DE19606326A1

DE19606326A1 - Kontrastmittelhaltige Liposomenformulierung sowie deren Verwendung für die In-vivo-Diagnostik, insbesondere für die Darstellung des Intravasalraumes

Info

Publication number: DE19606326A1
Application number: DE19606326A
Authority: DE
Inventors: Andreas Dr Sachse; Georg Dr Roesling; Jens Dr Leike; Werner Prof Dr Krause; Gabriele Dr Schuhman-Giampieri; Peter Dr Muschick; Wolf-Ruediger Press
Original assignee: Schering AG
Current assignee: SACHSE, ANDREAS, DR., 10589 BERLIN, DE
Priority date: 1995-02-09
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 1996-08-22
Also published as: NO973666D0; NO973666L; CA2212162A1; EP0806969A2; WO1996024381A3; AU4789096A; WO1996024381A2; JPH10513466A

Description

Die Erfindung betrifft kantrastmittelhaltige Liposomen formulierungen mit hoher intravasaler Verweildauer, die für die Darstellung des Intravasalraumes geeignet sind.

Stand der Technik

Liposomen haben in den vergangenen Jahren zunehmende Bedeutung als patentielle Trägersysteme für die verschiedenen Typen von Kantrastmitteln erlangt. Die Verwendung liposomaler Kontrast mittelformulierungen ist für alle bildgebenden diagnostischen Verfahren (Röntgendiagnostik, Computertomographie, MRI- Diagnostik, Radiodiagnostik) beschrieben worden (Seltzer, St. E., Liposomes in diagnostic imaging, In: Gregoriadis, G. (Hrsgb.), Liposomes as drug carriers, Jahn Wiley & Sons Ltd., Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore 1988, S. 509).

Aufgrund ihrer Struktur ermöglichen die Liposomen sowohl den Einschluß hydrophiler Kontrastmittel in der Wasserphase als auch den Einschluß lipophiler Kontrastmittel in die Bilayerphase (Seltzer, St. E., Radiology 171, 19-21 (1989)).

Nach intravenöser Gabe werden Liposomen bevorzugt in den Organen des mononukleären Phagozytensystems (MPS, auch RES genannt) angereichert, wobei die höchsten Konzentrationen in der Leber und Milz erreicht werden. Dieses sogenannte passive Targeting macht man sich im Falle kontrastmittelhaltiger Liposomen zunutze, um eine selektive Anreicherung dieser Substanzen in der gesunden Leber zu erreichen. So kannte beispielsweise mit dem liposomal verkapselten Röntgenkontrast mittel Iopromid (Ultravist®) eine Abgrenzung tumoröser Veränderungen der Leber im Kaninchenmodell erzielt werden (Sachse, A. et al., Invest. Radiol. 28, 838-844 (1993)).

Das in vivo Verhalten von Liposomen läßt sich in einem hohen Maß durch eine Veränderung der chemischen Zusammensetzung sowie der physikalischen Eigenschaften der Vesikel beeinflussen. Die Bluthalbwertszeit und Organverteilung der Liposomen wird durch Parameter wie die Vesikelgröße, Oberflächenladung (Zeta potential), Lipidzusammensetzung und Lipiddosis beeinflußt (Senior, J.H., CRC Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. 3, 123-193 (1987)). So kann die Bluthalbwertszeit von Liposomen beispielsweise durch eine Reduktion der Liposomengröße bzw. eine Rigidifizierung der Membran z. B. durch Verwendung gesättigter Phospholipide (z. B. Distearoylphosphatidylcholin, DSPC) deutlich verlängert werden. Die Einführung einer Ladung wiederum kann zu einer drastischen Erhöhung der MPS Aufnahme und damit zu einer Reduktion der Bluthalbwertszeit führen. Darüber hinaus wird die Blutverweildauer sehr stark durch die applizierte Lipiddosis bzw. Partikelanzahl beeinflußt. Bei höheren Lipidkonzentrationen kommt es so zu einer Abnahme der relativen Leberaufnahme, wahrscheinlich infolge einer Sättigung des Leberaufnahmemechanismus. Gleichzeitig wird eine höhere Milzaufnahme sowie eine verlängerte Blutverweildauer beobachtet.

Im Hinblick auf therapeutische oder diagnostische Anwendungen von Liposomen bei Organen außerhalb des MPS bestand ein großes Interesse die Bluthalbwertszeit von Liposomen deutlich zu verlängern. Hierdurch erhoffte man unter anderem eine verstärkte Extravasation entsprechender Liposomen in Bereichen mit geschädigtem Gefäßendothel (z. B. Tumoren oder Entzündungen) erreichen zu können. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, daß durch die Oberflächenmodifizierung von Liposomen (Hydraphilisierung) deren Blutverweildauer verändert werden kann. Hierbei erwiesen sich vor allem Lipidderivate des Polyethylenglycols (z. B. DSPE-PEG1900) gegenüber den zunächst verwendeten Palysacchariden oder Glykolipiden (z. B. GMI) als günstig (Allen, T.M., Adv. Drug. Delivery Rev. 13, 285-309 (1994)). Dieser Effekt der PEGylierung wird auf die Ausbildung einer sterischen Barriere an der Liposomenoberfläche zurück geführt, durch die die Wechselwirkung der Liposomen mit ver schiedenen Plasmabestandteilen (z. B. Plasmaproteine oder Opsonine) deutlich verändert wird. Die Bluthalbwertszeiten solcher sterisch stabilisierter Liposomen (SSL) liegen bei Verwendung von PEGs mit Molekulargewichten zwischen 1900 und 5000 im Bereich von etwa 9 bis 16 Stunden. Die Leberaufnahme entsprechender Liposomen (100-200 nm) erreichte dabei Werte bis etwas unterhalb 25% der applizierten Dosis. Festzuhalten ist jedoch, daß die Leber und Milz nach wie vor die Hauptauf nahmeorgane für die SSL darstellen.

