JPS61158932A - 体内腫瘍の目標攻撃、診断または治療用ミセル粒子組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は体内の腫瘍細胞にミセル粒子を運搬する方法に
係わる。より特異的には、このような腫瘍を診断及び／
又は治療する目的で患者体内に、イメージング薬剤又は
化学療法薬剤を含有する中性又は荷電したリン脂質ミセ
ル粒子を導入する方法に関する。

（従来の技術） 患者体内の腫瘍のような異常部位（ａｂｎｏｒｍａ　ｌ
　ｉ　ｔｉｅｓ）を診断し治療し得るためには、その前
にその異常部位の場所を突き止めることがしばしば必要
となる。これは悪性腫瘍のような異常部位について特に
あてはまることである。なぜならば、このような腫瘍の
治療はまずその箇所を決定することがその基礎になるか
らである。例えば、治療薬剤を悪性腫瘍細胞に到達させ
この腫瘍を消滅せしめ得る為には、この細胞の部位が同
定されなければならない。

長年に亘って、患者体内の腫瘍部位（ＩＯＣａｌｉＺａ
ｔｉｏｎ）のような特定部位（５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｏ
ｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を簡便な方法によって同定すべ
く幾多の試みがなされて来た。例えば、診断の目的で、
選択された可動粒子を患者体内に導入しこの粒子がガン
細胞に移動することを含む簡便な方法によって患者体内
のガン細胞の部位を同定することは望ましいことであろ
う。

更に、このようなガン細胞を治療する目的で、患者体内
に化学療法薬剤を導入し、この薬剤を特定部位に移動さ
せてその特定部位でガン細胞を攻撃させることもまた望
ましいことであろう。モノクローナル抗体を用いた最近
の発達した方法が現われるまでは、診断の目的で腫瘍の
ような特定部位を目標攻撃（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）する
簡便且つ信頼性のある方法、及び治療の目的で患者体内
の腫瘍に化学療法薬剤をうまく運搬する方法は開発され
てこなかった。

化学療法薬剤を体内に経口投与、皮下投与又は静脈内投
与するとそれを接種された体内の正常細胞に害を及ぼし
、患者の状態を悪化させてしまい、腫瘍細胞の活動は所
望する程押えることが出来ない。過去に於いては、患者
体内の正常細胞に対するこのような毒性が化学療法薬剤
を用いた腫瘍の治療に於ける主な欠点であった。このよ
うな化学療法に効能がないことはこの薬剤が体内の他の
細胞によって摂取乃至排泄されてしまう前に、自由に循
環して腫瘍細胞内に局在化（１ｏｃａｌｉｚｅ）するこ
とが出来ないということにもその原因がある。

先行技術の化学療法薬剤による腫瘍治療を改善する試み
には、これらの薬剤を小胞又はリポソームの形態の生物
分解可能なリン脂質ミセル粒子内に封入する（　ｅｎｃ
ａｐｓｕ　ｆａｔ　１ｏｎ）ことが含まれている。

この薬剤の封入化によって循環する薬剤の潜在的な毒性
が軽減されているものと考えられている。

研究者達は化学療法薬剤を運搬する為にこのような封入
化を体内の腫瘍に選択的に目標攻撃させることに利用し
ようとして来た。しかしながら、本発明前にはイメージ
ング薬剤又は薬剤封入粒子を腫瘍細胞内に確実に位置さ
せる（　ｐｌａｃｅ）試みは発表されて来なかった。

固形腫瘍又はその転移部位は血管外に位置している為に
、イメージング薬剤又は化学療法薬剤を静脈内注射して
ｌ１ｓｔＩＩＵ胞への目標攻撃を達成するためには、こ
れらの薬剤は通常の循環系から血管膜を越えて血管外相
−に入っていく必要がある。

この挙動は“濡出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔ　１ｏｎ）”
として知られている。通常は、低分子量タンパク質のよ
うな小さな物質や膜透過性分子が受動拡散（ｐａｓｓｉ
ｖｅｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）として知られているプロセス
によって腫瘍の毛細血管壁を越えることができる。しか
しながら、この受動拡散によっては薬剤を含んでいる大
きな粒子が腫瘍の近傍内に治療レベルに達する程充分に
蓄積することは難しいと考えられていた。

エイチ・アイ・パターソン（Ｈ，１，ｐａｔｅｒｓｏｎ
）、腫瘍に於ける血管及び血管内空間（Ｖａｓｃｕｌａ
ｒ　ａｎｄ　Ｅｘｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　５ｐａｃｅ
ｓ　ｉｎ　Ｔｕｍｏｒｓ）　；腫瘍血管透過性（Ｔｕｍ
ｏｒ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）
、第■章、腫瘍血液循環（Ｔｕｗ＋ｏｒ　Ｂｌｏｏｄ　
Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、　１９７９年参照。

腫瘍部位のような特定部位を小胞のような粒子に化学療
法薬剤を封入したもので目標攻撃することは、封入され
た薬剤が血管膜を透過して挙動するのが不可能なことと
、このような動きを検出することが不可能であるために
、その進歩が妨げられて来た。普通の場合は、薬剤封入
小胞のような大きな構造物は毛細血管のような血管から
逃れることはできず、従って循環系にとどまるものであ
る。しかしながら、腫瘍の血管形態の構造を研究した結
果、腫瘍に関係する様々な血管、特に毛細血管は腫瘍細
胞の成長パターンの結果、その構造に変化を来たすこと
が判明した。腫瘍の毛細血管の透過性を研究したところ
、毛細血管のこれら形態的変化によって成る種の物質が
毛細血管膜を通過できることが示唆された。このような
変化の中には未分化に由来する血管内皮細胞の欠陥、及
び腫瘍細胞の侵入による血管壁の崩壊が含まれる。

腫瘍によって変化を受けた毛細血管の例としては内皮ラ
イニング（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｌｉｎｉｎｇ）が
中断されている血管及び内皮に穴のあいた血管がある（
前述のエイチ・アイ・パターソン参照）。

