かつ安全に使用するためにもドラッグデリバリーシステムの開発が求められている。その中でも特に標的指向(ターゲティング)DDSとは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むといった概念である。そのための代表的な材料としての微粒子性キャリアであるリポソームが注目されている。この粒子に標的指向機能をもたせるために、リポソームの脂質の種類、組成比、粒子径、表面電荷を変化させるなどの受動的ターゲティング法が試みられているが、いまだ本法は不十分であり更なる改良が求められている。
一方、高機能のターゲティングを可能にするために、能動的ターゲティング法も試みられている。これは「ミサイルドラッグ」ともよばれ理想的なターゲティング法であるが、国内外においていまだ完成されたものはなく今後の発展が大いに期待されているものである。本法は、リポソーム膜面上にリガンドを結合させ、標的組織の細胞膜面上に存在するレセプターに特異的に認識させることによって、積極的にターゲティングを可能にさせる方法である。この能動的ターゲティング法での標的となる細胞膜面上に存在するレセプターのリガンドとしては、抗原、抗体、ペプチド、糖脂質や糖タンパク質などが考えられる。これらのうち、糖脂質や糖タンパク質の糖鎖は、生体組織の発生や形態形成、細胞の増殖や分化、生体防御や受精機構、癌化とその転移機構などの様々な細胞間コミュニケーションにおいて情報分子としての重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。
また、その標的となる各組織の細胞膜面上に存在するレセプターとしてのセレクチン、シグレック、ガレクチンなどの各種のレクチン(糖鎖認識タンパク質)についての研究も進んできたことから、各種の分子構造を有する糖鎖は新しいDDSリガンドとして注目されてきている(非特許文献1および非特許文献2を参照のこと)。
外膜表面にリガンドを結合したリポソームについては、癌などの標的部位に選択的に薬物や遺伝子などを送達するためのDDS材料として多くの研究がなされてきた。しかしながら、それらは、生体外では標的細胞に結合するが、生体内では期待される標的細胞や組織にターゲティングされないものがほとんどである(非特許文献3および非特許文献4を参照のこと)。糖鎖の分子認識機能を利用したDDS材料の研究開発においても、糖鎖を有する糖脂質を導入したリポソームについて若干の研究が知られているが、それらの機能評価は生体外(in vitro)によるもののみであり、糖鎖を有する糖タンパク質を導入したリポソームの研究はほとんど進んでいない(非特許文献5、非特許文献6、非特許文献7および非特許文献8)を参照のこと)。したがって、糖脂質や糖タンパク質の多種多様な糖鎖を結合したリポソームについての調製法と生体内動態(in vivo)解析を含めた体系的な研究は、これまで未開発で今後の進展が期待される重要課題である。さらに新しいタイプのDDS材料研究として、投与が最も簡便・安価に行える経口投与で使用可能なDDS材料開発も重要課題である。たとえば、ペプチド性医薬品などは一般的に水溶性で高分子量であり消化管の小腸粘膜透過性が低いため酵素分解を受けるなどにより経口投与してもほとんど腸管吸収されない。そこでこれらの高分子量の医薬品や遺伝子などを腸管から血液中へ送達するためのDDS材料としてリガンド結合リポソームの研究が注目されつつある(非特許文献9を参照のこと)。
特許文献1は、医薬として許容される担体と、セレクチンレセプターに選択的に結合する成分を含む化合物とを有する医薬組成物を開示している。しかし、この医薬組成物は、炎症性疾患および細胞の付着により媒介される他の病気を阻害するための医薬自体として、経口投与を目的とした糖鎖が用いられており、糖鎖修飾リポソームとは異なる。
特許文献2は、ポリエチレングリコール誘導体化両親媒性小胞形成脂質と負電荷小胞形成脂質とを含む非電荷小胞形成脂質からなるリポソームを含んでなる、非経口投与用医薬組成物を開示している。しかし、この医薬組成物は非経口投与用であり、本願発明の経口投与に特に適した糖鎖修飾リポソームとは異なる。糖鎖についての記載はない。
本発明者らは、糖鎖をリンカータンパク質を介してリポソームに結合させた糖鎖修飾リポソームを開発した(特許文献3)。さらに、糖鎖の種類および糖鎖結合量が各標的細胞または標的組織への指向性に関連するようであることを見出した(特許文献4〜6および非特許文献10)。しかし、現在までに、種々の応用において利用可能な最適な糖鎖修飾リポソームは開発されていない。また、種々の経路での投与において有用な糖鎖について体系的な研究はなされておらず、具体的にどのような糖鎖を用いればよいかは不明のままであった。
従って、簡便な実験・アッセイにより最適な送達製剤を設計するための方法に対する需要が存在する。
特表平5−507519公報
特表2004−517835公報
特開2003−226638公報
特開2003−226647公報
国際公開第2005/011632号パンフレット
国際公開第2005/011633号パンフレット
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そこで、本発明は、簡便な実験・アッセイにより最適な送達製剤を設計するための方法およびそれによって製造された送達媒体を探索することを課題とする。
上記の課題を解決するために、本発明者等は鋭意研究の結果、インビトロアッセイ系における結果を、特定の情報処理によって加工することによって得られた結果に基づいてインビボにおいて有用な送達媒体を一定の確率で製造することができること(以下、ローリングモデルともいう)を見出したことによって、上記課題を解決した。
従って、本発明は、以下を提供する。
(1)所望部位に関連する細胞表面分子との強結合または弱結合に基づく結合を特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
(2)所望部位に関連する細胞表面分子とのローリングモデルに基づく結合を特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
(3)所望部位に関連する細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、強結合阻害濃度(IC)の阻害濃度が低いことを特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
(4)所望部位に関連する細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、弱結合ICの阻害濃度が高いことを特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
(5)所望部位に関連する細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、弱結合ICの阻害濃度が高い、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
(6)所望部位に関連する細胞表面分子とのローリングモデルに基づく結合、並びに、その他の強結合または弱結合に基づく結合の少なくとも1種類の結合を含むことを特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
(7)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
(8)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
(9)上記強結合ICと上記弱結合ICとの境界は、ICnにおいてnが30と31との間に存在する、項目1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
(10)上記強結合ICは、ICnにおいてnが30以下で測定され、上記弱結合ICはICnにおいてnが31以上で測定される、項目1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
(11)上記強結合ICと上記弱結合ICとの境界は、ICnにおいてnが30と31との間に存在する、項目1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
(12)所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、IC30以下の強結合ICの阻害濃度が10−9M以下である、項目3に記載の送達媒体。
(13)所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、約IC31以上の弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上である、項目4に記載の送達媒体。
(14)所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、約IC30以下の強結合ICの阻害濃度が10−9M以下であり、かつ、約IC31以上の弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上である、項目5に記載の送達媒体。
(15)所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、上記強結合ICについて、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を有し、かつ、上記弱結合ICについて、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC60の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を有する、項目14に記載の送達媒体。
(16)上記強結合ICおよび上記弱結合ICの少なくとも1つは、上記条件において少なくとも2つの条件を有することを特徴とする、項目15に記載の送達媒体。
(17)上記送達媒体は、リポソームである、項目1〜16のいずれか1項に記載の送達媒体。
(18)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームである、項目1〜16のいずれか1項に記載の送達媒体。
(19)上記ICは、E−セレクチンとの親和性において測定される、項目1〜16のいずれか1項に記載の送達媒体。
(20)上記所望部位は、炎症部位および癌部位からなる群より選択される、項目1〜16のいずれか1項に記載の送達媒体。
(21)リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号53、リポソーム番号69、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号117、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号213、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285およびリポソーム番号295からなる群より選択されるリポソームを含む、項目12に記載の送達媒体。
(22)リポソーム番号3、リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号38、リポソーム番号40、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号50、リポソーム番号53、リポソーム番号56、リポソーム番号60、リポソーム番号68、リポソーム番号69、リポソーム番号70、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号111、リポソーム番号116、リポソーム番号117、リポソーム番号120、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号129、リポソーム番号130、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号141、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号155、リポソーム番号175、リポソーム番号178、リポソーム番号183、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号197、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号209、リポソーム番号213、リポソーム番号218、リポソーム番号220、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号233、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号236、リポソーム番号237、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号254、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285、リポソーム番号290、リポソーム番号292およびリポソーム番号295なる群より選択されるリポソームを含む、項目13に記載の送達媒体。
(23)リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号53、リポソーム番号69、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号111、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号213、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285およびリポソーム番号295なる群より選択されるリポソームを含む、項目14に記載の送達媒体。
(24)リポソーム番号3、リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号38、リポソーム番号40、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号50、リポソーム番号53、リポソーム番号56、リポソーム番号60、リポソーム番号68、リポソーム番号69、リポソーム番号70、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号111、リポソーム番号116、リポソーム番号117、リポソーム番号120、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号129、リポソーム番号130、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号141、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号155、リポソーム番号175、リポソーム番号178、リポソーム番号183、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号197、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号209、リポソーム番号213、リポソーム番号218、リポソーム番号220、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号233、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号236、リポソーム番号237、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号254、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285、リポソーム番号290、リポソーム番号292およびリポソーム番号295なる群より選択されるリポソームを含む、項目15に記載の送達媒体。
(25)リポソーム番号3、リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号38、リポソーム番号40、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号50、リポソーム番号53、リポソーム番号56、リポソーム番号60、リポソーム番号68、リポソーム番号69、リポソーム番号70、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号111、リポソーム番号116、リポソーム番号117、リポソーム番号120、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号129、リポソーム番号130、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号141、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号155、リポソーム番号175、リポソーム番号178、リポソーム番号183、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号197、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号209、リポソーム番号213、リポソーム番号218、リポソーム番号220、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号233、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号236、リポソーム番号237、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号254、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285、リポソーム番号290、リポソーム番号292およびリポソーム番号295なる群より選択されるリポソームを含む、項目16に記載の送達媒体。
(26)所望の物質の所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、上記製造方法は:
A)上記送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、を包含する、方法。
(27)上記送達媒体は、リポソームを含む、項目26に記載の方法。
(28)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含む、項目26に記載の方法。
(29)上記候補は、糖鎖修飾リポソームにおいて複数の糖鎖種類を含む糖鎖修飾リポソームを含む、項目26に記載の方法。
(30)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目26に記載の方法。
(31)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目26に記載の方法。
(32)上記細胞表面分子は、E−セレクチン、P−セレクチン、L−セレクチン、ガレクチン1、ガレクチン2、ガレクチン3、ガレクチン4、ガレクチン5、ガレクチン6、ガレクチン7、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、ガレクチン11、ガレクチン12、ガレクチン13、ガレクチン14、マンノース6リン酸受容体、カルネキシン、カルレティキュリン、ERGIC−53、VIP53、インターロイキン類、インターフェロン類および増殖因子類からなる群より選択されるレクチンを含む、項目26に記載の方法。
(33)上記細胞表面分子は、E−セレクチンを含む、項目26に記載の方法。
(34)上記細胞表面分子は、E−セレクチンを含み、上記部位は、経口投与、肝臓、小腸、大腸、リンパ節、肝臓、心臓、膵臓、肺、脳、骨髄、血中、腎臓、脾臓、胸腺、筋肉、炎症部位および癌部位からなる群より選択される、項目26に記載の方法。
(35)上記細胞表面分子は、E−セレクチンを含み、上記部位は、腫瘍および炎症部位からなる群より選択される、項目26に記載の方法。
(36)上記親和性は、n%阻害濃度(ICn)で示され、ここで、nは1〜99の範囲である、項目26に記載の方法。
(37)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定と、約IC31以上の弱結合ICでの測定とを包含する、項目26に記載の方法。
(38)上記親和性の測定は、IC30〜IC10の間の少なくとも1点での強結合ICでの測定と、IC40〜IC60の間の少なくとも1点での弱結合ICでの測定とを包含する、項目26に記載の方法。
(39)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とする、項目26に記載の方法。
(40)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が10−9M以下の候補を選択することを特徴とする、項目26に記載の方法。
(41)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とし、ここで、上記選択は、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、項目26に記載の方法。
(42)上記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とする、項目26に記載の方法。
(43)上記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする、項目26に記載の方法。
(44)上記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とし、ここで、上記選択は、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC60の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、項目26に記載の方法。
(45)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICおよび約IC31以上の弱結合ICでの測定での測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、上記弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とする、項目26に記載の方法。
(46)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が10−9M以下で、かつ、上記弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする、項目26に記載の方法。(47)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、上記弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とし、ここで、上記選択は、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たし、かつ、上記弱結合ICについて、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC60の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、項目26に記載の方法。
(48)上記親和性の測定は、競合阻害アッセイ、非競合阻害アッセイおよび結合アッセイからなる群より選択される方法によって行われる、項目26に記載の方法。
(49)所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、上記製造方法は:
A)上記送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された上記送達媒体の組成を分析する工程;
C)上記組成に基づいて、上記選択された送達媒体を生成する工程、
を包含する、方法。
(50)さらに、上記選択された送達媒体に送達が所望される物質を含ませる工程を包含する、項目49に記載の方法。
(51)上記送達媒体は、リポソームを含む、項目49に記載の方法。
(52)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含む、項目49に記載の方法。
(53)上記候補は、糖鎖修飾リポソームにおいて複数の糖鎖種類を含む糖鎖修飾リポソームを含む、項目49に記載の方法。
(54)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目49に記載の方法。
(55)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目49に記載の方法。
(56)上記細胞表面分子は、E−セレクチン、P−セレクチン、L−セレクチン、ガレクチン1、ガレクチン2、ガレクチン3、ガレクチン4、ガレクチン5、ガレクチン6、ガレクチン7、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、ガレクチン11、ガレクチン12、ガレクチン13、ガレクチン14、マンノース6リン酸受容体、カルネキシン、カルレティキュリン、ERGIC−53、VIP53、インターロイキン類、インターフェロン類および増殖因子類からなる群より選択されるレクチンを含む、項目49に記載の方法。
(57)上記細胞表面分子は、E−セレクチンを含む、項目49に記載の方法。
(58)上記細胞表面分子は、E−セレクチンを含み、上記部位は、経口投与、肝臓、小腸、大腸、リンパ節、肝臓、心臓、膵臓、肺、脳、骨髄、血中、腎臓、脾臓、胸腺、筋肉、炎症部位および癌部位からなる群より選択される、項目49に記載の方法。
(59)上記細胞表面分子は、E−セレクチンを含み、上記部位は、腫瘍および炎症部位からなる群より選択される、項目49に記載の方法。
(60)上記親和性は、ICnで示され、ここで、nは1〜99の範囲である、項目49に記載の方法。
(61)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定と、約IC31以上の弱結合ICでの測定とを包含する、項目49に記載の方法。
(62)上記親和性の測定は、IC30〜IC10の間の少なくとも1点での強結合ICでの測定と、IC40〜IC60の間の少なくとも1点での弱結合ICでの測定とを包含する、項目49に記載の方法。
(63)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(64)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が10−9M以下の候補を選択することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(65)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とし、ここで、上記選択は、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、項目49に記載の方法。
(66)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(67)上記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(68)上記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とし、ここで、上記選択は、IC60の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC40の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、項目49に記載の方法。
(69)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICおよび約IC31以上の弱結合ICでの測定での測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、上記弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(70)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が10−9M以下で、かつ、上記弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(71)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、上記弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とし、ここで、上記選択は、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たし、かつ、上記弱結合ICについて、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC60の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、項目49に記載の方法。
(72)上記親和性の測定は、競合阻害アッセイ、非競合阻害アッセイおよび結合アッセイからなる群より選択される方法によって行われる、項目49に記載の方法。
(73)上記組成の分析に加え、上記組成の送達媒体の調製法を決定する工程をさらに包含する、項目49に記載の方法。
(74)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含み、上記組成の分析は、上記糖鎖修飾リポソームにおける糖鎖の種類および密度の分析を包含することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(75)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含み、上記組成の分析は、上記糖鎖修飾リポソームの製造法を決定することを包含する、項目49に記載の方法。
(76)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含み、上記組成の分析に代えて、上記糖鎖修飾リポソームの製造法を決定することを包含する、項目49に記載の方法。
(77)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含み、上記糖鎖修飾リポソームの生成において、上記組成に基づいて決定された糖鎖の種類および量をリポソームへの結合に適切な条件下で反応させる工程をさらに包含する、項目49に記載の方法。
(78)上記結合において、リンカーが使用される、項目57に記載の方法。
(79)上記リンカーは、タンパク質である、項目78に記載の方法。
(80)上記リンカーは、アルブミンである、項目78に記載の方法。
(81)上記リポソームを親水性化させる工程をさらに包含する、項目77に記載の方法。
(82)上記選択された送達媒体のインビボでの動態を確認する工程をさらに包含する、項目49に記載の方法。
(83)所望されない部位への送達がされない送達媒体の製造方法であって、上記製造方法は:
A)上記送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;および
B)所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、を包含する、方法。
(84)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目83に記載の方法。
(85)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目83に記載の方法。
(86)所望されない部位への送達がされない送達媒体の製造方法であって、上記製造方法は:
A)上記送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された上記送達媒体の組成を分析する工程;および
C)上記組成に基づいて、上記選択された送達媒体を生成する工程、
を包含する、方法。
(87)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目86に記載の方法。
(88)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目86に記載の方法。
(89)特異的送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、上記製造方法は:
A)上記送達媒体の候補について、上記特異的送達がされる部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)上記送達媒体の候補について、上記特異的送達がされない部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;および
C)所望部位への送達に対応し、かつ、所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、
を包含する、方法。
(90)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目89に記載の方法。
(91)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目89に記載の方法。
(92)特異的送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、上記製造方法は:
A)上記送達媒体の候補について、上記特異的送達がされる部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)上記送達媒体の候補について、上記特異的送達がされない部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
C)所望部位への送達に対応し、かつ、所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された上記送達媒体の組成を分析する工程;および
D)上記組成に基づいて、上記選択された送達媒体を生成する工程、
を包含する、方法。
(93)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目92に記載の方法。
(94)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目92に記載の方法。
(95)項目26〜94に記載の方法によって製造された送達媒体。
(96)所望部位への薬物の送達を必要とする被験体を予防または処置するための方法であって、上記方法は:
A)所望部位への送達を達成するための送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程;および
C)上記選択された送達媒体を用いて上記予防または処置に必要な薬剤を上記被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
(97)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目96に記載の方法。
(98)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目96に記載の方法。
(99)所望部位への薬物の送達を必要とする被験体を予防または処置するための方法であって、上記方法は:
A)所望部位への送達を達成するための送達媒体の候補について、上記部位に関連するd細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された上記送達媒体の組成を分析する工程;
C)上記組成に基づいて、上記予防または処置に必要な薬剤を含む、上記選択された送達媒体を生成する工程;
D)上記選択された送達媒体を上記被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
(100)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目99に記載の方法。
(101)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目99に記載の方法。
(102)所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造装置であって、上記装置は:
A)上記送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する手段;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する手段、を備える、装置。
(103)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目102に記載の装置。
(104)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目102に記載の装置。
(105)所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造装置であって、上記装置は:
A)上記送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する手段;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する手段;
C)選択された上記送達媒体の組成を分析する手段;
D)上記組成に基づいて、上記選択された送達媒体を生成する手段、
を備える、装置。
(106)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目105に記載の装置。
(107)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目105に記載の装置。
(108)所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造のための、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性の使用。
(109)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目108に記載の使用。
(110)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目108に記載の使用。
(111)予防または処置に使用される薬剤、および項目1〜25のいずれか1項に記載の送達媒体または項目26〜94のいずれか1項に記載の方法によって製造された送達媒体を含む、医薬組成物。
(1)所望部位に関連する細胞表面分子との強結合または弱結合に基づく結合を特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
(2)所望部位に関連する細胞表面分子とのローリングモデルに基づく結合を特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
(3)所望部位に関連する細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、強結合阻害濃度(IC)の阻害濃度が低いことを特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
(4)所望部位に関連する細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、弱結合ICの阻害濃度が高いことを特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
(5)所望部位に関連する細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、弱結合ICの阻害濃度が高い、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
(6)所望部位に関連する細胞表面分子とのローリングモデルに基づく結合、並びに、その他の強結合または弱結合に基づく結合の少なくとも1種類の結合を含むことを特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
(7)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
(8)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
(9)上記強結合ICと上記弱結合ICとの境界は、ICnにおいてnが30と31との間に存在する、項目1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
(10)上記強結合ICは、ICnにおいてnが30以下で測定され、上記弱結合ICはICnにおいてnが31以上で測定される、項目1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
(11)上記強結合ICと上記弱結合ICとの境界は、ICnにおいてnが30と31との間に存在する、項目1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
(12)所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、IC30以下の強結合ICの阻害濃度が10−9M以下である、項目3に記載の送達媒体。
(13)所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、約IC31以上の弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上である、項目4に記載の送達媒体。
(14)所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、約IC30以下の強結合ICの阻害濃度が10−9M以下であり、かつ、約IC31以上の弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上である、項目5に記載の送達媒体。
(15)所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、上記強結合ICについて、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を有し、かつ、上記弱結合ICについて、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC60の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を有する、項目14に記載の送達媒体。
(16)上記強結合ICおよび上記弱結合ICの少なくとも1つは、上記条件において少なくとも2つの条件を有することを特徴とする、項目15に記載の送達媒体。
(17)上記送達媒体は、リポソームである、項目1〜16のいずれか1項に記載の送達媒体。
(18)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームである、項目1〜16のいずれか1項に記載の送達媒体。
(19)上記ICは、E−セレクチンとの親和性において測定される、項目1〜16のいずれか1項に記載の送達媒体。
(20)上記所望部位は、炎症部位および癌部位からなる群より選択される、項目1〜16のいずれか1項に記載の送達媒体。
(21)リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号53、リポソーム番号69、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号117、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号213、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285およびリポソーム番号295からなる群より選択されるリポソームを含む、項目12に記載の送達媒体。
(22)リポソーム番号3、リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号38、リポソーム番号40、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号50、リポソーム番号53、リポソーム番号56、リポソーム番号60、リポソーム番号68、リポソーム番号69、リポソーム番号70、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号111、リポソーム番号116、リポソーム番号117、リポソーム番号120、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号129、リポソーム番号130、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号141、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号155、リポソーム番号175、リポソーム番号178、リポソーム番号183、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号197、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号209、リポソーム番号213、リポソーム番号218、リポソーム番号220、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号233、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号236、リポソーム番号237、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号254、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285、リポソーム番号290、リポソーム番号292およびリポソーム番号295なる群より選択されるリポソームを含む、項目13に記載の送達媒体。
(23)リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号53、リポソーム番号69、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号111、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号213、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285およびリポソーム番号295なる群より選択されるリポソームを含む、項目14に記載の送達媒体。
(24)リポソーム番号3、リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号38、リポソーム番号40、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号50、リポソーム番号53、リポソーム番号56、リポソーム番号60、リポソーム番号68、リポソーム番号69、リポソーム番号70、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号111、リポソーム番号116、リポソーム番号117、リポソーム番号120、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号129、リポソーム番号130、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号141、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号155、リポソーム番号175、リポソーム番号178、リポソーム番号183、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号197、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号209、リポソーム番号213、リポソーム番号218、リポソーム番号220、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号233、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号236、リポソーム番号237、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号254、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285、リポソーム番号290、リポソーム番号292およびリポソーム番号295なる群より選択されるリポソームを含む、項目15に記載の送達媒体。
(25)リポソーム番号3、リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号38、リポソーム番号40、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号50、リポソーム番号53、リポソーム番号56、リポソーム番号60、リポソーム番号68、リポソーム番号69、リポソーム番号70、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号111、リポソーム番号116、リポソーム番号117、リポソーム番号120、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号129、リポソーム番号130、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号141、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号155、リポソーム番号175、リポソーム番号178、リポソーム番号183、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号197、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号209、リポソーム番号213、リポソーム番号218、リポソーム番号220、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号233、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号236、リポソーム番号237、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号254、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285、リポソーム番号290、リポソーム番号292およびリポソーム番号295なる群より選択されるリポソームを含む、項目16に記載の送達媒体。
(26)所望の物質の所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、上記製造方法は:
A)上記送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、を包含する、方法。
(27)上記送達媒体は、リポソームを含む、項目26に記載の方法。
(28)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含む、項目26に記載の方法。
(29)上記候補は、糖鎖修飾リポソームにおいて複数の糖鎖種類を含む糖鎖修飾リポソームを含む、項目26に記載の方法。
(30)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目26に記載の方法。
(31)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目26に記載の方法。
(32)上記細胞表面分子は、E−セレクチン、P−セレクチン、L−セレクチン、ガレクチン1、ガレクチン2、ガレクチン3、ガレクチン4、ガレクチン5、ガレクチン6、ガレクチン7、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、ガレクチン11、ガレクチン12、ガレクチン13、ガレクチン14、マンノース6リン酸受容体、カルネキシン、カルレティキュリン、ERGIC−53、VIP53、インターロイキン類、インターフェロン類および増殖因子類からなる群より選択されるレクチンを含む、項目26に記載の方法。
(33)上記細胞表面分子は、E−セレクチンを含む、項目26に記載の方法。
(34)上記細胞表面分子は、E−セレクチンを含み、上記部位は、経口投与、肝臓、小腸、大腸、リンパ節、肝臓、心臓、膵臓、肺、脳、骨髄、血中、腎臓、脾臓、胸腺、筋肉、炎症部位および癌部位からなる群より選択される、項目26に記載の方法。
(35)上記細胞表面分子は、E−セレクチンを含み、上記部位は、腫瘍および炎症部位からなる群より選択される、項目26に記載の方法。