Im Falle der Anwendung liposomaler Zubereitungen für die Darstellung des Intravasalraumes (blood pool imaging) ist es notwendig eine Aufnahme der Liposomen in das MPS weitestgehend zu vermeiden. Aufgrund des relativ großen Blutvolumens benötigt man insbesondere bei der CT hohe Kontrastmittelkonzentrationen im Gefäßsystem, um eine aussagefähige Bildgebung zu ermög lichen. Kommt es im Rahmen von diagnostischen Untersuchungen im Bereich des Gefäßsystems zu einer Anreicherung des liposomalen Kontrastmittels beispielsweise in der Leber und Milz, so kann dies u. U. zu einer nachteiligen Beeinflussung der Funktionen des MPS (z. B. Immunabwehr) führen. An Mäusen ließ sich so schon mit kleinen bis mittleren Placebo-Liposomendosen (20-80 mg/kg) eine deutliche Beeinträchtigung des MPS-Aufnahme vermögens für Kohlepartikel nachweisen (Allen, T.M. et al., Jaurn. Pharm. Exper. Therap. 229, 267-275 (1984)). Darüber hinaus kann auch das verkapselte Kontrastmittel zu Veränderungen des RES führen.

Wie weiter oben bereits erwähnt, haben liposomale Kontrast mittel bereits Eingang in die Entwicklung von organspezifischen Kantrastmitteln gefunden. So beschreibt die WO 88/09165 injizierbare, wäßrige Liposomenzubereitungen mit iodhaltigen Röntgenkontrastmitteln sowie ein Verfahren zur Herstellung entsprechender Formulierungen. Aufgrund der Größe (0,15-3 µm) sowie der hohen Kontrastmitteleinschlüsse (Iod/Lipidquotient zwischen 1,5 und 6 g/g) sollen entsprechende Zubereitungen besonders für die Darstellung der Leber geeignet sein.

In der EP 0160552 A2 sind micellare bzw. liposomale Kontrast mittel für die magnetische Resonanztomographie (MRT, MRI) beschrieben. Die erfindungsgemäßen, kleinen unilamellaren Liposomen (SUV 60 ± 10 nm) sollen nach i.v. Applikation an tumortragenden Mäusen zu einer verstärkten Tumoranreicherung des liposomalen Gd-DTPA führen.

In WO 90/04943 sind liposomale MRT Kontrastmittel, Methoden für deren Herstellung sowie Anwendungen beschrieben. Die er findungsgemäßen Liposomen weisen einen mittleren Durchmesser unterhalb von 50 nm auf und sollen neben der Anwendung zur Darstellung von Tumoren der Leber und Milz auch für die Dar stellung des Gefäßsystems, des Herzens sowie die Perfusion von Geweben (blood pool imaging) geeignet sein. Diese kleinen Liposomen weisen jedoch den Nachteil auf, daß aufgrund ihres beschränkten Volumens nur geringe Mengen hydrophiler Komponenten eingeschlossen werden können. Ferner wurde in Abhängigkeit von der Lipidzusammensetzung der Liposomenmembran bei MRI-Kontrastmitteln eine deutliche Reduktion der Relaxivität der verkapselten Komponente beschrieben. In jüngerer Zeit haben daher lipophile, paramagnetische Chelate zunehmend an Bedeutung gewannen. Diese Komponenten sind in die Liposomenmembran (Bilayer) eingebaut und verhalten sich hin sichtlich ihrer Pharmakakinetik daher wie die Membranlipide. Entsprechende Liposomen (Memsomes), welche zur Verlängerung der Bluthalbwertszeit zusätzlich oberflächenmodifiziert (PEGylilert) wurden, sollen aufgrund ihrer hohen Relaxivität besonders für das blood-pool imaging geeignet sein (Tilcack, T., J. Liposome Res. 4, 909-936 (1994)).

Der letztgenannte Autor beschreibt ferner aberflächen modifizierte (PEG) Liposomen zur Darstellung des Gefäßsystems in der Nukleardiagnostik. Hierbei kann die radioaktive Komponente entweder in der inneren Wasserphase oder der Membranphase eingeschlossen sein. An der Oberfläche radioaktiv markierte Liposomen (PE-DTTA und 99mTc), mit einem mittleren Durchmesser von ca. 100 nm, wiesen bei Oberflächenhydra philisierung mit 4-6 mol% PE-PEG 6000 (SSL) eine Bluthalbwertszeit oberhalb von 12 Stunden auf. Nach 8 Stunden kannte mit entsprechenden Zubereitungen eine hohe Aktivität im Herzen und den Blutgefäßen erhalten werden. Gleichzeitig war jedoch eine deutliche Leberanreicherung nachweisbar.

Die Darstellung des Gefäßsystems hat eine sehr große Bedeutung in der radiologischen Praxis. Neue Kontrastmittel für eine spezifische Darstellung von Gefäßen und dem Herz (z. B. partikuläre Systeme, Makromoleküle) sollten nach einer intravenösen Injektion einen längeren Zeitraum im Gefäßsystem verbleiben. Durch diesen "blood pool effect" neuer Kontrast mittel, könnten viele pathologische Zustände, die einerseits durch eine Verminderung des Blutflusses (z. B. durch Thrombase, Embolien, Tumoren) oder andererseits durch eine abnorme Zunahme des Blutflusses (z. B. durch die Störung der kapillären Integrität) charakterisiert sind, mit nichtinvasiven Methoden genauer diagnostiziert werden. Weiterhin wäre eine exakte Darstellung der Perfusion verschiedener Gewebe und Organe (z. B. Herz, Lunge) bzw. von pathologischen Veränderungen im Herzen (z. B. Herzklappendefekte) zu erreichen.