腫瘍血管形態に関する上述のようなことが知られている
にも拘らず、パターソンのような研究者達は、腫瘍毛細
血管を通過する大きな分子又は物質の輸送はただ受動拡
散のみによって起り、そして治療効果に充分な量に薬剤
が濃縮されることは難しいと結論づけている（前述のエ
イチ・アイ・パターソン著の第８３頁参照）。

このような形態学的研究に先立って、濡出に関する研究
によって小胞は毛細血管を″′毛細血管通過輸送（ｔｒ
ａｎｓｃａｐｉｌｌａｒｙｐａｓｓａｇｅ）”によって
通過し腫瘍細胞に達し得るかも知れないということが示
唆された（ジー・グレゴリアゾイス（Ｇ、　Ｇｒｅｇｏ
ｒｉａｄｉｓ）　、生物系に於けるリポソーム（Ｌｉｐ
ｏｓＯｍｅｓ　Ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｙｓｔ
ｅｓｓ）、ブレボリアデス版。

第２章、　１９８０年）。しかしながら、入手されたデ
ータによると小胞はイン・ヴイボに於いては不安定であ
り放射標識が溢れていたということが指摘された。従っ
てこれによって、小胞が長い間循環しこのような小胞か
ら薬剤がゆっくりと遊離されて、このリポソームが実際
には毛細血管壁を通過することなく該壁と相互作用を持
ち、これによっておそらくは薬剤が腫瘍内に検出される
ようになるという、上記のものにとって代わる理論が明
確に提唱された。Ｉｄ、他の研究者等は単純に、静脈内
投与後に小胞は血管壁を浸透しないと結論づけた。ビー
・ライマン（Ｂ、　Ｒｙｍａｎ）等、パイオル・セル（
Ｂｉｏｌ　Ｃａ１ｌ）第４７巻、　７１−８０頁、　　
１９８３年；ジー・・ボステ（Ｇ、　Ｐｏ５ｔｅ）　、
パイオル・セル、第４７巻、１９−３８頁、　１９８３
年ニジ−・ボステ等、化学療法への新たなアプローチ（
Ｎｏｖｅｌ　Ａｐｐｒｏｃｈｅｓ　ｔ。

ｃａｎｃｅｒ　ＣｈｅｌＯｔｈｅｒａｌ）Ｖ）　、アカ
デミツクプレス　１６６−２３０頁、　１９８４年；ジ
ー・ボステ、レセプターを介した薬剤のターゲツティン
グ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｔａｒｇｅ
ｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｄｒｕｇｓ）　　４２７−４７３頁、
　１９８５年を参照のこと。

このように先行技術に於いて治療薬剤を運搬する小胞は
腫瘍細胞に到達するためには血管障壁を通過する必要の
あることを認めてはいるが、その経験からして、リン脂
質小胞のようなミセル粒子を静脈投与しても血管外の腫
瘍細胞へ封入薬剤を効果的に運搬することには効果がな
いということがわかっている。

従って、本発明は、体内の腫瘍細胞に対する封入された
イメージング及び化学療法薬剤の濡出を増大させる簡便
な方法を提供するものである。本発明は更に、体内のこ
のような腫瘍部位の同定及びその特性づけを提供するも
のである。本発明はまたこのような腫瘍細胞へ化学療法
薬剤を運搬することを提供するものである。

（本発明の要約） 本発明に方法に於いて、単一ラメラリン脂質小胞形態の
小さな（２０００人より小さい）生物分解可能なミセル
粒子が提供される。該小胞内には、例えばジステアロイ
ルホスファチジルコリン（Ｏ３ＰＣ）のような、少なく
とも１８の炭素原子をもつ炭化水素を含む中性リン脂質
が純粋に（約９８％以上の純度）含まれている。

体内の粒子の位置を検出するために粒子内の内容物又は
リン脂質分子を、例えば放射性物質を用いて標識し得る
。更に、腫瘍治療目的で化学療法薬剤をリン脂質分子又
は粒子内の内容物と会合させ得る。特に化学療法薬剤と
してはメトトレキ七ｐ−トが有用である。

リン脂質小胞が腫瘍をイメージングする目的で体内に導
入される場合には、ガンマ線放出のインジウム−１１１
をガンマカメライメージング技術を利用して用い得る。

インジウム−１１１は適当な物質、好適にはニトリロト
リ酢酸（ＮＴＡ）のような弱いキレート化剤とキレート
化し得る。ＮＴＡはインジウム−１１１と弱い結合を形
成するので有利なものである。その結果、リン脂質小胞
が腫瘍に到達し長い時間かかって溶解した際に１．腫瘍
に於いてＮＴＡはインジウム−１１１とより強力なキレ
ートを形成するタンパク質に置換される。なぜならばそ
のタンパク質はインジウム−１１１と強力な結合を形成
し、その結果インジウム−１１１が２４時間以上に亘っ
て該腫瘍に残留する。これによって腫瘍のイメージング
及び診断が長時間に亘って可能になる。

本明細書中で述べたリン脂質小胞が患者の血流内に導入
されると、それらは患者体内の腫瘍のようなガン性増殖
（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ　ｇｒｏｗｔｈｓ）が局在してい
る特定部位に完全なまま移動に局在化する。こうして特
定部位のガン性増殖が同定され治療され得る。例えば、
イメージング薬剤又は化学療法薬剤をリン脂質小胞内に
含有しその後患者体内に導入し体内の腫瘍部位を目標攻
撃し得る。

イメージング薬剤又は化学療法薬剤を含有するリン脂質
小胞の患者体内に於ける腫瘍への移動を増大させるには
、粒子から外側に向って伸長している正に荷電した分子
を持つリン脂質小胞の第１グループを患者の血流内に導
入して、細網内皮組織系を含む患者体内で肝臓、牌臓及
び他の組織中の食細胞による取り込みを阻害し得る。