(36)上記親和性は、n%阻害濃度(ICn)で示され、ここで、nは1〜99の範囲である、項目26に記載の方法。
(37)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定と、約IC31以上の弱結合ICでの測定とを包含する、項目26に記載の方法。
(38)上記親和性の測定は、IC30〜IC10の間の少なくとも1点での強結合ICでの測定と、IC40〜IC60の間の少なくとも1点での弱結合ICでの測定とを包含する、項目26に記載の方法。
(39)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とする、項目26に記載の方法。
(40)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が10−9M以下の候補を選択することを特徴とする、項目26に記載の方法。
(41)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とし、ここで、上記選択は、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、項目26に記載の方法。
(42)上記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とする、項目26に記載の方法。
(43)上記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする、項目26に記載の方法。
(44)上記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とし、ここで、上記選択は、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC60の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、項目26に記載の方法。
(45)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICおよび約IC31以上の弱結合ICでの測定での測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、上記弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とする、項目26に記載の方法。
(46)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が10−9M以下で、かつ、上記弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする、項目26に記載の方法。(47)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、上記弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とし、ここで、上記選択は、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たし、かつ、上記弱結合ICについて、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC60の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、項目26に記載の方法。
(48)上記親和性の測定は、競合阻害アッセイ、非競合阻害アッセイおよび結合アッセイからなる群より選択される方法によって行われる、項目26に記載の方法。
(49)所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、上記製造方法は:
A)上記送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された上記送達媒体の組成を分析する工程;
C)上記組成に基づいて、上記選択された送達媒体を生成する工程、
を包含する、方法。
(50)さらに、上記選択された送達媒体に送達が所望される物質を含ませる工程を包含する、項目49に記載の方法。
(51)上記送達媒体は、リポソームを含む、項目49に記載の方法。
(52)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含む、項目49に記載の方法。
(53)上記候補は、糖鎖修飾リポソームにおいて複数の糖鎖種類を含む糖鎖修飾リポソームを含む、項目49に記載の方法。
(54)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目49に記載の方法。
(55)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目49に記載の方法。
(56)上記細胞表面分子は、E−セレクチン、P−セレクチン、L−セレクチン、ガレクチン1、ガレクチン2、ガレクチン3、ガレクチン4、ガレクチン5、ガレクチン6、ガレクチン7、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、ガレクチン11、ガレクチン12、ガレクチン13、ガレクチン14、マンノース6リン酸受容体、カルネキシン、カルレティキュリン、ERGIC−53、VIP53、インターロイキン類、インターフェロン類および増殖因子類からなる群より選択されるレクチンを含む、項目49に記載の方法。
(57)上記細胞表面分子は、E−セレクチンを含む、項目49に記載の方法。
(58)上記細胞表面分子は、E−セレクチンを含み、上記部位は、経口投与、肝臓、小腸、大腸、リンパ節、肝臓、心臓、膵臓、肺、脳、骨髄、血中、腎臓、脾臓、胸腺、筋肉、炎症部位および癌部位からなる群より選択される、項目49に記載の方法。
(59)上記細胞表面分子は、E−セレクチンを含み、上記部位は、腫瘍および炎症部位からなる群より選択される、項目49に記載の方法。
(60)上記親和性は、ICnで示され、ここで、nは1〜99の範囲である、項目49に記載の方法。
(61)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定と、約IC31以上の弱結合ICでの測定とを包含する、項目49に記載の方法。
(62)上記親和性の測定は、IC30〜IC10の間の少なくとも1点での強結合ICでの測定と、IC40〜IC60の間の少なくとも1点での弱結合ICでの測定とを包含する、項目49に記載の方法。
(63)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(64)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が10−9M以下の候補を選択することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(65)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とし、ここで、上記選択は、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、項目49に記載の方法。
(66)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(67)上記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(68)上記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とし、ここで、上記選択は、IC60の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC40の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、項目49に記載の方法。
(69)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICおよび約IC31以上の弱結合ICでの測定での測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、上記弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(70)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が10−9M以下で、かつ、上記弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(71)上記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、上記選択は、上記強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、上記弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とし、ここで、上記選択は、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たし、かつ、上記弱結合ICについて、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC60の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、項目49に記載の方法。
(72)上記親和性の測定は、競合阻害アッセイ、非競合阻害アッセイおよび結合アッセイからなる群より選択される方法によって行われる、項目49に記載の方法。
(73)上記組成の分析に加え、上記組成の送達媒体の調製法を決定する工程をさらに包含する、項目49に記載の方法。
(74)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含み、上記組成の分析は、上記糖鎖修飾リポソームにおける糖鎖の種類および密度の分析を包含することを特徴とする、項目49に記載の方法。
(75)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含み、上記組成の分析は、上記糖鎖修飾リポソームの製造法を決定することを包含する、項目49に記載の方法。
(76)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含み、上記組成の分析に代えて、上記糖鎖修飾リポソームの製造法を決定することを包含する、項目49に記載の方法。
(77)上記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含み、上記糖鎖修飾リポソームの生成において、上記組成に基づいて決定された糖鎖の種類および量をリポソームへの結合に適切な条件下で反応させる工程をさらに包含する、項目49に記載の方法。
(78)上記結合において、リンカーが使用される、項目57に記載の方法。
(79)上記リンカーは、タンパク質である、項目78に記載の方法。
(80)上記リンカーは、アルブミンである、項目78に記載の方法。
(81)上記リポソームを親水性化させる工程をさらに包含する、項目77に記載の方法。
(82)上記選択された送達媒体のインビボでの動態を確認する工程をさらに包含する、項目49に記載の方法。
(83)所望されない部位への送達がされない送達媒体の製造方法であって、上記製造方法は:
A)上記送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;および
B)所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、を包含する、方法。
(84)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目83に記載の方法。
(85)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目83に記載の方法。
(86)所望されない部位への送達がされない送達媒体の製造方法であって、上記製造方法は:
A)上記送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された上記送達媒体の組成を分析する工程;および
C)上記組成に基づいて、上記選択された送達媒体を生成する工程、
を包含する、方法。
(87)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目86に記載の方法。
(88)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目86に記載の方法。
(89)特異的送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、上記製造方法は:
A)上記送達媒体の候補について、上記特異的送達がされる部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)上記送達媒体の候補について、上記特異的送達がされない部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;および
C)所望部位への送達に対応し、かつ、所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、
を包含する、方法。
(90)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目89に記載の方法。
(91)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目89に記載の方法。
(92)特異的送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、上記製造方法は:
A)上記送達媒体の候補について、上記特異的送達がされる部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)上記送達媒体の候補について、上記特異的送達がされない部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
C)所望部位への送達に対応し、かつ、所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された上記送達媒体の組成を分析する工程;および
D)上記組成に基づいて、上記選択された送達媒体を生成する工程、
を包含する、方法。
(93)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目92に記載の方法。
(94)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目92に記載の方法。
(95)項目26〜94に記載の方法によって製造された送達媒体。
(96)所望部位への薬物の送達を必要とする被験体を予防または処置するための方法であって、上記方法は:
A)所望部位への送達を達成するための送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程;および
C)上記選択された送達媒体を用いて上記予防または処置に必要な薬剤を上記被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
(97)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目96に記載の方法。
(98)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目96に記載の方法。
(99)所望部位への薬物の送達を必要とする被験体を予防または処置するための方法であって、上記方法は:
A)所望部位への送達を達成するための送達媒体の候補について、上記部位に関連するd細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された上記送達媒体の組成を分析する工程;
C)上記組成に基づいて、上記予防または処置に必要な薬剤を含む、上記選択された送達媒体を生成する工程;
D)上記選択された送達媒体を上記被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
(100)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目99に記載の方法。
(101)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目99に記載の方法。
(102)所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造装置であって、上記装置は:
A)上記送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する手段;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する手段、を備える、装置。
(103)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目102に記載の装置。
(104)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目102に記載の装置。
(105)所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造装置であって、上記装置は:
A)上記送達媒体の候補について、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する手段;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する手段;
C)選択された上記送達媒体の組成を分析する手段;
D)上記組成に基づいて、上記選択された送達媒体を生成する手段、
を備える、装置。
(106)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目105に記載の装置。
(107)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目105に記載の装置。
(108)所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造のための、上記部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性の使用。
(109)上記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、項目108に記載の使用。
(110)上記細胞表面分子は、レクチンである、項目108に記載の使用。
(111)予防または処置に使用される薬剤、および項目1〜25のいずれか1項に記載の送達媒体または項目26〜94のいずれか1項に記載の方法によって製造された送達媒体を含む、医薬組成物。
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および添付の図面、ならびに当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
本発明によって、糖鎖修飾リポソームなどの有用な送達媒体の設計方法ならびにローリングモデルに基づくその製造法およびその利用法が提供される。本発明の送達媒体は、目的送達部位に所望の薬物を提供することが可能なDDS製剤開発の幅を大いに広げるものである。本発明により、癌治療、遺伝子治療、再生医療などの各分野での新しい治療を実現させるために必要なデリバリーシステムの開発・実用化が可能となる。このような経口投与に有用な種々の送達媒体は、本発明によって初めて提供されるものである。
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞(例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など)は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書(定義を含めて)が優先する。
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を適宜説明しながら本発明の好ましい実施形態を説明する。本発明では、糖鎖修飾リポソームを中心に説明するが、本発明のローリングモデルは、それに限定されないことが理解される。
(細胞表面分子を使用したインビトロアッセイ)
本発明は、1つの局面において、所望の物質の所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造方法を提供する。この製造方法は:A)該送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;およびB)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程を包含する。
本発明は、1つの局面において、所望の物質の所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造方法を提供する。この製造方法は:A)該送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;およびB)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程を包含する。
あるいは、本発明の製造方法は:A)該送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された該送達媒体の組成を分析する工程;およびC)該組成に基づいて、該選択された送達媒体を生成する工程、を包含する。
本明細書において「送達媒体」は、所望の物質の送達を媒介する担体(ビヒクル)をいう。送達される物質が薬物であれば、「薬物送達媒体」という。送達媒体には、脂質担体、リポソーム、脂質ミセル、リポタンパク質ミセル、脂質安定化エマルション、シクロデキストリン、ポリマー性ナノ粒子、ポリマー性微粒子、ブロック共重合体ミセル、ポリマー-脂質ハイブリッド系、誘導体化された一本鎖ポリマーなどが含まれうる。
薬物送達システム(Drug Delivery System、DDS)とは、ドラッグデリバリーシステムとも呼ばれ、吸収制御型DDS、放出制御型DDS、標的指向型DDSに分類すること もある。理想的なDDSは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むシステムである。ターゲティングDDS(Targeting DDSと書き、和訳は標的指向性DDSである。)は、パッシブ・ターゲティング(受動的・標的指向性)DDSとアクティブ・ターゲティング(能動的・標的指向性)DDSとに分類される。前者はキャリアー(薬物運搬体)の粒子径や親水性など物理化学的性質を利用して体内挙動を制御する方法である。後者はこれらに特殊な仕組みを付け加えて積極的に標的組織への指向性を制御しようとする方法であり、例えば標的組織を構成する特定細胞の標的分子への特異的分子認識機能を有する抗体や糖鎖などを結合したキャリアーを利用する方法があり“ミサイルドラッグ”と呼ばれることもある。
本明細書において「封入(encapsulation)」とは、送達媒体との安定的な会合のことを意味する。このため、媒体は、インビボで投与された場合に1つまたは複数 の薬剤が媒体と安定的に会合している限り、1つまたは複数の薬剤を取り囲む必要はない。したがって、「〜と安定的に会合した」および「〜中に封入された」または「〜とともに封入された」または「〜の中または〜とともに封入された」は、同義の用語であることを意図している。それらは本明細書において互換的に用いられる。安定的な会合は、送達媒体との共有結合、好ましくは切断可能な結合によるもの、非共有結合、および、薬剤を送達媒体の内部に捕捉することなどを含む、さまざまな手段によって生じさせうる。会合は、薬剤が、それが投与された対象における標的部位に送達されるまで、非拮抗的な比で送達媒体と会合したまま保たれる程度に、十分に安定でなければならない。
本明細書において、送達媒体として用いられる物質は、送達される生体に適合する物質(本明細書において「生体適合性物質」という)であれば、どのような物質であっても用いることができることが理解される。好ましくは、そのような生体適合性物質は、好ましくは、生分解性の物質(例えば、生分解性ポリマー)であり得るが、生体に有害な効果を有しない限り、どのような物質あってもよい。そのような物質としては、脂質(リポソームなど)、ポリエステル、シクロデキストリン、ポリアミノ酸、シリコン(例えば、多孔性シリコンまたはバイオシリコン材料、例えばその全体の開示を本明細書において参考として援用するWO99/53898に記載のものであってもよい。メソ多孔性、マイクロ多孔性または多結晶シリコン)、エチレンビニルアセテートコポリマー、ポリビニルアルコールなどを挙げることができる。生分解性ポリマーは、限定しないが、ポリエステル、例えばポリ乳酸グリコール酸コポリマー(PLGA)等、疎水性ポリアミノ酸、例えばポリアラニン、ポリロイシン等、ポリ無水物(polyanhydride)、ポリグリセロールセバシン酸(PGS)、Biopol等によって例示されうる。疎水性ポリアミノ酸は、疎水性アミノ酸から調製されるポリマーを意味する。本発明において適用され得る非生分解性ポリマーは、限定しないが、シリコン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、例えばポリメチルメタクリラート等、エチレンビニルアセテートコポリマー等によって例示され得る。
本発明の送達媒体は、水溶性物質を含んでもよい。水溶性物質は、薬物分散系の内側への水の浸潤を制御する役割を果たす物質である。投与されうる動物またはヒトの体温で固体(調製物の形態として)である限り、水溶性の物質の観点で、且つ、生理学的に許容される水溶性物質の観点で、制限はない。1つの水溶性物質、あるいは2またはそれ以上の水溶性物質の組み合わせも使用され得る。水溶性物質は、具体的には、合成ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンポリプロピレングリコール)、糖類(例えば、スクロース、マンニトール、グルコース、コンドロイチン硫酸ナトリウム)、多糖類(例えば、デキストラン)、アミノ酸(例えば、グリシンおよびアラニン)、無機塩(例えば、塩化ナトリウム)、有機塩(例えば、クエン酸ナトリウム)およびタンパク質(例えば、ゼラチンおよびコラーゲン並びにそれらの混合物)、から成る群のうちの1または複数のものから選択されうる。更に、水溶性物質が有機溶媒および水の両方の中で溶解する両親媒性物質である場合、それは、例えばその溶解性を変化させることによって親油性医薬の放出を制御する作用を有する。両親媒性物質は、限定しないが、ポリエチレングリコールまたはその誘導体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールまたはその誘導体、脂肪酸とアルキル硫酸ナトリウムの糖エステル、そして更に具体的には、ポリエチレングリコール、ポリオキシステアラート40、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレングリコール、脂肪酸のスクロースエステル、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、デソキシコール酸ナトリウム(デオキシ コール酸ナトリウム(DCA))、から成る群から選択される1または複数のものを含んでもよい。水溶性物質は、水溶性であり、且つin vivoでなんらかの活性を有する物質、例えば低分子量薬、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、またはワクチンとして使用される抗原性物質、すなわち水溶性薬、を含んでいてもよい。
シクロデキストリンは空洞形成性で水溶性の多糖であり、その空洞内に水に溶けない薬剤を収容することができる。当業者に知られた手順を用いて薬剤をシクロデキストリン中に封入することができる。例えば、Atwoodら編、「包含性化合物(Inclusion Compounds)」第2巻および第3巻、Academic Press、NY (1984);Benderら、「シクロデキストリンの化学(Cyclodextrin Chemistry)」、Springer−Verlag、Berlin (1978);Szeitliら、「シクロデキストリンおよびその包含複合体(Cyclodextrins and Their Inclusion Complexes)」、Akademiai Kiado,Budapest,Hungary(1982)および国際公開公報第00/40962号を参照されたい。
ナノ粒子および微粒子は、ポリマー性外殻(ナノカプセル)によって囲まれた、またはポリマー基質の全体に固体もしくは液体が分散した(ナノスフェア)、薬剤の濃縮性コアである。ナノ粒子および微粒子の一般的な調製法は、Soppimathら(J.Control Release(2001)70(12):1−20)に記載されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。用いうるその他のポリマー性送達媒体には、親水性外殻によって囲まれた疎水性コアを含む薬剤を含むブロック共重合体ミセルが含まれる;これは一般に、疎水性薬剤のための担体として用いられ、Allenら、「コロイドおよび表面B(Colloids and Surface B)、Biointerfaces(1999)Nov 16 (1−4):3−27に記載された通りに調製することができる。ポリマー−脂質ハイブリッド系は、脂質単層によって囲まれたポリマー性ナノ粒子からなる。ポリマー粒子は疎水性薬剤の組み入れのための積み荷空間(cargo space)として働き、脂質単層は疎水性コアと外部水性環境との間の安定化性境界として働く。ポリマーにはポリカプロラクトンおよびポリ(d,l−ラクチド)などを用いることができ、脂質単層は一般に脂質の混合物から構成される。適した調製方法は、ポリマー性ナノ粒子に関する上記の参考文献にあるものと同様である。誘導体化された一本鎖ポリマーとは、生物活性物質との共有結合によってポリマー−薬剤結合物を形成するために適合化されたポリマーである。ポリアミノ酸、多糖類(デキストリンもしくはデキストランなど)および合成ポリマー(N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド(HPMA)共重合体など)を含むさまざまなポリマーが、ポリマー−薬剤結合物の合成用に提唱されている。適した調製法は、VeroneseおよびMorpurgo、IL Farmaco (1999)54(8):497−516に詳述されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。
本明細書において「細胞表面分子」とは、細胞の表面に存在する任意の分子をいい、例えば、レクチン、細胞接着分子、レセプター、タンパク質、脂質、リン脂質、細胞膜貫通ドメイン、細胞外マトリクスなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において、「レクチン」とは、細胞膜複合糖質(糖タンパク質および糖脂質)の糖鎖と結合能を有する物質をいい、細胞凝集,分裂誘発,機能活性化,細胞障害などの効果をおよぼす能力を有する。糖鎖を細胞が発信する情報分子とすれば、レクチンは受信分子であるといえる。一定の性質を有する細胞または組織は、それに相応したレクチンのパターンを有する。レクチンは、感染、生体防御、免疫、受精、標的細胞へのターゲティング、細胞分化、細胞間接着、新生糖タンパク質の品質管理および細胞内選別輸送などを実現する。レクチンは、多用な糖鎖結合性を有し、速やかな結合および解離という固有の物理化学的性質を有することにより厳格に制御されている。糖鎖認識蛋白質とも呼ばれる。植物レクチンについての研究は古く、既に約300種類が知られている。最近、動物レクチンについても活発に研究が行われており、新規レクチンの発見が続いている。動物細胞膜上に在る主要なレクチンファミリーのレクチン群(約100種類以上)に基づく多彩な糖鎖認識機能が研究されている。とりわけ、多様な構造をもつ糖鎖リガンドの構造情報を受け取るレセプター(情報受容蛋白質、または、標的分子)としての機能が注目されている。本明細書では、おもにレクチンをもとに説明を行うが、レクチン以外の細胞表面分子でも、同様の説明が成り立つことが理解される。
本明細書において「リガンド」とは、生物化学分野において、蛋白質に特異的に結合する物質をいう。例えば、酵素に結合する基質や、細胞膜上に存在する各種の受容体蛋白質(レセプターという)と結合するペプチド、ホルモン、神経伝達物質などをそれぞれの蛋白質に対するリガンドと呼ぶ。そこで、本研究の場合は、標的組織の特定細胞膜上に存在する各種のレクチン蛋白質(レセプターの一種として機能するもの)を標的分子として利用するために、その蛋白質のリガンドである糖鎖をリポソーム表面に導入してアクティブ・ターゲティング機能を付与したDDSナノ粒子の作製を行ったことになる。
レクチンは細胞膜表面上に存在し、それを認識する糖鎖が同時に存在する。この場合細胞間相互作用が生じる。レクチン陽性細胞と糖鎖リガンド陽性細胞とが相互作用する場合はもあり得る。レクチン陽性細胞に可溶性糖タンパク質が作用する場合、および糖鎖リガンド陽性細胞に可溶性レクチンが作用する場合もある。
糖鎖とレクチンとの結合解離定数(KD)は、10−3〜10−6M程度であり、抗原抗体反応(KD:10−7〜10−12)に比べると結合力ははるかに弱い。しかし、細胞間接着、選別においては、結合すべきか否かを弱い結合で認識することが重要であると考えられる。したがって、好ましい実施形態では、細胞表面分子は、この程度の結合解離定数を有するものであることが有利であり得るがそれに限定されない。
糖鎖およびレクチンは、1分子中に複数の結合部位を有していたり、分子集合体として存在することもあることから、結合力の弱さの反面、多価性により補完される(10−8〜10−10M)。結合特異性が厳しいことから、厳密に特定の組織等に物質を送達することなどに利用することができる。
本発明の実施において、そのスクリーニングにおいて送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性が測定される。このインビトロ親和性における特定の傾向を有する送達媒体が、インビボにおいて好ましい送達媒体であることを見出した。これを本明細書において「ローリングモデル」という。
本発明の「ローリングモデル」は、ICnにおいてnが比較的小さな強結合における阻害濃度が低く、nが比較的大きな弱結合における阻害濃度が高い送達媒体が、標的臓器または組織において良好な送達を示したことを発見したことに基づき、強結合と弱結合との境界にある閾値付近でなだらかな濃度曲線を示す物質が好ましいことを見出したことによって完成された。そのような物質は、標的臓器または組織において、強固に結合するのではなく、適度に結合しながら回転する(ローリングする)という性質を有するはずであるとの理論を見出し、実際にそのような物質をスクリーニングしてインビボで試験を行ったところ、実質的にすべての物質がインビボで好ましい送達結果を示した。従って、本発明は、ある送達物質が、標的となる臓器または組織において好ましい送達結果を示すかどうかを、インビトロにおける簡易なアッセイを行うことによって決定することができるという画期的なアッセイ系・スクリーニングシステムを提供することになる。
従って、本明細書において「強結合」とは、ICnにおいてnが比較的小さなICnにおける結合をいい、具体的には、約ICn(ここで、nは、代表的に約30よりも小さい。)における結合をいう。強結合は、比較的強い結合力(例えば、抗原抗体反応が入ると考えられる)をみるのに適しているようである。ここで、「強結合阻害濃度(IC)」とは、低い阻害率における阻害濃度をいう。
従って、本明細書において「弱結合」とは、ICnにおいてnが比較的大きなICnにおける結合をいい、具体的には、約ICn(ここで、nは、代表的に約31よりも大きい。)における結合をいう。弱結合は、比較的弱い結合力(例えば、非特異的結合に近い結合が入ると考えられる)をみるのに適しているようである。ここで、「弱結合阻害濃度(IC)」とは、高い阻害率における阻害濃度をいう。
これらの強結合および弱結合は、レクチンのような細胞表面分子によっても異なることが想定され、使用される系によって、当業者は適宜ICnにおけるnを決定することができることが理解される。
これらの強結合と弱結合との指数を、好ましくは組み合わせてみることによって、本発明は、ローリングするのに適切な送達媒体をインビトロの系で見出すことに成功した。
本発明によって、選択された送達媒体は、組織に強固に結合せず、媒体と共に送達された薬剤などの活性成分を効率よく目的とする標的に放出することになるので、組織に強固に結合するような抗原抗体反応よりもはるかに効率のよい送達を達成することになる。そのような送達を理想的に達成する系を簡便に見出すことができるのが本発明の「ローリングモデル」理論である。
理論に束縛されることを望まないが、DDSの技術要素としては、薬剤放出技術、薬剤標的化技術および薬剤吸収制御技術の3つが主に存在すると考えられる。薬剤放出技術には、薬剤を高分子マトリクスなどに分散させて一定量の薬剤を長時間にわたって放出させたりする「放出制御技術」と、水に溶けにくいタンパク質製剤などをリポソームなどの担体に包含させることによって体内で有効に薬効を発現させたりする「効果的放出技術」とがある。
薬剤標的化技術には、癌組織を認識するリガンドまたは抗体などを用いて薬剤を積極的に患部に送達する「能動的標的化技術」と、薬剤にポリエチレングリコールなどを結合させることによって、血管に注射された薬剤が肝臓などで代謝されにくくし、体内を長時間循環させることによって、癌などの患部に薬剤を蓄積させる「受動的標的化技術」とが存在する。
薬剤吸収制御技術には、粘膜または皮膚などを通して薬剤を吸収させる「薬剤導入技術」と、細胞内に遺伝子を導入して疾患を治療する遺伝子治療などに用いられる「遺伝子導入技術」とが存在する。
このうち、本発明のローリングモデルでは、能動的標的化技術と効果的放出技術との最適な組み合わせを簡便に見出すことができることが明らかになった。これは、従来方法では、見出すことができなかった格別の効果であるといえる。
本発明において使用され得る細胞表面分子としては、代表的にレクチンが挙げられ、レクチンには、セレクチン(例えば、L−セレクチン、E−セレクチン、Pセレクチンなど)、糖タンパク質の細胞内輸送選別に関わるレクチン(例えば、マンノース6リン酸受容体、カルネキシン、カルレティキュリン、ERGIC−53、VIP53など)、サイトカイン(インターロイキン類、インターフェロン類、成長因子(増殖因子)類など)、ガレクチン等を挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において「セレクチン」とは、レクチンのうち、糖鎖を認識する細胞接着分子の一群で,N末端を細胞外にC末端を細胞内にもつ膜貫通型の糖タンパク質をいう。末端から順番に,Ca2+依存的に糖鎖を認識するレクチンドメイン(L)、3個のジスルフィド結合をもつEGF(epidermal growth factor)様ドメイン(E)、補体結合タンパク質と相同性をもつ補体結合ドメイン(C)を細胞外にもつことからこれらの分子はLECAM(lectin−type cell adhesion
molecule)、あるいはLECAMファミリーという名称でよばれることもある。白血球に発現されるL−セレクチン(LECAM−1),活性化血管内皮細胞に発現されるE−セレクチン(ELAM−1,LECAM−2),活性化血小板・活性化血管内皮細胞に発現されるP−セレクチン(GMP−140,LECAM−3)の少なくとも3種類の分子が存在する。
molecule)、あるいはLECAMファミリーという名称でよばれることもある。白血球に発現されるL−セレクチン(LECAM−1),活性化血管内皮細胞に発現されるE−セレクチン(ELAM−1,LECAM−2),活性化血小板・活性化血管内皮細胞に発現されるP−セレクチン(GMP−140,LECAM−3)の少なくとも3種類の分子が存在する。
L−セレクチンは、ほとんどの白血球に恒常的に発現している。L−セレクチンのリガンドとしては、GlyCAM−1(glycosylatkon−dependent cell adhesion molecule)、CD34、MAdCAM−1(mucosal addressin cell adhesion molecule)などが知られている。L−セレクチンは、シアリル−6−スルホLeXとの結合によって細胞間接着が達成され、血流中のリンパ球が特定のリンパ組織に集まるホーミング現象に関与する。
E−セレクチンは、炎症を起こしている血管内皮細胞上に浴発現しており、これにより、顆粒球、単球などが炎症箇所に集まる。血管内皮細胞が、インターロイキン1(IL−1)、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、エンドトキシンなどで刺激されると、数時間以内に発現が誘導される。従って、本発明のローリング理論では、E−セレクチンとのインビトロ親和性は、血管内皮細胞、炎症部位、腫瘍などへの送達の指標となることが理解される。
P−セレクチンは、血小板のα顆粒および内皮細胞のWeibel−Palade体に含まれている。トロンビンの刺激により脱顆粒が起こり、細胞表面に移行して発現する。P−セレクチンは、Pセレクチン糖タンパク質リガンド(PSGL−1)分子のシアリルLeX糖鎖とN末端側の硫酸化チロシン残基を合わせて認識することが知られている。
マンノース6リン酸受容体は、高マンノース型糖鎖の非還元末端のマンノース残基の6位にリン酸基が付加された構造を認識する受容体である。これは、トランスゴルジネットワークに存在している。リソソームに局在する酵素群は選別輸送のための標識として特定の糖鎖を有している理由でもある。
マンノース6リン酸受容体には、抗親和性を示すCa2+非依存性の受容体と低親和性のCa2+依存性の受容体の2種類存在する。前者は275kDa、後者は46kDaの巻く貫通型糖タンパク質である。
カルネキシンおよびカルレティキュリンは、分子シャペロンの一種であり、Glc1Man5−9GlcNAc糖鎖を特異的に結合するレクチンである。
ERGIC−53(ER−Golgi intermediate compartment)およびVIP36(vesicular integral protein 36)は、糖結合部位とカルシウム結合部位とを含む細胞内レクチンである。ERGIC−53およびVIP36は、それぞれ小胞体からシスゴルジ、および小胞体から細胞膜に存在する。
レクチンと臓器との関係については、以下に説明され得る。生体内の各種組織の細胞膜面上などに存在するレセプターとして、セレクチン、DC−SIGN、DC−SGNR、コレクチン、アシアログリコプロテインレセプターやマンノース結合蛋白質等のC−タイプレクチン、シグレック等のIタイプレクチン、マンノース−6−リン酸受容体などのPタイプレクチン、Rタイプレクチン、Lタイプレクチン、Mタイプレクチン、ガレクチンなどの各種のレクチン(糖鎖認識蛋白質)についての研究が進んできたことから、これらのレクチンに結合できる各種の分子構造を有する糖鎖は新しいDDSリガンドとして注目されてきている。
レクチンと臓器との関係では、例えば、ヒトの組織でのレクチン発現が明らかとなってきているものを列挙すると以下のとおりである。
(1)血球や骨髄細胞には、アシアログリコプロテインレセプター、CD11b、CD18、CD22、CD23、CD31、CD69、ガレクチン−5、ガレクチン−10、インターロイキン−2、マクロファージマンノースレセプター、N−CAM(CD56)、NKR−P1、シアロアドヘシン;
(2) 血漿や血清には、C−リアクティブプロテイン、P35、マンナンバインディングレクチン、セーラムアミロイドP;
(3) 骨や軟骨には、アグレカン;
(4) 各種組織の上皮細胞には、アシアログリコプロテインレセプター(肝臓)、C−リアクティブプロテイン(肝臓)、ガレクチン−2(腸)、ガレクチン−4とガレクチン−6(腸)、ガレクチン−7、HIPとPAP(腸、膵臓)、P35(肝臓)、セーラムアミロイドPコンポーネント(肝臓)、サーファクタントプロテインA(肺)、サーファクタントプロテインD(肺);
(5) 筋肉では、サルコレクチン;
(6) 神経組織では、ブレビカン、セレベラーソルブルレクチン、ミエリンアソシエイティドグリコプロテイン、N−CAM;
(7) 胎盤では、プラセンタGp120レセプター;
組織非特異的に、カルレティクリン、CD44、CD54、ERGIC−53、ガレクチン−1、ガレクチン−3、ガレクチン−8、ガレクチン−9、インターロイキン1、ホスホマンノシルレセプターI、ホスホマンノシルレセプターII、テトラネクチン、スロンボスポンジン、腫瘍壊死因子、ベルシカン;
レクチンと疾患組織との関係では、炎症性疾患全般(脳炎、網脈絡膜炎、肺炎、肝炎、関節炎など)、並びに、続発的に炎症を引き起こす疾患(悪性腫瘍、リウマチ、脳梗塞、糖尿病、アルツハイマー病など)において、E−セレクチンやP−セレクチンなどの発現が解明されつつある。また、癌や脳疾患や心疾患や動脈硬化などにおいては、E−セレクチン、セレクチン、ガレクチン、シグレックなどの各種レクチンの発現が報告されている。レクチンと臓器や疾患との関係については、未だに不明な点が多く、今後解明されていくことと期待される。
(1)血球や骨髄細胞には、アシアログリコプロテインレセプター、CD11b、CD18、CD22、CD23、CD31、CD69、ガレクチン−5、ガレクチン−10、インターロイキン−2、マクロファージマンノースレセプター、N−CAM(CD56)、NKR−P1、シアロアドヘシン;
(2) 血漿や血清には、C−リアクティブプロテイン、P35、マンナンバインディングレクチン、セーラムアミロイドP;
(3) 骨や軟骨には、アグレカン;
(4) 各種組織の上皮細胞には、アシアログリコプロテインレセプター(肝臓)、C−リアクティブプロテイン(肝臓)、ガレクチン−2(腸)、ガレクチン−4とガレクチン−6(腸)、ガレクチン−7、HIPとPAP(腸、膵臓)、P35(肝臓)、セーラムアミロイドPコンポーネント(肝臓)、サーファクタントプロテインA(肺)、サーファクタントプロテインD(肺);
(5) 筋肉では、サルコレクチン;
(6) 神経組織では、ブレビカン、セレベラーソルブルレクチン、ミエリンアソシエイティドグリコプロテイン、N−CAM;
(7) 胎盤では、プラセンタGp120レセプター;
組織非特異的に、カルレティクリン、CD44、CD54、ERGIC−53、ガレクチン−1、ガレクチン−3、ガレクチン−8、ガレクチン−9、インターロイキン1、ホスホマンノシルレセプターI、ホスホマンノシルレセプターII、テトラネクチン、スロンボスポンジン、腫瘍壊死因子、ベルシカン;
レクチンと疾患組織との関係では、炎症性疾患全般(脳炎、網脈絡膜炎、肺炎、肝炎、関節炎など)、並びに、続発的に炎症を引き起こす疾患(悪性腫瘍、リウマチ、脳梗塞、糖尿病、アルツハイマー病など)において、E−セレクチンやP−セレクチンなどの発現が解明されつつある。また、癌や脳疾患や心疾患や動脈硬化などにおいては、E−セレクチン、セレクチン、ガレクチン、シグレックなどの各種レクチンの発現が報告されている。レクチンと臓器や疾患との関係については、未だに不明な点が多く、今後解明されていくことと期待される。
動物レクチンを一次構造で分類すると、例えば、次のような14種類のファミリーに分けられる。
(1)C−タイプ、(2)S−タイプ(ガレクチン)、(2)I−タイプ(シグレク他)、(4)P−タイプ(ホスホマンノシルレセプター)、(5)ペントラキシン、(6)エッグレクチン、(7)カルレティキュリンやカルネキシン、(8)ERGIC−53やVIP−36、(9)ジスコイジン、(10)フコレクチン、(11)アネキシンレクチン、(12)フィコリン、(13)タキレクチン5Aや5B、(14)ナメクジレクチン、そして、C−タイプのファミリーは、以下のサブファミリーに分類される。(1)ヒアレクチン、(2)アシアログリコプロテインレセプター、(3)コレクチン、(4)セレクチン、(5)NKグループトランスメンブランレセプター、(6)マクロファージマンノースレセプター、(7)シングルドメインレクチン、さらに、生物学的意義が解明されていないが、糖鎖結合活性を有するオーファンレクチン群として、以下のものが知られている。(1)アンフォテリシン、(2)CD11bやCD18、(3)CEL−III、(4)コンプレメントファクターH、(5)エントアメーバ接着レクチン、(6)カエルシアル酸結合レクチン、(7)タキレクチン−1やタキレクチン−P、(8)タキレクチン−2、(9)タキレクチン−3、(10)スロンボスポンジン、(11)インターロイキン−1、(12)インターロイキン−2、(13)インターロイキン−3、(14)インターロイキン−4、(15)インターロイキン−5、(16)インターロイキン−6、(17)インターロイキン−7、(18)インターロイキン−8、(19)インターロイキン−12、(20)腫瘍壊死因子。
(1)C−タイプ、(2)S−タイプ(ガレクチン)、(2)I−タイプ(シグレク他)、(4)P−タイプ(ホスホマンノシルレセプター)、(5)ペントラキシン、(6)エッグレクチン、(7)カルレティキュリンやカルネキシン、(8)ERGIC−53やVIP−36、(9)ジスコイジン、(10)フコレクチン、(11)アネキシンレクチン、(12)フィコリン、(13)タキレクチン5Aや5B、(14)ナメクジレクチン、そして、C−タイプのファミリーは、以下のサブファミリーに分類される。(1)ヒアレクチン、(2)アシアログリコプロテインレセプター、(3)コレクチン、(4)セレクチン、(5)NKグループトランスメンブランレセプター、(6)マクロファージマンノースレセプター、(7)シングルドメインレクチン、さらに、生物学的意義が解明されていないが、糖鎖結合活性を有するオーファンレクチン群として、以下のものが知られている。(1)アンフォテリシン、(2)CD11bやCD18、(3)CEL−III、(4)コンプレメントファクターH、(5)エントアメーバ接着レクチン、(6)カエルシアル酸結合レクチン、(7)タキレクチン−1やタキレクチン−P、(8)タキレクチン−2、(9)タキレクチン−3、(10)スロンボスポンジン、(11)インターロイキン−1、(12)インターロイキン−2、(13)インターロイキン−3、(14)インターロイキン−4、(15)インターロイキン−5、(16)インターロイキン−6、(17)インターロイキン−7、(18)インターロイキン−8、(19)インターロイキン−12、(20)腫瘍壊死因子。
上記のような多種多様な動物レクチンの臓器や疾患との関連が明らかになるにつれて、本発明の送達媒体(糖鎖修飾リポソームなど)の疾患治療や診断への有用性や応用分野が広がっていくものと予測される。また、多彩な動物レクチンの生物学的意義を解明するためにも、本発明の送達媒体は研究用試薬などとして有用である。
ドラッグターゲティングシステム(DDS)分野での研究開発は、標的指向性DDSに関して、パッシブ・ターゲティング(受動的・標的指向性)DDSとアクティブ・ターゲティング(能動的・標的指向性)DDSとに分類される。パッシブ・ターゲティングDDSはキャリアー(薬物運搬体)の粒子径や親水性など物理化学的性質を改変して体内挙動を制御する方法である。アクティブ・ターゲティングDDSはこれらに分子認識機能などの特異な仕組みを付け加えて積極的に標的組織への指向性を高めようとする方法である。これまでのアクティブ・ターゲティングの研究では、各種の細胞表面分子と分子認識機能を有する各種のリガンド(抗体、トランスフェリン、葉酸、単糖など)を結合したリポソームなどのDDSナノ粒子について多くの研究がなされてきた。しかしながら、それらは、生体外では標的細胞に結合しても、生体内では期待される標的組織や細胞にターゲティングされないものが多かった(文献1、文献2)。例えば、乳がん細胞表面の細胞表面分子である「HER2」と呼ばれるたんぱく質に対する抗体「anti‐HER2」をリガンドとして、anti‐HER2抗体を結合したリポソームと結合しないリポソームのマウス尾静注後の体内分布が調べられた(文献3)。その結果、リポソームのがん組織への集積性はanti‐HER2の結合により向上しなかった。また、他のがん細胞の細胞表面分子である葉酸受容体を標的分子として、葉酸を結合したリポソームと結合しないリポソームのマウス尾静注後の体内分布が調べられた(文献4)。その結果、リポソームのがん組織への集積性は葉酸を結合しても向上しなかった。これら2種類のリガンド結合リポソームの標的は、図3の細胞表面分子(1)のタイプではなくて、いずれも細胞表面分子(2)のタイプであった。
(文献1)Forssen E., Willis M., Adv. Drug Deliv.
Rev., 29, 249-271 (1998).
(文献2)Vyas S.P. et al., Crit. Rev. Ther.
Drug Carrier Syst., 18, 1-76 (2001).
(文献3)Drummond D.C. et
al.,Pharmacological Rev. 51, 691-743 (1999).
(文献4)Gabizon A. et al.,
Adv. Drug Deliv.
Rev., 56,1177-1192 (2004).。
(文献1)Forssen E., Willis M., Adv. Drug Deliv.
Rev., 29, 249-271 (1998).
(文献2)Vyas S.P. et al., Crit. Rev. Ther.
Drug Carrier Syst., 18, 1-76 (2001).
(文献3)Drummond D.C. et
al.,Pharmacological Rev. 51, 691-743 (1999).
(文献4)Gabizon A. et al.,
Adv. Drug Deliv.