Die bisherigen Ansätze zur Bereitstellung entsprechender Kontrastmittel in der CT und MRT scheiterten an den unzureichenden, pharmazeutischen bzw. pharmakologischen Eigenschaften dieser Arzneistoffträgersysteme. So ist es notwendig entsprechende Kontrastmittel mit definierten chemisch-physikalischen Eigenschaften in großen Mengen reproduzierbar herstellen zu können. Darüber hinaus muß trotz der Notwendigkeit der Gabe großer Kontrastmittelmengen (vor allem für die Anwendung in der CT) eine sehr gute Verträg lichkeit der entsprechenden Trägersysteme gegeben sein, um zu einer positiven Risiko/Nutzen Abschätzung zu gelangen. Da der diagnostisch relevante Untersuchungszeitraum für die Darstellung des Intravasalraumes sich etwa über den Bereich von ca. zwei Stunden nach der Injektion (p.i.) beschränkt, sollten entsprechende Kontrastmittel möglichst rasch und vollständig ausgeschieden werden. Ferner sollte es zu keiner übermäßigen Anreicherung in bei dieser Indikation diagnostisch nicht relevanten Bereichen kommen.

Es besteht daher für die Darstellung des Intravasalraumes ein Bedarf an liposomalen Kontrastmitteln, die die o.g. Nachteile vermeiden, eine hinreichende Bluthalbwertszeit aufweisen und sich nur in geringem Maße in Leber, Milz oder anderen Organen anreichern.

Diese Aufgabe wurde durch die vorliegende Erfindung gelöst, insbesondere durch die liposomalen Kontrastmittel formulierungen, wie sie in den Patentansprüchen gekennzeichnet sind.

Die Erfindung betrifft daher wirkstoffhaltige Liposomenformulierungen, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
40-90% Phospholipide oder Amphiphile,
10-50% Sterole,
0-25% Ladungsträger,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 100-400 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein Röntgen- oder MRI-Kontrastmittel oder ein Radiodiagnostikum ist.

Die Erfindung betrifft bevorzugt wirkstoffhaltige Liposomenformulierungen, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
40-70% Phospholipide oder Amphiphile,
30-50% Sterole,
5-20% Ladungsträger,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 100-400 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein Röntgen- oder MRI-Kontrastmittel oder ein Radiodiagnostikum ist.

Die Erfindung betrifft besonders bevorzugt wirkstoffhaltige Liposomenformulierungen, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
60-70% Phosphatidylcholin,
20-30% Cholesterol,
2-10% Phosphatidylglycerol, Phasphatidsäure und/oder Cholesterolhemisuccinat,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 150-350 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein Röntgen- oder MRI-Kontrastmittel oder ein Radiodiagnostikum ist.

Die zur Herstellung erfindungsgemäßer, kontrastmittelhaltiger Liposomenzubereitungen geeigneten Verfahren bzw. Verfahrens schritte können i.d.R. den in der Liposomentechnologie bekannten Standardmethoden zugerechnet werden. (z. B. New, R.R.C., Preparation of liposomes, In: New, R.R.C. (Hrsgb.), Liposomes: a practical approach, Oxford University Press, New York, 1990). Zur Herstellung von Liposomensuspensionen mit den erfindungsgemäßen Eigenschaften eignet sich jedoch in besonderer Weise die kontinuierliche Hochdruckextrusion (WO 94/08626). Darüber hinaus kann jedoch beispielsweise auch die Verwendung anderer mechanischer- oder Mehrphasen dispersionsverfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Zubereitungen erfolgen. Die auf diese Weise produzierten erfindungsgemäßen Liposomenzubereitungen können direkt oder in lyophilisierter Form gelagert bzw. zur Anwendung bereitgehalten werden. Letztere Proben sind jeweils vor der Anwendung zu resuspendieren.

Die erfindungsgemäßen Liposomenformulierungen enthalten neben dem verkapselten Anteil eines hydrophilen (wasserlöslichen) Kontrastmittels einen unverkapselten Anteil desselben. Der verkapselte Anteil liegt i.d.R. zwischen 15 und 95% der Gesamtkonzentration. Besonders geeignet sind jedoch solche Zubereitungen bei denen zwischen 30 und 75% verkapselt sind. Die besten Ergebnisse wurden mit Zubereitungen erzielt in denen 40 bis 65% des Kontrastmittels verkapselt sind. Es kannte gezeigt werden, daß überraschenderweise der freie Kontrastmittelanteil eine positive Beeinflussung der diagnostischen Qualität der erfindungsgemäßen Zubereitungen bedingt.