このようなリン脂質小胞に結合した伸長している正に荷
電した分子は突き出たアミノ基を含む脂質溶性分子、例
えば、コレステロールの６−アミノマンノース誘導体の
ようなコレステロールのアミノサツカライド誘導体であ
り得る。同時に、又は適当時間後に、例えば約１時間後
に、小さい（２０００人より小さい）リン脂質小胞の第
２グループを患者血流内に導入し、患者体内の腫瘍のよ
うな特定部位に第２グループの小胞を完全なまま位置さ
せ得る。このようなリン脂質小胞は好ましくは中性でコ
レステロールを含み得る。

（発明の詳しい記載） 本明細書中に於いて、゛ミセル粒子゛′及び゛ミセル”
とは両親媒性分子の自発的な凝集によって引き起こされ
る水溶性粒子を意味する。両親媒性分子は親水及び疎水
部分を含んでいる。本発明に於いて好適な両親媒性分子
は生物由来の脂質である。このようなミセルは小球、ｍ
内体又は長い円筒形の形態をとり得、そして両親媒性分
子の２つの平行な層から成る二重層でもあり得る。この
ような二重層ミセルは通常内部に水性成分を含む単一ラ
メラの球状小胞であり、又゛リポソーム″としても知ら
れているものである。

これらの小胞を調製する方法は、これまで当業者に公知
のものである。典型的には、これらの小胞は、例えばジ
ステアロイルホスフォチジルコリンのようなリン脂質か
ら超音波処理によって調製され、例えばコレステロール
のような中性脂質といった他の物質を含んでいても良い
し、更に小胞の二重層中の分子に足場（ａｎｃｈｏｒ　
＞を持ち得る基を持つ正又は負に荷電した化合物、サツ
カライド。

抗体及び他の官能リガルドのような表面修飾剤（５ｕｒ
ｆａｃｅ　ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）を含み得る。我々ハ、
有る種のリン脂質分子を含有することで小胞がイン・ヴ
イボで安定化されることを発見した。相転移点は炭化水
素の鎖の数の関数であることは公知である（シー・タン
フォード（Ｃ，Ｔａｎｆｏｒｄ）　、疎水性効果（Ｔｈ
ｅ　Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　ＥＨｅｃｔ）第２版、　
１９８０年）成る種のリン脂質、例えば少なくとも１８
の炭素原子を有する炭化水素を持つリン脂質分子は相転
移が比較的高い温度（３７℃より＾い）で起り、本明細
書中の組成物にこれらのリン脂質を使うと−ｒ＞二丈ヱ
ｆで優れた安定性を示す小胞が得られることを我々は発
見した。成る場合には、入手し易いことと経済的である
が故に、より短い炭化水素鎖を使うのが望ましいことも
あり得る。その場合にはこれらの鎖は小胞組成物に少量
しか加えないようにして、血清中での小胞の安定性を保
つ為にリン脂質の大部分は炭素原子の数が少なくとも１
８の炭化水素で構成されているようにすべきである。

リン脂質ミセル粒子の安定性はコレステロールの添加に
よって更に増大し得る。小胞中にリン脂質の０−５０重
量％のコレステロールを添加することによって安定した
小胞が得られる。

小胞のｍ製 イオノフオアＡ　２３１８７を含む小さな単一ラメラ小
胞（Ｓｍａｌｌ　ｕｎｉｌａａ＋ｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉ
ｃｌｅｓ；　５ＵＶ）を従来の方法に従ってジステアロ
イルホスフォアチジルコリン（ＤＳＰＣ）　、コレステ
ロール（ｃｈ）　、ジセチルホスフエート（ＤＰ）、ス
テアリルアミン（ＳＡ）及び６−７ミノマンノース（＾
Ｈ）、及びコレステロールの６−アミノマンニトール（
ＡＨＬ）誘導体から調製した。本川ａｍ中に引例として
記されているマウク（Ｈａｕｋ）及びギャンブル（Ｇａ
ｍｂｌｅ）　、アナル・バイオケ（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
）、　　９４，３０２−３０７頁。

１９７９年参照のこと。

簡単に述べると、そそれぞれＤＳＰＣ：　Ｃｈ＝　２　
：　１　。

０３ＰＣ：Ｃｈ：Ｘ　＝４　：　１　：　１　（ここで
ＸはＳＡ、ＤＰ又はＡＭＬ）及び０３ＰＣ：　Ｃｈ：　
ＡＨ＝　８　：　３　：　１のモル比から、なる１０＃
ＩＦの脂質のクロロホルム溶液をＮ２下で蒸発乾燥させ
、更に真空下で乾燥させた。

各試ｗＡ＠に１１ＩＨのニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）を
含む１０ｍ）４リン酸、　１））Ｉ　７．４のリン酸緩
衝液０．９％食塩（ＰＢＳ）を加え、Ｎ２下でチタニウ
ムマイクロトップを備えたＭＳＥブランドブローブソニ
ケーターで５〜１５分間超音波処理した。この超音波処
理により小さな単一ラメラ小胞を得て、これを以下の実
験に用いた。

小胞を６０℃にて１０分間アニーリングし３００ＸＩＪ
で遠心分離にかけた。３０Ｘ１．５ｃｊＲの５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ｇ−５０カラムを用いて封入されなかったＮＴ
Ａと小胞とを分離した。小胞の大きさは酢酸ウランでネ
ガティブ染色した調製物を電子顕微鏡で観察して決定し
た。前述の全ての小胞は電子顕微鏡によって０゜１ミク
ロン（１０００人）より小さい平均直径を有することが
示された。例えば口ｓｐｃ　：　ｃｈ小胞は約５２８人
の平均直径であった。しかしながら約２０００人の大き
さの小胞でも本発明の所望の結果を得るには充分である
と考えられる。

上述のようにして得られた小胞は化学的に純粋である。

゛化学的に純粋″とはリン脂質小胞を構成する物質が９
８％より高い割合で純粋であるということである。例え
ば、加えたリン脂質がジステアロイルホスフォチジルコ
リンである場合、この物質は９８％より高い純度で用い
られているということである。同じような制限が他の成
分、例えばコレステロールのようなものにも当てはまる
。このようにして得られた小胞は実験動物内に注射され
た時に安定である。