Rev., 56,1177-1192 (2004).。
本発明において使用され得るリガンドには、各種のレクチン分子と分子認識機能を有する各種の糖鎖リガンド、さらに、多数のレクチン分子も含まれている各種の細胞表面分子と分子認識機能を有する各種のリガンド等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明のDDS送達媒体の標的分子としては、例えば、図12のレクチン分子(1)のタイプであり、場合によっては更にレクチン分子(2)のタイプの併用も可能である。また、図13のレクチン分子(1)のタイプであり、場合によっては更に細胞表面分子(2)のタイプの併用も可能である。また、図14の細胞表面分子(1)のタイプであり、場合によっては更に細胞表面分子(2)のタイプの併用も可能である。また、図15の細胞表面分子(1)のタイプであり、場合によっては更にレクチン分子(2)のタイプの併用も可能である。
レクチン分子については、現在以下の表1Aのように判明しており、今後さらに解明が進むと考えられ、これらの知識を有する当業者は、本発明の記載に基づいて、種々の実施形態を実施することができることが理解される。
[表1A]現在までに解明されたレクチン分子
(文献1)http://www.imperial.ac.uk/research/animallectins/
(文献2)http://www.cermav.cnrs.fr/lectines/
(文献1)http://www.imperial.ac.uk/research/animallectins/
(文献2)http://www.cermav.cnrs.fr/lectines/
細胞表面分子については、現在以下の表1Bのように判明しており、今後さらに解明が進むと考えられ、これらの知識を有する当業者は、本発明の記載に基づいて、種々の実施形態を実施することができることが理解される。
[表1B]現在までに解明された細胞表面分子
(文献3)http://www.hlda8.org/HLDAtoHCDM.htm
[表1B]現在までに解明された細胞表面分子
(文献3)http://www.hlda8.org/HLDAtoHCDM.htm
本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。サイトカインの一部は、レクチンとして定義され得る。
本明細書において用いられる「増殖因子」または「細胞増殖因子」とは、本明細書では互換的に用いられ、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。増殖因子もまた、レクチンの一部として定義され得る。
サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、肝実質細胞増殖因子(HGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)のような増殖活性を有するものが挙げられる。
サイトカインおよび増殖因子などの生理活性物質は一般に、機能重複現象(redundancy)があることから、他の名称および機能で知られるサイトカインまたは増殖因子であっても、本発明に使用される生理活性物質の活性を有する限り、本発明において使用され得る。また、サイトカインまたは増殖因子は、本明細書における好ましい活性を有してさえいれば、本発明の治療法または医薬の好ましい実施形態において使用することができる。
ガレクチンは、βガラクトシドに結合するレクチンの総称である。糖鎖認識部位(CRD)のアミノ酸配列に相同性を有するタンパク質群であることが分かっている。少なくとも14種類のガレクチンが同定されており、分子量は14−36kDaであり、CRDを1−2種類有している。ガレクチンはまく結合領域を持たない可溶性タンパク質であるが、生体内においては種々のリガンドに結合する。β−ガラクトースの水酸基の置換、アグリコン分子に関する結合特異性に関与する。ガレクチンは、細胞質、核、細胞膜、細胞外マトリクスなどにおいて見出されている。ガレクチンは、細胞−基質間相互作用、細胞増殖制御、核からのRNA輸送制御、細胞骨格形成、アポトーシスの誘導または抑制、神経誘導などに関与するといわれている。ガレクチンは構造によって4つに分類され、ガレクチン1、2および7は同型2量体、ガレクチン5は単量体、ガレクチン4、6、8および9はリンカーペプチドにより繋がった2つの結合領域を有する一本鎖のポリペプチド、ガレクチン3は単一の結合領域を有し短いN末端を持つタンパク質である。ガレクチンの種類によって、組織における発現や分布は異なる。ガレクチンの分布は組織特異的である。ヒトにおいては、ガレクチン1は骨格筋、神経細胞、腎臓、胎盤および胸腺、ガレクチン2は腫瘍の肝臓、ガレクチン3は活性化マクロファージ、好酸球、好中球、肥満細胞、小腸、呼吸器官の上皮および感覚神経細胞、ガレクチン4は腸や口腔の上皮、ガレクチン5は赤血球や細網細胞、ガレクチン6は腸管上皮、ガレクチン7はケラチノサイト、ガレクチン8は肺、肝臓、腎臓、心臓および脳、ガレクチン9は肝臓、小腸、腎臓、リンパ組織、肺、心筋および骨格筋において発現している。
以下に特異的分布をするレクチンを以下に説明する。
マンノース6リン酸受容体は、各細胞のトランスゴルジネットワークに分布し、リソソーム酵素上の高マンノース型糖鎖をリガンドとして認識することが知られている。
カルネキシンは、小胞体に分布し、新生糖タンパク質のαグルコシル化N型糖類をリガンドとして認識することが知られている。
カルテティキュリンは、小胞体に分布し、新生糖タンパク質のαグルコシル化N型糖類をリガンドとして認識することが知られている。
ERGIC−53は、小胞体からシスゴルジに分布し、マンノース含有糖鎖をリガンドとして認識することが知られている。
VIP36は、小胞体から細胞膜に分布し、高マンノース型糖鎖をリガンドとして認識することが知られている。
ガレクチンは、上述のように、組織特異的な分布をしており、β−ガラクトース型糖鎖をリガンドとして認識することが知られている。
Siglec1(シアロアドヘシン)は、マクロファージに分布し、Siaα2−3Galをリガンドとして認識することが知られている。
Siglec2(CD22)は、リンパ球(B細胞)に分布し、Siaα2−6Galβ1−4GlcNAcをリガンドとして認識することが知られている。
Siglec3(CD33)は、ミエロイド細胞に分布し、Siaα2−3Galをリガンドとして認識することが知られている。
Siglec4a(MAG)は、末梢神経に存在し、Siaα2−3Galをリガンドとして認識することが知られている。
Siglec5(ミエリンタンパク質)は、単球に存在し、シアル酸含有糖鎖をリガンドとして認識することが知られている。
N−CAMは、末梢神経に分布し、高マンノース型糖鎖をリガンドとして認識することが知られている。
Po(哺乳類の末梢ミエリン、成熟シュワン細胞上に存在する細胞間接着因子)は、末梢神経に分布し、HNK−1抗原をリガンドとして認識することが知られている。
L−セレクチンは、白血球に分布し、血管内皮細胞上のシアリル6−スルホLeXをリガンドとして認識することが知られている。
E−セレクチンは、血管内皮細胞に存在し、リンパ球のシアリルLeXをリガンドとして認識することが知られている。
P−セレクチンは、血管内皮細胞に存在し、リンパ球PSGL−1上のシアリルLeXとチロシン硫酸をリガンドとして認識することが知られている。
マンノース結合タンパク質は、リンパ球(ナチュラルキラー細胞)に存在し、N型糖鎖をリガンドとして認識することが知られている。
アシアロ糖タンパク質受容体は、肝臓に分布し、血清等タンパク質の三本鎖および四本鎖複合型糖鎖をリガンドとして認識する。
マクロファージマンノース受容体は、マクロファージに分布し、マンノース含有糖鎖をリガンドとして認識することが知られている。
アンチトロンビン(血液凝固因子)は血液に存在し、ヘパリンをリガンドとして認識することが知られている。
FGFは血液に分布し、ヘパラン硫酸をリガンドとして認識することが知られている。
インターロイキン2(IL−2)は、血液に分布し、IL−2受容体αサブユニット上の高マンノース型糖鎖をリガンドとして認識することが知られている。
インターロイキン1α(IL−1α)は、血液に分布し、アシアロ二本鎖糖鎖をリガンドとして認識することが知られている。
インターロイキン1β(IL−1β)は、血液に分布し、GPIアンカー糖鎖糖脂質GM4をリガンドとして認識することが知られている。
インターロイキン3(IL−3)は、血液に分布し、ヘパラン硫酸をリガンドとして認識することが知られている。
インターロイキン6(IL−6)は、血液に分布し、HNK−1抗原をリガンドとして認識することが知られている。
インターロイキン7(IL−7)は、血液に分布し、シアリルTn抗原をリガンドとして認識することが知られている。
腫瘍壊死因子α(TNF−α)は、血液に分布し、マンノース含有糖鎖をリガンドとして認識することが知られている。
本明細書においてインビトロでのレクチンとの「インビトロ親和性」とは、目的とする部位に関連するレクチン(例えば、炎症部位であれば、E−セレクチンなど)とのインビトロ実験での親和性(例えば、本明細書における実施例7など)を測定することによって決定することができる。この親和性は、例えば、Yamazaki,N.(1999)Drug Delivery System,14,498−505に記載されているように、レクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定することができる。すなわち、レクチン(例えば、E−selectin;R&D Systems Co.,USA;このレクチンは、目的とする臓器に応じて変更することが可能である。)を96穴マイクロプレートに固定化する。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(タンパク質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートする。PBS(pH 7.2)で3回洗浄する後、horseradish peroxidase(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定することができる。
結合定数は、ICn(nは1〜99の任意の数、例えば、10、20、30、40、50、60;単位は濃度(M)))で表すことができる。ここで、ICnの算出方法は以下の通りである。ここで、ICは阻害濃度(Inhibitory Concentration)を指す。
まず、種々の濃度での結合指数(割合)を測定する。例えば、ここでは、サンプルLY−1の値を測定する。
その結果を表1に示す。ここでは、in vitroでのレクチン結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999)Drug Delivery System,14,498−505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(例えば、E−selectin;R&D Systems Co.,USA;このレクチンは、目的とする臓器に応じて変更することが可能である。)を96穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(タンパク質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH
7.2)で3回洗浄した後、horseradish peroxidase(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、sulfo−NHS−biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon−30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を以下のように処理して計算した。
7.2)で3回洗浄した後、horseradish peroxidase(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、sulfo−NHS−biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon−30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を以下のように処理して計算した。
従って、サンプルLY−1の平均値の比をWとすると、サンプルLY−1の平均値をXとし、hotをY、coldをZとしたときの計算式は、
W=(X−Z)/(Y−Z)×100
と表すことができる。
W=(X−Z)/(Y−Z)×100
と表すことができる。
表1、表2をもとに作成したサンプルLY−1と系列IC50のグラフ1を図2に示す。
グラフ1は表1をもとに作成したものである。X軸は対数メモリになっている。折れ線グラフ上の各点はサンプルLY−1の各濃度(横軸)における測定値の平均の比を示す。サンプルによってコントロールの値が異なるので比較しやすいようにグラフの縦軸をhotとcoldの差を1としてその比で表す。Sample LY−1のグラフと系列IC50のグラフの交点のX座標がIC50の値である。交点は座標1(0.11,0.562)と座標2(0.33,0.414)を含む直線上にありその式はy=−0.673x+0.636となる。y=0.5(系列IC50の式)の 2本の直線の交点のx座標は0.202となる。この値を蛋白質の分子量69000で割り、さらにリポソーム1個あたりの蛋白質の個数300で割ると9.76E−09となる。
これらの計算は、コンピュータプログラムを用いて自動化することができる。
本明細書では、「インビボ親和性」とは、実際の生体内でのある送達媒体の送達先との親和性であり、各臓器への生態動態を調べることによって決定することができる。そのような具体例としては、例えば、経口投与または静脈投与し、マウスの各臓器へのリポソームの集積を評価することによって調べることができる。静脈注射または経口投与し、その後、全各臓器を摘出する。各臓器は1% Triton X溶液と、HG30ホモゲナイザー(日立工機)を用いて組織ホモジネートとして調製の後、100%メタノールとクロロホルムを用いて組織ホモジネでトに含まれるリポソームを抽出する。リポソーム量は、リポソームに結合したFITCの蛍光強度を蛍光マイクロプレートリーダーBiolumin960(モレキュラーダイナミック社)を用いて行い、490nmのexitationと520nmのemissionで計測する。この方法では、数値で表現することもできるが、相対的に例えば、+++、++、+、−などの評価を行うことも可能である。
本発明では、特定のレクチンのような細胞表面分子を用いたインビトロアッセイでのインビトロ親和性をn%阻害濃度(ICn;ここで、nは0〜100の範囲である)で示し、この数値が予想外にインビボでの親和性(送達特異性)に相関していることを見出したことに一部基づく。この結果、ローリングモデルに基づいて送達媒体を効率よく、簡便に正確に設計することができるようになった。このような簡易な送達媒体の設計は従来の技術では不可能であり、知られていなかった。本発明は、数百という送達媒体の候補を調査し体系的に研究することによって上記理論を確立し、発明を完成させた。
さらに、体系的な研究の結果、インビトロ親和性の測定を、IC35〜30の間の数値(例えば、約IC31と約IC30との間)を分岐点に、それよりICnにおけるnの小さな強結合ICと、ICnにおけるnの大きな弱結合ICとをそれぞれ少なくとも1点ずつ測定し、それらを総合して比較することによって、理想的なインビボ親和性を高確率で予測することができることを見出した。その結果、強結合ICでは低濃度の値を示し、弱結合ICでは高濃度の値を示す送達媒体(例えば、糖鎖修飾リポソーム)が、インビボ親和性において高い親和性を示すことが示された。理論に束縛されることを望まないが、このような特性を示す送達媒体は、「ローリング」という観点で好ましい性質を有することが予期される。
従来能動的に所望の物質の送達を行うアクティブターゲティングは、標的細胞に存在する分子に特異性の高い分子を用いて実現させようとしてきた。結合性が高ければ高いほどより十分に選択的に効率よく送達させることができると考えられてきた。しかし、この考えに基づくアクティブターゲティングはうまくいかないことが明らかとなってきた。これは、理論に束縛されることを所望しないが、結合性が高すぎると、送達媒体が標的に結合したままとなり、送達すべき分子が効率よく送達されないことに原因があるようであることが、本発明によって明らかにされた。なぜなら、強結合ICと弱結合ICとの両方が低濃度で競合阻害される場合、最も特異性の高い結合であると考えられるが、この場合の、インビボ親和性はそれほど高くないことが多かった。従って、必ずしも強い結合が良いのではなく、むしろ、強結合ICでは低濃度の値を示し、弱結合ICでは高濃度の値を示す送達媒体が標的部位においてローリングを行い、送達されるべき物質を効率よく送達させることができると考えられる。
好ましくは、本発明におけるインビトロ親和性の測定は、IC30〜IC10の間の少なくとも1点での強結合ICでの測定と、IC40〜IC60の間の少なくとも1点での弱結合ICでの測定とを包含する。IC30〜IC10の間の少なくとも1点での強結合ICでの測定においては、その中のICnの選択は、任意でよいようである。同様にIC40〜IC60の間の少なくとも1点での弱結合ICでの測定においては、その中のICnの選択は、任意でよいようである。
1つの実施形態において、インビトロ親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、この選択は、該強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを包含する。この場合、少なくとも一定確率で、ローリングの良い、すなわち、インビボ親和性のよい送達媒体を同定することができる。好ましくは、親和性の測定は、約IC31以下の強結合ICでの測定を含み、この選択は、該強結合ICの阻害濃度が代表的には10−9M以下の候補を選択する。ここで、IC30より小さな結合とは、ICnにおけるnが30より小さな数値を有することをいい、逆にIC31以上の結合とは、ICnにおけるnが31以上の数値を有することをいう。
好ましい実施形態において、上記選択は、IC30の阻害濃度が10−9M以下であり、IC20の阻害濃度が10−9M以下であり、およびIC10の阻害濃度が10−9M以下である。
別の実施形態において、本発明におけるインビトロ親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、この選択は、該強結合ICの阻害濃度が高い候補を選択する。好ましくは、インビトロ親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、この選択は、該弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択する。
好ましい実施形態では、選択は、IC60の阻害濃度が10−9M以上であり、IC50の阻害濃度が10−9M以上であり、IC40の阻害濃度が10−9M以上で行われる。
好ましい実施形態では、本発明におけるインビトロ親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICおよび約IC31以上の弱結合ICでの測定での測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、該弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とする。
さらに好ましい実施形態では、本発明におけるインビトロ親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が10−9M以下であり、かつ、該弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする。
さらに好ましい実施形態では、本発明におけるインビトロ親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とし、ここで、該選択は、IC60の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC30の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC10の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする。
一つの好ましい実施形態では、図11に示すような濃度・阻害率曲線グラフにおいて、実線のようななだらかなカーブを有していることが、ローリングモデルにおいて有利な形状であり得る。点線のようなカーブを有する場合(例えば、抗原抗体反応)、ローリングがうまくいかず、選択的な送達に支障が出ることが本発明において実証された。
上記数値を決めるインビトロ親和性の測定方法としては、競合阻害アッセイ、非競合阻害アッセイ、結合アッセイなどによって行われる。
本発明では、好ましい送達媒体がインビトロで決定されると、その組成に基づいてさらに送達媒体を生成することができる。このとき、送達媒体には、送達が所望される物質(例えば、医薬組成物など)を含ませることができる。
ここで、好ましい送達媒体の組成が不明である場合は、必要に応じて、その組成を決定することができる。そのような組成の決定方法としては、当該分野において公知の任意の方法を用いることができる。組成が分析されると、その組成を有する送達媒体の調製法を決定することができる。そのような調製法の決定には、WO2002/081723、特開平9−31095公報、特開平11−42096公報、特開2004−180676公報、畑中研一、西村紳一郎、大内辰郎および小林一清(1997)糖質の科学と工業、講談社、東京などを参照することができる。送達媒体が糖鎖修飾リポソームである場合、組成のみならず、糖鎖の種類および密度が重要な役割を果たしていることが本発明において明らかになった。従って、好ましい実施形態では、組成の分析は、糖鎖修飾リポソームにおける糖鎖の種類および密度の分析を包含し得る。一旦、糖鎖の種類および密度が決定されると、当業者は、本発明に記載の手法に従って、糖鎖修飾リポソームの製造法を決定することができる。この様な製造法としては、例えば、糖鎖修飾リポソームの生成において、決定された組成に基づいて決定された糖鎖の種類および量をリポソームへの結合に適切な条件下で反応させることなどを挙げることができる。ここでは、好ましくは、リンカーを用いることができ、リンカーとしては、例えば、アルブミンのようなタンパク質を用いることができる。必要に応じてリポソームを親水性化させても良い。
好ましい実施形態では、本発明の方法では、選択された送達媒体のインビボでの動態を確認する工程がさらに包含される。
別の局面では、所望される部位への送達に類似する方法で、所望されない部位への送達がされない送達媒体の製造方法が本発明において提供される。この方法は、製造方法は:
A)該送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;B)所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、を包含する。
A)該送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;B)所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、を包含する。
あるいは、この製造方法は、A)該送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;B)所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された該送達媒体の組成を分析する工程;C)該組成に基づいて、該選択された送達媒体を生成する工程、を包含する、方法であり得る。
別の局面において、本発明は、特異的送達を達成するための送達媒体の製造方法を提供する。この製造方法は:A)該送達媒体の候補について、該特異的送達がされる部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;B)該送達媒体の候補について、該特異的送達がされない部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;およびC)所望部位への送達に対応し、かつ、所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、を包含する。
あるいは、この方法は、A)該送達媒体の候補について、該特異的送達がされる部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;B)該送達媒体の候補について、該特異的送達がされない部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;C)所望部位への送達に対応し、かつ、所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された該送達媒体の組成を分析する工程;およびD)該組成に基づいて、該選択された送達媒体を生成する工程、を包含する、方法であり得る。
このようにして製造された送達媒体もまた、本発明の範囲内に包含される。
(送達方法)
別の局面において、本発明は、生物学的因子を必要とする被験体において、標的部位に該生物学的因子を送達するための方法を提供する。この方法は、本発明の糖鎖修飾リポソームを経口投与する工程を包含し、該糖鎖修飾リポソームは該生物学的因子の有効量を含有する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の(糖鎖修飾リポソーム)に記載される任意の形態が使用され得る。
別の局面において、本発明は、生物学的因子を必要とする被験体において、標的部位に該生物学的因子を送達するための方法を提供する。この方法は、本発明の糖鎖修飾リポソームを経口投与する工程を包含し、該糖鎖修飾リポソームは該生物学的因子の有効量を含有する。ここで糖鎖修飾リポソームは、上述の(糖鎖修飾リポソーム)に記載される任意の形態が使用され得る。
(送達媒体の具体的説明)
本明細書において「糖鎖」とは、単位糖(単糖および/またはその誘導体)が1つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が2つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類(グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体)の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖(ポリサッカリド)」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。代表的には、約20種類の単糖(グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体など)が鎖状につながった物質で、生体の細胞内外の蛋白質や脂質に付いている。単糖の配列によって機能が異なり、通常は複雑に枝分かれしていて、人体には数百種類以上の多様な構造の糖鎖があると予想されており、さらに、人体において有用な構造は数万種類以上あると考えられている。細胞間での分子・細胞認識機能など蛋白質や脂質が生体内で果たす高次機能に関係していると見られているが、そのメカニズムは未解明の部分が多い。核酸、蛋白質に次ぐ第3の生命鎖として現在のライフサイエンスで注目されている。とりわけ、細胞認識におけるリガンド(情報分子)としての糖鎖の機能が期待され、その高機能材料開発への応用が研究されている。
本明細書において「糖鎖」とは、単位糖(単糖および/またはその誘導体)が1つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が2つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類(グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体)の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖(ポリサッカリド)」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。代表的には、約20種類の単糖(グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体など)が鎖状につながった物質で、生体の細胞内外の蛋白質や脂質に付いている。単糖の配列によって機能が異なり、通常は複雑に枝分かれしていて、人体には数百種類以上の多様な構造の糖鎖があると予想されており、さらに、人体において有用な構造は数万種類以上あると考えられている。細胞間での分子・細胞認識機能など蛋白質や脂質が生体内で果たす高次機能に関係していると見られているが、そのメカニズムは未解明の部分が多い。核酸、蛋白質に次ぐ第3の生命鎖として現在のライフサイエンスで注目されている。とりわけ、細胞認識におけるリガンド(情報分子)としての糖鎖の機能が期待され、その高機能材料開発への応用が研究されている。
本明細書において「糖」または「単糖」とは、少なくとも1つの水酸基および少なくとも1つのアルデヒド基またはケトン基を含む、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンをいい、糖鎖の基本単位を構成する。本明細書において、糖はまた、炭水化物ともいい、両者は互換的に用いられる。本明細書において、特に言及するときは、糖鎖は、1つ以上糖が連なった鎖または配列をいい、糖または単糖というときは、糖鎖を構成する1つの単位をいう。
ここで、n=2、3、4、5、6、7、8、9および10であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース,後者をケトースという。本発明では、いずれの形式のものでも使用され得る。
本発明において糖を記載するために使用する命名法は、通常の命名法に従う。例えば、ガラクトース
は、Gal;
Nアセチルガラクトサミン
Nアセチルガラクトサミン
は、GalNAc;
マンノース
マンノース
は、Man;
グルコース
グルコース
は、Glc;
Nアセチルグルコサミン
Nアセチルグルコサミン
は、GlcNAc;
フコース
フコース
は、Fuc;
Nアセチルノイラミン酸
Nアセチルノイラミン酸
は、Neu5Ac;
セラミド
セラミド
は、Cer;L−セリン
CH2(OH)CH(COOH)NH2
は、Serにより表す。なお、Cerは通常脂質に分類されるが、本明細書では、糖鎖を構成する糖の一種の定義にも入ることから特に言及しない限り、糖として扱う。また、Serは通常アミノ酸に分類されるが、本明細書では、糖鎖を構成する糖の一種の定義にも入ることから特に言及しない限り、糖として扱う。環状の2つのアノマーは、αおよびβにより表す。表示上の理由により、aまたはbと表すことがある。従って、本明細書において、αとa、βとbは、アノマー表記については交換可能に使用される。
CH2(OH)CH(COOH)NH2
は、Serにより表す。なお、Cerは通常脂質に分類されるが、本明細書では、糖鎖を構成する糖の一種の定義にも入ることから特に言及しない限り、糖として扱う。また、Serは通常アミノ酸に分類されるが、本明細書では、糖鎖を構成する糖の一種の定義にも入ることから特に言及しない限り、糖として扱う。環状の2つのアノマーは、αおよびβにより表す。表示上の理由により、aまたはbと表すことがある。従って、本明細書において、αとa、βとbは、アノマー表記については交換可能に使用される。
本明細書において、ガラクトースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはβ−D−ガラクトースであり、特に言及しないときには、β−D−ガラクトースを指すものとして使用される。
本明細書において、アセチルガラクトサミンとは、任意の異性体を指すが、代表的にはN−アセチル−α−D−ガラクトサミンであり、特に言及しないときには、N−アセチル−α−D−ガラクトサミンを指すものとして使用される。
本明細書において、マンノースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはα−D−マンノースであり、特に言及しないときには、α−D−マンノースを指すものとして使用される。
本明細書において、グルコースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはβ−D−グルコースであり、特に言及しないときには、β−D−グルコースを指すものとして使用される。
本明細書において、アセチルグルコサミンとは、任意の異性体を指すが、代表的にはN−アセチル−β−D−グルコサミンであり、特に言及しないときには、N−アセチル−β−D−グルコサミンを指すものとして使用される。
本明細書において、フコースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはα−L−フコースであり、特に言及しないときには、α−L−フコースを指すものとして使用される。
本明細書において、アセチルノイラミン酸とは、任意の異性体を指すが、代表的にはα−N−アセチルノイラミン酸であり、特に言及しないときにはα−N−アセチルノイラミン酸を指すものとして使用される。
本明細書において、セリンとは、任意の異性体を指すが、代表的にはL−セリンであり、特に言及しないときにはL−セリンを指すものとして使用される。
本明細書において、糖の表示記号、呼称、略称(Glcなど)などは、単糖を表すときと、糖鎖中で使用されるときとは、異なることに留意する。糖鎖中、単位糖は、結合先の別の単位糖との間に脱水縮合があるので、相方から水素または水酸基を除いた形で存在することになる。従って、これらの糖の略号は、単糖を表すときに使用されるときは、すべての水酸基が存在するが、糖鎖中で使用されるときは、水酸基が結合先の糖の水酸基とが脱水縮合されて酸素のみが残存した状態を示していることが理解される。
糖が、アルブミンと共有結合されるときには、糖の還元末端がアミノ化され、そのアミン基を介してアルブミンなどの他の成分に結合することができるが、その場合は還元末端の水酸基がアミン基に置換されたものを指すことに留意する。
単糖は一般に、グリコシド結合により結合されて二糖および多糖を形成する。環の平面に関する結合の向きは、αおよびβにより示す。2つの炭素の間の結合を形成する特定の炭素原子も記載する。
本明細書において糖鎖は、
により表される。従って、例えば、ガラクトースのC−1とグルコースのC−4との間のβグリコシド結合は、Galβ1,4Glcにより表される。
糖鎖の分岐は、括弧により表し、結合する単位糖のすぐ左に配置して表記する。例えば、
と表され、括弧の中は、
と表記される。従って、例えば、ガラクトースのC−1とグルコースのC−4との間がβグリコシド結合し、さらにこのグルコースのC−3がフコースのC−1とαグリコシド結合している場合、Galβ1,4(Fucα1,3)Glcと表される。単糖は、(潜在)カルボニル原子団になるだけ小さい番号を付けることを基本にして表される。有機化学命名法の一般基準では(潜在)カルボニル原子団より優位な原子団が分子中に導入されたときでも、通常上記の番号付けで表される。
本明細書において使用される糖鎖としては、例えば、Gal、GalNAc、Man、Glc、GlcNAc、Fuc、Neu5AcおよびSerからなる群より選択される少なくとも1つまたは少なくとも2つの単位糖を有する糖鎖が挙げられる。2つ以上の組み合わせが使用可能な理由としては、理論に束縛されないが、上記糖の各々が目的の送達部位の組織または細胞に局在するレクチンのような細胞表面分子に対して特異性を有しており、混在してもその特異性を発揮すると考えられるからである。
(リポソーム)
本発明のローリング方法において使用可能な送達媒体は、どのような媒体であっても使用することができるが、特に好ましい例としては、リポソームを利用した送達媒体を挙げることができる。
本発明のローリング方法において使用可能な送達媒体は、どのような媒体であっても使用することができるが、特に好ましい例としては、リポソームを利用した送達媒体を挙げることができる。
本明細書において「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。リポソームは内部に水を含んだ閉鎖小胞であるため、水溶性の薬剤などを小胞内に保持させることも可能である。したがって、このようなリポソームによって、細胞膜を通過しえない薬物や遺伝子などを細胞内に送達するのに使われる。また、生体適合性も良いのでDDS用のナノ粒子性キャリアー材料としての期待が大きい。
リポソームの調製は、当該分野において公知の任意の手法により製造することができる。例えば、その中でもコール酸透析法による方法が挙げられる。コール酸透析法では、a)脂質と界面活性剤の混合ミセルの調製、およびb)混合ミセルの透析により製造を実施する。次に本発明の糖鎖リポソームにおいて好ましい実施形態では、リンカーとしてタンパク質を使用することが好ましく、タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質のリポソームへのカップリングは、以下の2段階反応によって行うことができる。a)リポソーム膜上のガングリオシド部分の過ヨウ素酸酸化、およびb)還元的アミノ化反応による酸化リポソームへの糖タンパク質のカップリングである。その反応フローの一例を図1に示す。このような手法によって望ましい糖鎖を含む糖タンパク質をリポソームに結合することができ、所望の糖鎖を有する多種多様な糖タンパク質・リポソームコンジュゲートを得ることができる。リポソームの純度や安定性を見るために粒径サイズ分布を調べることが非常に重要である。その方法として、ゲル濾過クロマト法(GPC)および走査型電顕(SEM)や動的光散乱法(DLS)などを使うことができる。ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、コレステロール、ジセチルリン酸(DCP)、ガングリオシドのモル比 35:45:5:15のタイプのリポソームを製造することができる。なお、このリポソームは4℃で数ヶ月保存しても安定である。リポソームのin vivoでの安定性は、マウスを使って調べることができる。リポソームをマウスに静注し、3時間後に採血して血清を調製し、孔径0.03μmの膜を用いて限外濾過を行いリポソームを精製し回収する。そのSEM観察の結果、このリポソームの形態はin vivoでの3時間処理・回収前後においても変化がないことを確認することができる。
本発明の糖鎖修飾リポソームを構成する脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類(ガングリオシド類など)、ホスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類、コレステロール類等が挙げられる。
ホスファチジルコリン類としては、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられる。
ホスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
ホスファチジン酸類としては、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸が挙げられる。長鎖アルキルリン酸塩類としてはジセチルリン酸等が挙げられる。
糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ホスフナチド、グロボシド、ガングリオシド類等が挙げられる。ガングリオシド類としては、ガングリオシドGM1(Galβ1,3GalNAcβ1,4(NeuAα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1’Cer)、ガングリオシドGDla、ガングリオシドGTlb等が挙げられる。
ホスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロ−ル、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等が好ましい。
このうち、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、糖脂質類、およびコレステロール類はリポソームの安定性を上昇させる効果を有するので、構成脂質として添加するのが望ましい。例えば、本発明のリポソームを構成する脂質として、ホスファチジルコリン類(モル比0〜70%)、ホスファチジルエタノールアミン類(モル比0〜30%)、ホスファチジン酸類、および長鎖アルキルリン酸塩からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜30%)、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜40%)、ならびにコレステロール類(モル比0〜70%)を含むものが挙げられる。ガングリオシドのような糖脂質を含むことが好ましい。アルブミンのようなリンカーの結合が容易になるからである。
好ましい実施形態において、本発明におけるリポソームは、ガングリオシドを含ませてそれにペプチドなどのリンカーを結合させ、糖鎖を結合させることが可能である。
リポソームを作製するときに糖脂質を合わせることによって、この糖脂質中に含まれる糖鎖を構成成分として含む、本発明の糖鎖修飾リポソームを作製することができる。
(糖鎖修飾リポソーム)
1つの局面において、本発明は、糖鎖修飾リポソームを提供する。従来、生体内では所望の標的細胞または組織に十分にターゲティングするものは提供されてこなかった。本発明は、生体内の所望の標的細胞または組織に指向性有する糖鎖修飾リポソームを提供することにより、従来DDS材料では不可能であったターゲティングが可能になるという効果を有する。さらに体系的に、このような糖鎖修飾リポソームは、Gal、GalNAc、Man、Glc、GlcNAc、FucおよびNeu5Acからなる群より選択される少なくとも1つの構造を有する糖鎖が結合されている。
1つの局面において、本発明は、糖鎖修飾リポソームを提供する。従来、生体内では所望の標的細胞または組織に十分にターゲティングするものは提供されてこなかった。本発明は、生体内の所望の標的細胞または組織に指向性有する糖鎖修飾リポソームを提供することにより、従来DDS材料では不可能であったターゲティングが可能になるという効果を有する。さらに体系的に、このような糖鎖修飾リポソームは、Gal、GalNAc、Man、Glc、GlcNAc、FucおよびNeu5Acからなる群より選択される少なくとも1つの構造を有する糖鎖が結合されている。
本明細書において「糖鎖修飾リポソーム」とは、糖鎖とリポソームとを含む物質をいい、好ましくは、糖鎖が直接または間接的に結合することによって修飾されたリポソームをいう。糖鎖がリポソームに結合した形態を具体的に表すと、
S−(M)−L
(S:糖鎖、M:リンカー(あってもなくてもよい)、L:リポソーム、−:共有結合のような結合または架橋剤(例えば、DTSSP))
となる。
S−(M)−L
(S:糖鎖、M:リンカー(あってもなくてもよい)、L:リポソーム、−:共有結合のような結合または架橋剤(例えば、DTSSP))
となる。
ガングリオシドをリポソームに入れる場合、本発明の糖鎖修飾リポソームは、
S−M−GS−L
(GS:ガングリオシドの糖鎖部分)
で表される。
S−M−GS−L
(GS:ガングリオシドの糖鎖部分)
で表される。
より具体的に表すと、本明細書において、糖鎖修飾リポソームの「糖鎖のリポソーム近位端」とは、リポソームに対して最も近位にある糖鎖の末端部分をいう。糖鎖が分岐している場合は、該当する末端部分のすべてを近位端と呼ぶ。
「糖鎖のリポソーム最近位端」とは、リポソームに対して最も近位にある糖(単糖)をいう。従って、本明細書において、「糖鎖のリポソーム近位端に二糖以上からなる糖鎖が含まれる」というときは、糖鎖のリポソーム近位端には、糖鎖のリポソーム最近位端にある糖(単糖)のほかに、上記二糖以上からなる糖鎖中に含まれる他の糖(単糖;これは、最近位端の糖と同じであっても異なっていてもよい。)も含まれることが理解される。
本明細書において、糖鎖修飾リポソームの「糖鎖のリポソーム遠位端」とは、リポソームに対して最も遠位にある糖鎖の末端部分をいう。糖鎖が分岐している場合は、該当する末端部分のすべてを遠位端と呼ぶ。
「糖鎖のリポソーム最遠位端」とは、リポソームに対して最も遠位にある糖(単糖)をいう。従って、本明細書において、「糖鎖のリポソーム遠位端に二糖以上からなる糖鎖が含まれる」というときは、糖鎖のリポソーム遠位端には、糖鎖のリポソーム最遠位端にある糖(単糖)のほかに、上記二糖以上からなる糖鎖中に含まれる他の糖(単糖;これは、最遠位端の糖と同じであっても異なっていてもよい。)も含まれることが理解される。
本明細書のローリングモデルに適合するものとしては、例えば、以下の表にあるリポソーム番号(これらは、それぞれ、右の構造に対応する。)
本明細書において使用する場合、「修飾結合密度」とは、糖鎖修飾リポソームを作製する際に使用される糖鎖の量であり、リポソームの脂質1mgあたりに結合した糖鎖の密度(mg糖鎖/mg脂質)として本明細書において便宜的に使用される。本発明の糖鎖修飾リポソームの結合密度は、理論に束縛されることを望まないが、経験的に、調製するときに使用した糖鎖の量は、リポソームに結合した糖鎖の密度にほぼ比例していることが分かっている。従って、本明細書では、特に言及しない限り、調製時に使用した量によって結合密度が確定される。インビトロにおいて、例えば、E−セレクチンを用いて間接的に決定することができる。本発明において、送達媒体が糖鎖修飾リポソームである場合は、リポソームに結合される糖鎖の種類と結合密度を選択することにより、目的の送達部位に対する指向性を制御することができる。以下に送達媒体とその臓器指向性を示す。
標的指向性の評価(++、+)の定義は、以下のとおりである。また、評価(−)はネガティブな結果を表し、NAは未測定を表す。
標的指向性の評価(++、+)の定義は、以下のとおりである。また、評価(−)はネガティブな結果を表し、NAは未測定を表す。
なお、経口では、投与10分後に腸管により吸収されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の倍数表記として表すこととする
これは、すべてを同じTrisを基準にした場合は、以下のように表される。
これは、すべてを同じTrisを基準にした場合は、以下のように表される。
本発明において、ローリングモデルにより提供される送達媒体は、以下の表に記載される糖鎖密度を含む糖鎖修飾リポソームであってもよい。
本発明において、代表的な送達媒体である糖鎖修飾リポソームは、以下の方法によって製造され得る。具体的には、この方法は、(a)リポソームを提供する工程;(b)該リポソームを親水性化処理する工程;(c)必要に応じて、該親水性化処理されたリポソームにリンカーを結合させて、リンカー結合リポソームを生成する工程;および(d)該リポソームに、上記表3に記載される糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する工程を包含する。
好ましくは、この方法において工程(b)のリポソームを親水性化処理する工程が、リポソームの脂質膜上またはリンカー上に、直接または間接的に低分子量の親水性化合物を結合することによって実施され、工程(c)において使用されるリンカーが、ヒト由来のタンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)であり、工程(d)において、該リポソームに、直接または間接的に糖鎖を結合させる条件下で、糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成してもよい。
リポソームとリンカー、リンカーと糖鎖とは、二官能性架橋剤(例えば、DTSSP)などを利用して結合されることが好ましい。
本発明の送達媒体は、薬剤または遺伝子を封入または結合し得る。薬剤としては、例えば、アルキル化系抗癌剤、代謝拮抗剤、植物由来抗癌剤、抗癌性抗生物質、生物学的応答調節剤(biological response modifiers:BRM)・サイトカイン類、白金錯体系抗癌剤、免疫療法剤、ホルモン系抗癌剤、モノクローナル抗体等の腫瘍用薬剤、中枢神経用薬剤、末梢神経系・感覚器官用薬剤、呼吸器疾患治療薬剤、循環器用薬剤、消化器官用薬剤、ホルモン系用薬剤、泌尿器・生殖器用薬剤、ビタミン・滋養強壮剤、代謝性医薬品、抗生物質・化学療法薬剤、検査用薬剤、抗炎症剤、眼疾患薬剤、中枢神経系薬剤、自己免疫系薬剤、循環器系薬剤、糖尿病、高脂血症のような生活習慣病薬剤、副腎皮質ホルモン、免疫抑制剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、抗サイトカイン抗体、抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、siRNA、miRNA、smRNA、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(Oligodeoxynucleotide:ODN)またはDNAのような遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子、抗体医薬、分子標的薬、骨粗鬆症・骨代謝改善薬、神経ペプチド、生理活性ペプチド・蛋白質が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「リンカー」とは、糖鎖とリポソーム表面との結合を介在する分子である。本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて、糖鎖はリンカーを介してリポソーム表面に結合してもよい。リンカーは、当業者が適宜選択することができるが、生体適合性であるものが好ましく、より好ましくは、薬学的に受容可能である。本明細書において使用されるリンカーとしては、例えば、生体由来タンパク質、好ましくは、ヒト由来タンパク質、より好ましくは、ヒト由来血清タンパク質、さらにより好ましくは、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンであり得る。特に、ヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。