Zur Herstellung erfindungsgemäßer Formulierungen geeignete, hydrophile Kontrastmittel (Diagnostika) sind aus der radialogischen Praxis (z. B. CT, MRT, Nukleardiagnostik) allgemein bekannt. Hierzu gehören zunächst einmal die Röntgenkontrastmittel wie beispielsweise Amidotrizoat, Metrizoat, Iopromid, Iohexol, Iopamidol, Iosimid, Ioversol, Iomeprol, Iopentol, Ioxilan, Iobitridol, Ioxaglat, Iotrolan, Iodixanol, Bis-[{3-N-(2,3-Dihydroxypropyl-carbamoyl)-5- carbamoyl}-2,4,6-triiod-N-(2,3-dihydroxypropyl)-anilid] malonsäure und 5-Hydroxyacetylamino-2,4,6-triiod isophthalsäure- [(2,3-dihydroxy-N-methyl-propyl)-(2,3- dihydroxypropyl)]diamid, die in der CT Verwendung finden. Nicht limitierende Beispiele aus dem Bereich der MRT (NMR)- Kontrastmittel sind beispielsweise Gd-DTPA, Gd-EOB-DTPA, Gd- DOTA, Gd-BOPTA und Mn-DPDP. Bei den MRT-Kontrastmitteln sind Verbindungen auf der Basis von metallhaltigen Makrozyklen, wie beispielsweise Gadobutrol, zur Herstellung erfindungsgemäßer Formulierungen besonders geeignet.

Bei den MRT Kontrastmitteln können auch solche Substanzen Verwendung finden, die andere Zentrolatome als Gadolinium enthalten. Weitere geeignete Lanthaniden sind so beispielsweise Dysprosium oder Ytterbium. Bei speziellen, erfindungsgemäßen Anwendungen können solche Substanzen (wie z. B. Dy- oder Yb-EOB- DTPA) auch als kontrastgebende Komponenten für die Computertomographie eingesetzt werden.

Die wäßrige Phase kann ferner die dem Fachmann bekannten Hilfsstoffe wie beispielsweise Puffersubstanzen, isotonisierende Zusätze oder konservierende Zusätze enthalten.

Die bei den erfindungsgemäßen Formulierungen verwendeten Lipidbestandteile sind in der Literatur allgemein beschrieben. Bei den Phospholipiden handelt es sich um natürliche oder synthetische Phospholipide wie beispielsweise Phosphotidyl cholin, Phosphatidylethanolamin oder Sphingolipide, wobei natürlich vorkommende Phospholipide, wie z. B. Sojaphosphatidylcholin (SPC) und Eiphosphatidylcholin (EPC) bevorzugt sind. Es können auch Gemische der vorstehend genannten Komponenten verwendet werden.

Als amphiphile Substanzen seien beispielsweise Hexadecyl poly(3) glycerol, Dialkylpoly(7) glycerol-ether und Alkylglucoside genannt. Es können auch Gemische der vorstehend genannten Komponenten verwendet werden. Darüber hinaus können aber auch andere synthetisch oder biotechnologisch gewonnene amphiphile Substanzen zur Herstellung erfindungsgemäßer Liposomen verwendet werden. Bei Verwendung von amphiphilen Substanzen werden sogenannte Niosomen, d. h. Liposomen aus nicht-ionogenen Vesikelbildnern erhalten.

Als Sterol wird inbesondere Cholesterol verwendet.

Als Ladungsträger werden beispielsweise Komponenten wie Fettsäuren (z. B. Stearinsäure, Palmitinsäure), Dicetylphosphat, Cholesterolhemisuccinat oder natürliche bzw. synthetische Phospholipide wie Phosphatidylglycerol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure oder Phosphatidylinositol eingesetzt. Weiterhin können auch geladene amphiphile Substanzen (s. o.) als Ladungsträger verwendet werden. Es können auch Gemische der vorstehend genannten Komponenten verwendet werden.

Zusätzlich kann die Liposomenmembran auch konservierende Zusätze wie beispielsweise α-Tocopherol als Antioxidans enthalten.

Die erfindungsgemäßen Liposomenzubereitungen enthalten keine aberflächenhydraphilisierenden Zusätze wie beispielsweise DSPE- PEG oder GMI (s.o) zur Verlängerung der Bluthalbwertzeit. Es kannte gezeigt werden, daß DSPE-PEG-haltige Zubereitungen eine reduzierte, akute Verträglichkeit gegenüber unmodifizierten Liposomen aufweisen.

Besonders geeignete Formulierungen werden erhalten, wenn die als Ausgangsstoffe verwendeten Lipide in folgenden Mischungs verhältnissen vorliegen:

a) 60% Sojaphosphatidycholin, 30% Cholesterol, 10% Sojaphosphatidylglycerol,
b) 70% Sojaphosphatidycholin, 20% Cholesterol, 10% Sojaphosphatidylglycerol,
c) 75% Sojaphosphatidycholin, 20% Cholesterol, 5% Sojaphosphatidylglycerol,
d) 50% Sojaphosphatidycholin, 40% Cholesterol, 10% Sojaphosphatidylglycerol,
e) 60% Sojaphosphatidycholin, 30% Cholesterol, 10% Distearoylphosphatidylglycerol,
f) 70% Sojaphosphatidycholin, 20% Cholesterol, 10% Distearoylphosphatidylglycerol,
g) 60% Sojaphosphatidycholin, 30% Cholesterol, 10% Dimyristoylphosphatidylglycerol,
h) 60% Sojaphosphatidycholin, 30% Cholesterol, 10% Distearoylphosphatidsäure,
i) 70% Sojaphosphatidycholin, 20% Cholesterol, 10% Distearoylphosphatidsäure oder
k) 75% Sojaphosphatidycholin, 20% Cholesterol, 5% Distearoylphosphatidsäure.

Der mittlere Durchmesser erfindungsgemäßer Liposomen formulierungen liegt zwischen 100 und 400 nm (gemessen durch Photonenkorrelationsspektraskapie (PCS), siehe Beispiele). In besonders geeigneten Zubereitungen weisen die Liposomen mittlere Durchmesser zwischen 150 und 250 nm auf.