コレステロールのアミノマンノース及びアミノマンニト
ール誘導体のサツカライド部分はリン脂質小胞から外側
に向って伸長している。つまり、このような誘導体を小
胞や他のミセルの二重層内に添加ないしは会合させた場
合に、ミセル粒子の表面から約５−２５人、好ましくは
約１０人の範囲でアミン部分が伸長していることになる
。小胞の場合には、小胞二重層内の分子に足場（ａｎｃ
ｈｏｒ）を持つことのできる疎水性部分、及び少なくと
も少しは親水性であって疎水性領域とアミノ官能基との
間の必要な距離にまたがっている連結部分（Ｉｉｎｋｉ
ｎｇ　ｐｏｒｔｉｏｎ）を含む分子設計が適当であるよ
うに思われる。この親水性はこの連結部分を二重層内に
もぐり込ませないようにする為に必要であり、そしてア
ミンを表面から゛伸長（ｅｘｔｅｎｄ）　”させておく
為に明らかに必要なものである。

本発明の範囲内での適当な伸長アミンの例としては、６
−アミノマンノースコレステロール誘導体、例えば６−
（５−コレステシー３−β−イロキシ）へキシル−６−
アミノ−６−デオキシ−チオーＤ−マンノピラノサイド
である。この例では、コレステロール部分が疎水性部分
になり、一方アミノマンノースは相対的に親水性である
。他の具体例も可能である。例えば、他のコレステロー
ル誘導体に結合した他のアミノ糖類も同様に疎水性部分
及び親水性部分の代替具体例として適当である。小胞や
他のミセルの表面に共有結合又は他の方法で会合し得る
ポリアミン及びポリアミノ酸も使用し得る。これらの物
質及びコレステロールはリン脂質小胞に安定性を付与す
る傾向がある。コレステロールは全リン脂質重量の０−
５０％で含有され得、残部はリン脂質である。

上述の化学的に純粋な小胞組成物はＬｚニュヱｌびＬス
ニ丈ヱ上二に於ける漏れ（ｌｅａｋａｇｅ）に対して極
めて安定である。卵レシチンのようなリン脂質混合物は
純粋リン脂質よりももつと流動性の高い膜を形成し、そ
の結果、純粋リン脂質に較べてより容易にその内容物を
漏らすことになる。

−Ｌユ」ユυしｌｌ量 イオノフオアＡ　２３１８７の存在によって予め形成さ
れた小胞内にＩｎ−１１１を容易に負荷させる（ｌｏａ
ｄ！ｎｏ）コとができる。Ｉｎ−１１１は６０−８０℃
で小胞内に負荷される（マウク及びギセンブル、アナル
・バイオケ、　９４．３０２−３０７頁、　１９７９年
参照）。リン酸緩衝液０．９％塩化ナトリウム、　１）
８７．４　　（ＰＢＳ）中（７）１０ｍＨＥＤＴＡ溶液
０．１ｄを添加してインキュベーションを終え、セファ
デックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ−５０カラムによ
って未封入のＩｎ−１１１とこれを負荷された小胞とを
分離する。この方法によって添加したＩｎ−１１１のう
ち９０％までが予め形成された小胞内に取り込まれ、３
００μＣｉ／ａ１９脂質までの比活性が得られた。

ＥＭＴ６腫　モデル ２０−２５９重聞０オスＢＡＬＢ／ｃマウスの６侵脚部
に０、ｌｌＩｒ１滅Ｖ４ｍ塩リン酸緩衝液中の５Ｘ１０
”ＭＥＴ６細胞を皮下注射した。ｍ瘍を１０〜２０日間
増殖させた後、この動物をイメージングの研究に用いた
。この段階で腫瘍は０．２−０．４　Ｃｌであった。３
０μＣｉまでの負荷をもつ１ｍ２Ｒｇの小胞を含む０．
５−までのＰＢＳを各動物の尾静脈から注射した。

対象動物には小胞内に封入されていないＩｎ−１１１−
ＮＴＡを注射した。

ガンマカメライメージング １ｎ−１１１負荷小胞注射侵の１時間及び２４時間に、
各動物を４０■／Ｋｇのベントパルビタールナトリウム
で麻酔にかけガンママシンチレーションカメラ装置から
’＋２ｃｙｒの距離のプラットフォーム上に６ｍのビン
ホールドで固定した。体全体の背部像をＸ線フィルム上
に得、それに対応するデジタル化データを磁気ディスク
に蓄えコンピューター分析に用いた。

放射性の生物内　布 ２４時間後に動物を殺し、放射性の器官分布を測定する
ために解剖に付した。器官及び組織を削りＰＢＳで洗い
それを吸い取って乾かし秤量した。

放射性をウェル型ガンマ線スペクトロメーターで測定し
注射前の小胞内に存在した活性に基づいて定量化した。

幾つかの実験では、ガンマ線摂動角相関（ｔｈｅ　ｇａ
ｖａｍａ　ｒａｙ　ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ　ａｎｇｕｌａ
ｒ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　；　ＰＡＣ）分光学方法
を用いて各組織内のｌ　ｎ−１１１の回転相関時間（ｔ
ｈｅ　ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ
　ｔｉｍｅ）を測定し、それによって無傷の小胞内に残
存している同位元素の割合を評価した。マウク及びギャ
クブル、　Ｐ、Ｎ、＾、Ｓ　　（米国）　７６、　７６
５−７６９頁、　１９７９年を参照のこと（本明細書中
に引例として含まれている）６ オートラジオ　ラフィ Ｉｎ−１１１標識の代りに［３日］−ジパルミトイルホ
スファチジルコリン（［３）１　］　−ＤＰＰＣ）をマ
ーカーとして加えて前述の組成に類似した組成でオート
ラジオグラフィ用の小さい中性単一ラメラ小胞を調製し
オートラジオブライ感光を行った。