本明細書において「架橋剤」とは、橋をかけるように,鎖式高分子の分子間で化学結合を形成させることをいう。代表的には、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖などの高分子と他の分子(例えば、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖)との間に作用し、分子内または分子間で,共有結合のなかったところを結ぶ共有結合を形成させる薬剤をいう。本明細書においては、リポソームと糖鎖とはこの架橋剤によって共有結合が形成されていてもよく、あるいは、リンカーを介し、かつ、そのリンカーと糖鎖との間、およびリンカーとリポソームとの間が架橋剤によって結合されていてもよい。架橋剤は、架橋を目的とする標的によって変動し、例えば、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、カルボジイミド類、イミドエステル類など挙げることができるがそれらに限定されない。アミノ基含有物質を架橋する場合、アルデヒド含有基、例えば、グルタルアルデヒドを用いることができる。具体的には、例えば、ビススルホスクシニミジルスベラート、ジスクシニミジルグルタレート、ジチオビススクシニミジルプロピオネート、ジスクシニミジルスベラート、3,3’−ジチオビススルホスクシニミジルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、エチレングリコールビススルホスタシニミジルスクシネート等の2価試薬などを使用することができる。
本明細書において使用される用語「タンパク質(蛋白質)」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変(例えば、標識成分との結合体化)。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の1または2以上のアナログを含むポリペプチド(例えば、非天然のアミノ酸などを含む)、ペプチド様化合物(例えば、ペプトイド)および当該分野において公知の他の改変が包含される。
本明細書では、特に言及するときは、「タンパク質」は、比較的小さな分子量を有するアミノ酸のポリマーまたはその改変体を指し、「ペプチド」というときは、比較的大きな分子量を有するアミノ酸のポリマーまたはその改変体を指すことがあることが理解されるべきである。そのような分子量としては、たとえば、約30kDa、好ましくは約20kDa、より好ましくは約10kDaなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、「生体由来タンパク質」とは、生物に由来するタンパク質をいい、どの生物(たとえば、任意の種類の多細胞生物(例えば、動物(たとえば、脊椎動物、無脊椎動物)、植物(たとえば、単子葉植物、双子葉植物など)など))由来のタンパク質でもよい。好ましくは、脊椎動物(たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など)由来のタンパク質、より好ましくは、哺乳動物(例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など)由来のタンパク質が用いられる。さらに好ましくは、霊長類(たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト)由来のタンパク質が用いられる。最も好ましくは投与を目的とする生体由来のタンパク質が用いられる。
本明細書で使用される場合「ヒト由来血清タンパク質」は、ヒトの血液が自然に凝固したときに残る液体部分に含まれるタンパク質をいう。
本明細書で使用される場合、「ヒト血清アルブミン」は、ヒトの血清中に含まれるアルブミンをいい、「ウシ血清アルブミン」は、ウシの血清中に含まれるアルブミンをいう。
本発明における糖鎖修飾リポソームは、リポソーム膜またはリンカーの少なくとも一方が親水性化合物、好ましくは、トリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカンを結合させることにより親水性化されていてもよい。
本明細書中で使用される場合、「親水性化」は、リポソーム表面に親水性化合物を結合させることをいう。親水性化に用いる化合物としては、低分子の親水性化合物、好ましくは少なくとも1つのOH基を有する低分子の親水性化合物、さらに好ましくは、少なくとも2つのOH基を有する低分子の親水性化合物が挙げられる。また、さらに少なくとも1つのアミノ基を有する低分子の親水性化合物、すなわち分子中に少なくとも1つのOH基と少なくとも1つのアミノ基を有する親水性化合物が挙げられる。親水性化合物は、低分子なので、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンのような細胞表面分子による糖鎖分子認識反応の進行を妨げることはない。また、親水性化合物には、本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて、レクチンのような細胞表面分子等の特定の標的を指向するために用いられるレクチンのような細胞表面分子が結合し得る糖鎖は含まれない。このような親水性化合物として、例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンなどを含むトリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカン等のアミノアルコール類等が挙げられ、さらに具体的には、トリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノエタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノメタン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシエチル)アミノプロパン、トリス(ヒドロキシプロピル)アミノプロパン等が挙げられる。さらに、OH基を有する低分子化合物にアミノ基を導入した化合物も本発明の親水性化合物として用いることができる。該化合物は限定されないが、例えば、セロビオース等のレクチンのような細胞表面分子が結合しない糖鎖にアミノ基を導入した化合物が挙げられる。例えば、リポソーム膜の脂質ホスファチジルエタノールアミン上に架橋用の2価試薬とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとを用いてリポソーム表面を親水性化する。親水性化合物の一般式は、下記式(1)、式(2)、式(3)等で示される。
X−R1(R2OH)n式(1)
H2N−R3−(R4OH)n式(2)
H2N−R5(OH)n式(3)
ここで、R1、R3およびR5は、C1からC40、好ましくはC1からC20、さらに好ましくはC1からC10の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R2、R4は存在しないかもしくはC1からC40、好ましくはC1からC20、さらに好ましくはC1からC10の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示す。Xはリポソーム脂質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、例えば、COOH、NH、NH2、CHO、SH、NHS−エステル、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、EDC、ピリジルジスルフィド、アジドフェニル、ヒドラジド等が挙げられる。nは自然数を示す。このような親水性化合物で親水性化を行ったリポソームの表面は、薄く親水性化合物で覆われている。但し、その親水性化合物の覆いの厚みは小さいので、リポソームに糖鎖を結合させた場合であっても、糖鎖等の反応性を抑制することはない。
X−R1(R2OH)n式(1)
H2N−R3−(R4OH)n式(2)
H2N−R5(OH)n式(3)
ここで、R1、R3およびR5は、C1からC40、好ましくはC1からC20、さらに好ましくはC1からC10の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示し、R2、R4は存在しないかもしくはC1からC40、好ましくはC1からC20、さらに好ましくはC1からC10の直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を示す。Xはリポソーム脂質と直接または架橋用の二価試薬と結合する反応性官能基を示し、例えば、COOH、NH、NH2、CHO、SH、NHS−エステル、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、EDC、ピリジルジスルフィド、アジドフェニル、ヒドラジド等が挙げられる。nは自然数を示す。このような親水性化合物で親水性化を行ったリポソームの表面は、薄く親水性化合物で覆われている。但し、その親水性化合物の覆いの厚みは小さいので、リポソームに糖鎖を結合させた場合であっても、糖鎖等の反応性を抑制することはない。
リポソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリポソームを作成する方法(特開2000−302685号(例えば、CNDAC含有リポソーム製剤ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパ ルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン;ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセ ロール;スフィンゴミエリン;コレステロール;ポリエチレングリコール部分の分子量が約2000であるN−モノメトキシポリエチレングリコールサクシニル−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(以下、PEG2000−DSPEとする。);CNDAC塩酸塩、グルコース水溶液およびトレハロース水溶 液を使用し、Banghamら(J.Mol.Biol.8、660−668(1964)参照。)の方法により、多重層リポソームの粗分散液を得た。」と記載されている。))等の方法を採用することによっても行うことができる。このうち、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することが特に好ましい。本発明のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いる手法は、ポリエチレングリコールなどを用いる従来の親水性化方法と比較していくつかの点で好ましい。例えば、本発明のように糖鎖をリポソーム上に結合してその分子認識機能を標的指向性に利用するものでは、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンは低分子量物質であるので従来のポリエチレングリコールなどの高分子量物質を用いる方法に比べて、糖鎖に対する立体障害となりにくく標的細胞膜面上のレクチンのような細胞表面分子(糖鎖認識タンパク質)による糖鎖分子認識反応の進行を妨げないので特に好ましい。
また、本発明によるリポソームは該親水化処理後においても粒径分布や成分組成、分散特性が良好であり、長時間の保存性や生体内安定性も優れているのでリポソーム製剤化して利用するために好ましい。トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化するには、例えばジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等の脂質を用いて、常法により得たリポソーム溶液にビススルフォスクシニミジルスベラート、ジスクシニミジルグルタレート、ジチオビススクシニミジルプロピオネート、ジスクシニミジルスベラート、3,3’−ジチオビススルフォスクシニミジルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミジルスクシネート等の2価試薬を加えて反応させることにより、リポソーム膜上のジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン等の脂質に2価試薬を結合させ、次いでトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを、該2価試薬の−方の結合手と反応させることにより、リポソーム表面にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合せしめる。
このように、リポソームを親水性化処理したリポソームは、生体内で極めて安定であり、後述のように標的指向性を有する糖鎖を結合しなくても、生体内での半減期が長いためドラッグデリバリーシステムにおけるドラッグ担体として好適に用いることができる。本発明は、表面を低分子化合物で親水性化したリポソームをも包含する。
本明細書において見出されたローリングモデルに基づく送達媒体の設計において、インビトロでの評価基準は、例えば、レクチンの一種(例えば、E−セレクチン)に対する実験によって決定することができる。その実験の結果は、以下により表すことができる。
特に、関連が深い炎症部位および腫瘍部位について、さらに細かく調査した。
炎症部位
(腫瘍部位)
本明細書において使用される場合「リポソーム番号」とは、以下の表7、表8、表9、表10、表11、表12に示される糖鎖を結合した糖鎖修飾リポソームを参照する番号である。
本明細書において使用される糖鎖修飾リポソームは、例えば、表7に示される糖鎖が腸管から血中への移行のために適切な密度で含まれ得る。
本明細書において使用する場合、「修飾結合密度」とは、糖鎖修飾リポソームを作製する際に使用される糖鎖の量であり、リポソームの脂質1mgあたりに結合した糖鎖の密度(mg糖鎖/mg脂質)として表される。本発明の糖鎖修飾リポソームの結合密度は、理論に束縛されることを望まないが、経験的に、調製するときに使用した糖鎖の量は、リポソームに結合した糖鎖の密度にほぼ比例していることが分かっている。従って、本明細書では、特に言及しない限り、調製時に使用した量によって結合密度が確定される。インビトロにおいて、例えば、E−セレクチンを用いて間接的に決定することができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、リポソームに結合される糖鎖の種類と結合密度を選択することにより、目的の送達部位に対する指向性を制御することができる。以下、表7にリポソーム番号、糖鎖の構造、修飾結合密度およびその経口投与(経腸)指向性を示す。
(表7)
「++」は、糖鎖の代わりにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソーム(基準リポソーム)を経口投与した場合、投与10分後に腸管により吸収されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の4〜6倍になることを表す。
「+」は、糖鎖の代わりにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソーム(基準リポソーム)を経口投与した場合、投与10分後に腸管により吸収されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の3〜4倍になることを表す。
好ましくは、本発明の経口投与に適する糖鎖修飾リポソームは、上記の表7に示される種類の糖鎖および修飾結合密度ならびにそれらの組み合わせを用いて調製され得る。理論に束縛されないが、一旦標的指向性が+または++であることがわかれば、2種以上の糖鎖を組み合せても同様の効果が期待できるからである。なぜなら、標的組織または標的細胞のレクチンが好ましいと認識する糖鎖は、組み合せても同様に好ましいと認識されるからである。
本発明において使用される経口投与に適する糖鎖修飾リポソームは、好ましくは、リポソーム番号27、29、40、45、50、53、56、67、68、69、70、71、87、105、117、120、125、139、142、150、152、153、154、175、184、186、197、204、224、225、230、236、237、240、273、285、288または290であり得る。
本明細書において使用される糖鎖修飾リポソームは、例えば表8に示される糖鎖が腫瘍への送達のために適切な密度で含まれ得る。
本明細書で使用される場合、腫瘍への送達とは、線維肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、骨膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃癌、食道癌、直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、頭部および頸部の癌、皮膚癌、脳の癌、扁平上皮癌、脂腺癌腫、乳頭状癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌腫、絨毛上皮癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、小細胞性肺癌腫、非小細胞性肺癌種、膀胱癌腫、上皮細胞癌腫、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、カポジ肉腫からなる群より選択される腫瘍への送達をいう。
本明細書において使用する場合、「修飾結合密度」とは、糖鎖修飾リポソームを作製する際に使用される糖鎖の量であり、リポソームの脂質1mgあたりに結合した糖鎖の密度(mg糖鎖/mg脂質)として表される。本発明の糖鎖修飾リポソームの結合密度は、理論に束縛されることを望まないが、経験的に、調製するときに使用した糖鎖の量は、リポソームに結合した糖鎖の密度にほぼ比例していることが分かっている。従って、本明細書では、特に言及しない限り、調製時に使用した量によって結合密度が確定される。インビトロにおいて、例えば、E−セレクチンを用いて間接的に決定することができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、リポソームに結合される糖鎖の種類と結合密度を選択することにより、目的の送達部位に対する指向性を制御することができる。以下、表8にリポソーム番号、糖鎖の構造、修飾結合密度およびその腫瘍指向性を示す。
(表8)
「++」は、糖鎖の代わりにGalβ1,3GalNAcβ1,4(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1Cerを結合させたリポソーム(基準リポソーム)を静脈注射した場合、静脈注射5分後に腫瘍に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の2〜4倍になることを表す。
「+」は、糖鎖の代わりにGalβ1,3GalNAcβ1,4(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1Cerを結合させたリポソーム(基準リポソーム)を静脈注射した場合、静脈注射5分後に腫瘍に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1〜2倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームを基準リポソームとする場合、「++」は、静脈注射5分後に腫瘍に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1.5〜2.5倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームを基準リポソームとする場合、「+」は、静脈注射5分後に腫瘍に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1.1〜1.4倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームは腫瘍指向性をわずかに有するので、基準リポソームとしてGalβ1,3GalNAcβ1,4(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1Cerを使用した。
好ましくは、本発明の腫瘍への送達に適する糖鎖修飾リポソームは、上記の表8に示される種類の糖鎖および修飾結合密度ならびにそれらの組み合わせを用いて調製され得る。理論に束縛されないが、一旦標的指向性が+または++であることがわかれば、2種以上の糖鎖を組み合せても同様の効果が期待できるからである。なぜなら、標的組織または標的細胞のレクチンが好ましいと認識する糖鎖は、組み合せても同様に好ましいと認識されるからである。
本発明において使用される腫瘍への送達に適する糖鎖修飾リポソームは、好ましくは、リポソーム番号22、27、29、38、40、41、45、53、60、68、69、71、87、91、93、96、105、106、111、116、117、120、125、139、150、151、152、153、154、155、184、186、189、191、195、197、204、209、213、218、220、224、225、229、230、233、234、235、236、237、240、263、285、288、290、292、または295であり得る。
本明細書において使用される糖鎖修飾リポソームは、例えば表9に示される糖鎖が炎症部位への送達のために適切な密度で含まれ得る。
本明細書で使用される場合、炎症部位への送達とは、物理的、化学的、または生物学的作用物質による損傷や異常刺激によって罹患した血管および隣接する組織に起こる細胞学的・組織学的反応の動的な複合体からなる基本的な病理学上の過程の生じている領域への送達をいう。炎症部位であるかどうかは、炎症性物質(プロスタグランジン類、ロイコトリエン類等)を検出することによって確認することができる。
本明細書において使用する場合、「修飾結合密度」とは、糖鎖修飾リポソームを作製する際に使用される糖鎖の量であり、リポソームの脂質1mgあたりに結合した糖鎖の密度(mg糖鎖/mg脂質)として表される。本発明の糖鎖修飾リポソームの結合密度は、理論に束縛されることを望まないが、経験的に、調製するときに使用した糖鎖の量は、リポソームに結合した糖鎖の密度にほぼ比例していることが分かっている。従って、本明細書では、特に言及しない限り、調製時に使用した量によって結合密度が確定される。インビトロにおいて、例えば、E−セレクチンを用いて間接的に決定することができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、リポソームに結合される糖鎖の種類と結合密度を選択することにより、目的の送達部位に対する指向性を制御することができる。以下、表9にリポソーム番号、糖鎖の構造、修飾結合密度およびその炎症部位への指向性を示す。
(表9)
「+」は、糖鎖の代わりにGalβ1,3GalNAcβ1,4(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1Cerを結合させたリポソーム(基準リポソーム)を静脈注射した場合、静脈注射5分後に炎症部位に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1〜2倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームを基準リポソームとする場合、「++」は、静脈注射5分後に炎症部位に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1.5〜4.9倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームを基準リポソームとする場合、「+」は、静脈注射5分後に炎症部位に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1.2〜1.5倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームは炎症部位への指向性をわずかに有するので、基準リポソームとしてGalβ1,3GalNAcβ1,4(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1Cerを使用した。
好ましくは、本発明の炎症部位への送達に適する糖鎖修飾リポソームは、上記の表9に示される種類の糖鎖および修飾結合密度ならびにそれらの組み合わせを用いて調製され得る。理論に束縛されないが、一旦標的指向性が+または++であることがわかれば、2種以上の糖鎖を組み合せても同様の効果が期待できるからである。なぜなら、標的組織または標的細胞のレクチンが好ましいと認識する糖鎖は、組み合せても同様に好ましいと認識されるからである。
本発明において使用される炎症部位への送達に適する糖鎖修飾リポソームは、好ましくは、リポソーム番号22、27、38、40、41、50、53、56、60、68、69、70、71、76、87、91、93、96、105、106、111、116、117、120、125、137、139、146、150、151、152、153、154、155、183、184、186、189、191、195、197、199、204、209、213、218、220、224、229、230、233、234、235、237、240、263、288、290、292、または295であり得る。
本明細書において使用される糖鎖修飾リポソームは、例えば表10に示される糖鎖が肝臓への送達のために適切な密度で含まれ得る。
本明細書で使用される場合、肝臓への送達とは、横隔膜の下の右季肋部および心窩部上部にわたる領域への送達をいう。
本明細書において使用する場合、「修飾結合密度」とは、糖鎖修飾リポソームを作製する際に使用される糖鎖の量であり、リポソームの脂質1mgあたりに結合した糖鎖の密度(mg糖鎖/mg脂質)として表される。本発明の糖鎖修飾リポソームの結合密度は、理論に束縛されることを望まないが、経験的に、調製するときに使用した糖鎖の量は、リポソームに結合した糖鎖の密度にほぼ比例していることが分かっている。従って、本明細書では、特に言及しない限り、調製時に使用した量によって結合密度が確定される。インビトロにおいて、例えば、E−セレクチンを用いて間接的に決定することができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、リポソームに結合される糖鎖の種類と結合密度を選択することにより、目的の送達部位に対する指向性を制御することができる。以下、表10にリポソーム番号、糖鎖の構造、修飾結合密度およびその肝臓指向性を示す。
(表10)
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームを基準リポソームとする場合、「++」は、静脈注射5分後に肝臓に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1.5〜2.1倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームを基準リポソームとする場合、「+」は、静脈注射5分後に肝臓に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1.2〜1.5倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームは肝臓指向性をわずかに有するので、基準リポソームとしてGalβ1,3GalNAcβ1,4(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1Cerを使用した。
好ましくは、本発明の肝臓内送達に適する糖鎖修飾リポソームは、上記の表10に示される種類の糖鎖および修飾結合密度ならびにそれらの組み合わせを用いて調製され得る。理論に束縛されないが、一旦標的指向性が+または++であることがわかれば、2種以上の糖鎖を組み合せても同様の効果が期待できるからである。なぜなら、標的組織または標的細胞のレクチンが好ましいと認識する糖鎖は、組み合せても同様に好ましいと認識されるからである。
本発明において使用される肝臓内送達に適する糖鎖修飾リポソームは、好ましくは、リポソーム番号3、16、22、27、29、37、38、41、53、67、70、91、96、106、111、117、130、139、146、150、151、152、154、178、183、184、195、199、209、218、225、229、230、234、236、239、240、285、290、または292であり得る。
本明細書において使用される糖鎖修飾リポソームは、例えば表11に示される糖鎖が膵臓内への送達のために適切な密度で含まれ得る。
本明細書で使用される場合、膵臓への送達とは、十二指腸の弯曲部から脾臓にのびる被膜をもたない長い分葉腺、十二指腸曲内の平らな頭部、腹部を横切る細長い三面体形の体部、および脾臓と接する尾部にわたる領域への送達をいう。
本明細書において使用する場合、「修飾結合密度」とは、糖鎖修飾リポソームを作製する際に使用される糖鎖の量であり、リポソームの脂質1mgあたりに結合した糖鎖の密度(mg糖鎖/mg脂質)として表される。本発明の糖鎖修飾リポソームの結合密度は、理論に束縛されることを望まないが、経験的に、調製するときに使用した糖鎖の量は、リポソームに結合した糖鎖の密度にほぼ比例していることが分かっている。従って、本明細書では、特に言及しない限り、調製時に使用した量によって結合密度が確定される。インビトロにおいて、例えば、E−セレクチンを用いて間接的に決定することができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、リポソームに結合される糖鎖の種類と結合密度を選択することにより、目的の送達部位に対する指向性を制御することができる。以下、表11にリポソーム番号、糖鎖の構造、修飾結合密度およびその膵臓内指向性を示す。
(表11)
「++」は、糖鎖の代わりにGalβ1,3GalNAcβ1,4(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1Cerを結合させたリポソーム(基準リポソーム)を静脈注射した場合、静脈注射5分後に膵臓内に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の2〜4倍になることを表す。
「+」は、糖鎖の代わりにGalβ1,3GalNAcβ1,4(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1Cerを結合させたリポソーム(基準リポソーム)を静脈注射した場合、静脈注射5分後に膵臓内に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1〜2倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームを基準リポソームとする場合、「++」は、静脈注射5分後に膵臓内に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1.5〜2.2倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームを基準リポソームとする場合、「+」は、静脈注射5分後に膵臓内に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1.2〜1.5倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームは膵臓内指向性をわずかに有するので、基準リポソームとしてGalβ1,3GalNAcβ1,4(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1Cerを使用した。
好ましくは、本発明の膵臓内送達に適する糖鎖修飾リポソームは、上記の表11に示される種類の糖鎖および修飾結合密度ならびにそれらの組み合わせを用いて調製され得る。理論に束縛されないが、一旦標的指向性が+または++であることがわかれば、2種以上の糖鎖を組み合せても同様の効果が期待できるからである。なぜなら、標的組織または標的細胞のレクチンが好ましいと認識する糖鎖は、組み合せても同様に好ましいと認識されるからである。
本発明において使用される膵臓内送達に適する糖鎖修飾リポソームは、好ましくは、リポソーム番号22、27、29、38、40、56、60、68、69、70、71、76、87、91、93、96、105、106、111、116、117、120、125、127、130、137、139、142、146、150、151、152、153、154、155、175、184、191、195、197、199、204、207、209、213、218、220、224、225、229、230、233、234、235、237、249、273、292、または295であり得る。
本明細書において使用される糖鎖修飾リポソームは、例えば表12に示される糖鎖が脳内への送達のために適切な密度で含まれ得る。
本明細書で使用される場合、脳への送達とは、頭蓋内にある中枢神経系全般にわたる領域(大脳、小脳、延髄等)への送達をいう。
本明細書において使用する場合、「修飾結合密度」とは、糖鎖修飾リポソームを作製する際に使用される糖鎖の量であり、リポソームの脂質1mgあたりに結合した糖鎖の密度(mg糖鎖/mg脂質)として表される。本発明の糖鎖修飾リポソームの結合密度は、理論に束縛されることを望まないが、経験的に、調製するときに使用した糖鎖の量は、リポソームに結合した糖鎖の密度にほぼ比例していることが分かっている。従って、本明細書では、特に言及しない限り、調製時に使用した量によって結合密度が確定される。インビトロにおいて、例えば、E−セレクチンを用いて間接的に決定することができる。本発明の糖鎖修飾リポソームは、リポソームに結合される糖鎖の種類と結合密度を選択することにより、目的の送達部位に対する指向性を制御することができる。以下、表12にリポソーム番号、糖鎖の構造、修飾結合密度およびその脳指向性を示す。
(表12)
「++」は、糖鎖の代わりにGalβ1,3GalNAcβ1,4(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1Cerを結合させたリポソーム(基準リポソーム)を静脈注射した場合、静脈注射5分後に脳内に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の3〜7倍になることを表す。
「+」は、糖鎖の代わりにGalβ1,3GalNAcβ1,4(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1Cerを結合させたリポソーム(基準リポソーム)を静脈注射した場合、静脈注射5分後に脳内に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の2〜3倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームを基準リポソームとする場合、「++」は、静脈注射5分後に脳内に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1.7〜3.7倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームを基準リポソームとする場合、「+」は、静脈注射5分後に脳内に送達されたリポソームの平均値が基準リポソームの平均値の1.1〜1.4倍になることを表す。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソームは脳指向性をわずかに有するので、基準リポソームとしてGalβ1,3GalNAcβ1,4(Neu5Acα2,3)Galβ1,4Glcβ1,1Cerを使用した。
好ましくは、本発明の脳内送達に適する糖鎖修飾リポソームは、上記の表12に示される種類の糖鎖および修飾結合密度ならびにそれらの組み合わせを用いて調製され得る。理論に束縛されないが、一旦標的指向性が+または++であることがわかれば、2種以上の糖鎖を組み合せても同様の効果が期待できるからである。なぜなら、標的組織または標的細胞のレクチンが好ましいと認識する糖鎖は、組み合せても同様に好ましいと認識されるからである。
本発明において使用される脳内送達に適する糖鎖修飾リポソームは、好ましくは、リポソーム番号22、29、38、40、45、50、53、56、60、67、68、69、70、71、76、80、87、93、105、106、116、120、127、129、137、141、142、146、150、151、152、154、155、175、178、184、186、189、197、207、209、213、218、224、229、230、233、235、237、249、273、290、292、または295であり得る。
上記の表に記載されるような本発明の好ましい糖鎖修飾リポソームは、以下の方法によって製造され得る。具体的には、この方法は、(a)リポソームを提供する工程;(b)該リポソームを親水性化処理する工程;(c)必要に応じて、該親水性化処理されたリポソームにリンカーを結合させて、リンカー結合リポソームを生成する工程;および(d)該リポソームに、上記表3に記載される糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する
工程を包含する。
工程を包含する。
好ましくは、この方法において、工程(b)のリポソームを親水性化処理する工程は、リポソームの脂質膜上またはリンカー上に、直接または間接的に低分子量の親水性化合物を結合することによって実施され、工程(c)において使用されるリンカーは、ヒト由来のタンパク質であり、かつ工程(d)において、該リポソームに、直接または間接的に糖鎖を結合させる条件下で、糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する。
リポソームとリンカー、リンカーと糖鎖とは、二官能性架橋剤(例えば、DTSSP)などを利用して結合されることが好ましい。
本発明の送達媒体は、薬剤または遺伝子を封入または結合し得る。薬剤としては、例えば、バイオ医薬品またはバイオ治療用物質(例えば、siRNA、shRNA、siRNA誘導体、shRNA誘導体、RNA、RNA誘導体、DNA、DNA誘導体、モノクローナル抗体、ワクチン、インターフェロン、ホルモン、プロスタグランジン、転写因子、組換えタンパク質、抗体医薬、核酸>
医薬、遺伝子治療薬)、アルキル化系抗癌剤、代謝拮抗剤、植物由来抗癌剤、抗癌性抗生物質、生物学的応答調節剤(biological response modifiers:BRM)・サイトカイン類、白金錯体系抗癌剤、免疫療法剤、ホルモン系抗癌剤、モノクローナル抗体等の腫瘍用薬剤、中枢神経用薬剤、末梢神経系・感覚器官用薬剤、呼吸器疾患治療薬剤、循環器用薬剤、消化器官用薬剤、ホルモン系用薬剤、泌尿器・生殖器用薬剤、ビタミン・滋養強壮剤、代謝性医薬品、抗生物質・化学療法薬剤、検査用薬剤、抗炎症剤、眼疾患薬剤、中枢神経系薬剤、自己免疫系薬剤、循環器系薬剤、糖尿病、高脂血症のような生活習慣病薬剤、副腎皮質ホルモン、免疫抑制剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、抗サイトカイン抗体、抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、siRNA、shRNA、miRNA、smRNA、アンチセンスRNAまたはODNまたはDNAのような遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子、抗体医薬が挙げられるが、これらに限定されない。
医薬、遺伝子治療薬)、アルキル化系抗癌剤、代謝拮抗剤、植物由来抗癌剤、抗癌性抗生物質、生物学的応答調節剤(biological response modifiers:BRM)・サイトカイン類、白金錯体系抗癌剤、免疫療法剤、ホルモン系抗癌剤、モノクローナル抗体等の腫瘍用薬剤、中枢神経用薬剤、末梢神経系・感覚器官用薬剤、呼吸器疾患治療薬剤、循環器用薬剤、消化器官用薬剤、ホルモン系用薬剤、泌尿器・生殖器用薬剤、ビタミン・滋養強壮剤、代謝性医薬品、抗生物質・化学療法薬剤、検査用薬剤、抗炎症剤、眼疾患薬剤、中枢神経系薬剤、自己免疫系薬剤、循環器系薬剤、糖尿病、高脂血症のような生活習慣病薬剤、副腎皮質ホルモン、免疫抑制剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、抗サイトカイン抗体、抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、siRNA、shRNA、miRNA、smRNA、アンチセンスRNAまたはODNまたはDNAのような遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子、抗体医薬が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の送達媒体は、生物学的因子を必要とする被験体へ生物学的因子の経口投与するため、および呼吸器系、循環器系、消化器系、泌尿器・生殖器系、中枢神経系、末梢神経系などの障害を有する哺乳動物を処置するためにも使用され得る。
本発明送達媒体は、送達媒体の特性(例えば、糖鎖の種類による)と結合密度を調節することによって、腸管での吸収制御性、各種臓器への送達特異性を高めることもできる。腸管吸収制御性を高める糖鎖と特定の組織または器官への指向性を有する糖鎖の両方を送達媒体に結合させることにより、特定組織または器官への指向性と腸管吸収制御性の両方の特性を併せ持った送達媒体を作製することも可能である。
本発明の送達媒体の調製は、pH、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本発明の送達媒体は、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤等の固形製剤、シロップ剤、懸濁剤、溶液剤等の液状製剤として経口的に投与することができる。送達媒体は、投与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、送達媒体が患者による摂取に適した液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。
本発明の送達媒体は、薬剤または生物学的因子などの有効成分が意図される目的を達成するのに有効な量で、媒体中に含有される組成物を含む。「処置するのに有効な量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果(例えば、予防、治療、再発防止など)を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、処置有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量(例えば、処置有効量)を確認する1つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
治療有効量、予防有効量などおよび毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順(例えば、ED50、集団の50%において治療的に有効な用量;およびLD50、集団の50%に対して致死的である用量)によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ED50/LD50として表され得る。小さな治療係数を呈する薬物送達媒体が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないED50を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用する細胞の種類等により適宜選択される。
本発明の薬物送達媒体は、当該分野で公知の様式と同様の様式(例えば、混合、溶解など)で製造され得る。
本明細書において「指示書」は、本発明の糖鎖修飾リポソームまたは経口投与用薬物送達媒体などを投与する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人(患者本人であり得る)に対して記載したものである。この指示書は、本発明の糖鎖修飾リポソームまたは経口投与用薬物送達媒体などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁(例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局(FDA)など)が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書(package insert)であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体(例えば、インターネットで提供されるホームページ(ウェブサイト)、電子メール)のような形態でも提供され得る。
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤(日本薬局方第14版またはその最新版、Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company,1990などを参照)と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、pH、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与(例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など)であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または薬学的アジュバント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、単離された多能性幹細胞、またはその改変体もしくは誘導体を、1つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる:リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸;アスコルビン酸、α−トコフェロール;低分子量ポリペプチド;タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン);親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン);アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン);モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物(グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む);キレート剤(例えば、EDTA);糖アルコール(例えば、マンニトールまたはソルビトール);塩形成対イオン(例えば、ナトリウム);ならびに/あるいは非イオン性表面活性化剤(例えば、Tween、プルロニック(pluronic)またはポリエチレングリコール(PEG))。
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤(例えば、スクロース)を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、pH7.0−8.5のTris緩衝剤またはpH4.0−5.5の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
本発明が化粧品として使用されるときもまた、当局の規定する規制を遵守しながら化粧品を調製することができる。
本発明の送達媒体または組成物は、農薬の成分としても用いることができる。農薬組成物として処方される場合、必要に応じて、農学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤などを含み得る。
本発明の送達媒体または組成物が、農薬として使用される場合は、除草剤(ピラゾレートなど)、殺虫・殺ダニ剤(ダイアジノンなど)、殺菌剤(プロベナゾールなど)、植物成長調整剤(例、パクロブトラゾールなど)、殺線虫剤(例、ベノミルなど)、共力剤(例、ピペロニルブトキサイドなど)、誘引剤(例、オイゲノールなど)、忌避剤(例、クレオソートなど)、色素(例、食用青色1号など)、肥料(例、尿素など)などもまた必要に応じて混合され得る。
(保健・食品)
本発明はまた、保健・食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品・健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。好ましくは、本発明の送達媒体は、低アレルゲン食品としても用いることができる。
本発明はまた、保健・食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品・健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。好ましくは、本発明の送達媒体は、低アレルゲン食品としても用いることができる。
本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患(種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体(または患者)に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患(種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に1回(例えば、1週間に1回−1ヶ月に1回)の投与が挙げられる。1週間−1ヶ月に1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
別の局面において、本発明は、所望部位への薬物の送達を必要とする被験体を予防または処置するための方法を提供する。この方法は:A)所望部位への送達を達成するための送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程;およびC)該選択された送達媒体を用いて該予防または処置に必要な薬剤を該被験体に投与する工程、を包含する。
あるいは、この方法は、方法は:A)所望部位への送達を達成するための送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された該送達媒体の組成を分析する工程;C)該組成に基づいて、該予防または処置に必要な薬剤を含む、該選択された送達媒体を生成する工程;D)該選択された送達媒体を該被験体に投与する工程、を包含する。