Die erfindungsgemäßen Liposomenformulierungen sind bei Kühlschranklagerung über einen Zeitraum von mindestens 9 Monaten meistens jedoch mehr als 12 Monaten stabil. In besonders geeigneten Fällen sind entsprechende Formulierungen auch bei Raumtemperatur über diesen Zeitraum stabil. Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Liposomenformulierungen hitzesterilisierbar. So zeigten Versuche mit erfindungsgemäßen Formulierungen, die 20 min. bei 121°C behandelt wurden, daß keine signifikanten Veränderungen eintraten.

Bei den besonderen pharmakologischen Eigenschaften erfindungs gemäß er Formulierungen, ist zunächst einmal die begrenzte Plasmastabilität (z. B. in Humanplasma) zu nennen. So wurde in vitro gezeigt, daß der Verkapselungsgrad schon in den ersten 2 h um ca. 20 bis 30% abnahm. Bis 6 h nach Vermischung der Liposomensuspension mit dem Plasma nahm der Anteil des verkapselten Kontrastmittels weiter ab (auf ca. 60%). Vorzugsweise liegt die Plasmastabilität der erfindungsgemäßen Formulierungen im Humanplasma nach 2 h im Bereich von 50-90 bzw. 60-80% des ursprünglich verkapselten Anteils.

Durch die frühe leakage des Kontrastmittels aus den Liposomen wird eine rasche Elimination der kontrastgebenen Komponente ermöglicht. Werden entsprechende, leere Liposomen zu späteren Zeitpunkten in Organen des MPS angereichert, so kommt es zu keiner intrazellulären Belastung durch das Kontrastmittel. Insofern werden im Rahmen erfindungsgemäßer Anwendungen i.d.R. auch keine Liposomen mit lipaphilen Kontrastmitteln benutzt, da diese sich zusammen mit der Liposomenhülle zu späteren Zeitpunkten in Leber und Milz anreichern würden.

Die maximale Kontrastmittelanreicherung erfindungsgemäßer Liposomenformulierungen in Leber und Milz innerhalb von einen Zeitraum von 24 h liegt in der Regel unterhalb von 10%, immer jedoch unterhalb von 20%. Zu späteren Zeitpunkten findet nach Gabe erfindungsgemäßer Formulierungen keine weitere Erhöhung der Kontrastmittelkonzentration in Leber und Milz gegenüber den frühen Zeitpunkten statt, d. h. es tritt keine Spätanreicherung auf. Trotz der geringen Anreicherung erfindungsgemäßer Formulierungen in Leber und Milz werden vorzugsweise solche Kontrastmittel verkapselt, die eine rasche und vollständige Ausscheidung aus dem MPS aufweisen und darüber hinaus keine toxischen Zersetzungsprodukte bilden.

Mit erfindungsgemäßen Liposomenzubereitungen werden zu frühen Zeitpunkten (15 bis 60 min p.i.) Blutkonzentrationen bis zu 75% der applizierten Dosis im Blut gefunden, in der Regel 30-55%. Nach 4 h liegt die mittlere Blutkonzentration jedoch unterhalb von 25%, in der Regel bei 15 bis 20%.

Die Bluthalbwertszeiten der erfindungsgemäßen, liposomalen Kontrastmittel betragen in der Regel weniger als 8 Stunden, immer jedoch weniger als 16 Stunden.

Es konnte gezeigt werden, daß sich die erfindungsgemäßen Liposomenformulierungen überraschenderweise besonders für die Anwendung in blood-pool imaging Indikationen eignen. So zeigten beispielsweise Iopromid-haltige Liposomen in einer Dosis von 200 mg Gesamtiod/kg im Kaninchen eine deutliche Zunahme der Röntgendichte im Blut über den gesamten Untersuchungszeitraum von 20 Minuten. Im direktem Vergleich zu dem wäßrigen, monomeren Kontrastmittel Iopromid (Ultravist®) kannte so beispielweise für die Liposomen ein deutlich höherer Kontrastunterschied (ΔHU) zwischen Aorta und Lebergewebe nachgewiesen werden.

In Organverteilungsstudien an Ratten wurde mit einer erfindungsgemäßen Formulierung nach i.v. Gabe von 250 mg Gesamtiod/kg (eingesetzte Iod/Lipidmenge 1 : 1,5) ebenfalls eine Blutkonzentration von ca. 1,8 mg Iod/g (angenommenes Blutvolumen 58 ml/kg) nach 15 min erhalten. Dieser Wert liegt im Bereich der 1,0 bis 5,0 mg Iod/g vorzugsweise 1,5 bis 3,0 mg Iod/g die für ein diagnostisches Imaging als ausreichend angesehen werden. Zu früheren Zeitpunkten (< 15 min p.i.) können deutlich höhere Iodkonzentrationen erreicht werden, die diagnostisch ebenfalls von Vorteil sind. Diese liegen so beispielsweise im Bereich von maximal 10-25 mg Iod/g bzw. 15-20 mg Iod/g.

Trotz der relativ hohen Kontrastmittelkonzentrationen, die in dieser CT Anwendung benötigt werden, sind hier überraschender weise die erfindungsgemäßen Formulierungen mit ihren relativ niedrigen Iod/Lipidquotienten besonders geeignet. Das Verhältnis eingeschlossenes Iod zu verwendetem Lipid bei den erfindungsgemäßen Formulierungen liegt so lediglich im Bereich von etwa 0,1 bis 1,4, bevorzugt 0,2-0,8 mg, besonders bevorzugt 0,25-0,65 mg verkapseltes Iod/mg Lipid.