オートラジオブライ研究用にＥＭＴ６腫瘍切片（２５−
５Ｑｓｙ　）をメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下移植し
、５〜１２日侵に実験に供した。ＥＭＴ６腫瘍担持マウ
スにその後２２５−３５０μＣｉの［３Ｈ］標識小胞を
静脈内注射し、バックグランド用のコントロールとして
通常の食塩水を注射した。１５時間後、動物を殺した。

腫瘍、心臓、骨格筋、肝臓、牌臓、皮膚の試料を取り出
し、直ちに２％グルタルアルデヒド２％パラホルムアル
デヒド溶液に浸漬させ、１ｍ２履片に切断した。この試
料を更に１％四酸、化オスミウムで固定しその後脱水し
ＥＰＯＨ内に包埋して薄切片に切断した。

薄い（１，５μ）組織切片を顕微鏡スライド上に載せイ
ルフォード（ＩＨｏｒｄ）１４感光乳濁液でおおった。

１４−２１日間乳濁液を感光しその後現像した。組織を
１％トルイジンブルーで逆染色（ＣＯＵ口ｔｅｒ　５ｔ
ａｉｎｅｄ）シ光学顕微鏡写真を踊った。

結　　　果 ２４時間前に小さいＩｎ−１１１−Ｎ　Ｔ　Ａリン脂質
小胞を静脈内注射された腫瘍担持マウスの全身シンチグ
ラフを作成した。中性、負及び正に荷電したリン脂質小
胞を注射されたマウスでＥＭＴ６小胞のイメージが明瞭
に認められた。

腫瘍イメージングは小胞阻害（ｖｅｓｉｃｌｅ　ｂｌｏ
ｋａｄｅ）を用いると顕著に増大した。特に、中性０８
ＰＣ：ＣｈｌＪ：ｚ脂質小胞はＩｎ−１１１を多聞にＥ
ＭＴ６１１！！瘍に運搬しガンマカメライメージングに
よって腫瘍を明確に局所限定（１ｏｃａｌｉｚａｔｉｏ
ｎ）することができた。

第１表のデータからこれらの型の各小胞によって運搬さ
れたＩｎ−１１１の生物内分布の比較ができる。

第１表の第２１Ｉｌかられかるように、中性リン脂質小
胞が一番良＜　Ｉｎ−１１１を腫瘍組織に運搬した。リ
ン脂質小胞の腫瘍に対する特異的な目標攻撃はこの例で
は少なくとも、リン脂質小胞の通常の目標攻撃である肝
臓又は牌臓に対するそれと同じくらい高く、遊離のＩｎ
−１１１−Ｎ　Ｔ　Ａをイン・ヴイボで注射したときに
較べておよそ８倍もの比活性であった・この結果はこれ
まで小胞を腫瘍イメージング薬剤として用いた他の人達
が観察しなかったことである。これは第１表、第１ｆ［
Ｉ及び第２１１ＩＨの結果の比較かられかることである
。第１表からは更に、肝臓及び牌臓によるＩｎ−１１１
の取り込みが減少すると血清中に於ける残存リン脂質小
胞の濃度が上昇することがわかる。腫瘍部位の放射性も
大体血液中のＩｎ−１１１と相関して上昇する。

我々は以前にコレステロールの６−アミノマンノース誘
導体を持つ小胞が＆＞ニュヱ土工でＥＭＴ６腫瘍細胞と
強い会合することを示した。従って我々はＩｎ−１１１
で標識されたコレステロールのアミノマンノース誘導体
のリン脂質小胞を使って腫瘍イメージングを試みた。我
々はこの実験からこのようなリン脂質小胞中のＩｎ−１
１１の殆んど全てが最終的に肝臓と牌臓に沈積されると
いうことが判明した。第２表の第２欄及び第３１１１か
ら示されるようにこのようなリン脂質小胞を用いては腫
瘍に沈積する放射性が低いために腫瘍イメージングを得
ることができなかった。腫瘍に於いて放射活性の沈積が
低いのはこのような小胞の殆んど全てが肝臓及び牌臓に
取り込まれてしまったからである。

コレステロールの６−ＡＭ誘導体が低濃度であるような
小胞は肺に捕捉されないので、１ｎ−１１１負荷したＡ
Ｍ１２小ｗａ（第２表の第２欄）は第２表の第１欄の物
質よりも優れた！ｌ瘍イメージング薬剤と推定され得る
かも知れない。しかしながら第２表の第１及び第２欄を
較べるとこのようなことは言えないことが分る。実は、
ＡＭ１２小胞は肝臓及び牌臓に対して非常に高い親和性
を格っていた。例えば、血流中にリン脂質小胞を注射し
てから２４時間後に、肝臓と牌臓の放射性を合計したも
のは平均して全注ＩＩＩの７５％よりも大きいものにな
る。これは研究した幾つかの脂質組成物の中で最も高い
肝臓及び牌臓の小胞取り込み量であった。

我々は以前に正に荷電した小胞はＬλニュヱ土口で中性
や負に荷電した小胞よりもまるかに高い割合でＥＭＴ６
細胞に結合することを明らかにした。従って、我々はコ
レステロールのＡＭＬ誘導体、正に荷電した他の合成糖
脂質誘導体について研究した。これらのＡＭＬ小胞は肝
臓と牌臓に対して低い親和性を示しく第２表の第３欄）
、腫瘍による取り込みがＡＭ１２小胞（第２表の第２欄
）に較べて僅かに増加していた。しかしながら、このｔ
ｉ瘍と結合した放射性レベルはそれでも第１表で示され
た中性、正及び負の小胞のものと較べても３〜１０倍小
さいものであった。

更に、第３表に示されている組成のＩｎ−ｔ１１標識小
胞を注射する１時間前に食塩溶液（ｕ　　１１　’＋阻
害）又は８ＩＩｇＡ旧２小胞のいずれかをマウスに注射
した。２４時間後に上述の方法で組織生物内分布を測定
した。