このような送達媒体としては、例えば、所望部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、約IC30以下の強結合ICの阻害濃度が10−9M以下である、所望部位への送達を達成するための送達媒体;所望部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、約IC31以上の弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上である、所望部位への送達を達成するための送達媒体;所望部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、約IC30以下の強結合ICの阻害濃度が10−9M以下であり、かつ、約IC31以上の弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上である、所望部位への送達を達成するための送達媒体;所望部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC40の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を有し、かつ、IC30の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC10の阻害濃度が10−9Mであることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を有する、所望部位への送達を達成するための送達媒体等を挙げることができるがそれらに限定されない。ここで、このICは、E−セレクチンとの親和性において測定され得るが、それに限定されない。これらの送達媒体もまた、本発明の範囲内に入ることが理解される。この場合、E−セレクチンは、少なくとも炎症部位および癌部位と密接に相関することから、これらを炎症部位および癌部位に送達するために用いることができる。
上記条件に入る具体的な糖鎖修飾リポソームとしては、以下を挙げることができる。
好ましくは、送達媒体は、リポソーム(例えば、糖鎖修飾リポソーム)であり得る。
従って、本発明はまた、予防または処置に使用される薬剤、および本発明の送達媒体または本発明の送達媒体製造法によって製造された送達媒体を含む、医薬組成物を提供する。
(改変)
本明細書では、送達媒体は、所望により、実際に測定された媒体に置換を施すことができる。糖鎖である場合、糖鎖の水酸基にメチル基を導入することなどによって、特異性を改変することが可能である。そのような改変により作製された改変体は、本発明のローリングモデルに従って、インビトロでのスクリーニングによってその親和性を測定することができる。
本明細書では、送達媒体は、所望により、実際に測定された媒体に置換を施すことができる。糖鎖である場合、糖鎖の水酸基にメチル基を導入することなどによって、特異性を改変することが可能である。そのような改変により作製された改変体は、本発明のローリングモデルに従って、インビトロでのスクリーニングによってその親和性を測定することができる。
本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の1または2以上(または数個)の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を1つ除去して1価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を2つ除去して2価の置換基に置換することも可能である。
本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の1または2以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を1つ除去して1価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を2つ除去して2価の置換基に置換することも可能である。
本発明における置換基としては、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、アシル、アシルアミノ、チオカルボキシ、アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルまたは置換されたスルフィニルが挙げられるがそれらに限定されない。このような置換基は、本発明において、アミノ酸の設計のときに、適宜利用することができる。
好ましくは、置換基は、複数存在する場合それぞれ独立して、水素原子またはアルキルであり得るが、複数の置換基全てが水素原子であることはない。より好ましくは、独立して、置換基は、複数存在する場合それぞれ独立して、水素およびC1〜C6アルキルからなる群より選択され得る。置換基は、すべてが水素以外の置換基を有していても良いが、好ましくは、少なくとも1つの水素、より好ましくは、2〜n(ここでnは置換基の個数)の水素を有し得る。置換基のうち水素の数が多いことが好ましくあり得る。小さな置換基または極性のある置換基は本発明の効果(特に、アルデヒド基との相互作用)に障害を有し得るからである。従って、水素以外の置換基としては、好ましくは、C1〜C6アルキル、C1〜C5アルキル、C1〜C4アルキル、C1〜C3アルキル、C1〜C2アルキル、メチルなどであり得る。ただし、本発明の効果を増強し得ることもあることから、小さな置換基を有することもまた好ましくあり得る。
本明細書において、C1、C2、、、Cnは、炭素数を表す。従って、C1は炭素数1個の置換基を表すために使用される。
本明細書において「保護反応」とは、Bocのような保護基を、保護が所望される官能基に付加する反応をいう。保護基により官能基を保護することによって、より反応性の高い官能基の反応を抑制し、より反応性の低い官能基のみを反応させることができる。保護反応は、例えば、脱水反応により行うことができる。
本明細書において「脱保護反応」とは、Bocのような保護基を脱離させる反応をいう。脱保護反応としては、Pd/Cを用いる還元反応のような反応が挙げられる。脱保護反応は、例えば、加水分解により行うことができる。
本明細書において「保護基」としては、例えば、フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)基、アセチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、t−ブトキシカルボニル基、t−ブチルジメチル基、シリル基、トリメチルシリルエチル基、N-フタルイミジル基、トリ
メチルシリルエチルオキシカルボニル基、2−ニトロ−4,5−ジメトキシベンジル基、2-ニトロ-4,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、カルバメート基などが代表
的な保護基として挙げられる。保護基は、例えば、アミノ基、カルボキシル基などの反応性の官能基を保護するために用いることができる。反応の条件や目的に応じ、種々の保護基を使い分けることができる。ヒドロキシ基の保護基にはアセチル基、ベンジル基、シリル基またはそれらの誘導体などが、アミノ基の保護基にはアセチル基のほかベンジルオキシカルボニル基、t−ブトキシカルボニル基またはそれらの誘導体などを使用することができる。アミノオキシ基およびN-アルキルアミノオキシ基の保護基として、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、2-ニトロ-4,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニ
ル基またはそれらの誘導体が好ましい。
メチルシリルエチルオキシカルボニル基、2−ニトロ−4,5−ジメトキシベンジル基、2-ニトロ-4,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、カルバメート基などが代表
的な保護基として挙げられる。保護基は、例えば、アミノ基、カルボキシル基などの反応性の官能基を保護するために用いることができる。反応の条件や目的に応じ、種々の保護基を使い分けることができる。ヒドロキシ基の保護基にはアセチル基、ベンジル基、シリル基またはそれらの誘導体などが、アミノ基の保護基にはアセチル基のほかベンジルオキシカルボニル基、t−ブトキシカルボニル基またはそれらの誘導体などを使用することができる。アミノオキシ基およびN-アルキルアミノオキシ基の保護基として、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、2-ニトロ-4,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニ
ル基またはそれらの誘導体が好ましい。
本発明の各方法において、目的とする生成物は、反応液から夾雑物(未反応減量、副生成物、溶媒など)を、当該分野で慣用される方法(例えば、抽出、蒸留、洗浄、濃縮、沈澱、濾過、乾燥など)によって除去した後に、当該分野で慣用される後処理方法(例えば、吸着、溶離、蒸留、沈澱、析出、クロマトグラフィーなど)を組み合わせて処理して単離し得る。
本発明では、糖鎖の付加反応は、接触が起こる限り、原理的に進むことが理解されるが、好ましくは、例えば、25℃〜80℃で反応が進むことが理解される。適切な温度の上限としては、例えば、80℃、70℃、60℃、50℃、42℃、40℃などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような温度は、タンパク質の種類にもより、熱変性しやすいタンパク質は、上限が、例えば、37℃などであり得る。適切な温度の下限としては、例えば、25℃、30℃、32℃、37℃などであり得る。適切な温度の下限は、反応速度との関係から、必要な時間を考慮して当業者は適宜決定することができる。
反応時間もまた、当業者が、本明細書の記載を参酌して、適宜決定することができる。そのような時間としては、例えば、6時間〜5日などを挙げることができるがそれらに限定されない。
反応時間の下限としては、例えば、数時間(1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間など)、1日、数日(2−3日)などを挙げることができるが、それらに限定されず、当業者は、反応速度および効率などを考慮して本明細書の記載に基づいて適宜決定することができる。反応時間の上限としては、例えば、数日(2〜3日)、5日、6日、10日などを挙げることができるがそれらに限定されない。生産された糖タンパク質が分解したり、変性しない程度に反応時間の上限を設定することが望ましい。
(糖鎖修飾リポソームの製造方法)
別の局面において、本発明は、糖鎖修飾リポソームを製造する方法を提供する。この方法は、(a)リポソームを提供する工程;(b)該リポソームを親水性化処理する工程;(c)必要に応じて、該親水性化処理されたリポソームにリンカーを結合させて、リンカー結合リポソームを生成する工程;および(d)該リポソームに、糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する工程を包含する。好ましくは、この方法において、工程(b)のリポソームを親水性化処理する工程は、リポソームの脂質膜上またはリンカー上に、直接または間接的に低分子量の親水性化合物(例えば、トリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカンなど)を結合することによって実施され、工程(c)において使用されるリンカーは、ヒト由来の蛋白質(例えば、ヒト血清アルブミンなど)であり、そして工程(d)
において、該リポソームに、直接または間接的に糖鎖を結合させる条件下で、糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する。
別の局面において、本発明は、糖鎖修飾リポソームを製造する方法を提供する。この方法は、(a)リポソームを提供する工程;(b)該リポソームを親水性化処理する工程;(c)必要に応じて、該親水性化処理されたリポソームにリンカーを結合させて、リンカー結合リポソームを生成する工程;および(d)該リポソームに、糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する工程を包含する。好ましくは、この方法において、工程(b)のリポソームを親水性化処理する工程は、リポソームの脂質膜上またはリンカー上に、直接または間接的に低分子量の親水性化合物(例えば、トリス(ヒドロキシアルキル)アミノアルカンなど)を結合することによって実施され、工程(c)において使用されるリンカーは、ヒト由来の蛋白質(例えば、ヒト血清アルブミンなど)であり、そして工程(d)
において、該リポソームに、直接または間接的に糖鎖を結合させる条件下で、糖鎖を結合させて糖鎖修飾リポソームを生成する。
別の局面において、本発明は、目的の送達部位に薬物を送達するための糖鎖修飾リポソームの製造方法を提供する。この方法は、(a)種々の糖鎖密度を有する、該目的の送達部位への送達を達成する糖鎖修飾リポソームを提供する工程;(b)該糖鎖修飾リポソーム上の糖鎖密度について、該送達部位への最適な送達を達成する密度を決定する工程;および(c)該薬物を決定された最適な糖鎖修飾リポソームに組み込んで薬物含有リポソームを生成する工程を包含する。
(リポソームの製造)
リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、これには、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等を挙げることができる。
リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、これには、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等を挙げることができる。
また、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節することも可能である。本発明のリポソーム自体の製法について、具体的に述べると、例えば、まず、ホスファチジルコリン類、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはホスファチジルグリセロール類を配合成分とする脂質と界面活性剤コール酸ナトリウムとの混合ミセルを調製する。とりわけ、ホスファチジン酸類もしくはジセチルホスフェート等の長鎖アルキルリン酸塩類の配合は、リポソームを負に荷電させるために必須であり、ホスファチジルエタノールアミン類の配合は親水性化反応部位として、ガングリオシド類または糖脂質類またはホスファチジルグリセロール類の配合はリンカーの結合部位として必須のものである。ガングリオシド類、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも1種の脂質はリポソーム中で集合し、リンカーを結合させる足場(ラフト)として機能する。本発明のリポソームは、このようなタンパク質を結合させうるラフトが形成されることによりさらに安定化される。すなわち、本発明のリポソームは、リンカーを結合させるためのガングリオシド、糖脂質、ホスファチジルグリセロール類、スフィンゴミエリン類およびコレステロール類からなる群から選択される少なくとも、1種の脂質のラフトが形成されたリポソームを含む。そして、これにより得られる混合ミセルの限外濾過を行うことによりリポソームを作製する。本発明において使用するリポソームは、通常のものでも使用できるが、その表面は親水性化されていることが望ましい。上述のようにしてリポソームを作製した後にリポソーム表面を親水性化する。
本発明は、上記の親水性化化合物を用いて親水性化した糖鎖の結合していないリポソームそのものをも包含する。このような親水性化したリポソームは、リポソーム自体の安定性が高まり、また糖鎖を結合したときに糖鎖の認識性が高まるという利点がある。本発明のリポソームは、例えば、リポソームの構成脂質が、ホスファチジルコリン類(モル比0〜70%)、ホスファチジルエタノールアミン類(モル比0〜30%)、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩およびジセチルリン酸類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜30%)、ガングリオシド類、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類およびスフィンゴミエリン類からなる群から選択される1種以上の脂質(モル比0〜40%)、ならびにコレステロール類(モル比0〜70%)を含む、リポソームである。
本発明は、さらにリポソームに上記に親水性化化合物を結合させて、リポソームを親水性化する方法をも包含する。また、糖鎖の結合していない親水性化したリポソームをも包含する。糖鎖の結合していないリポソームに糖鎖を結合することにより、本発明の標的指向性リポソームまたは腸管吸収性リポソームを製造することができる。
(糖鎖の合成)
本発明の糖鎖修飾リポソームに使用され得る糖鎖は、一般的な糖鎖合成方法によって合成され得る。これらの方法としては、(1)化学合成による方法、(2)遺伝子組換え細胞あるいは微生物による発酵法、(3)糖加水分解酵素(グリコシダーゼ)を用いて合成する方法、(4)糖転移酵素(グリコシルトランスフェラーゼ)を用いて合成する方法が挙げられる。(WO2002/081723、特開平9−31095公報、特開平11−42096公報、特開2004−180676公報、畑中研一、西村紳一郎、大内辰郎および小林一清(1997)糖質の科学と工業、講談社、東京などを参照のこと)。本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて使用される糖鎖は、上記の方法により合成された糖鎖であっても、市販の糖鎖であってもよい。
本発明の糖鎖修飾リポソームに使用され得る糖鎖は、一般的な糖鎖合成方法によって合成され得る。これらの方法としては、(1)化学合成による方法、(2)遺伝子組換え細胞あるいは微生物による発酵法、(3)糖加水分解酵素(グリコシダーゼ)を用いて合成する方法、(4)糖転移酵素(グリコシルトランスフェラーゼ)を用いて合成する方法が挙げられる。(WO2002/081723、特開平9−31095公報、特開平11−42096公報、特開2004−180676公報、畑中研一、西村紳一郎、大内辰郎および小林一清(1997)糖質の科学と工業、講談社、東京などを参照のこと)。本発明の糖鎖修飾リポソームにおいて使用される糖鎖は、上記の方法により合成された糖鎖であっても、市販の糖鎖であってもよい。
(リポソームへの糖鎖の結合)
本発明においては、上記のようにして作製したリポソームに、上記の糖鎖のいずれかを直接結合させてもよいし、さらに、リンカーを介して糖鎖を結合させてもよい。この際、リポソームに結合させる糖鎖の種類は1種類に限らず、複数の糖鎖を結合させてもよい。この場合の複数の糖鎖は同じ組織または器官の細胞表面に共通して存在する異なるレクチンのような細胞表面分子に対して結合活性を有する複数の糖鎖であってもよいし、異なる組織または器官の細胞表面に存在する異なるレクチンのような細胞表面分子に対して結合活性を有する糖鎖であってもよい。前者のような複数の糖鎖を選択することにより、特定の標的組織または器官を確実に指向することができ、後者のような複数の糖鎖を選択することにより、1種類のリポソームに複数の標的を指向させることができ、マルチパーパスな標的指向性リポソームを得ることができる。
本発明においては、上記のようにして作製したリポソームに、上記の糖鎖のいずれかを直接結合させてもよいし、さらに、リンカーを介して糖鎖を結合させてもよい。この際、リポソームに結合させる糖鎖の種類は1種類に限らず、複数の糖鎖を結合させてもよい。この場合の複数の糖鎖は同じ組織または器官の細胞表面に共通して存在する異なるレクチンのような細胞表面分子に対して結合活性を有する複数の糖鎖であってもよいし、異なる組織または器官の細胞表面に存在する異なるレクチンのような細胞表面分子に対して結合活性を有する糖鎖であってもよい。前者のような複数の糖鎖を選択することにより、特定の標的組織または器官を確実に指向することができ、後者のような複数の糖鎖を選択することにより、1種類のリポソームに複数の標的を指向させることができ、マルチパーパスな標的指向性リポソームを得ることができる。
なお、糖鎖をリポソームに結合させるには、リポソームの製造時にリンカーおよび/または糖鎖を混合し、リポソームを製造させつつ糖鎖をその表面に結合させることも可能であるが、あらかじめリポソーム、リンカーおよび糖鎖を別途準備し、製造が完了したリポソームにリンカーおよび/または糖鎖を結合させたほうが望ましい。これは、リポソームにリンカーおよび/または糖鎖を結合させることにより、結合させる糖鎖の密度を制御できるからである。糖鎖のリポソームヘの直接結合は、以下に述べるような方法で行うことができる。
糖鎖を糖脂質として混合してリポソームを製造するか、製造後のリポソームのリン脂質に糖鎖を結合するとともに糖鎖密度を制御する。リンカーを用いて糖鎖を結合させる場合、リンカーとしては、生体由来のタンパク質、特にヒト由来タンパク質を用いるのが好ましい。生体由来のタンパク質は限定されないが、アルブミン等の血液中に存在するタンパク質、その他生体に存在する生理活性物質等が挙げられる。例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)等の動物の血清アルブミンが挙げられるが、特にヒト血清アルブミンを使用する場合は、各組織に対する取り込みが多いことがマウスについての実験により確かめられている。本発明のリポソームは、非常に安定であり、リポソームを形成した後にタンパク質を結合させたり、リンカーを結合させたり、糖鎖を結合させるという後処理が可能である。従って、リポソームを大量に製造した後に、目的に応じてそれぞれ異なるタンパク質を結合させたり、リンカーや糖鎖を結合させることにより、目的に応じた種々のリポソームを製造することが可能である。
本発明のリポソームには、糖鎖がリンカーを介して、あるいはリポソームを構成する脂質に直接結合している。本発明のリポソームは、糖脂質や糖タンパク質等の複合糖質型リガンドを有し、低分子化合物で親水化処理されているリポソームである。
また、後述のように、本発明の標的指向性リポソームを医薬として用いる場合、該リポソームは医薬効果を有する化合物を含んでいる必要がある。該医薬効果を有する化合物は、リポソーム中に封入させるか、あるいはリポソーム表面に結合させればよいが、リンカーとして、医薬効果を有するタンパク質を用いてもよい。この場合、タンパク質がリポソームと糖鎖を結合させるためのリンカーおよび医薬効果を有するタンパク質を兼ねることもある。薬効を有するタンパク質としては、生理活性タンパク質等が挙げられる。
リンカーを介して糖鎖をリポソームへ結合させるには以下に述べる方法で行えばよい。
まずリポソーム表面にタンパク質を結合させる。リポソームを、NaIO4、Pb(O2CCH3)4、NaBiO3等の酸化剤で処理して、リポソーム膜面に存在するガングリオシドを酸化し、次いで、NaBH3CN、NaBH4等の試乗を用いて、リンカーとリポソーム膜面上のガングリオシドを、還元的アミノ化反応により結合させる。このリンカーも、親水性化するのが好ましく、これにはリンガータンパク質にヒドロキシ基を有する化合物を結合させるが、例えば、ビススルフォスクシニミジルスベラート、ジスクシニミジルグルタレート、ジチオビススクシニミジルプロピオネート、ジスクシニミジルスベラート、3,3’−ジチオビススルフォスクシニミジルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミジルスクシネート等の2価試薬を用いて、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン等の上述の親水性化に用いる化合物をリポソーム上のリンカーと結合させればよい。
これを具体的に述べると、まず、リンカーの全てのアミノ基に架橋用2価試薬の一端を結合する。そして、各種糖鎖の還元末端をグリコシルアミノ化反応して得られる糖鎖グリコシルアミン化合物を調製し、この糖鎖のアミノ基とリポソーム上の上記で結合された架橋2価試薬の一部分の他の未反応末端とを結合する。糖鎖および/または親水性化合物とリポソームとの共有結合、または糖鎖および/または親水性化合物とリンカーとの共有結合は、リポソームが細胞内に取り込まれたときに切断することも可能である。例えば、リンカーと糖鎖がジスルフィド結合を介して共有結合されている場合、細胞内で還元されて糖鎖が切断される。糖鎖が切断されることによりリポソーム表面が疎水性になり、生体膜と結合し膜安定性が乱れリポソーム中に含まれる薬剤が放出される。
次に、このようにして得られる糖鎖結合リポソーム膜面上タンパク質の表面に糖鎖が結合していない未反応で残っている大部分の2価試薬未反応末端を用いて親水性化処理を行う。つまり、このリポソーム上タンパク質に結合している2価試薬の未反応末端とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン等の上述の親水性化に用いる化合物との結合反応を行い、リポソーム表面全体を親水性化する。リポソーム表面およびリンカーの親水性化は、各種組織への移行性、および血中における滞留性および各種組織への移行性を向上させる。これは、リポソーム表面およびリンカー表面が親水性化されることによって、糖鎖以外の部分が、各組織等においてはあたかも生体内水分であるかのようにみえ、これにより、標的以外の組織等に認識されず、糖鎖のみがその標的組織のレクチンのような細胞表面分子(糖鎖認識タンパク質)により認識されることに起因するものと思われる。
次いで、糖鎖をリポソーム上のリンカーに結合させる。これには、糖鎖を構成する糖類の還元末端を、NH4HCO3、NH2COONH4等のアンモニウム塩を用いてグリコシルアミノ化し、次いで、ビススルフォスクシニミジルスベラート、ジスクシニミジルグルタレート、ジチオビススクシニミジルプロピオネート、ジスクシニミジルスベラート、3,3’−ジチオビススルフォスクシニミジルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスタシニミジルスクシネート等の2価試薬を用いて、リポソーム膜面上に結合したリンカーと、上記グリコシルアミノ化された糖類とを結合させ、図1に示されるようなリポソーム複合体を得る。なお、これらの糖鎖は市販されている。
本発明のリポソーム、糖鎖等結合リポソームの粒径は、30〜500nm、好ましくは50〜350nmである。また、本発明のリポソームは、負に荷電していることが望ましい。負に荷電していることにより、生体中の負に荷電している細胞との相互作用を防ぐことができる。本発明のリポソーム表面のゼ−タ電位は、生理食塩水中において、37℃で、−50〜10mV、好ましくは−40〜0mV、さらに好ましくは−30〜−10mVである。
本発明の糖鎖修飾リポソームに含ませる薬剤としては、バイオ医薬品またはバイオ治療用物質(例えば、siRNA、siRNA誘導体、RNA、RNA誘導体、DNA、DNA誘導体、モノクローナル抗体、ワクチン、インターフェロン、ホルモン、プロスタグランジン、転写因子、組換えタンパク質、抗体医薬、核酸医薬、遺伝子治療薬)、アルキル化系抗癌剤、代謝拮抗剤、植物由来抗癌剤、抗癌性抗生物質、BRM・サイトカイン類、白金錯体系抗癌剤、免疫療法剤、ホルモン系抗癌剤、モノクローナル抗体等の腫瘍用薬剤、中枢神経用薬剤、末梢神経系・感覚器官用薬剤、呼吸器疾患治療薬剤、循環器用薬剤、消化器官用薬剤、ホルモン系用薬剤、泌尿器・生殖器用薬剤、ビタミン・滋養強壮剤、代謝性医薬品、抗生物質・化学療法薬剤、検査用薬剤、抗炎症剤、眼疾患薬剤、中枢神経系薬剤、自己免疫系薬剤、循環器系薬剤、糖尿病、高脂血症のような生活習慣病薬剤、副腎皮質ホルモン、免疫抑制剤、抗菌薬、抗ウイルス薬、血管新生抑制剤、サイトカイン、ケモカイン、抗サイトカイン抗体、抗ケモカイン抗体、抗サイトカイン・ケモカイン受容体抗体、siRNA、shRNA、miRNA、smRNA、アンチセンスRNAまたはODNまたはDNAのような遺伝子治療関連の核酸製剤、神経保護因子、抗体医薬、分子標的薬、骨粗鬆症・骨代謝改善薬、神経ペプチド、生理活性ペプチド・タンパク質等が挙げられる。例えば、腫瘍用薬剤として、塩酸ナイトロジェンマスタード−N−オキシド、シクロホスファミド、イホスファミド、プルスファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニートール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウムなどのアルキル化剤、メルカプトプリン、チオイノシン(メルカプトプリンリボシド)、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、塩酸アンシタビン(塩酸サイクロシチジン)、フルオロウラシル、5−FU、テガフール、ドキシフルリジン、カルモフールなどの代謝拮抗剤、エトポシド、硫酸ビンプラスチン、硫酸ピンクリスチン、硫酸ビンデシン、パクリタキセル、タキソール、塩酸イリノテカン、塩酸ノギテカンなどのアルカロイド等の植物由来抗癌剤、アクチノマイシンD、マイトマイシンC、クロモマイシンA3、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン(アクラシノマイシンA)、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチンなどの抗癌性抗生物質、その他、塩酸ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチン、L−アスパラギナーゼ、アセグラトン、塩酸プロカルバジン、クエン酸タモキシフェン、ウベニメクス、レンチナン、シゾフィラン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ホスフェストロール、メピチオスタン、エピチオスタノール等がある。本発明において、上述の薬剤にはその誘導体も包含される。
上述のような薬剤を含ませることにより、本発明のリポソームを、癌、炎症等の疾患の治療に用いることができる。ここで、癌は、腫瘍や白血病等のあらゆる新生物による疾患を含む。本発明の糖鎖修飾リポソームにこれらの薬剤を含ませて投与した場合、薬剤を単独で投与した場合に比較し、薬剤が癌、炎症部位に集積する。単独投与の場合に比べ、2倍以上、好ましくは5倍以上、さらに好ましくは10倍以上、特に好ましくは50倍以上集積し得る。
なお、医薬効果を有する化合物は、リポソームの中に封入させてもよいし、リポソーム表面に結合させてもよい。例えば、タンパク質は上記のリンカーの結合方法と同じ方法で表面に結合させることが可能であり、他の化合物もその化合物が有する官能基を利用することにより、公知の方法で、結合させることができる。また、リポソーム内部への封入は、以下の方法により行う。リポソームへ薬剤等を封入するには、周知の方法を用いればよく、例えば、薬剤等の含有溶液とホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはホスファチジルグリセロール類およびコレステロール類を含む脂質を用いてリポソームを形成することにより、薬剤等はリポソーム内に封入される。
したがって、本発明のリポソームに、治療あるいは診断に供しうる薬剤あるいは遺伝子を封入することによって得られるリポソーム製剤は、ガン組織、炎症組織、各種組織への移行性が選択的に制御されたものであり、治療薬剤あるいは診断剤の標的細胞、組織への集中による効力の増強あるいは他の細胞、組織に対する薬剤の取り込みの減少による副作用の軽減化等を図れるものである。
また、本発明の静注投与用並びに経口投与用薬物送達媒体を診断用に用いる場合は、リポソームに蛍光色素、放射性化合物等の標識化合物を封入又は結合させる。該標識化合物結合リポソームが患部に結合し、標識化合物が患部細胞に取り込まれ、該標識化合物の存在を指標に疾患を検出・診断することができる。
本発明を診断として用いる場合は、例えば、DNAプローブ診断薬、X線造影剤、放射性試薬、放射性造影剤、放射性診断薬、蛍光試薬、蛍光造影剤、蛍光診断薬、CT用造影剤、PET用造影剤、SPECT用造影剤、MRI用造影剤、エイズ診断薬、血液学的検査用試薬、機能検査用試薬、微生物検査用試薬、分子イメージング、インビボイメージング、蛍光イメージング、発光イメージング、セルソーター、PETおよびSPECT等に用いることができる。研究試薬としては、組換えDNA技術、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション法、酵素アッセイにおいて使用される試薬などが挙げられる。
本発明の結果、例えば実施例9と実施例10と実施例22Aと実施例22B、この糖鎖修飾リポソームがリガンドとしての糖鎖の機能を活用して、疾患患部や各種臓器へ薬物や蛍光物質や放射標識物質などをアクティブターゲティングにより高効率に集積・送達することを示すものである。従って、本発明の糖鎖修飾リポソームは、腫瘍などの標的組織での集積を可視化できるので、治療用薬剤送達媒体としての利用とともに、研究試薬や診断薬などとしての利用への送達媒体をも提供する。
本発明を診断として用いる場合は、例えば、DNAプローブ診断薬、X線造影剤、放射性診断薬、蛍光診断薬、CT用造影剤、PET用造影剤、SPECT用造影剤、MRI用造影剤、エイズ診断薬、血液学的検査用試薬、機能検査用試薬、微生物検査用試薬、分子イメージング、インビボイメージング、蛍光イメージング、発光イメージング、セルソーター、PETおよびSPECT等に用いることができる。研究試薬としては、組換えDNA技術、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション法、酵素アッセイにおいて使用される試薬などが挙げられる。
(美容・化粧)
別の実施形態において、本発明は、美容目的の治療、処置または改善を対象とし得る。そのような目的としては、純粋に健常状態への美容・化粧を目的とするのみならず、手術後または外傷後の変形および先天性の変形に対する美容治療も含まれる。例えば、乳房の組織増大術(豊胸術)、頬や上下眼瞼の陥凹に対する組織増大術、顔面半側萎縮症、顔面神経麻痺後の組織萎縮、漏斗胸などへの組織増大を目的として利用しうる。さらに、隆鼻術、整鼻術、オトガイ形成術(組織増大術)、前額形成術(組織増大術)、小耳症など耳介変形・奇形に対する耳介軟骨形成術へも利用できるがそれに限定されない。
別の実施形態において、本発明は、美容目的の治療、処置または改善を対象とし得る。そのような目的としては、純粋に健常状態への美容・化粧を目的とするのみならず、手術後または外傷後の変形および先天性の変形に対する美容治療も含まれる。例えば、乳房の組織増大術(豊胸術)、頬や上下眼瞼の陥凹に対する組織増大術、顔面半側萎縮症、顔面神経麻痺後の組織萎縮、漏斗胸などへの組織増大を目的として利用しうる。さらに、隆鼻術、整鼻術、オトガイ形成術(組織増大術)、前額形成術(組織増大術)、小耳症など耳介変形・奇形に対する耳介軟骨形成術へも利用できるがそれに限定されない。
本発明が美容・化粧分野において使用される場合、そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸;アスコルビン酸、α−トコフェロール;低分子量ポリペプチド;タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン);親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン);アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン);モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物(グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む);キレート剤(例えば、EDTA);糖アルコール(例えば、マンニトールまたはソルビトール);塩形成対イオン(例えば、ナトリウム);ならびに/あるいは非イオン性表面活性化剤(例えば、Tween、プルロニック(pluronic)またはポリエチレングリコール(PEG))などが挙げられるがそれらに限定されない。
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤(例えば、スクロース)を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、pH7.0−8.5のTris緩衝剤またはpH4.0−5.5の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
(保健・食品)
本発明はまた、保健・食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品・健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。好ましくは、本発明の糖鎖修飾リポソームに機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品を封入または結合させたものを食品組成物として用いることができる。本発明で用い得る機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品に限定はなく、摂取されて食品機能を有効に発現するように設計され、加工変換された食品ならばいずれのものも含まれる。
本発明はまた、保健・食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品・健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。好ましくは、本発明の糖鎖修飾リポソームに機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品を封入または結合させたものを食品組成物として用いることができる。本発明で用い得る機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品に限定はなく、摂取されて食品機能を有効に発現するように設計され、加工変換された食品ならばいずれのものも含まれる。
例えば、イチョウ葉、エキナシア、ノコギリヤシ、セントジョーンズワート、バレリアン、ブラックコホッシュ、ミルクシスル、月見草、ブドウ種子エキス、ビルペリー、ナツシロギク、当帰、大豆、フランス海岸松、ガーリック、高麗ニンジン、茶、ショウガ、アガリクス、メシマコブ、紫イペ、AHCC、酵母ベータグルカン、マイタケ、プロポリス、ビール酵母、穀類、梅、クロレラ、大麦若葉、青汁、ビタミン類、コラーゲン、グルコサミン、桑葉、ルイボス茶、アミノ酸、ローヤルゼリー、シイタケ菌糸体エキス、スピルリナ、田七ニンジン、クレソン、植物発酵食品、DHA、EPA、ARA、昆布、キャベツ、アロエ、メグスリノ木、ホップ、カキ肉エキス、ピクジエノール、ゴマ等が本発明に用い得る機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品として例示できる。これらは、そのままリポソームに含ませてもよいし、抽出物等の処理物を含ませてもよい。リポソームを含む食品組成物は、経口摂取される。用いるリポソームは、糖鎖が結合していなくてもよく、また腸管吸収を高める糖鎖または特定の組織もしくは器官を標的とした糖鎖が結合していてもよい。本発明のリポソームを食品組成物として投与する場合は、液体飲料、ゲル状食品、固形食品等の食品に加工すればよい。また、錠剤、顆粒等に加工してもよい。本発明の食品組成物は、リポソームが含む食品の種類に応じた機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品として用いることができる。例えば、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、炭水化物を含む食品であってもよい。
例えば、DHAを含むリポソームは、軽度老人性痴呆症や記憶改善に効果のある機能性食品、栄養補助食品または健康補助食品として用いることができる。
(製造装置)
別の局面において、本発明は、所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造装置を提供する。この装置は:A)該送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する手段;B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する手段、を備える。
別の局面において、本発明は、所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造装置を提供する。この装置は:A)該送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する手段;B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する手段、を備える。
あるいは、本発明は、所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造装置を提供する。この装置は:A)該送達媒体の候補について、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する手段;B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する手段;C)選択された該送達媒体の組成を分析する手段;D)該組成に基づいて、該選択された送達媒体を生成する手段、を備える。
(使用)
別の局面において、本発明は、所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造のための、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性の使用を提供する。この使用目的には、種々のものが考慮され、例えば、治療薬のみならず、診断薬(MRI造影剤など)、研究試薬(蛍光プローブなど)、化粧品、機能性食品など、医薬品、化粧品・農薬・食品をはじめ農学・医学・薬学分野はいうに及ばず、アッセイのための試薬としても使用可能であり、このような概念は、本発明の開示前には存在しなかったことから、その意義は大きい。
別の局面において、本発明は、所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造のための、該部位に関連するレクチンのような細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性の使用を提供する。この使用目的には、種々のものが考慮され、例えば、治療薬のみならず、診断薬(MRI造影剤など)、研究試薬(蛍光プローブなど)、化粧品、機能性食品など、医薬品、化粧品・農薬・食品をはじめ農学・医学・薬学分野はいうに及ばず、アッセイのための試薬としても使用可能であり、このような概念は、本発明の開示前には存在しなかったことから、その意義は大きい。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、市販されているものを使用した。
(実施例1.リポソームの調製)
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝液(pH 8.4)3mlに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とpH 7.2のリン酸緩衝液(Phosphate Buffred Saline(PBS):Na2HPO4(25.55g)/KH2PO4(2.72g)/NaN3(0.8g)/NaCl(35.4g))を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム(平均粒径100nm)10mlを調製した。
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝液(pH 8.4)3mlに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とpH 7.2のリン酸緩衝液(Phosphate Buffred Saline(PBS):Na2HPO4(25.55g)/KH2PO4(2.72g)/NaN3(0.8g)/NaCl(35.4g))を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム(平均粒径100nm)10mlを調製した。
(実施例2.リポソーム脂質膜面上の親水性化処理)
実施例1で調製したリポソーム溶液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH 8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3;Pierce Co.,USA)10mlを加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH 8.5)1mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間攪拌後、7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン上にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
実施例1で調製したリポソーム溶液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH 8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3;Pierce Co.,USA)10mlを加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH 8.5)1mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間攪拌後、7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン上にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
(実施例3.リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合)
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合は、既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)MethodsEnzymol.242,56−65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、はじめに、実施例2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1mlのTAPS緩衝液(pH
8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間攪拌し、次にPBS(pH 8.0)に2M NaBH3CN 100μlを加えて10℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。そして、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過をした後、HSA結合リポソーム液10mlを得た。
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合は、既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)MethodsEnzymol.242,56−65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、はじめに、実施例2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1mlのTAPS緩衝液(pH
8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間攪拌し、次にPBS(pH 8.0)に2M NaBH3CN 100μlを加えて10℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。そして、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過をした後、HSA結合リポソーム液10mlを得た。
(実施例4.糖鎖の調製)
以下の表4に示される糖鎖を使用した。
以下の表4に示される糖鎖を使用した。
各糖鎖の質量を計測し、以下の実施例5において使用するための前処理をした。2つ以上の糖鎖の組み合せを使用する場合、各糖鎖を混合した。
(実施例5.リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への糖鎖の結合)
実施例4において調整した各糖鎖50μgを、0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、実施例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。その結果、表2に示される糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
実施例4において調整した各糖鎖50μgを、0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、実施例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。その結果、表2に示される糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
以下の表10に、各糖鎖を用いた場合のリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への結合の結果を示す。特に明記しない限り、これらの糖鎖のリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミンへの結合は、実施例5と同様の方法および条件で行った。
(調製例1.リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの結合)