Im Hinblick auf die Anwendung erfindungsgemäßer Formulierungen in der MRT konnte anhand von Organverteilungsstudien an Ratten ebenfalls eine ausreichende Anreicherung der kontrastgebenen Komponente über einen diagnostisch relevanten Zeitraum erreicht werden. So wurde beispielsweise nach i.v. Gabe von 0,3 mmol Gesamt-Gd/kg (liposomales Gd-EOB-DTPA, eingesetze Gd/Lipidmenge [µmol/mg] = 1 : 1,5) 15 Minuten p.i. eine Blutkonzentration von ca. 1,7 µmol Gd/g (angenommenes Blutvolumen 58 ml/kg) erhalten. Nach 60 Minuten lag die Blutkonzentration noch bei ca. 1,1 µmol Gd/g und somit nach immer im diagnostisch relevanten Konzentrationsbereich von 0,15-2,5 µmol/g bzw. vorzugsweise 0,5 bis 2,0 µmol/g. Ähnlich wie in der oben beschriebenen Anwendung in der CT können auch hier zu frühen Zeitpunkten (< 15 min) wiederum wesentlich höhere Kontrastmittelkonzentra tionen im Blut resultieren.

Zur Herstellung erfindungsgemäßer Formulierungen für die MRT sind vor allem makrozyklische Kontrastmittel, wie Gadobutrol, besonders geeignet. Entsprechende Formulierungen gewährleisten eine rasche und vollständige Ausscheidung des Kontrastmittels. Die erfindungsgemäßen Formulierungen zeichnen sich darüber hinaus durch eine gegenüber dem freien Kontrastmittel nicht oder nur geringfügig veränderte Relaxivität aus.

Ausführungsbeispiele

Die folgenden Beispiele sollen den Erfindungsgegenstand erläu tern ohne ihn auf diese beschränken zu wollen.

Die hierbei verwendeten Abkürzungen sind nachfolgend definiert:

FEA
Röntgenfluoreszenzspektroskopie (Kaufman, L. et al., Invest. Radiol. 11, 210-215 (1976))
PCS	Photonenkorrelationsspektroskopie, Verfahren zur Messung von Teilchengrößen unter 1 µm (Gerät: Nicomp model 370)
⌀	Mittlerer Durchmesser (bestimmt durch PCS)
SPC	Sojaphosphatidylcholin, Lipoid S 100, Fa. Lipoid KG, Ludwigshafen
SPG	Sojaphosphatidylglycerol, Lipoid SPG, Fa. Lipoid KG
CH	Cholesterol, Cholesterol gepulvert, Fa. Merck, Darmstadt
CHHS	Cholesterolhemisuccinat, Fa. Sigma, Deisenhofen
DSPG	Distearoylphosphatidylglycerol, Fa. Sygena, Liestal, CH
DSPS	Distearoylphosphatidylserin, Fa. Sygena, Liestal, CH
DSPA	Distearoylphosphatidsäure, Fa. Sygena, Liestal, CH
DPPA	Dipalmitoylphosphatidsäure, Fa. Sygena, Liestal, CH
DMPG	Dimyristoylphosphatidylglycerol, Fa. Sygena, Liestal, CH
SPC35	Teilhydriertes Sojaphosphatidycholin; Lipoid SPC 35, Fa. Lipoid KG, Ludwigshafen
EPC	Eiphosphatidycholin; Lipoid E 100, Fa. Lipoid KG, Ludwigshafen
MW ± SD	Mittelwert ± Standardabweichung

Beispiel 1 Herstellung Iopromid-haltiger Liposomensuspensionen

Mit einer kontinuierlichen Hochdruckextrusionsmethode (incl. freeze-thaw) (Schneider, T. et al., Drug. Dev. Ind. Pharm. 20, 2787-2807 (1994)) werden Iopromid-haltige Liposomen mit verschiedenen Lipidzusammensetzungen hergestellt und hin sichtlich ihrer Eigenschaften untersucht.

Beispiel 2 Lagerstabilität Iopromid-haltiger Liposomensuspensionen

Gemäß Beispiel 1 hergestellte Liposomen (SPC/CH/SPG 6 : 3 : 1, eingesetzte Iod/Lipidmenge 1 : 1,5) werden im Kühlschrank bzw. bei Raumtemperatur gelagert und nach 9 Monaten hinsichtlich ihrer Stabilität untersucht.

Beispiel 3 Herstellung Gd-haltiger Liposomensuspensionen

Liposomen mit Gd-haltigen MRT Kontrastmitteln werden mittels des unter Beispiel 1 beschriebenen Hochdruckextrusions verfahrens hergestellt.

Beispiel 4 Plasmastabilität Iopromid-haltiger Liposomen

Gemäß Beispiel 1 hergestellte Liposamensuspensionen (Ansatz A: 198 nm, 42,9% verkapselt, Ansatz B: 103 nm, 34,7% verkapselt) wurden mit Humanplasma vermengt, wobei eine Iodkonzentration von ca. 5 mg/ml eingestellt wurde. Jeweils 1 ml dieses Plasma- Kontrastmittelgemisches wurde anschließend in einer Dianorm Gleichgewichtsdialyseapparatur (Dianorm, Heidelberg) gegen das entsprechende Humanplasma durch Dialysemembranen mit einem cutoff von 5000 Da (Dianarm) dialysiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben aus der Retentat- und Permeatseite entnommen und der Iodgehalt mittels Röntgenfluoreszenzspektra skapie (FEA) bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind der Fig. 1 zu entnehmen.