食塩溶液はコントロールとして用い、これは肝臓及び牌
臓内の細網内皮細胞を上述のように阻害しなかった。Δ
Ｍ１２小胞は正に荷電しており肝臓及び牌臓内の細網内
皮ＩＩｌ胞を効果的に阻害した。

肝臓及び牌臓内の細網内皮ＩＩＩ胞は少なくとも部分的
にＡＭ１２小胞によって阻害されたので、その優体内の
自流に注射されたリン脂質小胞は腫瘍により多く取り込
まれた。

第１表は、肝臓及び牌臓内の細網内皮細胞のいかなる事
前の阻害なしにＩｎ−１１１を含むリン脂質小胞を血流
中に導入した時の体内の各部分を目標攻撃したＩｎ−１
１１の四を示している。それに対して、第３表は肝臓及
び牌臓内の細網内皮ｌＩｌ胞を事前に阻害した後に、Ｉ
ｎ−１１１を含むリン脂質小胞を血流内に導入した時の
体内の各部分を目標攻撃した１ｎ−１１１の量を示して
いる。第１表及び第３表の比較から分るように、阻害（
ｂｌｏｃｋａｄｅ）を用いた例の殆んどに於いて腫瘍を
目標攻撃したＩｎ−１１１の量は顕著に増大していた。

更に、阻害を用いると肝臓及び牌臓に於いて摂取された
Ｉｎ−１１１指は第１表の肝臓及び牌臓に於いて摂取さ
れたＩｎ−１１１ｊｌよりも著しく減少していた。

上記の実施例に於いて、腫瘍を目標攻撃させるべきリン
脂質小胞の第２グループは、肝臓及び牌臓内の細網内皮
細胞を阻害する目的でリン脂質小胞の第１グループを血
流内に導入した約１時間後に、血流内に導入された。こ
の１時間という間隔以外も使用し得るものである。例え
ば、１時間よりかなり短くなり得る。リン脂質小胞は肝
臓及び牌臓をかなり長い期間に亘って阻害することがで
きるので、肝臓及び牌臓を阻害（ｂｌｏｃｋ）する為の
リン脂質小胞を導入すると同時に腫瘍を目標攻撃するリ
ン脂質小胞を導入することも考えられる。

第１図はＩｎ−１１１−ＮＴＡを封入した中性小胞（Ｏ
３ＰＣ：　Ｃｈ＝　２　：　１モル比）注射後の各時間
に於ける腫瘍及び血液の放射性を示したものである。

腫瘍に於ける放射性は注射後２４時間後に最大値に達す
る。２４時間後には放射性の９０％は血中から除去され
てしまった。この結果から時間の経過と伴に、インジウ
ムを含む小胞は無傷のまま（完全なまま）血中を循環し
選択的に腫瘍に蓄積されることが推測される。

ガンマ線摂動角相関（ＰＡＣ）分光学による選ばれた組
織に於ける各時間での研究によって小胞が無傷のまま血
流中にあることが確認された。

Ｉｎ−１１１で標識されたリン脂質小胞の注射後１〜４
８時間後に各腫瘍及び各血液試料をガンマ線摂動角相Ｉ
ＩＩ　（ＰＡＣ）分光計で測定した。無傷ままの小胞の
割合として示した第２図のＰＡＣによる測定結果に依る
と、血液内の放射性の８０％以上は４８時間後も小胞内
に留まってるのに対し、腫瘍に蓄積された放射性はその
殆んどが小胞から遊離されていることが分る。この結果
は腫瘍と結合した小胞は破壊ないし溶解されて１ｎ−１
１１はタンパク質のような高分子と結合しているのに対
し、血中の小胞は完全なまま残っていることを示してい
る。

ＭｌＭのＩｎ−１１１−ＥＤＴＡと小胞に封入されたＩ
ｎ−１１１−ＥＤＴＡの生物内分布の研究によって完全
なままの小胞の腫瘍局在化が更に示された（第４表の第
１及び第２欄）。ＥＤＴＡはＮＴＡと比較して強力なキ
レート化剤であって［ｎ−１１１を遊離してタンパク質
と結合させることはしない。更に未結合のＩ　ｎ　−１
１１−ＥＤＴＡは速やかに腎臓から排出される。

従って注射後２４時間後に残存している放射性は無傷の
小胞から来たものか又は無傷の小胞内に存在するもので
あり直接に結合したタンパク質から来たものではない。

第４表の結果から２４時間後に封入されたＩ　ｎ　−１
１１−ＥＤＴＡは１４ｃ標識サレタ小Ｕ　、！：同一の
薬物動力学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示
すことが分る。遊離の［ｎ−１１１−Ｅ口■＾は速やか
に排出されるためにどの組織にも殆んど蓄積されること
がない。

小胞内部の水相ではなくて膜成分を標識した効果を次に
検討した。小胞膜成分の生物内分布を追跡する為に１４
Ｃ標識した口ＰＰＣトレーサーを小胞に加えた。血中か
らの除去と組織内の生物内分布に関して１ｎ−１１１標
識を用いた実験と同様であった（第４表第３欄）。

種々の型のｉ瘍を担持したマウス内の小胞封入１ｎ−１
１１−ＮＴＡの生物内分布の研究も行った（第５表）。

これらの腫瘍の型のうちの７種に於いてｌＩＩ瘍に関係
する放射性は組織ダラムを基に計算して、肝臓での取り
込み量のすくなくとも５０％であった。ｌ１１ｍでの比
較的低い取り込みは結腸アゾンカルシノーマ３８．Ｂ−
１６メラノーマ、及び骨肉腫に於いて観察された。これ
らの結果はＩｎ−１１１の取り込みは腫瘍の種類の違い
によって程度が様々であることを示唆するものである。