比較試料としてのリポソームを調製するために、実施例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの結合を行った。この工程で既に大過剰である13mgのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが存在するのでリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理も同時に完結した。その結果、最終産物である親水性化処理されたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム(略称:TRIS)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
比較試料としてのリポソームを調製するために、実施例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの結合を行った。この工程で既に大過剰である13mgのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが存在するのでリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理も同時に完結した。その結果、最終産物である親水性化処理されたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム(略称:TRIS)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
(調製例2:糖脂質リポソームの調製)
糖脂質リポソーム(FEE,EEで始まるもの、例えば、リポソーム番号3、リポソーム番号37、リポソーム番号67、リポソーム番号218など)は以下のように調製した。
糖脂質リポソーム(FEE,EEで始まるもの、例えば、リポソーム番号3、リポソーム番号37、リポソーム番号67、リポソーム番号218など)は以下のように調製した。
リポソームはコール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド(糖脂質糖鎖としてGM1を100%含むもの)及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mg添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝液(pH8.4)3mlに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液3mlを得た。このミセル懸濁液にPBS緩衝液(pH7.2)を加えて10mlにしてから、このミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co., USA)とTAPS緩衝液(pH8.4)を用いた限外濾過にかけ均一な親水性化処理をしてないリポソーム粒子懸濁液10mlを調製した。このリポソーム液にボルトンハンター試薬(BHR ; Pierce Co., USA)5mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で4時間反応させジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをBH化した後、PBS緩衝液(PH7.2)で限外濾過にかけた。その結果、比較試料としてのリポソーム(略称:EEGM1−BH)10ml(総脂質量45.6mg、平均粒子径100nm)が得られた。
(実施例6.リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理)
実施例5の手段により調製された糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のHSAタンパク質表面の親水性化処理を行った。糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された糖鎖結合リポソーム複合体各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)を得た。
実施例5の手段により調製された糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のHSAタンパク質表面の親水性化処理を行った。糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された糖鎖結合リポソーム複合体各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)を得た。
(実施例7.各種の糖鎖結合リポソーム複合体によるレクチン結合活性阻害効果の測定)
実施例5および実施例6の手段により調製した各糖鎖結合リポソーム複合体のin vitroでのレクチンのような細胞表面分子の結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999)Drug Delivery System,14,498−505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(例えば、E−selectin;R&D Systems Co.,USA;このレクチンは、目的とする臓器に応じて変更することが可能である。)を96穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(タンパク質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH 7.2)で3回洗浄した後、horseradish peroxidase(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、sulfo−NHS−biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon−30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を以下のように処理して計算した。
実施例5および実施例6の手段により調製した各糖鎖結合リポソーム複合体のin vitroでのレクチンのような細胞表面分子の結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999)Drug Delivery System,14,498−505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(例えば、E−selectin;R&D Systems Co.,USA;このレクチンは、目的とする臓器に応じて変更することが可能である。)を96穴マイクロプレートに固化定した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(タンパク質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH 7.2)で3回洗浄した後、horseradish peroxidase(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、sulfo−NHS−biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon−30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を以下のように処理して計算した。
IC20〜IC50についての模式図を図3〜6に示す。グラフ1としてSampleLY−1とIC50の実験結果を図2に示す。
図2に示すグラフは表16、表17をもとに作成したサンプルLY-1と系列IC50のグラフである。
グラフ1は表1をもとに作成したものである。X軸は対数メモリになっている。折れ線グラフ上の各点はサンプルLY−1の各Concentration (横軸)における測定値の平均の比を示す。サンプルによってcontrolの値が異なるので比較しやすいようにグラフの縦軸をhotとcoldの差を1としてその比で表す。Sample LY−1のグラフと系列IC50のグラフの交点のX座標がIC50の値である。交点は座標1(0.11,0.562)と座標2(0.33,0.414)を含む直線上にありその式はy=−0.673x+0.636となる。y=0.5(系列IC50の式)の 2本の直線の交点のx座標は0.202となる。この値を蛋白質の分子量69000で割り、さらにリポソーム1個あたりの蛋白質の個数300で割ると9.76E−09となる。
このようにして得られたデータ結果を以下に示す。
特に、関連が深い炎症部位および腫瘍部位について、さらに細かく調査した。
炎症部位
(腫瘍部位)
(実施例8.クロラミンT法による各種糖鎖結合リポソームの125I標識)
クロラミンT(Wako Pure Chemical Co.,Japan)溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ3mg/mlならびに5mg/mlとなるように用事調製して用いた。実施例6により調製した糖鎖結合リポソームならびにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン結合リポソームを50μlずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて125I−NaI(NEN Life Science Product,Inc.USA)を15μl、クロラミンT溶液を10μl加え反応させた。5分ごとにクロラミンT溶液10μlを加え、この操作を2回繰り返した後15分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム100μlを加え、反応を停止させた。次に、Sephadex G−50(Phramacia Biotech.Sweden)カラムクロマト上に乗せ、PBSで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性(4×106 Bq/mg protein)を調整して125I標識リポソーム液を得た。
クロラミンT(Wako Pure Chemical Co.,Japan)溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ3mg/mlならびに5mg/mlとなるように用事調製して用いた。実施例6により調製した糖鎖結合リポソームならびにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン結合リポソームを50μlずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて125I−NaI(NEN Life Science Product,Inc.USA)を15μl、クロラミンT溶液を10μl加え反応させた。5分ごとにクロラミンT溶液10μlを加え、この操作を2回繰り返した後15分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム100μlを加え、反応を停止させた。次に、Sephadex G−50(Phramacia Biotech.Sweden)カラムクロマト上に乗せ、PBSで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性(4×106 Bq/mg protein)を調整して125I標識リポソーム液を得た。
(実施例9.各種の糖鎖結合リポソーム複合体のマウスでの腸管から血中への移行量の測定)
一昼夜水分以外絶食した雄性ddYマウス(7週齢)に、実施例6により125I標識された糖鎖結合ならびにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン結合リポソーム複合体0.2mlをタンパク質量として3μg/一匹の割合になるように、マウス用経口ゾンデで腸管内に強制投与した後、10分後にネンブタール麻酔下で下大動脈より血液1mlを採血した。そして、血中の125I放射能をガンマーカウンター(Alola ARC300)で測定した。さらに、各種のリポソーム複合体の生体内安定性を調べる目的で、各血液の血清をSephadex G−50で再クロマトしたが、いずれも大半の放射能が高分子量のボイドフラクションにみられ、各種のリポソーム複合体は生体内においても安定性を有していた。なお、腸管から血中への放射能移行量は、投与全放射能に対する血液1ml当たりの放射能の割合(%投与量/ml血液)で表示した。この結果を以下の表19に示す。
一昼夜水分以外絶食した雄性ddYマウス(7週齢)に、実施例6により125I標識された糖鎖結合ならびにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン結合リポソーム複合体0.2mlをタンパク質量として3μg/一匹の割合になるように、マウス用経口ゾンデで腸管内に強制投与した後、10分後にネンブタール麻酔下で下大動脈より血液1mlを採血した。そして、血中の125I放射能をガンマーカウンター(Alola ARC300)で測定した。さらに、各種のリポソーム複合体の生体内安定性を調べる目的で、各血液の血清をSephadex G−50で再クロマトしたが、いずれも大半の放射能が高分子量のボイドフラクションにみられ、各種のリポソーム複合体は生体内においても安定性を有していた。なお、腸管から血中への放射能移行量は、投与全放射能に対する血液1ml当たりの放射能の割合(%投与量/ml血液)で表示した。この結果を以下の表19に示す。
(実施例10.糖鎖修飾リポソームの生体内動態検討)
投与したリポソームは、上記実施例で作製した糖鎖結合リポソームのうち、糖鎖結合リポソーム(以下糖鎖+リポソーム)および糖鎖の結合していないリポソーム(以下糖鎖−リポソーム)である。正常マウスに対し、糖鎖+リポソーム、糖鎖−リポソームを、それぞれ静脈注射または経口投与し、マウスの各臓器へのリポソームの集積を評価することを目的として行った。
投与したリポソームは、上記実施例で作製した糖鎖結合リポソームのうち、糖鎖結合リポソーム(以下糖鎖+リポソーム)および糖鎖の結合していないリポソーム(以下糖鎖−リポソーム)である。正常マウスに対し、糖鎖+リポソーム、糖鎖−リポソームを、それぞれ静脈注射または経口投与し、マウスの各臓器へのリポソームの集積を評価することを目的として行った。
実験は、正常マウス、並びに、担癌マウスに対して行った。その手順は以下のとおりである。各種の糖鎖修飾リポソーム、並びに、糖鎖修飾無しのリポソームの各組織への分布量の測定は、正常マウス、並びに、Ehrlich ascites tumor(EAT)細胞(約2×107個)を雄性ddYマウス(7週齢)大腿部皮下に移植し、癌組織が0.3〜0.6gに発育(6〜8日後)したものを本実験に用いた。これらのマウスに実施例8により125I標識した各種リポソーム0.2mlを蛋白質量として3μg/一匹の割合となるように経口投与、又は、尾静脈に注入投与し、10分、又は、5分後に組織(血液、肝臓、心臓、肺、膵臓、脳、癌組織、癌の周囲の炎症組織、小腸、大腸、リンパ節、骨髄、腎臓、脾臓、胸腺、筋肉)を摘出、各組織の放射能をガンマカウンタ(Aloka ARC 300)で測定した。なお、各組織への放射能分布量は、投与全放射能に対する各組織1g当たりの放射能の割合(%投与量/g組織)を計測した。そして、糖鎖修飾リポソーム、並びに、糖鎖の代わりにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを結合させたリポソーム(基準リポソーム)を経口投与、又は静脈投与後に、血中又は各組織に送達された糖鎖修飾リポソームでの4匹の計測平均値と基準リポソームでの4匹の計測平均値との倍率を計算して、経口投与後の血中への移行性、並びに、各臓器への標的指向性を表20Aの定義に従って評価した。この結果を以下の表20Bに示す。
表14並びに表15Bは、各種の放射性糖鎖修飾リポソームの経口投与並びに静注投与でのマウスにおける各組織への放射性糖鎖リポソームの集積効果を示す評価結果である。これらの結果は、この糖鎖修飾リポソームがリガンドとしての糖鎖の機能を活用して、疾患患部や各種臓器へ薬物や蛍光物質や放射標識物質などをアクティブターゲティングにより高効率に集積・送達することを示すものである。従って、本発明の糖鎖修飾リポソームは、腫瘍などの標的組織での集積を可視化できるので、治療用薬剤送達媒体としての利用とともに、研究試薬や診断薬などとしての利用への送達媒体をも提供する。
(実施例11.抗癌剤ドキソルビシン封入リポソームの調製)
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)10mlに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液10mlを得た。このミセル懸濁液にTAPS緩衝液(pH8.4)で3mg/1mlになるよう完全に溶解した抗癌剤ドキソルビシンを撹拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このドキソルビシン入りミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)を用いた限外濾過にかけ均一な抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム粒子懸濁液10mlを調製した。
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)10mlに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液10mlを得た。このミセル懸濁液にTAPS緩衝液(pH8.4)で3mg/1mlになるよう完全に溶解した抗癌剤ドキソルビシンを撹拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このドキソルビシン入りミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)を用いた限外濾過にかけ均一な抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム粒子懸濁液10mlを調製した。
得られた生理食塩懸濁液中(37℃)の抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置(Model Nano ZS,MalvernInstruments Ltd,,UK)により測定した結果、粒子径は50〜350nm、ゼータ電位は−30〜−10mVであった。
(実施例12.抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム脂質膜面上の親水性化処理)
実施例11で調製した抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム溶液10m1をXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3;Pierce Co.,USA)10m1を加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩撹拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH8.5)1mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間撹拌後、7℃で一晩撹拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン上にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
実施例11で調製した抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム溶液10m1をXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3;Pierce Co.,USA)10m1を加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩撹拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH8.5)1mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間撹拌後、7℃で一晩撹拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン上にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
(実施例13.抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合)
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合は、既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)MethodsEnzymol.242,56−65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、まずはじめに、実施例2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1m1のTAPS緩衝液(pH8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間撹拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間撹拌し、次にPBS(pH8.0)に2M NaBH3CN 100μ1を加えて10℃で一晩撹拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。そして、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過をした後、HSA結合抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム液10mlを得た。
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合は、既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)MethodsEnzymol.242,56−65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、まずはじめに、実施例2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1m1のTAPS緩衝液(pH8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間撹拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間撹拌し、次にPBS(pH8.0)に2M NaBH3CN 100μ1を加えて10℃で一晩撹拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。そして、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過をした後、HSA結合抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム液10mlを得た。
(実施例14.糖鎖の調整)
実施例4と同様の手順により糖鎖を調整した。
実施例4と同様の手順により糖鎖を調整した。
(実施例15.抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への糖鎖の結合とリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理)
実施例14において調整した各糖鎖50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して各糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、実施例13で得た抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジル)プロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩撹拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩撹拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに各糖鎖の結合を行った。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩撹拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。その結果、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をしたリポソームを得た。その結果、各糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をした抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg)が得られた。
実施例14において調整した各糖鎖50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して各糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、実施例13で得た抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジル)プロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩撹拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩撹拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに各糖鎖の結合を行った。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩撹拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。その結果、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をしたリポソームを得た。その結果、各糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をした抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg)が得られた。
得られた生理食塩懸濁液中(37℃)の抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置(Model Nano ZS,Malvern Instruments Ltd,,UK)により測定した結果、粒子径は50〜350nm、ゼータ電位は−30〜−10mVであった。
(比較例.抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの結合によるリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理)
比較試料としての抗癌剤ドキソルビシン封入リポソームを調製するために、実施例13で得た抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジル)プロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩撹拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理リポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間撹拌し、その後7℃で一晩撹拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。その結果、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をした比較試料としての抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム(略称:DX−TRIS)2m1(総脂質量2mg、総蛋白量200μg)が得られた。
比較試料としての抗癌剤ドキソルビシン封入リポソームを調製するために、実施例13で得た抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジル)プロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩撹拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理リポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間撹拌し、その後7℃で一晩撹拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。その結果、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をした比較試料としての抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム(略称:DX−TRIS)2m1(総脂質量2mg、総蛋白量200μg)が得られた。
得られた生理食塩懸濁液中(37℃)の抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置(Model Nano ZS,Malvern Instruments Ltd.,UK)により測定した結果、粒子径は50〜350nm、ゼータ電位は−30〜−10mVであった。
(実施例16.リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理)
実施例15の手段により調製された糖鎖が結合したリポソームについて、以下の手順によりリポソーム上のHSA蛋白質表面の親水性化処理を行った。糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された糖鎖結合リポソーム複合体各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)を得た。
実施例15の手段により調製された糖鎖が結合したリポソームについて、以下の手順によりリポソーム上のHSA蛋白質表面の親水性化処理を行った。糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された糖鎖結合リポソーム複合体各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)を得た。
(実施例17.各種の糖鎖結合リポソーム複合体によるレクチン結合活性阻害効果の測定)
実施例16の手段により調製した各糖鎖結合リポソーム複合体のインビトロでのレクチン結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999)Drug Delivery
System,14,498−505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(E−selectin;R&D Systems Co.,USA)を96穴マイクロプレートに固定化した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(蛋白質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH 7.2)で3回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、sulfo−NHS−biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon−30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を以下の表21に示す。
実施例16の手段により調製した各糖鎖結合リポソーム複合体のインビトロでのレクチン結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999)Drug Delivery
System,14,498−505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(E−selectin;R&D Systems Co.,USA)を96穴マイクロプレートに固定化した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(蛋白質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH 7.2)で3回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、sulfo−NHS−biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon−30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。この測定結果を以下の表21に示す。
特に、関連が深い炎症部位および腫瘍部位について、さらに細かく調査した。
炎症部位
(腫瘍部位)
(実施例18.クロラミンT法による各種糖鎖結合リポソームの125I標識)
クロラミンT(Wako Pure Chemical Co.,Japan)溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ3mg/mlならびに5mg/mlとなるように用事調製して用いた。実施例16により調製した糖鎖結合リポソームならびにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン結合リポソームを各50μlずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて125I−NaI(NEN Life Science Product,Inc.USA)を15μl、クロラミンT溶液を10μl加え反応させた。5分ごとにクロラミンT溶液10μlを加え、この操作を2回繰り返した後15分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム100μlを加え、反応を停止させた。次に、Sephadex G−50(Phramacia Biotech.Sweden)カラムクロマト上に乗せ、PBSで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性(4×106 Bq/mg protein)を調整して125I標識リポソーム液を得た。
クロラミンT(Wako Pure Chemical Co.,Japan)溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ3mg/mlならびに5mg/mlとなるように用事調製して用いた。実施例16により調製した糖鎖結合リポソームならびにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン結合リポソームを各50μlずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて125I−NaI(NEN Life Science Product,Inc.USA)を15μl、クロラミンT溶液を10μl加え反応させた。5分ごとにクロラミンT溶液10μlを加え、この操作を2回繰り返した後15分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム100μlを加え、反応を停止させた。次に、Sephadex G−50(Phramacia Biotech.Sweden)カラムクロマト上に乗せ、PBSで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性(4×106 Bq/mg protein)を調整して125I標識リポソーム液を得た。
(実施例19.各種の糖鎖結合リポソーム複合体のマウスでの腸管から血中への移行量の測定)
一昼夜水分以外絶食した雄性ddYマウス(7週齢)に、実施例17により125I標識された糖鎖結合ならびにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン結合リポソーム複合体0.2mlをタンパク質量として3μg/一匹の割合になるように、マウス用経口ゾンデで腸管内に強制投与した後、10分後にネンブタール麻酔下で下大動脈より血液1mlを採血した。そして、血中の125I放射能をガンマーカウンター(Alola ARC300)で測定した。さらに、各種のリポソーム複合体の生体内安定性を調べる目的で、各血液の血清をSephadex G−50で再クロマトしたが、いずれも大半の放射能が高分子量のボイドフラクションにみられ、各種のリポソーム複合体は生体内においても安定性を有していた。なお、腸管から血中への放射能移行量は、投与全放射能に対する血液1ml当たりの放射能の割合(%投与量/ml血液)で表示した。この結果を表22に示す。
一昼夜水分以外絶食した雄性ddYマウス(7週齢)に、実施例17により125I標識された糖鎖結合ならびにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン結合リポソーム複合体0.2mlをタンパク質量として3μg/一匹の割合になるように、マウス用経口ゾンデで腸管内に強制投与した後、10分後にネンブタール麻酔下で下大動脈より血液1mlを採血した。そして、血中の125I放射能をガンマーカウンター(Alola ARC300)で測定した。さらに、各種のリポソーム複合体の生体内安定性を調べる目的で、各血液の血清をSephadex G−50で再クロマトしたが、いずれも大半の放射能が高分子量のボイドフラクションにみられ、各種のリポソーム複合体は生体内においても安定性を有していた。なお、腸管から血中への放射能移行量は、投与全放射能に対する血液1ml当たりの放射能の割合(%投与量/ml血液)で表示した。この結果を表22に示す。
(実施例20.糖鎖修飾リポソームの生体内動態検討)
投与したリポソームは、上記実施例で作製した糖鎖結合リポソームのうち、糖鎖結合リポソーム(以下、糖鎖+リポソーム)および糖鎖の結合していないリポソーム(以下、糖鎖−リポソーム)である。正常マウスに対し、糖鎖+リポソーム、糖鎖−リポソームをそれぞれ経口投与し、マウスの各臓器へのリポソームの集積を評価することを目的として行う。
投与したリポソームは、上記実施例で作製した糖鎖結合リポソームのうち、糖鎖結合リポソーム(以下、糖鎖+リポソーム)および糖鎖の結合していないリポソーム(以下、糖鎖−リポソーム)である。正常マウスに対し、糖鎖+リポソーム、糖鎖−リポソームをそれぞれ経口投与し、マウスの各臓器へのリポソームの集積を評価することを目的として行う。
あらかじめ調製したリポソーム溶液をマウスに経口投与し、その後、全各臓器を摘出する。各臓器は1% Triton X溶液と、HG30ホモゲナイザー(日立工機)を用いて組織ホモジネートとして調製の後、100%メタノールとクロロホルムを用いて組織ホモジネでトに含まれるリポソームを抽出する。リポソーム量は、リポソームに結合したFITCの蛍光強度を蛍光マイクロプレートリーダーBiolumin960(モレキュラーダイナミック社)を用いて行い、490nmのexitationと520nmのemissionで計測する。結果は、経口投与については、経口のみについてのデータを示し、他の臓器については、静脈注射のデータを示す。経口についても、経口投与により血中に移行した媒体は静脈注射と同様の傾向を示した。
(実施例21:抗癌剤ドキソルビシン封入リポソームの調製) リポソームはコール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mg添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)10mlに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液10m1を得た。このミセル懸濁液にTAPS緩衝液(pH8.4)で3mg/1mlになるよう完全に溶解した抗癌剤ドキソルビシンを撹拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このドキソルビシン入りミセル懸濁液をPM10膜(AmiconCo.,USA)とTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)を用いた限外濾過にかけ均一な抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム粒子懸濁液10mlを調製した。得られた生理食塩懸濁液中(37℃)の抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム粒子の粒子径とゼ一夕電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置(ModelNanoZS,MalvernInstrumentsLtd,,UK)により測定した結果、粒子径は50〜350nm、ゼータ電位は−30〜−10mVであった。
(実施例22A.各種の糖鎖結合リポソーム複合体の経口投与による担癌マウスでの制癌効果の測定)
(1)担癌マウスにおける尾静注投与による制癌効果
担癌マウスの作成は、ddY系7週齢マウス(雄性、体重35〜40g)の背部毛髪を電動バリカンで剃り、皮下にEhrlich Ascites Tumor(細胞約5x106個/匹)を移殖した。10日間程飼育・観察を行い、癌細胞の生着したものを選び実験に用いた。薬物投与並びに癌の体積測定は、投与薬剤として封入されたドキソルビシン濃度を0.0625mg/kgに調製したドキソルビシン封入リポソーム番号155投与群とコントロールとして生理食塩水投与群の2種類とし、担癌マウスに尾静脈投与を週4回、2週間投与した。癌細胞移植後10日目から、週2回の頻度で、4週間、ノギスを用いて癌の長径と短径を測定し、以下の式より癌の増殖体積を算出した。
(1)担癌マウスにおける尾静注投与による制癌効果
担癌マウスの作成は、ddY系7週齢マウス(雄性、体重35〜40g)の背部毛髪を電動バリカンで剃り、皮下にEhrlich Ascites Tumor(細胞約5x106個/匹)を移殖した。10日間程飼育・観察を行い、癌細胞の生着したものを選び実験に用いた。薬物投与並びに癌の体積測定は、投与薬剤として封入されたドキソルビシン濃度を0.0625mg/kgに調製したドキソルビシン封入リポソーム番号155投与群とコントロールとして生理食塩水投与群の2種類とし、担癌マウスに尾静脈投与を週4回、2週間投与した。癌細胞移植後10日目から、週2回の頻度で、4週間、ノギスを用いて癌の長径と短径を測定し、以下の式より癌の増殖体積を算出した。
癌体積(mm3)=(長径+短径2)/2
この結果を図1に示す。ドキソルビシン封入リポソーム番号155投与群とコントロールとして生理食塩水投与群の腫瘍の増殖体積の変化を各群で比較した結果、極めて少ない投与量にもかかわらず、ドキソルビシン封入リポソーム番号155投与群の癌の増殖抑制効果は、顕著で投与開始から癌の増殖が抑えられた。最終測定日である移植34日目における癌組織の大きさ(体積)を比較すると、ドキソルビシン封入リポソーム番号155投与群は生理食塩水投与群と比較し有意な抑制作用がみられた。これらの結果は、この制癌剤封入・糖鎖修飾リポソームが、極めて少ない薬剤投与量で強い制癌効果を有することを示すものである(図7)。
この結果を図1に示す。ドキソルビシン封入リポソーム番号155投与群とコントロールとして生理食塩水投与群の腫瘍の増殖体積の変化を各群で比較した結果、極めて少ない投与量にもかかわらず、ドキソルビシン封入リポソーム番号155投与群の癌の増殖抑制効果は、顕著で投与開始から癌の増殖が抑えられた。最終測定日である移植34日目における癌組織の大きさ(体積)を比較すると、ドキソルビシン封入リポソーム番号155投与群は生理食塩水投与群と比較し有意な抑制作用がみられた。これらの結果は、この制癌剤封入・糖鎖修飾リポソームが、極めて少ない薬剤投与量で強い制癌効果を有することを示すものである(図7)。
図7は、ドキソルビシン封入リポソーム番号155の尾静注投与での担癌マウスにおける制癌効果を示す図である。
(2)蛍光顕微鏡を用いた尾静注投与での癌組織へのドキソルビシンの移行の観察
蛍光顕微鏡による観察は、担癌マウスの癌部位の皮膚を切除し、癌組織を露出させスライドガラスに癌部位を固定させた。蛍光顕微鏡のステージ上にマウスを乗せて癌組織周囲血管の探索を行い、血管像が明瞭に観察できる位置を決定した。脂質濃度として2mg/mL、ドキソルビシン濃度として0.025mg/mLとしたドキソルビシン封入リポソーム番号155を0.2ml尾静脈内に投与した。投与直後からの癌組織へのドキソルビシンの集積を蛍光顕微鏡で観察した。修飾糖前投与による阻害実験については、ドキソルビシン封入リポソーム番号155投与5分前に修飾糖鎖(α1−6マンノビオース)溶液(60mM)を0.2mL投与し、上記と同様な方法により観察を行った。その結果を写真1に示す。ドキソルビシン封入リポソーム番号155投与後、直ちに癌組織周辺血管でのドキソルビシンの蛍光が観察された。投与後5分では血管壁部にドキソルビシンの赤色蛍光が観察された。その後、時間の経過と共に組織へのドキソルビシンの移行が観察され、2時間後には、癌血管周囲の腫瘍組織内部にドキソルビシンの蛍光がみられた。修飾糖鎖の前投与により、ドキソルビシン封入リポソーム番号155の腫瘍組織への集積が完全にブロックされて、ドキソルビシン封入リポソーム番号155投与直後からの血管壁からの蛍光は見られなかった。これらの結果は、この糖鎖修飾リポソームがリガンドとしての糖鎖の機能を活用して、疾患患部や各種臓器へ薬物や蛍光物質や放射標識物質などをアクティブターゲティングにより高効率に集積・送達することを示すものである(図8)。
(2)蛍光顕微鏡を用いた尾静注投与での癌組織へのドキソルビシンの移行の観察
蛍光顕微鏡による観察は、担癌マウスの癌部位の皮膚を切除し、癌組織を露出させスライドガラスに癌部位を固定させた。蛍光顕微鏡のステージ上にマウスを乗せて癌組織周囲血管の探索を行い、血管像が明瞭に観察できる位置を決定した。脂質濃度として2mg/mL、ドキソルビシン濃度として0.025mg/mLとしたドキソルビシン封入リポソーム番号155を0.2ml尾静脈内に投与した。投与直後からの癌組織へのドキソルビシンの集積を蛍光顕微鏡で観察した。修飾糖前投与による阻害実験については、ドキソルビシン封入リポソーム番号155投与5分前に修飾糖鎖(α1−6マンノビオース)溶液(60mM)を0.2mL投与し、上記と同様な方法により観察を行った。その結果を写真1に示す。ドキソルビシン封入リポソーム番号155投与後、直ちに癌組織周辺血管でのドキソルビシンの蛍光が観察された。投与後5分では血管壁部にドキソルビシンの赤色蛍光が観察された。その後、時間の経過と共に組織へのドキソルビシンの移行が観察され、2時間後には、癌血管周囲の腫瘍組織内部にドキソルビシンの蛍光がみられた。修飾糖鎖の前投与により、ドキソルビシン封入リポソーム番号155の腫瘍組織への集積が完全にブロックされて、ドキソルビシン封入リポソーム番号155投与直後からの血管壁からの蛍光は見られなかった。これらの結果は、この糖鎖修飾リポソームがリガンドとしての糖鎖の機能を活用して、疾患患部や各種臓器へ薬物や蛍光物質や放射標識物質などをアクティブターゲティングにより高効率に集積・送達することを示すものである(図8)。
図8は、ドキソルビシン封入リポソーム番号155の尾静注投与での担癌マウスにおける腫瘍血管から腫瘍組織並びに細胞へのドキソルビシンの集積効果を示す蛍光顕微鏡写真である。左側並びに右側の画像は、同一腫瘍組織・細胞のそれぞれ緑色並びに赤色の蛍光顕微鏡写真であって、緑色(左側の画像)は、血管、組織並びに細胞の自然蛍光を示し、赤色(右側の画像)は、蛍光物質であるドキソルビシンの腫瘍組織並びに癌細胞中での蛍光を示す。これらの結果は、この糖鎖修飾リポソームがリガンドとしての糖鎖の機能を活用して、疾患患部や各種臓器へ薬物や蛍光物質や放射標識物質などをアクティブターゲティングにより高効率に集積・送達することを示すものである。従って、本発明の糖鎖修飾リポソームは、腫瘍などの標的組織での集積を可視化できるので、治療用薬剤送達媒体としての利用とともに、研究試薬や診断薬などとしての利用への送達媒体をも提供する。
(実施例22B:各種の糖鎖結合リポソーム複合体の経口投与による担癌マウスでの制癌効果の測定)
(1)担癌マウスにおける経口投与による制癌効果
担癌マウスの作成は、ddY系7週齢マウス(雄性、体重35〜40g)の背部毛髪を電動バリカンで剃り、皮下にEhrlich Ascites Tumor(細胞約5x106個/匹)を移殖した。10日間程飼育・観察を行い、癌細胞の生着したものを選び実験に用いた。薬物投与並びに癌の体積測定は、投与薬剤として封入されたドキソルビシン濃度を0.375mg/kgに調製したドキソルビシン封入リポソーム番号237投与群とコントロールとして生理食塩水投与群の2種類とし、担癌マウスに経口投与を週4回、2週間投与した。癌細胞移植後10日目から、週2回の頻度で、4週間、ノギスを用いて癌の長径と短径を測定し、以下の式より癌の増殖体積を算出した。癌体積(mm3)=(長径+短径2)/2 この結果を図1に示す。ドキソルビシン封入リポソーム番号237投与群とコントロールとして生理食塩水投与群の腫瘍の増殖体積の変化を各群で比較した結果、極めて少ない投与量にもかかわらず、ドキソルビシン封入リポソーム番号237投与群の癌の増殖抑制効果は、顕著で投与開始から癌の増殖が抑えられた。最終測定日である移植34日目における癌組織の大きさ(体積)を比較すると、ドキソルビシン封入リポソーム番号237投与群は生理食塩水投与群と比較し有意な抑制作用がみられた。これらの結果は、この制癌剤封入・糖鎖修飾リポソームが、極めて少ない薬剤投与量で強い制癌効果を有することを示すものである(図9)。
(1)担癌マウスにおける経口投与による制癌効果