Beispiel 5 Organverteilung Iopromid-haltiger Liposomen bei der Ratte

Die in Beispiel 4 aufgeführte Liposomensuspension (Ansatz A) wurde in einer Dosis von 250 mg Gesamtiod/kg 16 männlichen Ratten (Gewicht: 137-160 g) injiziert und jeweils 4 Tiere 0,25; 1; 4 und 24 h nach der Injektion getötet. Anschließend wurden Leber, Milz, Lunge und Blut hinsichtlich ihres Iodgehalts mittels FEA untersucht. Der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse (% der applizierten Dosis/Organ) zu entnehmen.

Beispiel 6 Organverteilung oberflächenmodifizierter (DSPE- PEG) Liposomen

Eine DSPE-PEG-haltige Liposomensuspension (SPC/CH/SPG 6 : 3 : 1 + 5 mol% DSPE-PEG 2000-204 nm, 45% verkapselt) wurde in einer Dosis von 250 mg Gesamtiod/kg 16 männlichen Ratten (Gewicht: 136-160 g) injiziert und jeweils 4 Tiere 0,25; 1; 4 und 24 h nach der Injektion getötet. Anschließend wurden Leber, Milz, Lunge und Blut hinsichtlich ihres Iodgehalts mittels FEA untersucht. Der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse (% der applizierten Dosis/Organ) zu entnehmen.

Beispiel 7 Blood-pool imaging (CT) beim Kaninchen

Die in Beispiel 4 aufgeführte Liposomensuspension (Ansatz A) wurde in einer Dosis von 200 mg Gesamtiod/kg am Kaninchen untersucht. Als Kontrolle wurde das monomere Röntgenkontrast mittel Ultravist® (Iopromid (INN)) verwendet. Es wurde die Röntgendichte in Hounsfield Units (HU) in der Aorta und im Lebergewebe von 0 bis 20 Minuten nach einmaliger intravenöser Applikation gemessen (Spirol-CT, Somatom plus S, Firma Siemens, bei 120 kV). Aus den Meßwerten wurde die Fläche unter der Signal-Zeit-Kurve für Aorta und für Leber über 20 Minuten in HU_*min berechnet; die Differenz zwischen Aorta und Lebergewebe ist ein Maß für die Kontrastqualität. Die Ergebnisse wurden in Fig. 2 dargestellt.

Wie aus Fig. 2 deutlich wird, ist der Signalunterschied zwischen Aorta und Leber für die Iopromid-Liposomen deutlich höher als für das freie Iopromid (Ultravist®).

Beispiel 8 Plasmastabilität Gd-DTPA-EOB-haltiger Liposomen

Die Stabilität Gd-EOB-DTPA-haltiger Liposomen (Ansatz A: 359 nm, 51,3% verkapselt, Ansatz B: 105 nm, 32,6% verkapselt, s.a. Beispiel 3) in Humanplasma wurde wie unter Beispiel 4 beschrieben untersucht. Die bei der GGD eingesetzte Gd- Konzentration lag dabei bei 20 µmol Gd/ml. Das Ergebnis wurde in Fig. 3 dargestellt.

Beispiel 9 Blutspiegelverläufe nach Gabe Gd-EOB-DTPA-haltiger Liposomen an der Ratte

Die in Beispiel 8 aufgeführten Liposomensuspensionen (Ansatz A und B) wurden in einer Dosis von 0,3 mmol Gesamt-Gd/kg 16 männlichen Ratten (Gewicht: 137-158 g) injiziert und jeweils 4 Tiere 0,25; 1; 4 und 24 h nach der Injektion getötet. Anschließend wurden der Gd-Gehalt im Blut mittels ICP-AES (induktiv gekoppelte Plasmaatomemissionsspektroskopie) bestimmt. Auf eine Darstellung der Leberkonzentrationen wurde hier verzichtet, da sich auch das unverkapselte Gd-EOB-DTPA spezifisch in der Leber anreichert (Leberkontrastmittel für die MRT). Der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse (% der applizierten Dosis/Blut) zu entnehmen.

Beispiel 10 Blood-pool enhancement (CT) durch Gd-EOB-DTPA Liposomen am Kaninchen

Eine Gd-EOB-DTPA-haltige Liposomensuspension (Ansatz A, s. Beispiel 8) wurde in einer Dosis von 0,3 mmol Gd/kg i.v. (Ohrrandvene) einem anästhesierten Kaninchen verabreicht (3 ml/min). Da Gd-EOB-DTPA, welches eigentlich als MRT Leberkontrastmittel eingesetzt wird, auch Röntgenstrahlen absorbiert, konnte hier versuchsweise die Computertomographie (CT) zum Nachweis der Anreicherung der liposomalen Komponente im Blut herangezogen werden. In Fig. 4 ist der Verlauf der Röntgendichte in ΔHU in der Aorta über einen Zeitraum von einer Stunde dargestellt.

Claims

1. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
40-90% Phospholipide oder Amphiphile,
10-50% Sterole,
0-25% Ladungsträger,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 106-400 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein Röntgen- oder MRI-Kontrastmittel oder ein Radiodiagnostikum ist.

2. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung, dadurch gekennzeichnet, daß

3. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
60-70% Phosphatidylcholin,
20-30% Cholesterol,
2-10% Phosphatidylglycerol, Phosphatidsäure und/oder Cholesterolhemisuccinat,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 150-350 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein Röntgen- oder MRI-Kontrastmittel oder ein Radiodiagnostikum ist.

4. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß Phosphatidyl cholin, Phosphatidylethanolamin, Sojaphosphatidylcholin, Eiphosphatidycholin oder ein Sphingolipid als Phospholipid verwendet wird.

5. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß Hexadecyl poly(3)glycerol, Dialkylpoly(7)glycerolether oder ein Alkylglucosid als amphiphile Substanz verwendet wird.

6. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß Cholesterol als Sterol verwendet wird.

7. Wirkstoffhaltige Liposamenformulierung gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als Ladungsträger eine Fettsäure, Dicetylphosphat, Cholesterolhemisuccinat, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure oder Phosphatidylinosital verwendet wird.

8. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als Ladungsträger mindestens eine amphiphile Substanz verwendet wird.

9. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 150-250 nm aufweisen.

10. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff nur teilweise in den Liposomen verkapselt ist.

11. Wirkstoffhaltige Liposamenformulierung gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß 30-75% des Wirkstoffs in den Liposomen verkapselt sind.

12. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß 40-65% des Wirkstoffs in den Liposomen verkapselt sind.

13. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Mischungsverhältnisse der Komponenten vorliegen:

14. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff Amidotrizoat, Metrizoat, Iopromid, Iohexal, Iopamidol, Iosimid, Ioversol, Iomeprol, Iopentol, Ioxilan, Iobitridol, Ioxaglat, Iotrolan, Iodixanol, Bis-[{3-N-(2,3-Dihydroxy propyl-carbamoyl)-5-carbamoyl}-2,4,6-triiod-N-(2,3-di hydroxypropyl)-anilid]-malonsäure oder 5-Hydroxyacetyl amino-2,4,6-triiod-isophtholsäure- [(2,3-dihydroxy-N-methyl propyl)-(2,3-dihydroxypropyl)]diamid ist.

15. Wirkstoffhaltige Liposomenformulierung gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff Gd-DTPA, Gd-EOB-DTPA, Yb-EOB-DTPA, Dy-EOB-DTPA, Gd-DOTA, Gd-BOPTA, Gadobutrol oder Mn-DPDP ist.

16. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposomenformulierung für die Herstellung eines Mittels für die Röntgendiagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
40-90% Phospholipide oder Amphiphile,
10-50% Sterole,
0-25% Ladungsträger,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 100-400 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein Röntgenkontrastmittel ist.

17. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposomenformulierung für die Herstellung eines Mittels für die Röntgendiagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
40-70% Phospholipide oder Amphiphile,
30-50% Sterole,
5-20% Ladungsträger,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 100-400 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein Röntgenkontrastmittel ist.

18. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposomenformulierung für die Herstellung eines Mittels für die Röntgendiagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
60-70% Phosphatidylcholin,
20-30% Cholesterol,
2-10% Phosphatidylglycerol, Phosphatidsäure und/oder Cholesterolhemisuccinat,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 150-350 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein Röntgenkontrastmittel ist.

19. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposomenformulierung gemäß einem der Ansprüche 16-18 für die Herstellung eines Mittels für die röntgendiagnostische Darstellung des Intravasalraumes.

20. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposamenformulierung gemäß einem der Ansprüche 16-18 für die Herstellung eines Röntgenkontrastmittels für die Computertomographie.

21. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposomenformulierung gemäß Anspruch 20 für die Herstellung eines Mittels für die röntgendiagnostische Darstellung des Intravasalraumes mittels Computertomographie.

22. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposomenformulierung für die Herstellung eines Mittels für die MRI-Diagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
40-90% Phospholipide oder Amphiphile,
10-50% Sterole,
0-25% Ladungsträger,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 100-400 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein MRI-Kontrastmittel ist.

23. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposomenformulierung für die Herstellung eines Mittels für die MRI-Diagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
40-70% Phospholipide oder Amphiphile,
30-50% Sterole,
5-20% Ladungsträger,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 100-400 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein MRI-Kontrastmittel ist.

24. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposomenformulierung für die Herstellung eines Mittels für die MRI-Diagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
60-70% Phosphatidylcholin,
20-30% Cholesterol,
2-10% Phosphatidylglycerol, Phosphatidsäure und/oder Cholesterolhemisuccinat,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 150-350 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff MRI-Kontrastmittel ist.

25. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposamenformulierung gemäß einem der Ansprüche 22-24 für die Herstellung eines Mittels für die diagnostische Darstellung des Intravasal raumes mittels MRI.

26. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposomenformulierung für die Herstellung eines Mittels für die Radiodiagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
40-90% Phospholipide oder Amphiphile,
10-50% Sterole,
0-25% Ladungsträger,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 100-400 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein Radiodiagnostikum ist.

27. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposomenformulierung für die Herstellung eines Mittels für die Radiodiagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
40-70% Phospholipide oder Amphiphile,
30-50% Sterole,
5-20% Ladungsträger,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 100-400 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein Radiodiagnostikum ist.

28. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposomenformulierung für die Herstellung eines Mittels für die Radiodiagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß

a) folgendes Mischungsverhältnis der Lipide vorliegt:
60-70% Phosphatidylcholin,
20-30% Cholesterol,
2-10% Phosphatidylglycerol, Phosphatidsäure und/oder Cholesterolhemisuccinat,
b) die Liposomen einen mittleren Durchmesser von 150-350 nm aufweisen und
c) der Wirkstoff ein Radiodiagnostikum ist.

29. Verwendung von wirkstoffhaltigen Liposomenformulierung gemäß einem der Ansprüche 26-28 für die Herstellung eines Mittels für die radiodiagnostische Darstellung des Intravasalraumes.