オートラジオグラフィによる研究でヒト細胞の切片を作
成した。多数の感光粒子が腫瘍の表面あるいはその近傍
の急速に増殖するＥＭＴ６細胞の充填層上に直接発現し
、こうして腫瘍細胞内の小胞の存在が示された。対照的
に腫瘍の壊死中心（ｎｅｃｒｏＮｃ　ｃｏｒｅ）はオー
トラジオグラフィで余り感光しなかった。腫瘍塊の外側
部にある脂肪細胞（ａｄｉｏｐｏｃｙｔｅｓ）及び連結
組織（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｔｓｓｕｅ）にも又感
光粒子が余り見られなかった。

肝臓切片もまたその標識の全取り込み量から予想されて
いた通りに、オートラジオグラフィに於いて高い感光を
示した。肝臓の全領域に亘って銀粒子が均一な密度を示
していることは、他者によ　　　　”って指摘されたよ
うに（Ｏエルディック（Ｒｏｅｒｄｉｎｋ）等、バイオ
ケム・エト・バイオフィシ・アクタ（Ｂｉｏｃ、ｅｔ　
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、　７７０．　１９５−
２０２頁。

１９８４年）、小さな小胞が肝細胞に達していることを
確証するものである。

牌臓切片に於いても予想以上の感光を示したが、しかし
この牌臓の高い標識に関与した細胞を明確に同定するこ
とができなかった。検査した他の組織はオートラジオグ
ラフィに於ける顕著な感光を示すことはなかった。

対照組織は均一に低いオートラジオグラフィ感光を示し
たので、この実験で得られた感光は人為的なものではな
いことが確認された。

本明細書中で調製されたリン脂質小胞は体内の腫瘍に対
する化学療法薬剤メトトレキセートのような薬剤の運搬
を増加する目的で使用することもできる。この結果は第
６表に見られる実験から分る。ＭＴＸの運搬を示す為に
、フリーな［３１−１］メトトレキセート（［３８］Ｍ
ＴＸ）及び小胞にそれを封入したものを直接腫瘍担持マ
ウスに注射した。４時間侵に腫瘍内の［３Ｈ］ＭＴＸＩ
Ｉをシンチレーション計測によって測定した。０８ＰＣ
：　Ｃｈ　：ＳＡを４：に１のモル比で含むリン脂質小
胞を［１４Ｃ］コレステロールオレートで標識し、［３
Ｈ］ＭＴＸを該リン脂賀小胞内に封入した。

表から分るように腫瘍に達したリン脂質小胞の鎖は該腫
瘍に向ったフリーなＭＴＸの量より約３倍程大きかった
。

腫瘍によるＭＴＸの取り込みは好適な中性小胞（Ｏ８Ｐ
Ｃ：　Ｃｈ−２：　１モル比）を用いると更に増大され
た（第７表参照）。［３Ｈ］ＭＴＸの取り込みに於いて
封入されたものとそうでないものとの比は３時間及び１
６時間後に於いてそれぞれ４，２及び１１．２倍であっ
た。

本発明に於いて使用される小胞技術に於ける幾つかの改
良点によって腫瘍内に小胞が無傷で完全なまま運搬され
優れた腫瘍イメージングが可能になったものと思われる
。この改良点のうちの１つは、小さくて、少なくとも１
８の炭素原子鎖から成る炭化水素を含む化学的に純粋な
リン脂質小胞を用いたことであり、それによってＬＺ二
ｍで安定で所望のイメージング薬剤又は化学療法薬剤を
腫瘍に運搬することができるのである。

更にもう１つの改良点はＩｎ−１１１がＮＴＡとの錯体
の形態で封入されたことである。ＮＴＡは相対的に弱い
キレート化剤であり血清が存在するとＮＴＡは買換され
てしまう。つまり、１ｎ−１１１を含有するリン脂質小
胞が腫瘍を目標攻撃した際に、ＮＴＡは！瘍のタンパク
質に取って代わられてしまう。Ｉｎ−１１１は強固に腫
瘍のタンパク質と結合する。このタンパク質は細胞内に
あるので、１ｎ−１１１は腫瘍部位に固定される。この
状況によってイメージングの目的に有利な２つの顕著な
点が生じる。

第１の利点は漏れによる放射性損出は殆んどないという
ことである。減衰（ｄｅｃａｙ）を補正した後に我々は
典型的には注射後生なくとも２４時間後には始めの９０
％の放射性が動物に残存していることが観察された。こ
れはガンマカウンターに於ける固定数を蓄積するのに必
要な時間を基にした値である。

第２の利点はＩ　ｎ−１１１のような標識が小胞が破壊
された部位に固定されて残存する際に、全量の他にも組
織による小胞取り込みの速度に関する情報も得ることが
できるということである。

つまり、本研究に於いて、高い腫瘍の比活性（５ｐｅｃ
ｉｆｉｃ　ａＣｔｉＶｉｔｙ）が観察されたのは２４時
間に亘って１ｎ−１１１が腫瘍内に連続的に蓄積された
結果である。小胞内に含有されたＥＤＴＡはＮＴＡに較
べて強いキレート結合を形成する。ＥＤＴＡは腫瘍部位
に於いてタンパク質と置換することはない。つまりＩｎ
−１１１は細胞内に固定残留することはない。例えば、
ＥＤＴＡがリン脂質小胞内で１ｎ−１１１にキレートし
た際には、Ｉｎ−１１１−ＮＴＡ負荷小胞と比較してた
った２５％の腫瘍比活性しか達成されなかった。

もう１つの利点というのはＩｎ−１１１は予め形成され
た小胞内に負荷されることである。この高効率の方法に
よって２００−３００μＣｔ／Ｉｌｌ脂質の比活性が得
られた。

本明細書は特定の応用を参考にしながら開示説明をしで
あるが、本発明の原理は当業者に明らかな数多くの他の
応用も含むものである。従って本発明は添付の特許請求
の範囲でのみ限定されるものである。

第１表 ダラム組織当りの％注射投与量（±標準偏差）第２表 ダラム組織当りの％注射投与量（±標準偏差）第３表 監４ｆｉ 注射２４時間後に於ける放射性標識の生物内分布！」Ｌ
ｌ 小胞による腫瘍組織へのメトトレキセートの運搬の増大