担癌マウスの作成は、ddY系7週齢マウス(雄性、体重35〜40g)の背部毛髪を電動バリカンで剃り、皮下にEhrlich Ascites Tumor(細胞約5x106個/匹)を移殖した。10日間程飼育・観察を行い、癌細胞の生着したものを選び実験に用いた。薬物投与並びに癌の体積測定は、投与薬剤として封入されたドキソルビシン濃度を0.375mg/kgに調製したドキソルビシン封入リポソーム番号237投与群とコントロールとして生理食塩水投与群の2種類とし、担癌マウスに経口投与を週4回、2週間投与した。癌細胞移植後10日目から、週2回の頻度で、4週間、ノギスを用いて癌の長径と短径を測定し、以下の式より癌の増殖体積を算出した。癌体積(mm3)=(長径+短径2)/2 この結果を図1に示す。ドキソルビシン封入リポソーム番号237投与群とコントロールとして生理食塩水投与群の腫瘍の増殖体積の変化を各群で比較した結果、極めて少ない投与量にもかかわらず、ドキソルビシン封入リポソーム番号237投与群の癌の増殖抑制効果は、顕著で投与開始から癌の増殖が抑えられた。最終測定日である移植34日目における癌組織の大きさ(体積)を比較すると、ドキソルビシン封入リポソーム番号237投与群は生理食塩水投与群と比較し有意な抑制作用がみられた。これらの結果は、この制癌剤封入・糖鎖修飾リポソームが、極めて少ない薬剤投与量で強い制癌効果を有することを示すものである(図9)。
図9は、ドキソルビシン封入リポソーム番号237の経口投与での担癌マウスにおける制癌効果を示す図である。
(2)蛍光顕微鏡を用いた経口投与での癌組織へのドキソルビシンの移行の観察
蛍光顕微鏡による観察は、担癌マウスの癌部位の皮膚を切除し、癌組織を露出させスライドガラスに癌部位を固定させた。蛍光顕微鏡のステージ上にマウスを乗せて癌組織周囲血管の探索を行い、血管像が明瞭に観察できる位置を決定した。脂質濃度として4mg/mL、ドキソルビシン濃度として0.050mg/mLとしたドキソルビシン封入リポソーム番号237を0.3ml経口投与した。投与直後からの癌組織へのドキソルビシンの集積を蛍光顕微鏡で観察した。修飾糖前投与による阻害実験については、ドキソルビシン封入リポソーム番号237投与5分前に修飾糖鎖(α1−3マンノビオース)溶液(60mM)を0.3mL投与し、上記と同様な方法により観察を行った。その結果を写真1に示す。ドキソルビシン封入リポソーム番号237投与後、時間の経過と共に組織へのドキソルビシンの移行が観察され、6時間後には、癌血管周囲の腫瘍組織内部にドキソルビシンの蛍光がみられた。修飾糖鎖の前投与により、ドキソルビシン封入リポソーム番号237の腫瘍組織への集積が完全にブロックされて、ドキソルビシン封入リポソーム番号237投与直後からの血管壁からの蛍光は見られなかった。これらの結果は、この糖鎖修飾リポソームがリガンドとしての糖鎖の機能を活用して、疾患患部や各種臓器へ薬物や蛍光物質や放射標識物質などをアクティブターゲティングにより高効率に集積・送達することを示すものである(図10)。
(2)蛍光顕微鏡を用いた経口投与での癌組織へのドキソルビシンの移行の観察
蛍光顕微鏡による観察は、担癌マウスの癌部位の皮膚を切除し、癌組織を露出させスライドガラスに癌部位を固定させた。蛍光顕微鏡のステージ上にマウスを乗せて癌組織周囲血管の探索を行い、血管像が明瞭に観察できる位置を決定した。脂質濃度として4mg/mL、ドキソルビシン濃度として0.050mg/mLとしたドキソルビシン封入リポソーム番号237を0.3ml経口投与した。投与直後からの癌組織へのドキソルビシンの集積を蛍光顕微鏡で観察した。修飾糖前投与による阻害実験については、ドキソルビシン封入リポソーム番号237投与5分前に修飾糖鎖(α1−3マンノビオース)溶液(60mM)を0.3mL投与し、上記と同様な方法により観察を行った。その結果を写真1に示す。ドキソルビシン封入リポソーム番号237投与後、時間の経過と共に組織へのドキソルビシンの移行が観察され、6時間後には、癌血管周囲の腫瘍組織内部にドキソルビシンの蛍光がみられた。修飾糖鎖の前投与により、ドキソルビシン封入リポソーム番号237の腫瘍組織への集積が完全にブロックされて、ドキソルビシン封入リポソーム番号237投与直後からの血管壁からの蛍光は見られなかった。これらの結果は、この糖鎖修飾リポソームがリガンドとしての糖鎖の機能を活用して、疾患患部や各種臓器へ薬物や蛍光物質や放射標識物質などをアクティブターゲティングにより高効率に集積・送達することを示すものである(図10)。
図10は、ドキソルビシン封入リポソーム番号237の尾静注投与での担癌マウスにおける腫瘍血管から腫瘍組織並びに細胞へのドキソルビシンの集積効果を示す蛍光顕微鏡写真である。左側並びに右側の画像は、同一腫瘍組織・細胞のそれぞれ緑色並びに赤色の蛍光顕微鏡写真であって、緑色(左側の画像)は、血管、組織並びに細胞の自然蛍光を示し、赤色(右側の画像)は、蛍光物質であるドキソルビシンの腫瘍組織並びに癌細胞中での蛍光を示す。これらの結果は、この糖鎖修飾リポソームがリガンドとしての糖鎖の機能を活用して、疾患患部や各種臓器へ薬物や蛍光物質や放射標識物質などをアクティブターゲティングにより高効率に集積・送達することを示すものである。従って、本発明の糖鎖修飾リポソームは、腫瘍などの標的組織での集積を可視化できるので、治療用薬剤送達媒体としての利用とともに、研究試薬や診断薬などとしての利用への送達媒体をも提供する。
(実施例23:ローリングモデルに基づく投与に適した糖鎖修飾リポソームの調製)
実施例7に基づいて決定されたE−セレクチンでの測定結果を、以下に本発明のローリングモデルを用いて、模式化する。
実施例7に基づいて決定されたE−セレクチンでの測定結果を、以下に本発明のローリングモデルを用いて、模式化する。
代表的なIC10、IC20、IC30、IC40、IC50、IC60について計算するために用いたグラフを示す(代表的には、図2〜6を参照)。
次に、これらで求めたIC10などをインビボ親和性と比較した。その結果を以下の表に示す。表には、代表的に、腫瘍および炎症部位についての結果を載せる。
その結果、例えば、代表的にE−セレクチンの場合約IC30〜IC31の間に強結合と弱結合との閾値があることが明らかになった。他のレクチンでも同様の閾値があることが期待される。
さらに、所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、約IC30以下の強結合ICの阻害濃度が10−9M以下(好ましくは、5×10−10以下)であり、かつ、約IC31以上の弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上(好ましくは、5×10−8M以上、10−8M以上)であることも明らかになった。
E−セレクチンは、経口投与、肝臓、小腸、大腸、リンパ節、肝臓、心臓、膵臓、炎症部位および癌部位において発現が顕著であり、特に、炎症部位および癌部位において顕著で特徴的であることから、これらの臓器に対するインビトロの簡易ローリングモデルアッセイにおいてE−セレクチンを使用し得ることが明らかになった。これらの結果を元に、以下、送達媒体を作製する。
(1.リポソームの調製)
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝液(pH 8.4)3mlに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とPBS緩衝液(pH 7.2)を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム(平均粒径100nm)10mlを調製した。
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝液(pH 8.4)3mlに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得た。さらに、ミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とPBS緩衝液(pH 7.2)を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム(平均粒径100nm)10mlを調製した。
(2.リポソーム脂質膜面上の親水性化処理)
上記1.において調製したリポソーム溶液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH 8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3;Pierce Co.,USA)10mlを加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH 8.5)1mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間攪拌後、7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン上にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
上記1.において調製したリポソーム溶液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH 8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3;Pierce Co.,USA)10mlを加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH 8.5)1mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間攪拌後、7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン上にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
(3.リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合)
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合は、既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)MethodsEnzymol.242,56−65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、はじめに、上記2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1mlのTAPS緩衝液(pH 8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間攪拌し、次にPBS(pH 8.0)に2M NaBH3CN 100μlを加えて10℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。そして、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過をした後、HSA結合リポソーム液10mlを得た。
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合は、既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)MethodsEnzymol.242,56−65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、はじめに、上記2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1mlのTAPS緩衝液(pH 8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間攪拌し、次にPBS(pH 8.0)に2M NaBH3CN 100μlを加えて10℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。そして、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過をした後、HSA結合リポソーム液10mlを得た。
(4.糖鎖の調整)
糖鎖を実施例4と同じ手順で調整した。
糖鎖を実施例4と同じ手順で調整した。
(5.1.リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への糖鎖の結合)
4.において調整した各糖鎖50μgを、0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、実施例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。その結果、表2に示される糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。特に明記しない限り、これらの糖鎖のリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミンへの結合は、実施例5と同様の方法および条件で行った。
4.において調整した各糖鎖50μgを、0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して、各糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、実施例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。その結果、表2に示される糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。特に明記しない限り、これらの糖鎖のリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミンへの結合は、実施例5と同様の方法および条件で行った。
(5.2.リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの結合)
比較試料としてのリポソームを調製するために、実施例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。この工程で既に大過剰である13mgのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが存在するのでリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理も同時に完結した。その結果、最終産物である親水性化処理されたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム(略称:TRIS)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
比較試料としてのリポソームを調製するために、実施例3で得たリポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩攪拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩攪拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。この工程で既に大過剰である13mgのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが存在するのでリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理も同時に完結した。その結果、最終産物である親水性化処理されたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合した比較試料としてのリポソーム(略称:TRIS)2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)が得られた。
(6.リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上の親水性化処理)
上記5.1の手段により調製された糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のHSA蛋白質表面の親水性化処理を行った。糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH
7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された糖鎖結合リポソーム複合体各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)を得た。
上記5.1の手段により調製された糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のHSA蛋白質表面の親水性化処理を行った。糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH
7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された糖鎖結合リポソーム複合体各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)を得た。
(7.)
上述のようにして作製されたE−セレクチンに対応する臓器への送達に適合した組成物
を作製することができた。これらの組成物は、実際に上記実施例のように試験すると、インビボにおいて所望の臓器に首尾よく送達されることが分かる。
上述のようにして作製されたE−セレクチンに対応する臓器への送達に適合した組成物
を作製することができた。これらの組成物は、実際に上記実施例のように試験すると、インビボにおいて所望の臓器に首尾よく送達されることが分かる。
(実施例25.経口投与に適した抗癌剤ドキソルビシン封入リポソームの調製)
E-セレクチンは、経口投与による抗癌剤の指標でもあることから、ローリングモデルに基づいて最適な化合物について、以下に抗癌剤ドキソルビシン封入リポソームを調製し、実際に抗癌作用があるかどうか確認した。
E-セレクチンは、経口投与による抗癌剤の指標でもあることから、ローリングモデルに基づいて最適な化合物について、以下に抗癌剤ドキソルビシン封入リポソームを調製し、実際に抗癌作用があるかどうか確認した。
(1.抗癌剤ドキソルビシン封入リポソームの調製)
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)10mlに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液10mlを得た。このミセル懸濁液にTAPS緩衝液(pH8.4)で3mg/1mlになるよう完全に溶解した抗癌剤ドキソルビシンを撹拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このドキソルビシン入りミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)を用いた限外濾過にかけ均一な抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム粒子懸濁液10mlを調製した。
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)10mlに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液10mlを得た。このミセル懸濁液にTAPS緩衝液(pH8.4)で3mg/1mlになるよう完全に溶解した抗癌剤ドキソルビシンを撹拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このドキソルビシン入りミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)を用いた限外濾過にかけ均一な抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム粒子懸濁液10mlを調製した。
得られた生理食塩懸濁液中(37℃)の抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置(Model Nano ZS,MalvernInstruments Ltd,,UK)により測定した結果、粒子径は50〜350nm、ゼータ電位は−30〜−10mVであった。
(2.抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム脂質膜面上の親水性化処理)
上記1で調製した抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム溶液10m1をXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3;Pierce Co.,USA)10m1を加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩撹拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH8.5)1mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間撹拌後、7℃で一晩撹拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン上にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
上記1で調製した抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム溶液10m1をXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にした。次に、架橋試薬ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3;Pierce Co.,USA)10m1を加え、25℃で2時間攪拌した。その後、更に7℃で一晩撹拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過にかけた。次に、CBS緩衝液(pH8.5)1mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間撹拌後、7℃で一晩撹拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結した。これにより、抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜の脂質ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン上にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化された。
(3.抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合)
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合は、既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)MethodsEnzymol.242,56−65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、まずはじめに、上記2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1m1のTAPS緩衝液(pH8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間撹拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間撹拌し、次にPBS(pH8.0)に2M
NaBH3CN 100μ1を加えて10℃で一晩撹拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。そして、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過をした後、HSA結合抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム液10mlを得た。
リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合は、既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)MethodsEnzymol.242,56−65)により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は2段階化学反応で行い、まずはじめに、上記2で得られた10mlのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを1m1のTAPS緩衝液(pH8.4)に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム43mgを加えて室温で2時間撹拌して過ヨウ素酸酸化した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH8.0)で限外濾過することにより酸化されたリポソーム10mlを得た。このリポソーム液に、20mgのヒト血清アルブミン(HSA)を加えて25℃で2時間撹拌し、次にPBS(pH8.0)に2M
NaBH3CN 100μ1を加えて10℃で一晩撹拌してリポソーム上のガングリオシドとHSAとのカップリング反応でHSAを結合した。そして、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過をした後、HSA結合抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム液10mlを得た。
(4.糖鎖の調整)
実施例4と同様の手順により糖鎖を調整した。
実施例4と同様の手順により糖鎖を調整した。
(5.1.抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への糖鎖の結合)
上記4において調整した各糖鎖50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して各糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、実施例13で得た抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジル)プロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩撹拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩撹拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに各糖鎖の結合を行った。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩撹拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。その結果、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をしたリポソームを得た。その結果、各糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をした抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg)が得られた。
上記4において調整した各糖鎖50μgを0.25gのNH4HCO3を溶かした0.5ml水溶液に加え、37℃で3日間攪拌した後、0.45μmのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して各糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを得た。次に、実施例13で得た抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジル)プロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩撹拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液に上記の糖鎖のグリコシルアミン化合物50μgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩撹拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPに各糖鎖の結合を行った。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間攪拌し、その後7℃で一晩撹拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。その結果、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をしたリポソームを得た。その結果、各糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をした抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg)が得られた。
得られた生理食塩懸濁液中(37℃)の抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置(Model Nano ZS,Malvern Instruments Ltd,,UK)により測定した結果、粒子径は50〜350nm、ゼータ電位は−30〜−10mVであった。
(5.2.抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上へのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの結合)
比較試料としての抗癌剤ドキソルビシン封入リポソームを調製するために、実施例13で得た抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジル)プロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩撹拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理リポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間撹拌し、その後7℃で一晩撹拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。その結果、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をした比較試料としての抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム(略称:DX−TRIS)2m1(総脂質量2mg、総蛋白量200μg)が得られた。
比較試料としての抗癌剤ドキソルビシン封入リポソームを調製するために、実施例13で得た抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム液の一部分1mlに架橋試薬3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジル)プロピオネート(DTSSP;Pierce Co.,USA)1mgを加えて25℃で2時間、続いて7℃で一晩撹拌し、XM300膜とCBS緩衝液(pH8.5)で限外濾過してDTSSPがリポソーム上のHSAに結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理リポソーム1mlを得た。次に、このリポソーム液にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Wako Co.,Japan)13mgを加えて、25℃で2時間撹拌し、その後7℃で一晩撹拌し、XM300膜とPBS緩衝液(pH7.2)で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のDTSSPにグリコシル化アミン化合物の結合を行った。その結果、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理をした比較試料としての抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム(略称:DX−TRIS)2m1(総脂質量2mg、総蛋白量200μg)が得られた。
得られた生理食塩懸濁液中(37℃)の抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置(Model Nano ZS,Malvern Instruments Ltd.,UK)により測定した結果、粒子径は50〜350nm、ゼータ電位は−30〜−10mVであった。
(6.抗癌剤ドキソルビシン封入リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への糖鎖の結合とリンカー蛋白質(HSA)の親水性化処理)
上記5.1の手段により調製された糖鎖が結合したリポソームについて、以下の手順によりリポソーム上のHSA蛋白質表面の親水性化処理を行った。糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された糖鎖結合リポソーム複合体各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)を得た。
上記5.1の手段により調製された糖鎖が結合したリポソームについて、以下の手順によりリポソーム上のHSA蛋白質表面の親水性化処理を行った。糖鎖結合リポソーム2mlに、別々に、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン13mgを加えて、25℃で2時間、その後7℃で一晩攪拌した後、XM300膜とPBS緩衝液(pH 7.2)で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された糖鎖結合リポソーム複合体各2ml(総脂質量2mg、総蛋白量200μg、平均粒径100nm)を得た。
(7.各種の糖鎖結合リポソーム複合体によるレクチン結合活性阻害効果の測定)
上記5.1および5.2の手段により調製した各糖鎖結合リポソーム複合体のインビト
ロでのレクチン結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999)Drug Delivery System,14,498−505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(E−selectin;R&D Systems Co.,USA)を96穴マイクロプレートに固定化した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(蛋白質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH 7.2)で3回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、sulfo−NHS−biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon−30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。
上記5.1および5.2の手段により調製した各糖鎖結合リポソーム複合体のインビト
ロでのレクチン結合活性は、常法(Yamazaki,N.(1999)Drug Delivery System,14,498−505)に従いレクチン固定化マイクロプレートを用いた阻害実験で測定した。すなわち、レクチン(E−selectin;R&D Systems Co.,USA)を96穴マイクロプレートに固定化した。このレクチン固定化プレートに、比較リガンドであるビオチン化したフコシル化フェチュイン0.1μgとともに、濃度の異なる各種の糖鎖結合リポソーム複合体(蛋白質量として、0.01μg、0.04μg、0.11μg、0.33μg、1μg)を加え、4℃で2時間インキュベートした。PBS(pH 7.2)で3回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)結合ストレプトアビジンを添加し、さらに4℃で1時間インキュベート、PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して室温で静置、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.,USA)で測定した。フコシル化フェチュインのビオチン化は、sulfo−NHS−biotin reagent(Pierce Co.,USA)処理後、Centricon−30(Amicon Co.,USA)により精製した。HRPO結合ストレプトアビジンは、HRPOの酸化とNaBH3CNを用いた還元アミノ化法によるストレプトアビジンの結合により調製した。
(8.クロラミンT法による各種糖鎖結合リポソームの125I標識)
クロラミンT(Wako Pure Chemical Co.,Japan)溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ3mg/mlならびに5mg/mlとなるように用事調製して用いた。6により調製した糖鎖結合リポソームならびにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン結合リポソームを各50μlずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて125I−NaI(NEN Life Science Product,Inc.USA)を15μl、クロラミンT溶液を10μl加え反応させた。5分ごとにクロラミンT溶液10μlを加え、この操作を2回繰り返した後15分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム100μlを加え、反応を停止させた。次に、Sephadex G−50(Phramacia Biotech.Sweden)カラムクロマト上に乗せ、PBSで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性(4×106 Bq/mg protein)を調整して125I標識リポソーム液を得た。
クロラミンT(Wako Pure Chemical Co.,Japan)溶液並びに二亜硫酸ナトリウム溶液をそれぞれ3mg/mlならびに5mg/mlとなるように用事調製して用いた。6により調製した糖鎖結合リポソームならびにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン結合リポソームを各50μlずつ別々にエッペンチューブに入れ、続いて125I−NaI(NEN Life Science Product,Inc.USA)を15μl、クロラミンT溶液を10μl加え反応させた。5分ごとにクロラミンT溶液10μlを加え、この操作を2回繰り返した後15分後に還元剤として二亜硫酸ナトリウム100μlを加え、反応を停止させた。次に、Sephadex G−50(Phramacia Biotech.Sweden)カラムクロマト上に乗せ、PBSで溶出、標識体を精製した。最後に、非標識−リポソーム複合体を添加して比活性(4×106 Bq/mg protein)を調整して125I標識リポソーム液を得た。
(9.各種の糖鎖結合リポソーム複合体のマウスでの腸管から血中への移行量の測定)
一昼夜水分以外絶食した雄性ddYマウス(7週齢)に、実施例17により125I標識された糖鎖結合ならびにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン結合リポソーム複合体0.2mlを蛋白質量として3μg/一匹の割合になるように、マウス用経口ゾンデで腸管内に強制投与した後、10分後にネンブタール麻酔下で下大動脈より血液1mlを採血した。そして、血中の125I放射能をガンマーカウンター(Alola ARC300)で測定した。さらに、各種のリポソーム複合体の生体内安定性を調べる目的で、各血液の血清をSephadex G−50で再クロマトしたが、いずれも大半の放射能が高分子量のボイドフラクションにみられ、各種のリポソーム複合体は生体内においても安定性を有していた。なお、腸管から血中への放射能移行量は、投与全放射能に対する血液1ml当たりの放射能の割合(%投与量/ml血液)で表示した。
一昼夜水分以外絶食した雄性ddYマウス(7週齢)に、実施例17により125I標識された糖鎖結合ならびにトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン結合リポソーム複合体0.2mlを蛋白質量として3μg/一匹の割合になるように、マウス用経口ゾンデで腸管内に強制投与した後、10分後にネンブタール麻酔下で下大動脈より血液1mlを採血した。そして、血中の125I放射能をガンマーカウンター(Alola ARC300)で測定した。さらに、各種のリポソーム複合体の生体内安定性を調べる目的で、各血液の血清をSephadex G−50で再クロマトしたが、いずれも大半の放射能が高分子量のボイドフラクションにみられ、各種のリポソーム複合体は生体内においても安定性を有していた。なお、腸管から血中への放射能移行量は、投与全放射能に対する血液1ml当たりの放射能の割合(%投与量/ml血液)で表示した。
この結果、経口投与に最適な糖鎖の種類および結合密度が決定される。
(実施例22および23のまとめ)
ローリングモデルによって作製された送達媒体の標的指向性は、インビボでのアッセイ結果がインビトロで忠実に再現された。さらに糖鎖の結合密度を考慮することにより、より適切な送達媒体を選択することができた。この標的指向性は、送達媒体が薬物を含んでいても、含んでいなくても変更されなかった。
ローリングモデルによって作製された送達媒体の標的指向性は、インビボでのアッセイ結果がインビトロで忠実に再現された。さらに糖鎖の結合密度を考慮することにより、より適切な送達媒体を選択することができた。この標的指向性は、送達媒体が薬物を含んでいても、含んでいなくても変更されなかった。
(実施例24.ビタミンA封入リポソームの調製と封入薬物定量と保存安定性)
ローリングモデルによって適切であることが明らかになった送達媒体を用いて、次に、栄養素の送達を行った。リポソームはコール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mg添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)3mlに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液10mlを得た。このミセル懸濁液にTAPS緩衝液(pH8.4)で3mg/1mlになるよう完全に溶解したビタミンAを撹拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このビタミンA入りミセル懸濁液をPM10膜(AmiconCo.,USA)とTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)を用いた限外濾過にかけ均一なビタミンA封入リポソーム粒子懸濁液10mlを調製した。得られた生理食塩懸濁液中(37℃)のビタミンA封入リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置(ModelNanoZS,Malvern InstrumentsLtd,,UK)により測定した結果、粒子径は50〜350nm、ゼータ電位は−30〜−10mVであった。このリポソームの封入薬物量を吸光度260nmで測定するとおよそ280μg/m1の濃度でビタミンAが封入されていることがわかった。このビタミンA封入リポソームは、冷蔵庫中に1年間保存した後にも沈殿や凝集を起こすことなく安定であった。
ローリングモデルによって適切であることが明らかになった送達媒体を用いて、次に、栄養素の送達を行った。リポソームはコール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、ガングリオシドおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ35:40:5:15:5の割合で合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mg添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得た。得られた脂質膜をTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)3mlに懸濁、超音波処理し、透明なミセル懸濁液10mlを得た。このミセル懸濁液にTAPS緩衝液(pH8.4)で3mg/1mlになるよう完全に溶解したビタミンAを撹拌しながらゆっくりと滴下して均一に混合した後、このビタミンA入りミセル懸濁液をPM10膜(AmiconCo.,USA)とTAPS緩衝生理食塩液(pH8.4)を用いた限外濾過にかけ均一なビタミンA封入リポソーム粒子懸濁液10mlを調製した。得られた生理食塩懸濁液中(37℃)のビタミンA封入リポソーム粒子の粒子径とゼータ電位をゼータ電位・粒子径・分子量測定装置(ModelNanoZS,Malvern InstrumentsLtd,,UK)により測定した結果、粒子径は50〜350nm、ゼータ電位は−30〜−10mVであった。このリポソームの封入薬物量を吸光度260nmで測定するとおよそ280μg/m1の濃度でビタミンAが封入されていることがわかった。このビタミンA封入リポソームは、冷蔵庫中に1年間保存した後にも沈殿や凝集を起こすことなく安定であった。
このようなリポソームを用いて、所望の部位に送達することができるリポソームを作製することができた。
(実施例25:他の細胞表面分子を用いたローリングモデル)
E-セレクチン以外の細胞表面分子として、P−セレクチン、L−セレクチン、ガレクチン1、ガレクチン2、ガレクチン3、ガレクチン4、ガレクチン5、ガレクチン6、ガレクチン7、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、ガレクチン11、ガレクチン12、ガレクチン13、ガレクチン14、マンノース6リン酸受容体、カルネキシン、カルレティキュリン、ERGIC−53、VIP53、インターロイキン類、インターフェロン類および増殖因子類を用いて、同様のローリングモデルが作成可能かどうかを確認する。
E-セレクチン以外の細胞表面分子として、P−セレクチン、L−セレクチン、ガレクチン1、ガレクチン2、ガレクチン3、ガレクチン4、ガレクチン5、ガレクチン6、ガレクチン7、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、ガレクチン11、ガレクチン12、ガレクチン13、ガレクチン14、マンノース6リン酸受容体、カルネキシン、カルレティキュリン、ERGIC−53、VIP53、インターロイキン類、インターフェロン類および増殖因子類を用いて、同様のローリングモデルが作成可能かどうかを確認する。
P−セレクチン、L−セレクチン、ガレクチン1、ガレクチン2、ガレクチン3、ガレクチン4、ガレクチン5、ガレクチン6、ガレクチン7、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、ガレクチン11、ガレクチン12、ガレクチン13、ガレクチン14、マンノース6リン酸受容体、カルネキシン、カルレティキュリン、ERGIC−53、VIP53、インターロイキン類、インターフェロン類および増殖因子類は、市販のものまたは遺伝子工学手法を用いて製造することができる。
ガレクチン1は骨格筋、神経細胞、腎臓、胎盤および胸腺、ガレクチン2は腫瘍の肝臓、ガレクチン3は活性化マクロファージ、好酸球、好中球、肥満細胞、小腸、呼吸器官の上皮および感覚神経細胞、ガレクチン4は腸や口腔の上皮、ガレクチン5は赤血球や細網細胞、ガレクチン6は腸管上皮、ガレクチン7はケラチノサイト、ガレクチン8は肺、肝臓、腎臓、心臓および脳、ガレクチン9は肝臓、小腸、腎臓、リンパ組織、肺、心筋および骨格筋において発現していることから、これらの臓器への送達媒体の指標として有用である。
マンノース6リン酸受容体は、各細胞のトランスゴルジネットワークに分布することから、これらの細胞部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
カルネキシンは、小胞体に分布することから、これらの細胞部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
カルテティキュリンは、小胞体に分布することから、これらの細胞部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
ERGIC−53は、小胞体からシスゴルジに分布することから、これらの細胞部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
VIP36は、小胞体から細胞膜に分布することから、これらの細胞部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
Siglec1(シアロアドヘシン)は、マクロファージに分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
Siglec2(CD22)は、リンパ球(B細胞)に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
Siglec3(CD33)は、ミエロイド細胞に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
Siglec4a(MAG)は、末梢神経に存在することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
Siglec5(ミエリンタンパク質)は、単球に存在することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