【図面の簡単な説明】

第１図は白液中の放射活性標識リン脂質小胞の除去及び
腫瘍への蓄積の経時変化を示す。 第２図はガンマ線摂動角相関（ＰＡＣ）光度計で測定し
た腫瘍及び血液中に残存している完全なままの標識リン
脂質小胞の割合を示したものである。 第３図は標識小胞を含有する腫瘍を表わす一連のオート
ラジオグラフィである。 代理人　弁理１月Ｉ　　口　義　雄 手続ンｉｆ）正置 昭和６０年１２月１２日 ２、発明の名称　　　イメージング薬剤又は化学療法薬
剤を封入したミセル粒子を体内のＨ瘍に運搬する方法３
、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名　称　　　シティ・オヴ・ホープ・ナショナル・メゾ
イノノル・センター （ほか１名） ４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４
号　山田ビル（郵便番号１６０）電話（０３）　　３５
４−８６２３６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象　　　図　面 ８゜補正の内容

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ）化学的に純粋なリン脂質分子を含む２０００
   Åより小さい中性小ミセル粒子を調製し； ｂ）腫瘍内の該粒子の部位を検出する目的のイメージン
   グ薬剤、又は該腫瘍を治療する目的の化学療法薬剤を該
   ミセル粒子内に含有し；ｃ）前記ｂ）段階で得られたミ
   セル粒子を体の血流内に導入し腫瘍内に該粒子を完全な
   まま位置させる； というステップを含む、該腫瘍の診断又は治療を目的と
   して該薬剤を用いて体内の腫瘍を目標攻撃する方法。
2. （２）前記の化学的に純粋なリン脂質分子が少なくとも
   １８の炭素原子の長さをもつ炭化水素鎖を含むことを特
   徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）前記のリン脂質がジステアロイルホスフアチジル
   コリンであることを特徴とする特許請求の範囲第１項又
   は第２項に記載の方法。
4. （４）前記の化学療法薬剤がメトトレキセートであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載
   の方法。
5. （５）前記のイメージング薬剤が放射性元素、特にガン
   マ線を放出するもの、特異的にはインジウム−１１１で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項
   に記載の方法。
6. （６）インジウム−１１１が弱いキレート化剤、特にニ
   トリロトリ酢酸とキレートを作り、特定部位に於いて、
   該放射性標識と強力な結合を形成する物質によって弱い
   キレート化剤が置換されるようにすることを特徴とする
   特許請求の範囲第４項に記載の方法。
7. （７）前記の中性ミセル粒子がリン脂質の０〜５０重量
   ％のコレステロールをも含有することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。
8. （８）ａ）それが含有されているところの粒子から外側
   に向って伸張している正に荷電した分子を持つ化学的に
   純粋なリン脂質分子を含む小ミセル粒子の第１グループ
   を調製し； ｂ）前記の正に荷電した粒子の第１グループを体の血流
   内に導入し体内のマクロファージを阻害し；ｃ）腫瘍部
   位を決定する目的のイメージング薬剤又は該腫瘍を治療
   する目的の化学療法薬剤をその中に含有する化学的に純
   粋なリン脂質分子を含む２０００Åより小さい中性小ミ
   セル粒子の第２グループを調製し；そして ｄ）前記のイメージング又は化学療法薬剤を含有する前
   記の中性ミセル粒子の第２のグループを体の血流内に導
   入しその結果該マクロファージを阻害し、腫瘍内に前記
   粒子及び前記化学療法薬剤を完全なまま位置させる； というステップを含む、該腫瘍の診断又は治療を目的と
   する該イメージング薬剤又は該化学療法薬剤を含有する
   ミセル粒子を完全なまま腫瘍内に位置させる方法。
9. （９）前記の化学的に純粋なリン脂質分子の第２グルー
   プが少なくとも１８の炭素原子からなる炭化水素を含む
   ことを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の方法。
10. （１０）前記の中性ミセル粒子がリン脂質の０〜５０重
    量％のコレステロールをも含有することを特徴とする特
    許請求の範囲第８項に記載の方法。
11. （１１）リン脂質粒子から外側に向って伸張している前
    記の正に荷電した分子がアミノ基を含有する脂質溶性分
    子であることを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載
    の方法。
12. （１２）前記の正に荷電した分子が脂質溶性分子のアミ
    ノ−サッカライド誘導体であることを特徴とする特許請
    求の範囲第１１項に記載の方法。
13. （１３）前記の正に荷電した分子がコレステロールのア
    ミノ−サッカライド誘導体であることを特徴とする特許
    請求の範囲第１２項に記載の方法。
14. （１４）アミノ−サッカライド誘導体がアミノマンノー
    ス又はアミノマンニトールであることを特徴とする特許
    請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. （１５）前記のリン脂質がジステアロイルホスフアチジ
    ルコリンであることを特徴とする特許請求の範囲第８項
    に記載の方法。
16. （１６）前記の化学療法薬剤がメトトレキセートである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の方法。
17. （１７）前記のイメージング薬剤がニトリロトリ酢酸に
    キレートしているインジウム−１１１であることを特徴
    とする特許請求の範囲第８項に記載の方法。
18. （１８）前記の小ミセル粒子が球状の単一ラメラリン脂
    質小胞の形態であることを特徴とする特許請求の範囲第
    ８項に記載の方法。
19. （１９）腫瘍の診断又は治療を目的とするイメージング
    薬剤又は化学療法薬剤を含有し化学的に純粋なリン脂質
    分子を含む２０００Åより小さいミセル粒子をその内に
    含む該腫瘍。
20. （２０）前記のイメージング薬剤がインジウム−１１１
    であることを特徴とする特許請求の範囲第１９項に記載
    の腫瘍。
21. （２１）前記の化学療法薬剤がメトトレキセートである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１９項に記載の腫瘍
    。