N−CAMは、末梢神経に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
Po(哺乳類の末梢ミエリン、成熟シュワン細胞上に存在する細胞間接着因子)は、末梢神経に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
L−セレクチンは、白血球に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
P−セレクチンは、血管内皮細胞に存在することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
マンノース結合タンパク質は、リンパ球(ナチュラルキラー細胞)に存在することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
アシアロ糖タンパク質受容体は、肝臓することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
マクロファージマンノース受容体は、マクロファージに分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
アンチトロンビン(血液凝固因子)は血液に存在することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
FGFは血液に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
インターロイキン2(IL−2)は、血液に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
インターロイキン1α(IL−1α)は、血液に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
インターロイキン1β(IL−1β)は、血液に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
インターロイキン3(IL−3)は、血液に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
インターロイキン6(IL−6)は、血液に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
インターロイキン7(IL−7)は、血液に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
腫瘍壊死因子α(TNF−α)は、血液に分布することから、これらの部位へ送達する送達媒体の指標として有用である。
これらの細胞表面分子を実施例7に従って実験し、その結果をローリングモデルとして用いれば、対応する臓器・部位においてインビボで好ましい送達媒体を探索することが可能である。
本実施例において参照される細胞表面分子と臓器との関係については、以下に説明され得る。生体内の各種組織の細胞膜面上などに存在するレセプターとして、セレクチン、DC−SIGN、DC−SGNR、コレクチン、マンノース結合蛋白質等のC−タイプレクチン、シグレック等のIタイプレクチン、マンノース−6−リン酸受容体などのPタイプレクチン、Rタイプレクチン、Lタイプレクチン、Mタイプレクチン、ガレクチンなどの各種のレクチン(糖鎖認識蛋白質)についての研究が進んできたことから、各種の分子構造を有する糖鎖は新しいDDSリガンドとして注目されてきている。
細胞表面分子と臓器との関係では、例えば、ヒトの組織での細胞表面分子発現が明らかとなってきているものを列挙すると以下のとおりである。
(1)血球や骨髄細胞には、アシアログリコプロテインレセプター、CD11b、CD18、CD22、CD23、CD31、CD69、ガレクチン−5、ガレクチン−10、インターロイキン−2、マクロファージマンノースレセプター、N−CAM(CD56)、NKR−P1、シアロアドヘシン;
(2) 血漿や血清には、C−リアクティブプロテイン、P35、マンナンバインディングレクチン、セーラムアミロイドP;
(3) 骨や軟骨には、アグレカン;
(4) 各種組織の上皮細胞には、アシアログリコプロテインレセプター(肝臓)、C−リアクティブプロテイン(肝臓)、ガレクチン−2(腸)、ガレクチン−4とガレクチン−6(腸)、ガレクチン−7、HIPとPAP(腸、膵臓)、P35(肝臓)、セーラムアミロイドPコンポーネント(肝臓)、サーファクタントプロテインA(肺)、サーファクタントプロテインD(肺);
(5) 筋肉では、サルコレクチン;
(6) 神経組織では、ブレビカン、セレベラーソルブルレクチン、ミエリンアソシエイティドグリコプロテイン、N−CAM;
(7) 胎盤では、プラセンタGp120レセプター;
組織非特異的に、カルレティクリン、CD44、CD54、ERGIC−53、ガレクチン−1、ガレクチン−3、ガレクチン−8、ガレクチン−9、インターロイキン1、ホスホマンノシルレセプターI、ホスホマンノシルレセプターII、テトラネクチン、スロンボスポンジン、腫瘍壊死因子、ベルシカン;
細胞表面分子と疾患組織との関係では、炎症性疾患全般(脳炎、網脈絡膜炎、肺炎、肝炎、関節炎など)、並びに、続発的に炎症を引き起こす疾患(悪性腫瘍、リウマチ、脳梗塞、糖尿病、アルツハイマー病など)において、E−セレクチンやP−セレクチンなどの発現が解明されつつある。また、癌組織においては、E−セレクチンの発現が報告されている。細胞表面分子と臓器や疾患との関係については、未だに不明な点が多く、今後解明されていくことと期待される。
(1)血球や骨髄細胞には、アシアログリコプロテインレセプター、CD11b、CD18、CD22、CD23、CD31、CD69、ガレクチン−5、ガレクチン−10、インターロイキン−2、マクロファージマンノースレセプター、N−CAM(CD56)、NKR−P1、シアロアドヘシン;
(2) 血漿や血清には、C−リアクティブプロテイン、P35、マンナンバインディングレクチン、セーラムアミロイドP;
(3) 骨や軟骨には、アグレカン;
(4) 各種組織の上皮細胞には、アシアログリコプロテインレセプター(肝臓)、C−リアクティブプロテイン(肝臓)、ガレクチン−2(腸)、ガレクチン−4とガレクチン−6(腸)、ガレクチン−7、HIPとPAP(腸、膵臓)、P35(肝臓)、セーラムアミロイドPコンポーネント(肝臓)、サーファクタントプロテインA(肺)、サーファクタントプロテインD(肺);
(5) 筋肉では、サルコレクチン;
(6) 神経組織では、ブレビカン、セレベラーソルブルレクチン、ミエリンアソシエイティドグリコプロテイン、N−CAM;
(7) 胎盤では、プラセンタGp120レセプター;
組織非特異的に、カルレティクリン、CD44、CD54、ERGIC−53、ガレクチン−1、ガレクチン−3、ガレクチン−8、ガレクチン−9、インターロイキン1、ホスホマンノシルレセプターI、ホスホマンノシルレセプターII、テトラネクチン、スロンボスポンジン、腫瘍壊死因子、ベルシカン;
細胞表面分子と疾患組織との関係では、炎症性疾患全般(脳炎、網脈絡膜炎、肺炎、肝炎、関節炎など)、並びに、続発的に炎症を引き起こす疾患(悪性腫瘍、リウマチ、脳梗塞、糖尿病、アルツハイマー病など)において、E−セレクチンやP−セレクチンなどの発現が解明されつつある。また、癌組織においては、E−セレクチンの発現が報告されている。細胞表面分子と臓器や疾患との関係については、未だに不明な点が多く、今後解明されていくことと期待される。
動物レクチンを一次構造で分類すると、例えば、次のような14種類のファミリーに分けられる。
(1)C−タイプ、(2)S−タイプ(ガレクチン)、(2)I−タイプ(シグレク他)、(4)P−タイプ(ホスホマンノシルレセプター)、(5)ペントラキシン、(6)エッグレクチン、(7)カルレティキュリンやカルネキシン、(8)ERGIC−53やVIP−36、(9)ジスコイジン、(10)フコレクチン、(11)アネキシンレクチン、(12)フィコリン、(13)タキレクチン5Aや5B、(14)ナメクジレクチン、そして、C−タイプのファミリーは、以下のサブファミリーに分類される。(1)ヒアレクチン、(2)アシアログリコプロテインレセプター、(3)コレクチン、(4)セレクチン、(5)NKグループトランスメンブランレセプター、(6)マクロファージマンノースレセプター、(7)シングルドメインレクチン、
さらに、生物学的意義が解明されていないが、糖鎖結合活性を有するオーファンレクチン群として、以下のものが知られている。(1)アンフォテリシン、(2)CD11bやCD18、(3)CEL−III、(4)コンプレメントファクターH、(5)エントアメーバ接着レクチン、(6)カエルシアル酸結合レクチン、(7)タキレクチン−1やタキレクチン−P、(8)タキレクチン−2、(9)タキレクチン−3、(10)スロンボスポンジン、(11)インターロイキン−1、(12)インターロイキン−2、(13)インターロイキン−3、(14)インターロイキン−4、(15)インターロイキン−5、(16)インターロイキン−6、(17)インターロイキン−7、(18)インターロイキン−8、(19)インターロイキン−12、(20)腫瘍壊死因子。
(1)C−タイプ、(2)S−タイプ(ガレクチン)、(2)I−タイプ(シグレク他)、(4)P−タイプ(ホスホマンノシルレセプター)、(5)ペントラキシン、(6)エッグレクチン、(7)カルレティキュリンやカルネキシン、(8)ERGIC−53やVIP−36、(9)ジスコイジン、(10)フコレクチン、(11)アネキシンレクチン、(12)フィコリン、(13)タキレクチン5Aや5B、(14)ナメクジレクチン、そして、C−タイプのファミリーは、以下のサブファミリーに分類される。(1)ヒアレクチン、(2)アシアログリコプロテインレセプター、(3)コレクチン、(4)セレクチン、(5)NKグループトランスメンブランレセプター、(6)マクロファージマンノースレセプター、(7)シングルドメインレクチン、
さらに、生物学的意義が解明されていないが、糖鎖結合活性を有するオーファンレクチン群として、以下のものが知られている。(1)アンフォテリシン、(2)CD11bやCD18、(3)CEL−III、(4)コンプレメントファクターH、(5)エントアメーバ接着レクチン、(6)カエルシアル酸結合レクチン、(7)タキレクチン−1やタキレクチン−P、(8)タキレクチン−2、(9)タキレクチン−3、(10)スロンボスポンジン、(11)インターロイキン−1、(12)インターロイキン−2、(13)インターロイキン−3、(14)インターロイキン−4、(15)インターロイキン−5、(16)インターロイキン−6、(17)インターロイキン−7、(18)インターロイキン−8、(19)インターロイキン−12、(20)腫瘍壊死因子。
上記のような多種多様な動物レクチンの臓器や疾患との関連が明らかになるにつれて、本発明の送達媒体(糖鎖修飾リポソームなど)の疾患治療や診断への有用性や応用分野が広がっていくものと予測される。また、多彩な動物レクチンの生物学的意義を解明するためにも、本発明の送達媒体は研究用試薬などとして有用である。
(実施例26.ガングリオシドを含まない糖鎖修飾リポソームの調製)
(1.リポソームの調製)
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解させる。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得る。得られた脂質膜をTAPS緩衝液(pH 8.4)3mlに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得る。さらに、ミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とPBS緩衝液(pH 7.2)を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム(平均粒径100nm)10mlを調製する。
(1.リポソームの調製)
リポソームは既報の手法(Yamazaki,N.,Kodama,M.and Gabius,H.−J.(1994)Methods Enzymol.242,56−65)により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルホスフェート、及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを合計脂質量45.6mgになるように混合し、コール酸ナトリウム46.9mgを添加し、クロロホルム/メタノール溶液3mlに溶解させる。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜を得る。得られた脂質膜をTAPS緩衝液(pH 8.4)3mlに懸濁、超音波処理して、透明なミセル懸濁液を得る。さらに、ミセル懸濁液をPM10膜(Amicon Co.,USA)とPBS緩衝液(pH 7.2)を用いた限外濾過にかけ均一リポソーム(平均粒径100nm)10mlを調製する。
(2.リポソーム脂質膜面上の親水性化処理)
上記1.において調製したリポソーム溶液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH 8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にする。次に、架橋試薬bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3;Pierce Co.,USA)10mlを加え、25℃で2時間攪拌する。その後、更に7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結させる。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過にかける。次に、CBS緩衝液(pH 8.5)1mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間攪拌後、7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結させる。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化される。
上記1.において調製したリポソーム溶液10mlをXM300膜(Amicon Co.,USA)とCBS緩衝液(pH 8.5)を用いた限外濾過にかけ溶液のpHを8.5にする。次に、架橋試薬bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3;Pierce Co.,USA)10mlを加え、25℃で2時間攪拌する。その後、更に7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとBS3との化学結合反応を完結させる。そして、このリポソーム液をXM300膜とCBS緩衝液(pH 8.5)で限外濾過にかける。次に、CBS緩衝液(pH 8.5)1mlに溶かしたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン40mgをリポソーム液10mlに加えて、25℃で2時間攪拌後、7℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したBS3とトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとの化学結合反応を完結させる。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの水酸基が配位して水和親水性化される。
(3.リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン(HSA)の結合)
実施例3と同様の手法によりリポソーム膜面上へヒト血清アルブミン(HSA)を結合させる処理を行う。その結果、ヒト血清アルブミン(HSA)は、リポソーム膜面上に結合しないという結果を得る。得られた送達媒体をローリングモデルにより評価することによって、適切な媒体であるかどうかを判断することができる。
実施例3と同様の手法によりリポソーム膜面上へヒト血清アルブミン(HSA)を結合させる処理を行う。その結果、ヒト血清アルブミン(HSA)は、リポソーム膜面上に結合しないという結果を得る。得られた送達媒体をローリングモデルにより評価することによって、適切な媒体であるかどうかを判断することができる。
(実施例27:糖鎖修飾リポソーム以外の送達媒体)
次に、糖鎖修飾リポソーム以外の送達媒体についてローリングモデルが適用できるか検証する。
次に、糖鎖修飾リポソーム以外の送達媒体についてローリングモデルが適用できるか検証する。
ここでは、脂質(リポソームなど)以外の物質として、ポリエステル、シクロデキストリン、ポリアミノ酸、シリコンを選択して使用する。
得られた送達媒体をローリングモデルにより評価することによって、適切な媒体であるかどうかを判断することができる。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明は、目的の送達部位に物質を送達することができる送達媒体を自在に設計することができるという有用性を有する。従って、本発明は、送達媒体(例えば、糖鎖修飾リポソーム)に物質(例えば、薬剤や遺伝子)を封入した送達媒体および関連する有用性(例えば、治療、診断、予防、研究など)を提供する。
(実施例4.糖鎖の調製)
以下の表14に示される糖鎖を使用した。
以下の表14に示される糖鎖を使用した。
以下の表15に、各糖鎖を用いた場合のリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン(HSA)上への結合の結果を示す。特に明記しない限り、これらの糖鎖のリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミンへの結合は、実施例5と同様の方法および条件で行った。
Claims (111)
- 所望部位に関連する細胞表面分子との強結合または弱結合に基づく結合を特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
- 所望部位に関連する細胞表面分子とのローリングモデルに基づく結合を特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
- 所望部位に関連する細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、強結合阻害濃度(IC)の阻害濃度が低いことを特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
- 所望部位に関連する細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、弱結合ICの阻害濃度が高いことを特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
- 所望部位に関連する細胞表面分子とのインビトロ親和性に関し、強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、弱結合ICの阻害濃度が高い、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
- 所望部位に関連する細胞表面分子とのローリングモデルに基づく結合、並びに、その他の強結合または弱結合に基づく結合の少なくとも1種類の結合を含むことを特徴とする、所望部位への送達を達成するための送達媒体。
- 前記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
- 前記細胞表面分子は、レクチンである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
- 前記強結合ICと前記弱結合ICとの境界は、ICnにおいてnが30と31との間に存在する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
- 前記強結合ICは、ICnにおいてnが30以下で測定され、前記弱結合ICはICnにおいてnが31以上で測定される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
- 前記強結合ICと前記弱結合ICとの境界は、ICnにおいてnが30と31との間に存在する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の送達媒体。
- 所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、IC30以下の強結合ICの阻害濃度が10−9M以下である、請求項3に記載の送達媒体。
- 所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、約IC31以上の弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上である、請求項4に記載の送達媒体。
- 所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、約IC30以下の強結合ICの阻害濃度が10−9M以下であり、かつ、約IC31以上の弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上である、請求項5に記載の送達媒体。
- 所望部位に関連するレクチンとのインビトロ親和性に関し、前記強結合ICについて、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を有し、かつ、前記弱結合ICについて、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC60の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を有する、請求項14に記載の送達媒体。
- 前記強結合ICおよび前記弱結合ICの少なくとも1つは、前記条件において少なくとも2つの条件を有することを特徴とする、請求項15に記載の送達媒体。
- 前記送達媒体は、リポソームである、請求項1〜16のいずれか1項に記載の送達媒体。
- 前記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームである、請求項1〜16のいずれか1項に記載の送達媒体。
- 前記ICは、E−セレクチンとの親和性において測定される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の送達媒体。
- 前記所望部位は、炎症部位および癌部位からなる群より選択される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の送達媒体。
- リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号53、リポソーム番号69、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号117、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号213、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285およびリポソーム番号295からなる群より選択されるリポソームを含む、請求項12に記載の送達媒体。
- リポソーム番号3、リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号38、リポソーム番号40、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号50、リポソーム番号53、リポソーム番号56、リポソーム番号60、リポソーム番号68、リポソーム番号69、リポソーム番号70、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号111、リポソーム番号116、リポソーム番号117、リポソーム番号120、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号129、リポソーム番号130、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号141、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号155、リポソーム番号175、リポソーム番号178、リポソーム番号183、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号197、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号209、リポソーム番号213、リポソーム番号218、リポソーム番号220、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号233、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号236、リポソーム番号237、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号254、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285、リポソーム番号290、リポソーム番号292およびリポソーム番号295なる群より選択されるリポソームを含む、請求項13に記載の送達媒体。
- リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号53、リポソーム番号69、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号111、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号213、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285およびリポソーム番号295なる群より選択されるリポソームを含む、請求項14に記載の送達媒体。
- リポソーム番号3、リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号38、リポソーム番号40、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号50、リポソーム番号53、リポソーム番号56、リポソーム番号60、リポソーム番号68、リポソーム番号69、リポソーム番号70、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号111、リポソーム番号116、リポソーム番号117、リポソーム番号120、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号129、リポソーム番号130、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号141、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号155、リポソーム番号175、リポソーム番号178、リポソーム番号183、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号197、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号209、リポソーム番号213、リポソーム番号218、リポソーム番号220、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号233、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号236、リポソーム番号237、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号254、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285、リポソーム番号290、リポソーム番号292およびリポソーム番号295なる群より選択されるリポソームを含む、請求項15に記載の送達媒体。
- リポソーム番号3、リポソーム番号16、リポソーム番号27、リポソーム番号29、リポソーム番号38、リポソーム番号40、リポソーム番号41、リポソーム番号45、リポソーム番号50、リポソーム番号53、リポソーム番号56、リポソーム番号60、リポソーム番号68、リポソーム番号69、リポソーム番号70、リポソーム番号71、リポソーム番号76、リポソーム番号80、リポソーム番号87、リポソーム番号91、リポソーム番号93、リポソーム番号96、リポソーム番号105、リポソーム番号106、リポソーム番号111、リポソーム番号116、リポソーム番号117、リポソーム番号120、リポソーム番号125、リポソーム番号127、リポソーム番号129、リポソーム番号130、リポソーム番号137、リポソーム番号139、リポソーム番号141、リポソーム番号142、リポソーム番号146、リポソーム番号150、リポソーム番号151、リポソーム番号152、リポソーム番号153、リポソーム番号154、リポソーム番号155、リポソーム番号175、リポソーム番号178、リポソーム番号183、リポソーム番号184、リポソーム番号186、リポソーム番号191、リポソーム番号195、リポソーム番号197、リポソーム番号199、リポソーム番号204、リポソーム番号207、リポソーム番号209、リポソーム番号213、リポソーム番号218、リポソーム番号220、リポソーム番号224、リポソーム番号225、リポソーム番号229、リポソーム番号230、リポソーム番号233、リポソーム番号234、リポソーム番号235、リポソーム番号236、リポソーム番号237、リポソーム番号239、リポソーム番号240、リポソーム番号254、リポソーム番号263、リポソーム番号273、リポソーム番号285、リポソーム番号290、リポソーム番号292およびリポソーム番号295なる群より選択されるリポソームを含む、請求項16に記載の送達媒体。
- 所望の物質の所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、該製造方法は:
A)該送達媒体の候補について、該部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、を包含する、方法。 - 前記送達媒体は、リポソームを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記候補は、糖鎖修飾リポソームにおいて複数の糖鎖種類を含む糖鎖修飾リポソームを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、レクチンである、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、E−セレクチン、P−セレクチン、L−セレクチン、ガレクチン1、ガレクチン2、ガレクチン3、ガレクチン4、ガレクチン5、ガレクチン6、ガレクチン7、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、ガレクチン11、ガレクチン12、ガレクチン13、ガレクチン14、マンノース6リン酸受容体、カルネキシン、カルレティキュリン、ERGIC−53、VIP53、インターロイキン類、インターフェロン類および増殖因子類からなる群より選択されるレクチンを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、E−セレクチンを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、E−セレクチンを含み、前記部位は、経口投与、肝臓、小腸、大腸、リンパ節、肝臓、心臓、膵臓、肺、脳、骨髄、血中、腎臓、脾臓、胸腺、筋肉、炎症部位および癌部位からなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、E−セレクチンを含み、前記部位は、腫瘍および炎症部位からなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性は、n%阻害濃度(ICn)で示され、ここで、nは1〜99の範囲である、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定と、約IC31以上の弱結合ICでの測定とを包含する、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、IC30〜IC10の間の少なくとも1点での強結合ICでの測定と、IC40〜IC60の間の少なくとも1点での弱結合ICでの測定とを包含する、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とする、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が10−9M以下の候補を選択することを特徴とする、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とし、ここで、該選択は、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とする、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、前記選択は、該弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、前記選択は、該弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とし、ここで、該選択は、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC60の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICおよび約IC31以上の弱結合ICでの測定での測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、該弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とする、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が10−9M以下で、かつ、該弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、該弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とし、ここで、該選択は、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たし、かつ、前記弱結合ICについて、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC60の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、請求項26に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、競合阻害アッセイ、非競合阻害アッセイおよび結合アッセイからなる群より選択される方法によって行われる、請求項26に記載の方法。
- 所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、該製造方法は:
A)該送達媒体の候補について、該部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された該送達媒体の組成を分析する工程;
C)該組成に基づいて、該選択された送達媒体を生成する工程、
を包含する、方法。 - さらに、前記選択された送達媒体に送達が所望される物質を含ませる工程を包含する、請求項49に記載の方法。
- 前記送達媒体は、リポソームを含む、請求項49に記載の方法。
- 前記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含む、請求項49に記載の方法。
- 前記候補は、糖鎖修飾リポソームにおいて複数の糖鎖種類を含む糖鎖修飾リポソームを含む、請求項49に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項49に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、レクチンである、請求項49に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、E−セレクチン、P−セレクチン、L−セレクチン、ガレクチン1、ガレクチン2、ガレクチン3、ガレクチン4、ガレクチン5、ガレクチン6、ガレクチン7、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、ガレクチン11、ガレクチン12、ガレクチン13、ガレクチン14、マンノース6リン酸受容体、カルネキシン、カルレティキュリン、ERGIC−53、VIP53、インターロイキン類、インターフェロン類および増殖因子類からなる群より選択されるレクチンを含む、請求項49に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、E−セレクチンを含む、請求項49に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、E−セレクチンを含み、前記部位は、経口投与、肝臓、小腸、大腸、リンパ節、肝臓、心臓、膵臓、肺、脳、骨髄、血中、腎臓、脾臓、胸腺、筋肉、炎症部位および癌部位からなる群より選択される、請求項49に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、E−セレクチンを含み、前記部位は、腫瘍および炎症部位からなる群より選択される、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性は、ICnで示され、ここで、nは1〜99の範囲である、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定と、約IC31以上の弱結合ICでの測定とを包含する、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、IC30〜IC10の間の少なくとも1点での強結合ICでの測定と、IC40〜IC60の間の少なくとも1点での弱結合ICでの測定とを包含する、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とする、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が10−9M以下の候補を選択することを特徴とする、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とし、ここで、該選択は、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が低い候補を選択することを特徴とする、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、前記選択は、該弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、前記選択は、該弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とし、ここで、該選択は、IC60の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC40の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICおよび約IC31以上の弱結合ICでの測定での測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、該弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とする、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が10−9M以下で、かつ、該弱結合ICの阻害濃度が10−9M以上の候補を選択することを特徴とする、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、約IC30以下の強結合ICでの測定および約IC31以上の弱結合ICでの測定を含み、前記選択は、該強結合ICの阻害濃度が低く、かつ、該弱結合ICの阻害濃度が高い候補を選択することを特徴とし、ここで、該選択は、IC10の阻害濃度が10−9M以下であること、IC20の阻害濃度が10−9M以下であること、およびIC30の阻害濃度が10−9M以下であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たし、かつ、前記弱結合ICについて、IC40の阻害濃度が10−9M以上であること、IC50の阻害濃度が10−9M以上であること、およびIC60の阻害濃度が10−9M以上であることからなる群より選択される少なくとも1つの条件を満たすことをさらに特徴とする、請求項49に記載の方法。
- 前記親和性の測定は、競合阻害アッセイ、非競合阻害アッセイおよび結合アッセイからなる群より選択される方法によって行われる、請求項49に記載の方法。
- 前記組成の分析に加え、該組成の送達媒体の調製法を決定する工程をさらに包含する、請求項49に記載の方法。
- 前記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含み、前記組成の分析は、該糖鎖修飾リポソームにおける糖鎖の種類および密度の分析を包含することを特徴とする、請求項49に記載の方法。
- 前記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含み、前記組成の分析は、該糖鎖修飾リポソームの製造法を決定することを包含する、請求項49に記載の方法。
- 前記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含み、前記組成の分析に代えて、該糖鎖修飾リポソームの製造法を決定することを包含する、請求項49に記載の方法。
- 前記送達媒体は、糖鎖修飾リポソームを含み、該糖鎖修飾リポソームの生成において、前記組成に基づいて決定された糖鎖の種類および量をリポソームへの結合に適切な条件下で反応させる工程をさらに包含する、請求項49に記載の方法。
- 前記結合において、リンカーが使用される、請求項57に記載の方法。
- 前記リンカーは、タンパク質である、請求項78に記載の方法。
- 前記リンカーは、アルブミンである、請求項78に記載の方法。
- 前記リポソームを親水性化させる工程をさらに包含する、請求項77に記載の方法。
- 前記選択された送達媒体のインビボでの動態を確認する工程をさらに包含する、請求項49に記載の方法。
- 所望されない部位への送達がされない送達媒体の製造方法であって、該製造方法は:
A)該送達媒体の候補について、該部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;および
B)所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項83に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、レクチンである、請求項83に記載の方法。
- 所望されない部位への送達がされない送達媒体の製造方法であって、該製造方法は:
A)該送達媒体の候補について、該部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された該送達媒体の組成を分析する工程;および
C)該組成に基づいて、該選択された送達媒体を生成する工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項86に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、レクチンである、請求項86に記載の方法。
- 特異的送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、該製造方法は:
A)該送達媒体の候補について、該特異的送達がされる部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)該送達媒体の候補について、該特異的送達がされない部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;および
C)所望部位への送達に対応し、かつ、所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項89に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、レクチンである、請求項89に記載の方法。
- 特異的送達を達成するための送達媒体の製造方法であって、該製造方法は:
A)該送達媒体の候補について、該特異的送達がされる部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)該送達媒体の候補について、該特異的送達がされない部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
C)所望部位への送達に対応し、かつ、所望されない部位への不送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された該送達媒体の組成を分析する工程;および
D)該組成に基づいて、該選択された送達媒体を生成する工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項92に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、レクチンである、請求項92に記載の方法。
- 請求項26〜94に記載の方法によって製造された送達媒体。
- 所望部位への薬物の送達を必要とする被験体を予防または処置するための方法であって、該方法は:
A)所望部位への送達を達成するための送達媒体の候補について、該部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する工程;および
C)該選択された送達媒体を用いて該予防または処置に必要な薬剤を該被験体に投与する工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項96に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、レクチンである、請求項96に記載の方法。
- 所望部位への薬物の送達を必要とする被験体を予防または処置するための方法であって、該方法は:
A)所望部位への送達を達成するための送達媒体の候補について、該部位に関連するd細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する工程;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択し、選択された該送達媒体の組成を分析する工程;
C)該組成に基づいて、該予防または処置に必要な薬剤を含む、該選択された送達媒体を生成する工程;
D)該選択された送達媒体を該被験体に投与する工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項99に記載の方法。
- 前記細胞表面分子は、レクチンである、請求項99に記載の方法。
- 所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造装置であって、該装置は:
A)該送達媒体の候補について、該部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する手段;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する手段、を備える、装置。 - 前記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項102に記載の装置。
- 前記細胞表面分子は、レクチンである、請求項102に記載の装置。
- 所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造装置であって、該装置は:
A)該送達媒体の候補について、該部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性を測定する手段;
B)所望部位への送達に対応するインビトロ親和性を有する送達媒体を選択する手段;
C)選択された該送達媒体の組成を分析する手段;
D)該組成に基づいて、該選択された送達媒体を生成する手段、
を備える、装置。 - 前記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項105に記載の装置。
- 前記細胞表面分子は、レクチンである、請求項105に記載の装置。
- 所望部位への送達を達成するための送達媒体の製造のための、該部位に関連する細胞表面分子とのインビトロでのインビトロ親和性の使用。
- 前記細胞表面分子は、レクチン、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン、シアロムチン、カドヘリン、タンパク質、脂質、レセプター、抗原、酵素、メタロプロテアーゼ、チロシンフォスファターゼ、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、コスティミュラトリー分子、膜タンパク質および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項108に記載の使用。
- 前記細胞表面分子は、レクチンである、請求項108に記載の使用。
- 予防または処置に使用される薬剤、および請求項1〜25のいずれか1項に記載の送達媒体または請求項26〜94のいずれか1項に記載の方法によって製造された送達媒体を含む、医薬組成物。
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